JPH06510901A - 普遍性の部位特異的ヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 普遍性の部位特異的ヌクレアーゼ 発明の分野 本発明は、融合タンパク質の分野およびそれを部位特異的なヌクレアーゼとして 使用することに関する。さらに詳しくは、本発明の融合タンパク質は、リガンド −エキソヌクレアーゼまたはりガント−エンドヌクレアーゼからなるリガンド− タンパク質ハイブリ、ドである。

配列」）を認識し、これに結合することによって作用する。認識したときには、 す切断パターンによって各酵素が同定されている。

制限酵素は新規な組換え分子を創製する目的でＤＮＡを操作するために、遺伝子 操作をする者によって用いられることが多いが、これら酵素の部位特異性はこれ ら遺伝子操作の道具の有用性を制限する傾向を有する。あらゆる所望の認識配列 を切断するエンドヌクレアーゼを利用できないことが研究努力を挫折させること が多い。さらに、類似した一部のＲＮＡ制限酵素を天然から単離できないことが 、ＲＮへの構造および機能の研究の妨げとなっている。

この問題に向けて、１本鎖および２本鎖の両核酸上の予め選択した配列のところ で特異的に反応させるために、最近の数年間に反応性の基を保持するオリゴヌク レオチドが開発されている。例えば、以下に例示するいくつかの金属キレートＦ ｅ−ＥＤＴ八［Ｂｏｕｔｏｒ　ｉ　ｎ、＾、Ｓら、　ＦＥＢＳ　ＬｅｔＬ、１７ ２：　４３−４６　（１９８４）；　Ｃｈｕら、Ｐｒ。

ｅ、Ｎａｔｌ　＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬＩｓＡ　８２：　９６３−９６７　（１９ ８５）；　Ｄｒｅｙｅｒ、Ｇ、Ｂ、ら、Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌAＡｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、ＬＩｓＡ　８２：　９６８−９７２　（１９８５）：　Ｂｏｉｄｏｔ−Ｆｏ ｒｇｅｔ、ｉら＋　Ｃｏ５ｐｔｅｓ　Ｒｅｎｄｕｅ　ＡｃａпAＳｃｉ、５ｅ Ｃｕ−ツェナトロリン［Ｃｈｅｎら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ｕＳＡ　８３：　７１４１−７１５１　（１９８６）；０２−９７０６　（１ ９８９）；　Ｆｒａｎｃｏｉｓ、Ｊ、Ｃ，ら＋　Ｐｒｏｃ、ｌ１ａｔ１．＾ｃａ ｄ、ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ　８６：　９７O２−９７０６　（１ ９８９）］　；および］Ｆｅ−ポルフィリンＬｅ　Ｄｏａｎら＋　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：　８６４３−８６５９　（１９ｇ？）；　Ｌｅ 　Ｄｏａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：　８６４に−８６ ５９（１９ｇ？）］　’、ならの■ ブドウ球菌ヌクレアーゼおよびＲＮアーゼ−５が、オリゴヌクレオチドにつなが ｐ　８５：　１３４９−１３５３　（１９８ｇ）；　Ｌｅｅら＋　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　２７：　３１９７−３２０３　（１９８８）gＰｒａｓｅｕ ｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：　３０３１−３０３８　（１９８Ｂ ）］。

Ｃｏｒｅｙら［ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　２８：　８２７７−８２８６　（１ ９８９）］は、酵素に新規な結合ドメイン−功した。比較的非特異的なホスホジ ェステラーゼであるブドウ球菌ヌクレアーゼの特有の部位にオリゴヌクレオチド を融合させることによって、［）＼イブリ・２ドヌクレアーゼ」を創製した。こ のようなノーイブリッドヌクレアーゼは、それまで可能であった条件よりもさら に広範囲の条件下で１本鎖のＭ１３ｓｐ７　ＤＮＡを選択的に切断することがで きた［Ｌｅ　Ｄｏａｎら＋　Ｍｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ４ｄｓ　Ｒｅ＋＋、１５：　 ７７４９−７７６０（１９３７）；　ＰｒａｓｅｕＬｈ、Ｄ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：　１３４９−１３５３　（１９８８ j；　Ｌｅｅ。

Ｂ、　Ｌ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｗ＋１ｓｔｒｙ　２７：　３１９７−３２０３　（ １９８８）；　Ｐｒａｓｅｕｔｈ、Ｄ、ら＋　Ｂｉｏｃｈｅ高奄唐狽窒凵@２ 乙：　３０３１−３０３８　（１９８Ｂ）］。

発明の要約 本発明は、あらゆるヌクレオチド配列を選択的に切断することができる部位特異 的なエンドヌクレアーゼに関する。本発明の部位特異的なエンドヌクレアーゼは 、すがンドとヌクレアーゼのハイブリッドからなる融合タンパク質である。

初めにリガンド−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質のリガンドに特異的な受容 体を、切断しようとするヌクレオチド配列内の特定部位に結合（共有結合または 非共宵結合）させることによって、予め選択したヌクレオチド配列を本発明に従 って選択的に切断することができる。本発明のりガント−エンドヌクレアーゼ融 合タンパク質のリガンド成分を、リガンドと受容体の間の親和性に基づいてヌク レオチド配列内の受容体に結合させる。このように、受容体を含むヌクレオチド 配列を本発明の融合タンパク質と接触させることにより、ｌまたは多数の子め選 択した配列を消化することができ、これにより元のヌクレオチド配列を所望の部 位のところで断片化することができる。

本発明は特に、ブドウ球菌ヌクレアーゼとストレプトアビジンの間の融合体に関 する。このような融合タンパク質は、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用に よりビオチンを受容体として認識する。このビオチンは、本融合タンパク質によ って切断しようとするヌクレオチド配列に直接または間接的に結合させてよい。

ビオチンを、ヌクレオチド配列の一部に相補性であるオリゴヌクレオチドなどの 巨大分子に結合させるのが好ましい。ビオチン−オリゴヌクレオチドをこのヌク レオチド配列に結合（ハイブリダイズ）させることによって、本発明のブドウ球 菌ヌクレアーゼ−ストレプトアビジン融合タンパク質はこのヌクレオチド配列を 部位に指向して切断することができる。

さらに、本発明は部位特異的なエキソヌクレアーゼに関する。この態様において は、融合タンパク質はりガントとエキソヌクレアーゼのハイブリッドからなる。

本発明に従ってこの部位特異的な融合タンパク賃を使用することにより、ヌクレ オチド末端の制御されたエキソヌクレアーゼ消化が可能になる。即ち、規定した 配列を制御され！−右方法除去（加水分解）することができ、短縮されたスンレ オチドフラグメントをｉ４ることができる。

本発明の別の態様においては、受容体を含もヌクレオチド配列を初めにその対応 する抗受容体と結合させ、ヌクレオチド配列に結合した受容体−抗受容体フンブ レ、クスを得る。このコンプレックスの抗受容体成分は融合タンパク質のリガン ド部分によって認識され、従って、切断しようとするＤＮＡまたはＲＮＡ基質に ハイブリッドヌクレアーゼを結合させる。

また本発明は、受容体を間接的にＤＮＡまたはＲＮＡ分子に結合させることによ るＤＮＡまたはＲＮＡＭ質の消化に関する。即ち、切断しようとする配列に受容 体を直接的に結合させる代わりに、受容体を基質に対して親和性を有する巨大分 子に結合させる。この態様においては、基質と受容体の間の巨大分子「架橋」を 、ＤＮＡまたはＲＮＡ基質内の特異的な認識配列に結合するように、または基質 にランダムに結合するように設計することができる。

図面の簡単な説明 図１は、ヌクレアーゼ−ストレプトアビジン融合タンパク質を発現するベクター の構築を示す工程図である。

図２は、ヌクレアーゼ−ストレプトアビジン融合タンパク質によって切断される ＤＮＡ基質のａｌＡｌ製を示す工程図である。

好ましい帖様の説明 ！尋 以下の説明においては、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語を広く 利用する。各用語の範囲とともに、明細書および請求の範囲の一層明確かつ矛盾 のない理解を得るために、以下に定義を行なう。

融合タンパク’ｉｉ：本明細書中で用いる「融合タンパク質Ｊなる用語は、単一 の巨大分子を形成するように機能的に結合された２またはそれ以上の巨大分子（ その一方はヌクレアーゼである）を指すことを意味する。「機能的に結合」なる 用語は、それぞれの巨大分子の触媒または構造活性が融合タンパク貫中で保持さ れるような様式による６巨大分子の結合（共有結合または非共有結合）を意味す る。

例えば、ヌクレアーゼとリガンドの間のハイブリ・ラドからなる融合タンパク質 は、この融合タンパク質中にヌクレアーゼ活性および結合活性あるいはこれら活 性の少なくとも・一部を保持しているであろう。融合タンパク質の成分の１つと してのヌクレアーゼに加え−Ｃ１少なくとも１つのリガンドが含まれる。さらに 、１またはそれ以上のリガンドおよびヌクレアーゼから本発明の融合タンパク質 を調製することもできる。

去グ＞ｖ：本明細書中で用いる「リガンド」なる用語は、ある受容体（抗リガン ド）に対して固有の親和性を有するあらゆる巨大分子またはその一部を意味する 。本発明に従う唯一の制限は、この「リガンド」なる用語が核酸分子（ＲＮＡお よびＤＮＡを含む）を包含するらとができないことである。

机担国・本明細書中で用いる「親和性」なる用語は、リガンドと受容体または抗 受容体の間の、生化学的、化学的または物理的な自然引力を指すことを意味する 。この引力により、リガンドがその対応する受容体または対応する抗受容体に共 有または非共有結合する結果になる。さらに、受容体はその対応する抗受容体に 親ＩＯ性を有する。

受容体（抗リガンド）：本明細書中で用いる「受容体」なる用語は、特定のリガ または調製することができる。受容体を例示すると、ビオチン、アビジン、スト レプトアビジン、抗原、抗体、ラクチン、糖コンジュゲート、酵素、基質、補助 因子、阻害物質、カチオン、アニオン、疎水性部位、疎水性基、ホルモン、エフ ェクター、毒素、輸送タンパク質、ビタミン、アミノ酸、糖、膜、リポソームな どが含まれるが、これらに限定はされない。触媒的または生物学的に活性な受容 体なる用語は、対応するリガンドを認識し、それに結合しうる受容体を指すこと を意味する。

抗受容体ニ一部の状況においては、抗受容体は、ヌクレオチド配列に結合した受 容体に結合し、次いで融合タンパク質のリガンド部分に受容体として働く２重の 機能を発揮することができる。即ち、抗受容体により、互いに直接結合すること ができないリガンドと受容体を結合させ、リガンドと受容体の間の結合を得るこ とができる。

■・本明細書中で用いる基質なる用語は、本発明の融合タンパク質によって切断 または加水分解しようとするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。

フラグメント：「フラグメント」なる用語は、完全な巨大分子（リガンド、受容 体、抗受容体、またはヌクレアーゼ）の一部を指すことを意味する。これら巨大 分子の「触媒的または生物学的に活性なフラグメント」なる用語は、完全分子が 持つ触媒活性または生物学的活性、特に本発明の分子による特異的なリガンド／ 受容体結合または配列切断を可能にする活性の全部または一部を保持するフラグ メントを意味する。

奮罵俸：巨大分子の「変異体」なる用語は、天然分子またはそのフラグメントに 構造および触媒活性が大きく類似しているが、そのような分子またはそのフラグ メントと同一ではないリガンド、受容体、抗受容体、またはヌクレアーゼを指す ことを意味する。「変異体」なる用語はイソ酵素お上び了しルを包含することを 意味する。変異体は必ずしも天然分子から導かれるものではない。即ち、２つの 分子が類似の構造および触媒活性を有しているならば、これら分子の一方の組成 あるいは２次、３次または４次構造が他方において見い出されるものと同一では ないときであっても、これら分子はこの用語を本明細書中で用いるときには変異 体とみなされる。

■、融合タンパク質の触媒活性 本発明は、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ、１本鎖または２本鎖）の配列内のい ずれかまたは多数の子め選択した部位において切断することができる部位特異的 なエンドヌクレアーゼを提供するものである。さらに本発明は、ＤＮＡまたはＲ ＮＡ分子（１本鎖または２本鎖）の特定の末端から規定した数のヌクレオチドを 選択的に消化するのに有用な部位特異的なエキソヌクレアーゼに関する。

本発明によれば、本発明の部位特異的なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレ アーゼは、ヌクレアーゼとリガンドの間の／曙ブリ・ｙドである融合タン／４り 質を作成することによって創製される。この融合体は、融合タン７＜り質を構成 している各成分の触媒活性を保持するような方法で作成する。通常、本発明の融 合タンパク質は同様の方法で機能する。即ち、融合タンノ（り質のリガンド成分 は、この融合タンパク質の他の触媒活性が作用するであろう位置を指令する。即 ち、リガンドの結合活性は「認識配列」に対して親和性を有しており、この認識 配列が融合タンパク質によって結合されると、この融合タンｌ（り質のヌクレア ーゼ部分がこの認識配列の内部またはその近くを切断または加水分解する。本発 明の融合タンパク質について用いるときの「認識配列」は、結合受容体に密接に 関連した特異的配列と定義される。゛ 本発明のエンドヌクレアーゼ融合タン１＜り貫による切断の作用様式は■型制限 エンドヌクレアーゼの酵素機能に類似しているが、１つの重要な相違が明らｈｌ である。本発明においては、融合タンパク質のリガンド部分が認識配列に結合し た受容体を認識し、これに結合して、ヌクレアーゼおよび切断しようとする認識 配列を非常に近接させて配置する。このようにして、受容体と結合（共有結合ま たは非共有結合）しうるあらゆる認識配列が本発明の融合タン、（り質と結合し 、該特定の認識配列の内部またはその近くが切断される結果になる。

任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子または配列を本発明に従って切断すること力くで きる。このＤＮＡまたはＲＮＡ基質は、基質に対する融合タンｉ４り質のエンド ヌクレアーゼ部分によってのみ制限されるにすぎない。例えば、本発明の融合タ ンパク質は、本発明の融合タンパク質を２本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼを 用いて作成するときには、２本鎖ＤＮＡを切断するであろう。同様（こ、本発明 に従って１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを切断するためには、融合タンノくり質の エンドヌクレアーゼ部分は１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なエンドヌクレ アーゼ、例えばブドウ球菌ヌクレアーゼであるはずである。

１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子のエキソヌクレアーゼ消化が、既 知のエキソヌクレアーゼを用いて行なわれている。これらエキソヌクレアーゼに よる制御された消化が可能であるが、具なる長さの分子集団を得るための一般的 方法によってのみ可能であるにすぎない（即ち、酵素濃度、時間、温度および／ または酵素条件を変える○とにより加水分解を制御する）。しかし、本発明に従 うと、１本鎖または２本鎖の核酸分子の制御された部位特異的な消化が規定され た方法で達成され、核酸分子の特定末端が予め決めた長さまで短縮される。

１つの態様においては、本発明の融合タンパク質は基質ヌクレオチド配列に結合 した受容体に特異的に結合し、加水分解しようとする基質末端の近くに融合タン パク質のエキソヌクレアーゼが結合される。核酸分子のこの領域に融合タンパク 質が結合すると、エキソヌクレアーゼは該特定末端の消化を始める。この融合タ ンパク質がその核酸基質から除去されたときに消化が完結する。

本発明に従い、受容体を特定配列（本明細書中では「認識配列」と呼ぶ）に共有 結合または非共有結合させる。共有または非共有結合のいずれかにより融合タン パク質のリガンド部分を受容体−核酸コンプレックスに結合させることによって 、エキソヌクレアーゼはリガンド結合の近くに位置する核酸末端を加水分解する ことができる。

リガンドを除去する範囲までのエキソヌクレアーゼ消化はその基質から酵素を除 去する作用を有しており、エキソヌクレアーゼ消化を停止させる。このように、 末端近くの受容体の位置設定が特定末端の消化の範囲を決定する。

即ち、融合タンパク質を受容体−リガント相互作用によってヌクレオチド配列に 結合させ、エキソヌクレアーゼによる該特定末端の加水分解を開始させる。受容 体を含む配列内部のヌクレオチドが加水分解により除去されると、融合タンパク 質はヌクレオチド配列と相互作用することから効率的に離脱し、それによって特 定末端の加水分解を阻害する。

ヌクレオチド配列との相互作用からの融合タンパク質の離脱を容易にするために は、バッチ反応よりも連続フロー反応を用いる方が好ましいであろう。バッチ反 応においては、融合タンパク質は、受容体−基質への融合タンパク質の結合によ る代わりに、偶然の接触に起因する非特異的な加水分解または切断を行なうこと ができる。連続フロー系を本発明のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアー ゼの両融合体に用いることができ、この系は本発明の融合タンパク質を結合させ るカラム、フィルター、ゲル、泡状物などの使用を必要とする。融合タンパク質 を含むマトリックスに基質−受容体を通過させることにより、部位特異的な該基 質の切断または加水分解が可能になる。この系は消°化産物の除去が容易である ので、非特異的な相互作用が防止される。

融合タンパク質を連続フローマトリックスに非共有結合によりて結合させてもよ いが、共有結合によってマトリックスに結合させるのが好ましい。融合タンパク 質の所望の生物学的および触媒活性を破壊しない任意の方法で融合タンパク質を 固定化することができる（受容体−リガント相互作用による融合タンパク質の固 定化を含む）。例えば、融合タンパク質に２つのりガントを含有させて、融合体 をマトリックス上に付着および固定化させ、そして基質に結合した受容体と結合 させることができる。

本発明の酵素を用いる反応の条件（時間、温度、ＰＨ，および塩漬ｖ７ｔ＞は、 融合タンパク質のヌクレアーゼおよびリガンド成分、ならびに、切断すべき部位 の数および加水分解すべきヌクレオチドの数に依存して変化するであろう。通常 、使用される条件は天然の未融合ヌクレアーゼにとって最適である条件である。

このような条件は当分野で周知である。当業者なら、条件を変化させてそれぞれ の融合タンパク質に対して最適のヌクレアーゼ活性および最適の結合活性を得る ことができる。周知のヌクレアーゼおよび親和性検定を用いて、それぞれの融合 タンパク質に対して最適の反応条件を決定することができる。

■　融合タンパク質の種類 本発明の融合タンパク質は、これら融合体に伴われる２種類の基本的な活性、即 ちヌクレアーゼおよびリガンド結合活性を有する。この融合タンパク質を、該融 合タンパク質を導いた巨大分子成分のそれぞれの活性を保持するような方法で作 成する。即ち、本発明の融合タンパク質は最低でも２種類の巨大分子からなり、 その一方はヌクレアーゼ活性に関係しており、他方はそれに結合した結合活性を 有している。

当業者なら、多数のヌクレアーゼおよび／または受容体分子を機能的に結合させ て、複数の活性、従って複数の機能を有する多数の融合タンパク質「種」を創製 しうろことを理解しているであろう。例えば、本発明の融合タンパク質は、エン ドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよび２種類の異なるリガンド分子（同一 の核酸分子内の別の受容体に結合する）からなるハイブリッド分子を包含するこ とができる。この多機能融合タンパク質を受容体含有基質と接触させると、特定 末端の部位指向性の加水分解および基質配列内の予め選択した部位の内部または その近くのエンドヌクレアーゼ切断の結果が得られるであろう。ヌクレアーゼ、 受容体および／または抗受容体の池の組合せは、使用する基質および所望の結果 に依存して当業者には容易にわかることであろう。

Ａ　ヌクレアーゼ 本発明の融合タンパク質の少なくとも１つの成分はヌクレアーゼ活性を有する。

本発明のタンパク質ヌクレアーゼには、当業者に周知のエキソヌクレアーゼおよ びエンドヌクレアーゼの両方が含まれる。

ヌクレアーゼ活性を示す任意の巨大分子（タンパク質またはその他）を本発明に 従って用いることができ、これらには金属キレート、非タンパク質酵素（リボザ イム）、および触媒的に活性なタンパク質（酵素）が含まれるが、これらに限定 はされない。このような金属キレートには、Ｆｅ−ＥＤＴＡＳＣｕ−ツェナトロ リン、Ｆｅ−ポルフィリンおよびＦｅ（Ｉｆ）ブレオマイシン［Ｃａｒｔｅｒら 、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　８７：　９３７３−９３７７　（１９９０）およびＳｉｇｍａｎら、 　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｔ　５’ｌ：　２０７−Q３６　（１ ９９０）］が含まれるであろう。タンパク質ヌクレアーゼを用いて本発明の融合 タンパク質を作成するのが好ましい。しかし、本発明の態様の１つは、非タンパ ク質ｃｈｅＩ！１ｉｓｔｒｙ　２５：　４４７８−４４８２　（１９８６）：　 Ｂｅｅｎ、Ｍ、Ｄ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：　１４１２|１４１６　（ １９８ ８）、およびＤｏｕｄｎａら、　ＮａＬｕｒｅ　３３９：　５１９−５２２　（ １９８９）］を利用する。

本発明の融合タンパク質を作成するための例示エキソヌクレアーゼには、ＲＮＡ およびＤＮＡの両方に特異的なエキソヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレ アーゼ１１エキソヌクレアーゼＩ１１、エキソヌクレアーゼＶｌｌ、ラムダエキ ソヌクレアーゼ、ヤエナリ・ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢａ１３　Ｌヌクレア ーゼ　“ｐＨリボヌクレアーゼＢ、　ｃｅｒｅｕｓ、リボヌクレアーゼＣＩ・３ 、リボヌクレアーゼＨ１リボヌクレアーゼｐｈｙ＋、リボヌクレアーゼＰｈｙＭ 、リボヌクレアーゼＴｌ。

リボヌクレアーゼＴ２、およびリボヌクレアーゼＵ２が含まれる。

本発明に従って使用するエンドヌクレアーゼは、当業者に既知のあらゆるヌクレ アーゼラ包含していてよい。熱安定性であり、４個のヌクレオチドのみを認識す るエンドヌクレアーゼが好ましい。そのようなエンドヌクレアーゼには、Ｈａｓ Ｉｓ７−＞ｆｌｓ　０９７６）］が含まれる。本発明の融合タンパク質を作成す る際の唯一の必要条件は、使用されるエンドヌクレアーゼが非特異的なヌクレア ーゼであるということ、即ち、その天然の未融合の状態では該エンドヌクレアー ゼは特定の認識配列を認識せず、それに結合しないということである。

本発明のエンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、所望の鎖に対して基質特異性を 有する適切なエンドヌクレアーゼが融合タンパク質の成分として包含されている 限り、２本鎖または１本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ分子を消化することができる。

本発明に従って特定部位において１本鎖ＤＮＡを切断するための融合タンパク質 の好ましいエンドヌクレアーゼ成分は、ブドウ球菌ヌクレアーゼである。１本鎖 ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＲＮアーゼ−８、リボザイム、またはブドウ球菌ヌ クレアーゼを含有する融合タンパク質によって切断するのが好ましい。２本鎖Ｄ ＮＡはブドウ球菌ヌクレアーゼ、またはＡｌｕｌ、　ＨａｅｌｌｌもしくはＴａ ｑ（α）ｌのいずれかを構成成分とする融合タンパク質によって切断するのが好 ましく、一方、２本鎖ＲＮへはＲＮアーゼＡ　［Ｓｈａｌｏｎｇｏら、　Ｂｉ立 場−２３：　４８２０−４８２５　（１９８９）］の融８タンパク質で消化する のが好まいλ。

Ｂ　リガンド 本発明の融合タンパク質のすがンド成分は、その対応する受容体を認識し、それ に結合することができる任意の巨大分子またはその一部であってよＬＳ。本発明 に従う唯一の制限は、この融合タンノ寸り貫のりｉｆンド成分ｂ（核酸分子ＲＮ ＡまたはＤＮＡを含むことができないということである。表１・（こ、本発明迄 こｌｔ＋’で使用するための可能なリガンド、受容体の組合せを例示する。好ま しく（よ、１ノガンド一ヌクレアーゼ融合体のリガンド部分は、受容体；こ親和 性を有する触媒的１こ活性なタンパク質である。本方法において、タンノ（り質 −タン／マク質の融合体（ｉ、当業者に周知の組換えＤＮＡ法によって得ること 力（できる。し力１し、このＩＪガントは、周知の化学的手段によって融合タン ノ（り實のヌクレアーゼ部分；ご本吉合させた非タンパク質化合物であってもよ い。

ビオチン：アビジン、ストレプトアビジンなどアビジン、ストレプトアビジンな ど：ビオチン抗原：抗体 レクチン：糖コンシュケート 糖フンシュゲート：レクチン 酵素二基質、補助因子、阻害物質など カチオン：アニオン 疎水性部位−疎水性基 受容体：ホルモン、エフェクター、毒素など輸送タンパク′Ｊｌｔ：ビタミン、 アミノ酸、糖など１１５に丈ｊツ：ソーーーーーーーーー融合タンパク賃を得る ために用いる触媒的に活性なタンパク質リガンドには、受容体に親和性を有する あらゆるタンパク質が含まれる。このようなリガンドには、アビジン、ストレプ トアビジン、抗体もしくは抗原、酵素、レクチン、ホルモン、エフェクター、ま たは毒素が含まれるが、これらに限定はされない。タンパク貫リガンドが抗体で あるときには、全抗体またはＦａｂフラグメントのどちらかを用いてその対応す る抗原受容体に結合させる。別法では、抗原またはその触媒的に活性なフラグメ ントが、本発明の融合タンパク質のリガンド部分である。

本発明に従って使用する最も好ましいタンパク質リガンドはアビジンまたはスト レプトアビジンであり、これらはその対応する受容体であるビオチンに結合する 。

融合タンパク質の好ましい非タンパク質リガンド構成成分は、ビオチンまたはそ の触媒的に活性な変異体もしくはフラグメントである。ビオチンをリガンドとし て利用するときには、核酸に結合させる受容体はアビジンまたはストレプトアビ 融合タンパク質の各部分く即ち、ヌクレアーゼおよびリガンド）の単離は独立し て行なうことができ、次いで各成分をインビトロで化学的に融合させて本発明の 融合タンパク質を得る。この場合、実質的に純粋な天然または組換えのタンパク 質または非タンパク質を周知の化学的手段によって融合させる。

て分離する。この好ましい態様においては、タンパク質−タンパク質の融合分子 を、リガンドとヌクレアーゼをコードしている複数遺伝子を機能的に結合させる ことによって得る。このようにこれら遺伝子を結合させるためには、各遺伝子の 活性部位をＤＮＡレベルで適切なリーディング・フレーム（読み枠）内に結合さ せるべきであり、これにより、「ハイブリッド」遺伝子から翻訳されたタンパク 質が各遺伝子の活性または活性の一部を含有するようにする。

Ａ　ヌクレアーゼまたはリガンド遺伝子のクローニング種々の方法のいずれかを 用いて本発明の融合タンパク質の作成のためのヌクレアーゼまたはリガンド遺伝 子をクローニングする。このような方法の１つは、ヌクレアーゼまたはリガンド 遺伝子を含有する挿入体の存在について、ＤＮＡ挿入体（ヌクレアーゼまたはり ガントを発現するｍ胞から導く）のシャトルベクターライブラリーを分析するこ とが必要である。このような分析は、細胞をベクターでトランスフェクトし、次 いでヌクレアーゼまたはリガンドの触媒活性の発現を検定することによって実施 することができる。これら遺伝子をクローニングするための好ましい方法は、ヌ クレアーゼまたはリガンド分子のアミノ酸配列を決定することを必要とする。こ れを行なうために、ヌクレアーゼまたはリガンドタンパク貰を精製し、自動配列 決定機で分析することができる。別法では、両分子を臭化ンアノゲンで、または パパイン、キモトリプシンもしくはトリプシンなどのプロテアーゼでフラグメン ト化することができる［０４ｋｅ、　Ｙ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ ５７＋９７５１−９７５８　（１９８２）：　Ｌｉｕ、Ｃ，ら、ＩｎＬｊ、Ｐｅ ｐｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、２１：　２０９−２１５　（１９W３）］。

これらタンパク質の全アミノ酸配列を決定することができるが、これら分子のペ プチドフラグメントの配列を決定するのが好ましい。ペプチドが１０アミノ酸の 長さよりも長いときには、一般に、この配列情報は遺伝子（特定のヌクレアーゼ またはりガントの遺伝子など）のクローニングに十分である。

■またはそれ以上の適切なペプチドフラグメントが配列決定されたなら、これら をコードしうるＤＮＡ配列を試験する。遺伝コードは縮重しているので、１を越 えるコドンを用いて特定のアミノ酸をコードさせることができる［１１ａｔｓｏ ｎ、　Ｊ、　Ｄ、　。

［遺伝子の分子生物学ｊ中、第３版＋　１．Ａ、Ｂｅｎｊａ＋ｅｉｎ、　Ｉｎｃ 、＋　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃ＾（１９７７）、　ｐｐ、３５６−３５月。

これらペプチドフラグメントを分析して、最も低い縮重度を何するオリゴヌクレ オチドによってフードされつるアミノ酸配列を同定する。これは、単一コドンに よってのみフードされるアミノ酸を含む配列を同定することによって行なうのが 好ましい。

このようなアミノ酸配列が単一のオリゴヌクレオチドによってのみフードされて いることらあるが、アミノ酸配列がいずれか１組の類似オリゴヌクレオチドによ ってフードされうることか多い。重要なことは、この組の構成員のすべてがペプ チドフラグメントをコードしうるオリゴスクレオチドを含有しており、従ってこ のペプチドフラグメントをコードしている遺伝子と同一のヌクレオチド配列を含 有している可能性があるのに対して、この組の１つの構成員だけが該遺伝子のヌ クレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有していることである。この構成 員が該組中に存在しており、該組の他の構成員の存在下であってもＤＮＡとノー イブリダイズすることができるので、単一のオリゴヌクレオチドを用いてペプチ ドをコードしている遺伝子をクローニングする方法と同じ方法で未分画のオリゴ ヌクレオチドの組を用いることができる。

上に記載した方法と正に同様の方法で、ペプチドフラグメントをフードしうるオ リゴヌクレオチド配列または配列組に相補性であるヌクレオチド配列を有するオ リゴヌクレオチド（または、オリゴヌクレオチド組）を用いることができる。

ヌクレアーゼまたはリガンド遺伝子のフラグメントをコードしうる適切なオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド組（または、該オリゴヌクレオチドまた はオリゴヌクレオチド組に相補性のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド組）を同定しく上記の方法を用いる）、合成し、そして遺伝子の供給源に依存 してＤＮＡまたはｃＤＮＡＭＤＮＡレベル当分野で周知の手段によりハイブリダ イズさせる。通常、真核性遺伝子の単離はｅＤＮＡライブラリーをスクリーニン グするごとによって行ない、一方、原核性遺伝子を単離するためにはＤＮＡライ ブラリーを用いる。核酸ｌ＼イブリダイゼーシコンの方法は、　Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、Ｔ、ら［［分子クローニング、実験室マニュアル」中、第２版、　Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）］およびｌｌａｙｍｅｓ、 　Ｂ、　Ｄ、ら［［核酸Ｉ＼イブリダイゼーシ冒ン、実用的アプローチ」中。

ＩＲＬ　ｆ’ｒｅｓｓ、　１ａｓｈｉｎｇＬｏｎ、ＤＣ（１９３５）コが開示し ている（これら文献は本明細書の一部をｌｌ１代するものとする）、、使用する ＤＮＡまたはｃＤＮＡの供給源は、所望の配列に富ませるのが好ましい。このよ うな豊富化は、ヌクレアーゼまたはリガンドの合成を誘導する条件下で培養した 細胞からＲＮＡを抽出することによって得たｃＤＮＡから最も簡単に得ることが できる。

上記したような方法またはこれらと同様の方法により、ストレプトアビジン［＾ ｒｇＲｒａｎｓら＋　ｌ１ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４ （ン４）＋　１８７１−１８８２　（１９８６）］、アビジ刀mＫｕｌ ｏｍｓａら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、５ｕｐｐ、　ｐａｒｔ　２： 　２１０　（１９８ｇ）］、ヒトＢ型肝炎抗体しＨｏｎ（ら、　Ｋｏｒｅａｎ　 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋８（１）：　７−１８　（１９８６）］、ヒトアルデヒ ドデヒドロゲナーゼ［Ｈｓｕ、　Ｌ、　Ｃ，ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：　３７７１−３７７５　（１９８５）］、フィブ鴻 l クチン［５ｕｚｕｋｉ、　Ｓ、ら、　Ｅｕｒ、１１ｏ１．Ｂｔｏｌ、Ｏｒｇａｎ 、ｊ、　４−：　２５１９−２５２４　（１９１１５）コ、qトエス トロゲン受容体遺伝子［１ａｌＬｅｒ、　Ｐ、ら、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：　７８８９−７８９３　（１９８５）］、］組織 型ブラスミ／−ゲン活性化因子Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３ ０１：　２１４−２２１、　（１９１！２）］、およびヒト臨月胎盤アルカリホ スファターゼ相補性Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｋａｍ、　１．ら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：　８７１５−８７１９ 　（１９８５）］の遺伝子の成功裏のクローニングが可能になっている。

多数のヌクレアーゼ遺伝子が種々の方法を用いてクローニングされているが、こ れら遺伝子には５ｅｒｒａＬ　ｉａ−Ｍａｒｃａｓｃｅｎｓの細胞外ヌクレアー ゼＥＢａｌｌら、　Ｇｅｎｅ　５７：１８３−１９２　（１９８７）］、バクテ リオファージＴ５の５°エキソヌクレアーゼ［ＫａＬｉｍａｎら、　ＦＥＢＳ　 Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９５：　６１−６４　（１９８６）］、およびイヌ２型アデ ノウィルスのエンドヌクレアーゼ［５ｐｉｂｅｙら、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、 　７０（１）：　１６５−１７２　（１９８９）］の遺伝子が含まれる。ｌ１ｔ ｓｏｎ［Ｇｅｎｅ　７４：　２８に−２８９（１９８Ｂ）］は、制限エンドヌク レアーゼおよび修飾メチラーゼ遺伝子を単離およびクローニングするための４つ の方法を開示している。

ヌクレアーゼ遺伝子のクローニングならびにリガンド（ストレプトアビジン、ア ビジンおよび抗体）のクローニングを説明する上記文献はすべて本明細書の一部 を構成するものとする。

ヌクレアーゼまたはリガンド遺伝子をクローニングする別の方法においては、ヌ クレアーゼまたはりガントを発現しうる細胞から発現ベクター中にＤＮＡまたは ｃＤＮＡをクローニングすることによって発現ベクターのライブラリーを調製す る。次いで、このライブラリーにつき、ヌクレアーゼもしくはリガンドまたはそ のフラグメントもしくは変異体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードしうるヌクレオチド配列を有し、抗ヌクレアーゼまたは抗リガンド抗体に結 合するタンパク質を発現しうるライブラリー構成員をスクリーニングする。

Ｂ、ヌクレアーゼおよびリガンド遺伝子の融合上記の方法によって得たクローン 化ヌクレアーゼまたはリガンド遺伝子を機能的に結合させて「ハイブリッド」の ヌクレアーゼ−リガンド融合遺伝子を得ることができる。活性部位を含む全構造 遺伝子または部分を任意の組合せおよび任意の順序で融合させることができる。

唯一の要件は、これら構造遺伝子または構造遺伝子フラグメントを機能的に結合 させることである。次いで、得られたノ＼イブ’Ｊ　ｙド遺伝子を発現ベクター に機能的に結合させ、細菌または真核細胞に導入して、本発明のヌクレアーゼ− リガンド融合タンパク質を産生させる。融合タンパク質を作成する方法は当業者 に周知である。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ（米国特許４．６７５．３８２）は、ジフ テリア毒素とポリペプチドリガンド（ホルモンなど）のノ＼イブリタドタンパク 質を作成するための組換えＤＮＡ法を開示している。

遺伝子の融合体またはそのフラグメントの融合体は常法に従って構築することが できる。このような方法は、連結用の平滑末端化もしくは付着末端化、適切な末 端を得るための制限消化、必要に応じての付着末端の充填、所望でない結合を避 けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連結を包 合する。このような操作はＭａｎｉａＬｉｓ、　Ｔ、らが開示しており、当分野 では周知である。

免疫グロブリン遺伝子を他の遺伝子（ブドウ球菌ヌクレアーゼ、マウス腫瘍遺伝 子Ｃ−１ｙｅ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノーフラグメントを含 む）に融合させることによって、組換えＤＮＡ法により融合タンパク質が作成さ れている［Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　６０４−６１２　 （１９Ｂ４）；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ@Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、３４７−３９４１９８５年９月］り（以下 、余白） Ｃヌクレアーゼ−リガンド融合遺伝子の発現リガンド遺伝子に機能的に結合され たヌクレアーゼ遺伝子または少なくともこれら遺伝子の一部からなるＤＮＡ分子 を発現ベクター中に機能的に結合させ、宿主細胞に導入して、該細胞によりこれ らタンパク質を発現させることができる。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域の配列と所望の融合タンパク質を コードする配列）は、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシ フト突然変異を導入する結果にならず、（２）所望のタンパク質をコードする遺 伝子配列を転写させるプロモーター領域配列の能力に干渉せず、また、（３）プ ロモーター領域配列によって転写される所望のタンパク質遺伝子配列の能力に干 渉しないものであるならば、機能的に結合されていると言われる。

ヌクレアーゼ−リガンド融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を、常法に 従ってベクターＤＮＡと組換えることができる。本発明は、原核または真核の両 ｗｌ胞における所望の融合タンパク質の発現を含むものである。真核性宿主には 、酵母（特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、菌類（特に、＾ｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ）、インビボまたは組織培養における哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたは 霊長類細胞など）が含まれる。

酵母および哺乳動物細胞は、グリフシル化を含む翻訳後ペプチド修飾をも行なう ことができるという点で大きな利点を与える。これら宿主において所望のタンパ ク質を産生させるために利用することが可能な強力なプロモーター配列および高 コピー数のプラスミドを利用する多数の組換えＤＮＡ法が存在する。

酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子生成物のリーダー配列を認識し、リーダ ー配列を持つペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する。哺乳動物細胞は、タ ンパク質分子に対して翻訳後修飾を与える（正しい折り畳みまたは正しい部位で のグリフシル化を含む）。

宿主として有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋｌなどの線維芽 細胞起源の細胞またはその誘導体が含まれる。哺乳動物宿主に対して、所望の融 合タンパク質を発現させるためにいくつかの可能なベクター系が利用可能である 。多種多様の転写および翻訳調節配列を、宿主の性質に依存して使用することが できる。これら転写および翻訳調節シグナルを、アデノウィルス、ウシパピロー マウィルス、サルウィルスなどのウィルス供給源から導くことができる（ここで は、調節シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子に結合している）。

別法によれば、アクチン、フラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物発現産物に由来 するプロモーターを使用することができる。抑制または活性化が可能な転写開始 調節シグナルを選択して、遺伝子の発現を変調させることができる。重要なシグ ナルは、４文を変えることによって発現を抑制または開始させることができる温 度感受性の調節シグナル、または化学調節（例えば、中間代謝物）の支配下にあ る調節シグナルである。

真核宿主における所望の融合タンパク質の発現は真核性調節領域の使用を必要と する。通常、このような領域はＲＮＡ合成を開始させるに十分なプロモーター領 域を含有しているであろう。好ましい真核性プロモーターには、マウスメタロ５ 　（１９ｇ２）コ；ＳＶ４０初期プロモーター［Ｂｅｎｏｉｓｔ、　ｃ、ら＋　 ＮａＬｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０：　３０１：　５９５１−５９５５　（ １９８４）］が含まれる。

広く知られているように、真核性ｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードし ているコドンのところで開始される。このため、真核性プロモーターと所望の融 合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の間の結合がメチオニンをフードしう るどのような介在コドン（即ち、ＡＵＧ）をも含有しないことを確実なものにす るのが好ましい。このようなコドンの存在は、融合タンパク質が生成する結果に なるか（ＡｔＪＧフドンが所望の融合タンパク質コード化ＤＮＡ配列と同じリー ディング・フレーム内にあるとき）、またはフレームシフト突然変異の結果にな る（ΔＵＧコドンが所望の融合タンパク質コード化配列と同じリーディング・フ レーム内にないとき）。

また、ホルモン受容体分子の発現を原核細胞中で行なうこともできる。好ましい 原核性宿主には、Ｅ、ｃｃｌｉ（大腸菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　ＳＬｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ、　Ｒｇｅｕｄｏｓｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、５ｅｒｒａ Ｌ　ｉａなどの細菌が含まれる。最も好ましい原核性宿主は大腸菌である。特に 重要な細菌宿主には、大腸菌に１２株ＨＭＳ１７４（Ｆ−１ｒｅｃ　Ａ、ｒ　’ ｘ＋ｔｍ″ｘ、−Ｒｉｆ１１）およびＢＬ２１（Ｆ＼ｏｍｐＴ　、ｒ　−５ｍ− ５）ならびに池の腸内細菌（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ　Ｌｙｐｈｉｍｕｒｉｕ−ま たは５ｅｒｒａｔｉａ　＠ａｒｃｅｓｃｅｎ＋＋）および種々のＰｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓｆｉが含まれる。原核性宿主は、発現プラスミド中のレプリコＶおよび 制御配列に適合するものでなければならない。

原核細胞（例えば、大腸菌、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 、　ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｇなど）において所望の受容体分子を発現させるた めには、所望の融合タンパク質をコードしている配列を機能的な原核性プロモー ターに機能的に結合させることが必要である。このようなプロモーターは構成性 またはより好ましくは調節可能なもの（即ち、誘導性または脱抑制性）であって よい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージ大のｌ１１（プロモー ター、およびｐＢＲ３２２のｂ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターなど が含まれる。誘導性の原核性プロモーターの例には、バクテリオファージλの主 右側および左側プロモーター（ＰＬおよびＰ、）、大腸菌のｔｒｐ、　ｒｅｃＡ 、　１．ａｃＺ、　Ｉａｃ　ｌ　ＳｇａｌおよびＬａｃプロモーター、ａ−アミ ラーゼ［Ｌｌｌｓａｎｅｎ、　Ｉ　ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６２：　 １７６−１８２　（１９８５）］、Ｂ、５ｕｂＬｉｌｉｓの５−２８特異的プロ モーター［Ｇｉｌｍａｎ、　Ｍ、　Ｚら、　Ｇｅｎｅ　３２：　１１−２０　（ １９８４）］、ＢａｃｉｌｌｕｓのバクチリオファＧｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０ ３：　４６８−４７８　（１９８６）］が含まれる。原核性プロモーターは、Ｇ ｌ　ｉｃｋ、　Ｂ。

Ｒ，［Ｊ、ｌｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌ：　２７７−２８２　（１９８７ ）］；　Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、Ｙ、［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ@６８：　５０５− ５１６　（１９８６）］；およびＧＯｔｔｅｓｌＩａｎ、　Ｓ、　［＾ｎｎ、Ｒ ｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１ｇ＋　４１５−４４２　（１９８４）nが概説 している。

また、原核細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配列の上流のリポソー ム結合部位の存在が必要である。このようなリポソーム結合部位は、例えばＧ。

ｌｄ、Ｌ、ら［Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３５：　３６５−４０ ４　（１９８１）］が開示している。

所望の受容体融合タンパク質フード化配列および機能的に結合したプロモーター を、受容原核または真核細胞のどちらかに、直線分子または共有結合によって閉 じられた環状分子（より好ましい）のどちらであってもよい非復製ＤＮＡ（また は、ＲＮＡ）分子として導入することができる。このような分子は自律的に複製 することができないので、所望の受容体分子の発現は導入された配列の一時的な 発現によって起こるであろう。また、永久的な発現は、導入された配列の宿主染 色体中への組込みによって起こるであろう。

１つの態様においては、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中に組込むことがで きるベクターを用いる。導入されたＤＮＡを染色体中に安定に組込んだ細胞は、 発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーを も導入することによって選択することができる。このマーカーは、宿主の栄養要 求（例えば、１ｅｕ２またはｕｒａ　３であり、通常の酵母栄養要求マーカーで ある）、殺生物耐性（例えば、抗生物質または銅などの重金属耐性）などを補足 することができる。この選択マーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ遺伝 子配列に直接結合させることができるし、また、同時トランスフエフシランによ って同じ細胞中に導入することもできる。

好ましい態様においては、導入される配列は、受容宿主において自律的に複製ス ミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には、次のものが含まれ る：ベクターを含む受容細胞を認識し、ベクターを含まない受容細胞から選択す ることが容易であること：特定の宿主において望ましいベクターのコピー数；お よび、異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル（往復）」させうろことが 所望であるか否か。

一連の酵母遺伝子発現系のすべてを利用することができる。このような発現ベク ターの例には、酵母２ミクロン・サークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰ およびＹＲＰなと、またはこれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは 当分野で周知である［ＢｏＬｓＬｅｉｎ、　Ｄ、ら、　Ｍｉａ＋ｌＩｉ　Ｗｎｔ ｒ、Ｓｙ＋ｌｌｐ、　１９：　２６５−２７４　（１９８Q）； Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、ｒ酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの分子生物学：ラ イフサイクルおよび遺伝的性質」中、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　Ｎ Ｙ、　吹A４４５−４ ７０　（１９８１）：Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　２８：　２０３−２ ０４　（１９８２）］。

哺乳動物宿主用には、発現のためにいくつかの可能なベクター系が利用できる。

１つのベクター型は、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウ ィルスまたは５Ｖ４Ｑウイルスなどの動物ウィルスから導いた自律的に復製する 染色体外プラスミドを与えるＤＮＡ要素を利用する。第２のベクター型は、所望 の遺伝子配列の宿主染色体中への組込みに基づいている。導入されたＤＮＡを染 色体中に安定に組込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にす る１またはそれ以上のマーカーをも導入することによって選択することができる 。

このマーカーは、栄養要求宿主にプロトトロピー、殺生物耐性（例えば、抗生物 質または銅などの重金［）などを与えることができる。この選択マーカー遺伝子 は、発現させようとするＤＮＡ配列に直接結合させることもできるし、また、同 時形質転換によって同じ細胞中に導入することもできる。また、ｍＲＮＡの最適 合成のために別の要素が必要になることもある。これら要素には、スプライスシ グナル、ならびに、転写プロモーター、エンハンサ−および終止シグナルが含ま る。

好ましい原核性ベクターには、例えば大腸菌中で複製しうるプラスミド、例えば ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１、ｐｓｃｌｏｌ　ｐＡＣＹＣ１８４、ＷＶＸなどが含 まれる。このようなプラスミドを、例えば−ａｎ　ｉａｔ　ｉｓ＋　Ｔ、ら［「 分子クローニング、実験室マニュアルｊ巾、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａ ｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　ＮＹ　 （P９ ８２）コが開示している。ＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドにはｐＣ１９４、ｐＣ２ ２１，ｐＴｌ　２７などが含まれる。このようなプラスミドを、Ｇｒｙｃｚａｎ 、Ｔ、　［ｒＢａｃｉｌｌｉの分子生物学」中、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　ＮＹ　（１９８２）、　ｐｐ、３０７−３２９］が開示している。適当なＳ Ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには、ｐ　Ｉ　Ｊ　Ｉ　Ｏ１［Ｋｅｎｄａｌ ｌ、　Ｋ、　Ｊ、ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：　４１７７−４１８３ 　（１９ｇ？）］、およびφＣ３１などのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオ ファージ［Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆら、　ｒＡｃＬｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ 生物学の第６回国際シンポジウムＪ中、＾ｋａｄｅ＋＊１ａｉＫａｉｄｏ、　Ｂ ｕｄａｐｅｓｔ、　ｌｌｕｎｇａｒｙ　（１９８６）、　ｐｐ、４５−５４］が 含まれる。Ｐ＠ｅｕｄｏ＊ｏｎａｓプラスミドは、Ｊｏｈｎ、　Ｊ、　Ｆら［Ｒ ｅｖ、　Ｉｎｒｅｃｔ、Ｄｉｓ、　Ｐ、：　６９３−７０４　（１９８６）］、 およびＩｚａｋｉ、　j、　［！ ｐｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．３３：　７２９−７４２　（１９７ｇ）］が概 説している。

構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現用に調製したなら、このＤＮＡ構 築物を適当な宿主中に導入することができる。種々の方法、例えばプロトプラス ト融合法、リン酸カルシウム沈澱法、電気穿孔法、または他の通常の方法を用い ることができる。融合の後、細胞を培地で増殖させ、適当な活性についてスクリ ーニングする。配列が発現すると、本発明の融合タンパク質が産生ずる結果にな る。

Ｄ、ヌクレアーゼ−リガンド融合タンパク質の単離本発明の融合タンパク質分子 は、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動な どの常法に従って、上記の組換え分子から単離および精製することができる。融 合タンパク質のリガンド成分に指向した親和性クロマトグラフィーを用いて本発 明の融合タンパク質を精製するのが好ましい。固１ｉｌｃｈｅｋら［Ａｎａｌｙ ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７１：　１−３２　（１９８ｇ）］ を参照のこと。さらに、市販品から入手可能な多数の担体−ストレブトアピジン マトリノクスが既知である。

本発明によれば、ヌクレアーゼ融合タンパク質の存在を検出するための検定を通 常の生化学的な精製法の間に用いて、これら酵素の存在を測定することができる 。

本発明のヌクレアーゼ融合タンパク質は、そのヌクレアーゼ基質の切断に基づい て同定することができる。基質として、例えばアデノウィルス−２（Ａｄ−２） ＤＮＡを用いることができる。融合タンパク質にｌｉ？ＫＬ、た後、この基’１ ｉ（Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡ）を、消化産物の分離に一般的な緩ｌｉ系のアガロ ースゲルにおいて電気泳動により分離する。臭化エチジウムの存在下に紫外光の もとて基質を可視化する。

表１（Ｊ−記）は、本発明において使用するための可能性あるリガンド：受容体 または受容体・リガンドの組合せを例示するものである。本発明によれば、受容 体は特定リガンドに対して結合親和性を持ちうる任意の巨大分子またはその部分 を包含していてよい。特定リガンドを認識する受容体は天然に存在しているか、 または調製することができる。本発明に従う受容体には、タンパク質および非タ ンパク質の両分子が包含されていてよい。例示の受容体には、ビオチン、アビジ ン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、ラクチン、糖フンシュゲート、酵素、基 質、補助因子、阻害物質、カチオン、アニオン、疎水性部位、疎水性基、ホルモ ベエフェクター、毒素、輸送タンパク質、ビタミン、アミノ酸、糖、膜、および リポソームが含まれるが、これらに限定はされない。

受容体はその対応するリガンドに親手口性を有する触媒的に活性な非タンパク質 分子であるのが好ましい。本発明で用いる受容体は、消化または加水分解しよう とする核酸に直接または間接的に結合させてよい。間接的な結合は受容体を第２ の分子に非共有結合または共有結合のどちらかにより結合させることによって行 なう（この第２の分子は、切断または加水分解すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子内 の特定の認識配列を認識し、それに結合するように設計する）。別法によれば、 この受容体を、本発明の融合タンパク質と反応させようとするＤＮＡまたはＲＮ Ａ分子に直接結合させてもよい（共有結合または非共有結合による）。

Ｂ、結合 １、直接結合 切断または加水分解すべきＲＮＡまたはＤＮＡ分子への受容体の直接結合は、周 知の化学的または酵素的手段によって行なってよい。どの受容体を基質に結合さ せるべきかに依存して、当業者には周知である異なる方法を用いる。例えば、本 発明に従う受容体としてのビオチンは、多数の化学的および酵素的方法によって 基質に結合させることができる。ビオチン−核酸の相互作用の概説については、 Ｗｉｌｃｈｅｋら［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＠１ｓｔｒｙ　１７１ ：　１−３１　（１９８Ｂ）］を参照（この文献は本明細書の一部をｔ！成する ）。

ヌクレオチド含有受容体分子（その多くは市販品から入手可能である）を用い、 通常の二ノクトランスレーンヨン法により、受容体を２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ 中に直接導入することができる。この場合、２本鎖配列中のヌクレオチドを、ヌ クレオチド含有受容体分子で置換することができる。ビオチンは、ニックトラン スレーション法との関係でビオチン化ヌクレオチド三リン酸を使用することによ り成長中のＤＮＡ鎖中に導入されている［Ｌａｎｇｅｒら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾７８６６３３−６６３７　（１９８１）］ 。さらに、ピオチン含有化合物は、ＤＮＡ中へのビオチン部分の直接導入に適し ていることがわかっている［Ｆｏｒｓｔｅｒら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ［ ｌＲｅ５．１３−７４５−７６１　（１９８５）　；および、Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ ら＋　Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｔ　１４Q゜ ：　５１９−５２６　（＋９８７）コ。

別法によれば、１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを合成するための鎖重合法が、新規な 鎖においてヌクレオチド含有受容体分子を導入するための手段を与える。反応混 合物において受容体ラベルしたヌクレオチドを変えることによって（即ち、八− 受容体、Ｃ−受容体、Ｔ−受容体またはＣ−受容体）、新規な鎖を受容体で選択 的にラベルすることができる。この方法により、新規に合成した鎖は、配列全体 中のＡ、ＧＳＣ，またはＴヌクレオチド位置においてのみ受容体を含有すること ができる。２またはそれ以上の受容体−ヌクレオチドの組合せの使用により、配 列中の多数のヌクレオチド部位において受容体含有ヌクレオチドを導入すること が可能になる。

異なるヌクレオチド含有受容体を用いる４つの反応を設定することによって、本 発明はＤＮＡまたはＲＮＡ分子を配列決定する方法を与える。本発明に従ってＤ ＮＡまたはＲＮＡを配列決定するためには、ＡＳＧ、Ｃ，またはＴｙ、クレオチ ド部位に受容体を導入した４つの反応試験管のそれぞれをリガンド−ヌクレアー ゼと別々にインキュベートする。時間、温度および融合タンパク質濃度などの反 応条件を変えることによって、消化された分子のランダムな集団をそれぞれの反 −応試験管中に得ることができる。次いで、４種すべての反応の切断生成物を、 通常の配列決定法に従いゲル電気泳動によって分析する。・生成物を可視化する ために、この新規なりＮＡまたはＲＮＡ鎖をヌクレアーゼ消化の前または後にラ ベルする。本発明に従って使用するラベルには、酵素ラベル、放射性同位体ラベ ル、非放射活性同位体ラベル、蛍光ラベル、および化学発光ラベルが含まれるが 、これらに限定はされない。

２　間接結合 核酸基質への受容体の直接結合に加えて、切断すべきＤＮＡまたはＲＮＡ配列に 受容体分子を間接結合させることができる。この方法が最も好ましい。この態様 においては、受容体を巨大分子に結合させる（共有結合または非共有結合による ）。タンパク質および非タンパク質分子を結合させるための周知の化学的および 酵素的方法を用いることができる。次いで、この巨大分子−受容体コンプレック スが、基質の認識およびそれへの結合によって、基質への受容体の結合を媒介す る。このようにして、受容体を核酸基質に間接結合させる。従って、本発明に従 う受容体は、本発明の融合タンパク質と結合するであろう基質−巨大分子−受容 体のコンプレックスを形成していることがある。

基質に受容体を間接結合させる際に用いる巨大分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡに親 和性を有する（工意のタンパク質または非タンパク質分子であってよい。巨大分 子が基質内の特異的配列に親和性を有しているのが好ましいが、非特異的ＤＮＡ またはＲＮΔバインダーを用いて基質をランダムに消化するこ七もできる。ビオ チンに結合した抗体または酵素ラベルした抗体などの受容体−巨大分子の調製は 、１１ａｒｌｏｗら［［抗体、実験室マニュアル」中、　Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ 　）ｌａｒｂｏｒ、　ＩＩＹ　（１９８８）］が記載している。

最も好ましくは、部位特異的な巨大分子は、ハイブリダイゼーシヨンによって基 質に結合するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドプローブである。即ち、本発明に 従って、１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ巨大分子を含有する受容体を、当業者には 周知の通常のハイブリダイゼーシ揮ン法により、１本鎖基質にハイブリダイズさ せる。ビオチン残基を結合させた合成オリゴヌクレオチドの作成は、　Ｃｈｕら ［Ｄ！Ａ　４：　３２７−３３１　（１９８５）］が開示している。ヌクレオチ ド配列のビオチン化およびハイブリダイゼー７−１ンにおけるこれらの使用を議 論する多くの研究が、ｆｉｌｃｈｅｋらＣＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ ＋ａｉｓｔｒｙ　１７１：　１−３２　（１９１１８）］により概説されている 。

■・里４ 本発明の配列特異的な切断または加水分解物質は、遺伝子クローニング、核酸の 構造研究、および染色体マツピングにその用途を有している。本発明のエンドヌ クレアーゼ融合タンパク質を用いて、任意のヌクレオチド配列ＲＮＡまたはＤＮ Ａ内の予め決めた部位を選択的に切断することができる。このことは、利用可能 な１１型制限エンドヌクレアーゼが任意の予め決めた配列を切断するように加工 調製することができないことを考慮するときに特に重要である。既知の制限エン ドヌクレアーゼは、特異的な認識配列を認識し、その内部またはその近くを切断 することができるにすぎない。従って、これらの制限が研究努力を挫折させる末 端から任意の予め規定した数のヌクレオチドを除去することができる。既知のエ キソヌクレアーゼによる制御された消化が可能であるが、これは長さの変化した 分子集団を得るための一般的方法においてのみである（即ち、酵素濃度、時間、 温度および／または酵素条件を変化させることによって加水分解を制御する〉。

このように本発明前には、ＤＮＡまたはＲＮＡの加水分解中に除去されるヌクレ オチド数を具体的に制御することはできなかった。しかし、本発明によれば、１ 本鎖または２本鎖核酸分子の制御された消化が規定された方法で実施され、核酸 分子の特定末端が予め決めた長さまで短棒される。

末端からの一定数のヌクレオチドの規定された除去は、所望ではない配列が存在 しているときに必要である（即ち、致死性または非機能性プロモーター配列）。

５゛末端の制御された加水分解は、ＡＴＧ開始フドンの上流の配列の除去を容易 にし、従って特定遺伝子の天然制御要素の置換を可能にする。

また、本発明はＤＮＡまたはＲＮＡ分子を配列決定する方法を提供する。本発明 のこの特徴の有用性は自明である。

さらに、遺伝子研究のためのハイブリッド酵素の有用性に加えて、本発明は患者 の疾虫を診断するための物質を提供する。例えば、ウィルス感染によって引き起 こされる多（の疾患により宿主中に遺伝物質が導入される結果になる。本発明に よれば、これら独特の異種配列を認識し、それを切断するように融合タンパク質 を加工することができ、従って未感染宿主においては消化は起こらないであろう 。従って、この部位特異的な融合タンパク質との反応後に、宿主からのＤＮＡ試 料のゲル電気泳動を分析することにより、ウィルス感染を決定することができる 。多くのウィルス（パピローマウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス 、単純庖疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＨＴＬＶ−１ ゜トウモロフンモザイクウィルス、タバコモザイクウィルス、およびバクテリオ ファージを含むが、これらに限定はされない）を、原核宿主ならびに真核宿主に おいて検出することができる。

ここまで本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照することによって本 発明はさらに容易に理解されるであろう。これら実施例は例示のために挙げたも のであって、特に記すことがなければ本発明の限定を意図するものではない。

実施例１　ブドウ球菌ヌクレアーゼおよびストレプトアビジンのキメラタンパク 質の作成 ストレプトアビジン−またはアビジン−ピオチンコンプレックスは、異常に高い 親和性（ｋ、ｌ＝ＩＱ−１５Ｍ）に、従って２つの化合物間の非共有相互作用の 高い安定性に主に起因して、多種多様の生物分析への応用において極めて多用途 の一般的な仲介物質として非常に有用である［Ａｕ５ｕｂｅ１．　Ｐ、　ｌ！、 ら、「分子生物学の最近のプロトコールＪ　＋　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　１ｉｌｅｙ−１ｎＬｅｒｓｃｉｅｎｃ ｅ＋　mｅｗ Ｙｏｒｋ　（１９Ｂ？）］。多くのピオチン含有誘導体がピオチン部分をヌクレ オチド配列中に直接導入するのに適していることがわかっており、それらの一部 は市販品から入手可能である。さらに、通常のニックトランスレーシラン法また は鎖車合法によってＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に導入することができるビオチン 化したオリゴヌクレオチドが利用可能である。ＤＮＡまたはＲＮＡＭ質（即ち、 プラスミド、染色体など）がピオチン受容体でラベルされたときには、受容体配 置の部位は特異的な標的として働き、次いでこれが認識され、さらにストレプト アビジンまたはアビジンを含有する融合タンパク質と相互作用することができる 。

図１は、ブドウ球菌ヌクレアーゼとストレプトアビジンのキメラタンパク質をコ ードしているハイブリッド遺伝子の構築を示すものである。ｐＦＯＧ３０１はブ ドウ球菌ヌクレアーゼをフードしているＮＵＣ遺伝子を含有しており［５ｈｏｒ ｔｌｅ。

Ｄ、、釦式η　１８１−１８９　（１９８３）］、ｐＴＳＡ−１はストレプトア ビジンをフードしている遺伝子を含有している［５ａｎｏら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　８７：　１４２−１４６　（１９９０）およびＡｒ ｇａｒａｎａら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４：　 １８７１−１８８２　（１９８６）］。

ＮＵＣＪｌ伝子の増幅ならびに増幅したＮＵＣ遺伝子の５°末端へのＮｄｅｌ制 限部位の導入および３°末端へのＸｂａ１部位の導入は、ｐＦＯＧ３０１プラス ミドを増幅するＰＣＲを行なうためのプライマーとして、次のオリゴヌクレオチ ド：５’　−ＴＴＡＧ＾訂ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧ＾＾ＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡ ＧＴ−３’　（配列番号ｌ）および ５°−ＴＴＡＣ＾＾ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧ＾＾ＴＣＡＧＣＧＴＴ −３°　（配列番号２）を用いて行なう。ＰＣＲは製造元の方法（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ）に従って行なう。９５℃（１分）、４５°Ｃ（１分）、７５℃（ ２分）を約３０サイクル行なう。ＰＣＲ反応混合物１００μｍのうちの５μｍを 分析してＰＣＲ反応の成功を測定する。残りの反応混合物は１％アガロースゲル にかけ、ＰＣＲ産物を製造元の方法に従って（ｉｅｎｅｃｌｅａｎ［ＢＩｏ　１ ０１　Ｉｎｃ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ＾］で精製する。

ストレプトアビジンをフードしている遺伝子の増幅ならびに増幅した遺伝子の５ ′末端へのＸｂａ１部位の導入および３゛末端へのＢａ■８１部位の導入は、ｐ ＴＳＡ−１由来のストレプトアビジン遺伝子を増幅するＰＣＲを行なうためのプ ライマーとして、次のオリゴヌクレオチド・５°−ＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧ ＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣ−３’　（配列番号３）を用いて行なう 。ＰＣＲは製造元の方法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ閘ｓｒ）に従って行なう。ＰＣＲ 産物を上記のようにＧｅｎｅｃｌｅａｎで精製する。

次いで、増幅したＮＵＣ遺伝子をＸｂａｌおよびＮｄｅｌにより３７℃で２時間 、増幅したストレプトアビジン遺伝子をＸｂａｌおよびＢａｇｉＨｌにより３７ ℃で２時間、およびｐＥＴ３ａプラスミドをＮｄｅｌおよびＢａ５ＨＩにより３ ７℃で２時間、別々に消化することによってＮＵＣｉｌｌｉ子とストレプトアビ ジン遺伝子のＰＣＲ生成物をｐＥＴ３ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にク ローン化する。これら反応のすべてを、フェノール／Ｃ１１Ｃ１，抽出、続いて ＥＬＯＨ沈澱および７０％ＥｔＯＨ洗浄によって停止させる。次いで、消化した ＮｔＪＣおよびストレプトアビジンＤＮＡを凍結乾燥する。ｃｈ化したｐＥＴ３ ａＤＮＡを凍結乾燥し、次いで常法Ｄｌａｎｉａｔ１ｓら、１分子クローニング 、実験室マニュアルｊ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　 （１９１１９）Ｅに従って脱ホスホリル化し、清浄化する。次いで、消化したＮ ｔＪＣ遺伝子わよびストレプトアビジン遺伝子を、常法［Ｍａｎｉａｔｉｓ　； 上記コにより、消化して脱ホスホリル化したｐＥＴ３ａ発現ベクターに連結する 。連結反応混合物の一部を用いて、常法によりＨＭＳｔ７４セルライン［Ｆ−１ ｈｓｄＲ，ｒｅｅＡ、　Ｒｔｆ”　；　Ｃａ５ｐｂｅ１１ら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：　２２７６−２２８０　（１９７８）］ を形質転換する。いくつかのクローンを取り、アンピシリンを含むＬＢ培地で一 晩増殖させる。プラスミドＤＮＡをそれぞれの培養物から得、Ｎｄｅｌ／Ｂａａ ＨＩ制限消化によって分析する。正しい挿入サイズを何するプラスミドを選択し 、このＤＮＡを融合遺伝子の発現に用いる。このプラスミドＤＮＡをｐＥＴＮＡ Ｓ−１ｏｏと命名する（図１）。

実施例２　ブドウ球菌ヌクレアーゼおよびストレプトアビジンを含有するキメラ タンパク質の発現および精製 キメラタンパク質の構造遺伝子（図１）を大腸菌中で発現させる。常法［Ｍａｎ ｉａｔｉＳ、上記］に従い、ｐＥＮＳ−１００を用いてＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ −１０＠ｐＴ、ｈｓｄＳ。

ｇａｌ　；　５ｔｕｄｉｅｒら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８９：　１１３− １３０　（１９８６）およびＧｒｏｄｇｅｒｇら、　Ｊ、Ｂ≠モkｅ ｒｉｏｌ、１７０：　１２４５−１２５３　（１９８８）］を形質転換する。Ｂ Ｌ２１はＮｏｖａｇｅｎから入手可能である。ｐＥＴＮＳ−１００プラスミドを 保持するＢＬ２１（ＤＥ３）を、０．４％グルコースおよび５０μｌ／ｍｌのア ンピシリンを追加したＬＢ培地中、振盪しながら３７°Ｃで増殖させる。Ａｃ０ ０が１．０に達したときに、１００ｍＭＩＰＴＧを０．４＋ｎＭの最終濃度まで 加え、ＩａｃＵ　Ｖ　５プロモーターの支配下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子 を誘導する。誘導の後、さらに２時間、振盪しなから３７°Ｃて細胞をインキュ ベートするＥＳａｎｏら、　ｌ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　８７ ：　１４２−１４６　（１９９１１１）］。

融合タンパク貫を精製するためのすべての操作は４°Ｃで行なう。上記の誘導し た培養物（１００ｍｌ）を１６００ｘｇで１０分間遠心することによって収穫す る。

この細胞ペレットを１００＋ｎＭ　ＮａＣ１、ｂｓＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ）リ ス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）（ＸＯＯ＋ｍＤで洗浄し、上記のように遠心する。こ の細胞を、卵白リソチーム（ＩＩＩＩｇ）および０，１％τｒｉＬｏｎ　Ｘ−１ （１０を含む２＋Ｍ　ＥＤＴＡ、３０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）（１０ Ｂ？）に懸濁する。Ｍｇ５Ｏ，（１，０Ｍ）、ＤＮアーゼｌ　（１ｓｇ／ｍｌ） およびＲＮアーゼＡ（１ｍｇ／ａｔ）をそれぞれ１２ｍＭ、１０ｕｇ／’ｍｌお よび１０μｇ／諷ｌの最終濃度まで加え、この混合物を室温で１５分間放置する 。この細胞溶解物を３９．ＯＯＯｘｇにて室温で１５分間遠心し、沈澱物をもう 一部２鶴ＭＥＤＴＡ、３０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、０，１％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００（ｌ　Ｏｍｌ）で洗浄し、次いて上記のように遠心する。こ の沈澱物を穏やかに撹拌しながら６Ｍグアニジノ塩酸（ｐＨ１，５Ｘ５＋ｅｌ） に溶解し、０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ，（ｐＨ８，７）に対して透析してグアニジン ＨＣＩを除去する。この透析物を３９．０００ｘｇで１５胚ｋｌ−、Ａ岨ｃ−ｉ −，β７．＋　１４２−１４６　（＋９９０）］。

このキメラタンパク質を、上記のようにビオチン−親和性カラムによってさらに 精製する［Ｗｉｌｃｈｅｋ、　１１ら、　Ａｎｓｌ、Ｂｉｏｅｈｃ４１’υ：　 １−３２　（１９８８）］。

大施舅１　挿的ＤＮへの部位特異的な切断反応図２に示したようなボリスク１７ オチド基質（ａ）および（ｂ）を、環状の１本鎖Ｍｌ：３＋ｐ７　ＤＮＡから調 製する。１本ｍＭＩ３ｍｐ７　ＤＮＡは、Ｉｉｅｔｇｉｎ一方法［計挿ａｄｓ　 ｏｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：　２０　（１９８３）］に従い、ＲＦ　 ＭＬ３ｓｐ７　ＤＮＡ（八ｍｅｒｓｈａｍ）で大腸閑ＴＧＩ細胞を杉質転換する ことによって調製する。基’１（ａ）（図２）を調製するために、得られた閉環 １本ｖＡｌ）ＮＡをＢａｍＨｌで直線化する［Ｂｅｅｎ　＆　Ｃｈａｍｐｏｕｓ 、　１ｉｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ　ｌｏｔ：　９０　（１ ９８３）］。緩衝液［０，２Ｍ　ＮａＣｌ、ｌＯｍＭ）リス−）−ＩＣＩ（ｐＨ ７，４）、ＬｓＭ　ＥＤＴＡ］（８０μｌ）中の環状ＤＮＡ（約３０μｇ）を、 ９５°Ｃで２分間、次いで６５°Ｃで５分間加熱した。室温まで冷却した後、こ の混合物に０．２Ｍ　ＭｇＣ１＊（３μｌ）およびＢａ耐（１（６μｌ；７２単 位）を加え、次いて３７℃で一部インキユベートする。このＤＮＡを０．８％ア ガロースゲルで精製し、ウシ腸ホスファターゼ（Ｂ　ＲＬ）により脱ホスホリル 化する［Ｍａｎｉａｔｉｓら、＋９８２］。次いで、ＢＩＩＩＩＨＩで直線化し たＤＮＡの５゛末端をｓｔＰでラベルし、３゛末端を改良法［Ｃｈａｌｌｂｅｒ ｇ　＆　Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６ ５：　３９　（１９８O） ：　Ｂｅｅｎ　＆　Ｃｈａｍｐｏｕｓ　（１９８３）］でラベルする。簡単に説 明すると、２０＋＊Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、７識Ｍ　ＭｇＣｌ、、５ ０＋ａＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．０５ｍＭｄＧＴＰ、０．２５μＭ 　（、α−”Ｐ］ｄＡＴＰ（＾＋＋ｅｒｇｈａｗ、　８００Ｃｉ／＋５ｏｌ）、 およびＤＮＡポリメラーゼ１のクレノーフラグメント（１０単位）を含む緩衝液 （５０μｌ）中のＢ　ａｍＨｌ　消化ＤＮＡ（約４μｇ）を、ｌＩ″Ｃで３０分 間インキュベートする。

このＤＮＡを２回エタノール沈澱させて未導入のｄＡＴＰを除去する。

第２の基’Ｊｌｆ（ｂ）（図２）は、環状１本鎖ＤＮＡのヌクレオチド４６０〜 ４８９に、次のオリゴヌクレオチド・ ５°−ＣＣＣＣＴＣ＾＾＾ＴＧＣＴＴＴＡ＾＾ＣＡＧＴＴＣＡＧＡ＾＾＾−３′ （配列番号５）をアニーリングさせることによって調製する。次いで、２本鎖の 領域をＤｒａｌで切断する。４ｕＭの３Ｏ−ｎｕオリゴヌクレオチド、ｌＯａＭ 　ＭｇＣｌ、１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、および１０−Ｍ　Ｍｇ ＣＩｔを含む緩衝液（４５μｌ）中の環状ＤＮＡ（約２０μ艦）を７０℃に加熱 し、次いで３７℃までゆっくりと冷却し、次にＤｒａｌ（５１川；２００単位） を加える。この反応液を３７℃で一部インキユベートした。このＤＮＡを、上記 のように、０．８％アガロースゲルで精製し、ウシ腸ホスファターゼで脱ホスホ リル化し、その５′末端をラベルした・図２に示すような結合部位オリゴヌクレ オチド：５’　−ＣＣＣＧＣＡＣＪＡＧＣＣＧＣＴ４°（配列番号６）のビオチ ン化を、製造元の方法（Ｃ１ａｎ、　Ｔｅｃｈ）に従って調製する。このビオチ ン化したオリゴヌクレオチドを用いて、実施例２で調製したストレプトアビジン −ヌクレアーゼ融合タンパク質を、切断しようとするＤＮＡ基質（ａまたはｂ） に間接的に結合させる。

５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐ［４７，０）、５０ｍＭＮａＣ１および１ｍＭＥＤ ＴＡ中に約１２＊Ｍの”Ｐ−ラベル化基＠ＤＮＡ、１４ｎＭのビオチン化オリゴ ヌクレオチドおよび１４ｎＭのヌクレアーゼ−ストレプトアビジンキメラを含有 する反応混合物（合計容量１０μｌ）を調製することにより、融合タンパク質を 用いて基質（ａまたはｂ）を切断する。この混合物を６５℃で２分間加熱し、次 いで所望の温度に調節する。この反応を、’ｔ　ＯＯ＠Ｍ　ＣａＣ１−（ｌμｌ ）の添加によって開始させ、指定の反応時間の後に１０−Ｍエチレングリコール ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−四酢酸（ＥＧＴΔ）を含 むホルムアミド−色素混合物（１０μｌ）を添加することによって停止させた。

この停止させた反応混合物を３分間９０℃に加熱し、次いで氷上で冷却する。得 られたＤＮＡフラグメントを、７Ｍアレア（ｌ・２０架橋）を含む５％ポリアク リルアミドゲルまたは１％アガロースゲルで電気泳動し、次いでにｏｄａｋ　Ｘ ＡＲ５Ｘ−線フィルムを用いて一８０℃でオートラジオグラフィーを行なうこと により分析する。

組換えＤＮＡ技術、酵素学および／または関連分野の習熟者に明らかな本発明実 施のための上記態様の修飾は、後記の請求の範囲内に含まれるものとする。

本明細書中に挙げたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係して（する 分野の習熟者の技術レベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は 、その全体が本明細書の一部を構成する。

明確な理解を目的として例示および実施例を挙げて本発明をやや詳しく説明した が、ある種の変化および修飾を本明細書に添付した請求の範囲内で実施しうろこ とは明らかであろう。

（以下、余白） にＶ）連絡先： （Ａ）　出願番号：Ｕｓ （Ｂ）　出願日・本　日 （Ｃ）　分類：未　定 （ｖｉ）　弁理士／代理人情報： （２）　配列番号１の情報 （ｉ）　配列の特徴コ （Ａ）　長さ：３３塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）　配列：配列番号ｌ； ＴＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴ＾ＴＧＡＣＡＧＡ　ＡＴＡＣＴＴＡＴＴＡ　ＡＧＴ　 ３３（２）　配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ、３３塩基対 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数−一本鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列　配列番号２・ ＴＴＡＣＡＡＴＧＡＴ　ＣＴ＾ＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧ＾＾ＴＣＡＧＣＧＴＴ　３ ３（２）　配列番号３の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：３１塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号３： ＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡ　ＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡ　ＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣ３１（ ２）　配列番号４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３２塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列、配列番号４： ＣＧＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＧＣＧＧ　３２（ ２）　配列番号５の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝３０塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号５ ＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴ　ＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡ　ＧＴＴＣＡＧＡＡＡＡ　３０（ ２）　配列番号６の情報 （ｉ）　配列の特徴：　゛ （Ａ）　長さ：１５塩基対 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号６： ＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧ　ＣＣＧＣＴ　１５（２）　配列番号７の情報 （ｉ）　配列の特徴； （Ａ）　長さ：２２塩基対 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列　配列番号７： ＾ＴＣＧＴＣＧＴＣＴ　ＧＧＴＡ＾＾ＣＧＡＧ　ＧＧ　２２ＮＵＣ遺伝子　スト レプトアビジン遺伝子フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　 Ｚ　７８２３−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　９／１６ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．リガンドとエンドヌクレアーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質か らなる、任意のヌクレオチド配列を選択的に切断しうる部位特異的なエンドヌク レアーゼ。
2. ２．切断しようとするヌクレオチド配列がＲＮＡである請求項１に記載の部位特 異的なエンドヌクレアーゼ。
3. ３．切断しようとするヌクレオチド配列がＤＮＡである請求項１に記載の部位特 異的なエンドヌクレアーゼ。
4. ４．ヌクレアーゼがアビジンヌクレアーゼまたはその触媒的に活性なフラグメン トである請求項１に記載の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。
5. ５．リガンドがストレプトアビジンまたはその触媒的に活性なフラグメントであ る請求項１に記載の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。
6. ６．ヌクレアーゼがブドウ球菌ヌクレアーゼまたはその触媒的に活性なフラグメ ントである請求項１に記載の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。
7. ７．融合タンパク質がブドウ球菌ヌクレアーゼーストレプトアビジンコンジュゲ ートである請求項１に記載の部位特異的なエンドヌクレアーゼ。
8. ８．リガンドとエキソヌクレアーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質か らなる、任意のヌクレオチド配列を選択的に加水分解しうる部位特異的なエキソ ヌクレアーゼ。
9. ９．切断しようとするヌクレオチド配列がＲＮＡである請求項４に記載の部位特 異的なエキソヌクレアーゼ。
10. １０．切断しようとするヌクレオチド配列がＤＮＡである請求項４に記載の部位 特異的なエキソヌクレアーゼ。
11. １１．任意のヌクレオチド配列を予め決めた部位で選択的に切断するための方法 であって、 （ａ）切断しようとするヌクレオチド配列に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体 含有ヌクレオチド配列を、リガンドとエンドヌクレアーゼの間のハイブリッドで ある融合タンパク質と接触させ；そして（ｃ）工程（ｂ）の成分を、該受容体含 有ヌクレオチド配列の認識配列の内部またはその近くを切断するに十分な時間イ ンキュベートする；ことからなる方法。
12. １２．融合タンパク質がブドウ球菌ヌクレアーゼーストレプトアビジンコンジュ ゲートである請求項１１に記載の方法。
13. １３．受容体がビオチンである請求項１２に記載の方法。
14. １４．任意のヌクレオチド配列を予め決めた部位で選択的に切断するための方法 であって、 （ａ）該ヌクレオチド配列に結合しうる巨大分子に受容体を結合させ；（ｂ）該 受容体含有巨大分子を、該ヌクレオチド配列と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）の成 分を、リガンドとエンドヌクレアーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質 と接触させ：そして （ｄ）工程（ｃ）の成分を、該配列の認識配列の内部またはその近くを切断する に十分な時間インキュベートする； ことからなる方法。
15. １５．巨大分子が、切断しようとするヌクレオチド配列の部分に相補性のオリゴ ヌクレオチドである請求項１４に記載の方法。
16. １６．受容体がビオチンである請求項１５に記載の方法。
17. １７．融合タンパク質がブドウ球菌ヌクレアーゼーストレプトアビジンコンジュ ゲートである請求項１６に記載の方法。
18. １８．任意のヌクレオチド配列を予め決めた部位で選択的に切断するための方法 であって、 （ａ）切断しようとするヌクレオチド配列に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体 含有ヌクレオチド配列を、該受容体に結合しうる抗受容体と接触させ； （ｃ）該受容体−抗受容体含有ヌクレオチド配列を、リガンドとエンドヌクレア ーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質と接触させ：そして（ｄ）工程（ ｃ）の成分を、該受容体−抗受容体含有ヌクレオチド配列の認識配列の内部また はその近くを切断するに十分な時間インキュベートする；ことからなる方法。
19. １９．任意のヌクレオチド配列の末端から規定数のヌクレオチドを除去すること により該配列を加水分解するための方法であって、（８）加水分解しようとする ヌクレオチド配列に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有ヌクレオチド配列を 、リガンドとエキソヌクレアーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質と接 触させ：そして（ｃ）工程（ｂ）の成分を、該受容体含有ヌクレオチド配列を加 水分解するに十分な時間インキュベートする； ことからなる方法。
20. ２０．任意のヌクレオチド配列の末端から規定数のヌクレオチドを除去すること により該配列を加水分解するための方法であって、（ａ）該ヌクレオチド配列に 結合しうる巨大分子に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有巨大分子を、該ヌ クレオチド配列と接触させ：（ｃ）工程（ｂ）の成分を、リガンドとエキソヌク レアーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質と接触させ；そして （ｄ）工程（ｃ）の成分を、該配列を加水分解するに十分な時間インキュベート する；ことからなる方法。
21. ２１．任意のヌクレオチド配列の末端から規定数のヌクレオチドを除去すること により該配列を加水分解するための方法であって、（ａ）加水分解しようとする ヌクレオチド配列に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有ヌクレオチド配列を 、該受容体に結合しうる抗受容体と接触させ； （ｃ）該受容体−抗受容体含有ヌクレオチド配列を、リガンドとエキソヌクレア ーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質と接触させ；そして（ｄ）工程（ ｃ）の成分を、該受容体−抗受容体含有ヌクレオチド配列を加水分解するに十分 な時間インキュベートする； ことからなる方法。
22. ２２．ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを製造する方法であって、（ａ）切断し ようとするＤＮＡまたはＲＮＡ分子に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有Ｄ ＮＡまたはＲＮＡを、リガンドとエンドヌクレアーゼの間のハイブリッドである 融合タンパク質と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）の成分を、該受容体含有ＤＮＡま たはＲＮＡを切断するに十分な時間インキュベートし；そして （ｄ）切断されたＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを工程（ｃ）から得る；こと からなる方法。
23. ２３．ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを製造する方法であって、（ａ）該ヌク レオチド配列に結合しうる巨大分子に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有巨 大分子を、切断しようとするＤＮＡまたはＲＮＡ分子と接触させ； （ｃ）工程（ｂ）の成分を、リガンドとエンドヌクレアーゼの間のハイブリッド である融合タンパク質と接触させ； （ｄ）工程（ｃ）の成分を、該ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を切断するに十分な時間 インキュベートし；そして （ｅ）切断されたＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを工程（ｄ）から得る；こと からなる方法。
24. ２４．巨大分子が、切断しようとするヌクレオチド配列の部分に相補性のオリゴ ヌクレオチドである請求項２３に記載の方法。
25. ２５．受容体がビオチンである請求項２４に記載の方法。
26. ２６．融合タンパク質がブドウ球菌ヌクレアーゼーストレプトアビジンコンジュ ゲートである請求項２５に記載の方法。
27. ２７．ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを製造する方法であって、（ａ）切断し ようとするＤＮＡまたはＲＮＡ分子に受容体を結合させ；（ｂ）該受容体含有Ｄ ＮＡまたはＲＮＡを、該受容体に結合しうる抗受容体と接触させ； （ｃ）該受容体−抗受容体含有ＤＮＡまたはＲＮＡを、リガンドとエンドヌクレ アーゼの間のハイブリッドである融合タンパク質と接触させ；（ｄ）工程（ｃ） の成分を、該受容体−抗受容体含有ＤＮＡまたはＲＮＡを切断するに十分な時間 インキュベートし；そして（ｅ）切断されたＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを 工程（ｄ）から得る；ことからなる方法。
28. ２８．ＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する方法であって、（ａ）ＤＮＡまたはＲ ＮＡ配列全体にわたって特定種類のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＴに受容体を 結合させ； （ｂ）該受容体含有ヌクレオチド配列を、リガンドとエンドヌクレアーゼの間の ハイブリッドである融合タンパク質と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）の成分を、切 断産物のランダム集団を得るに十分な時間インキュベートし；そして （ｄ）該切断産物をゲル電気泳動によって分離することにより、ヌクレオチドの それぞれの種類について切断産物を比較する；ことからなる方法。
29. ２９．受容体がビオチンである請求項２８に記載の方法。
30. ３０．融合タンパク質がブドウ球菌ヌクレアーゼーストレプトアビジンコンジュ ゲートである請求項２９に記載の方法。