JPH06511144A - 腫瘍拒絶抗原前駆体、腫瘍拒絶抗原及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍拒絶抗原前駆体、腫瘍拒絶抗原及びそれらの使用本出願は、１９９１年１２ 月１２日に出願した米国特許出願第８０７．０４３号の一部継続出願であり、該 出願は１９９１年９月２３日に出願した米国特許出願第７６４．３６４号の一部 継続出願であり、該出願は１９９１年７月９日に出願した米国特許出願第７２８ ．８３８号の一部継続出願であり、該出願は１９９１年５月２３日に出願し、米 国特許出願第７０５、７０２号の一部継続出願であって、これらは現在放棄され ている。 発明の分野 本発明は、腫瘍学の研究に応用される免疫遺伝学の分野に一般的に関するもので ある。より具体的には、いわゆる腫瘍拒絶抗原の提示及びここに「腫瘍拒絶抗原 ｍＩ駆体」と呼ばれるものの発現を介する生体免疫系により腫瘍が認識されるメ カニズムの研究及び分析に関する。 背景及び従来技術 宿主生体による癌細胞の認識又は認識不足の研究は、多くの異なった方針におい て進められた。本分野を理解することは、基礎免疫学及び腫瘍学の両方をかなり 理解することであると思われる。 マウスの腫瘍に関する初期の研究により、マウスの腫瘍が同系の動物に移植され た時に腫瘍細胞を拒絶する分子としての特性を示すことが明らかになった。これ らの分子は、宿主動物においてＴ−細胞により「認識」され、移植された細胞の 溶解を伸う細り包障害性Ｔ−細胞応答を引き起こす。この証拠は、まず、メチル コラントレンのような化学癌原性物質によりインビトロにおいて誘発された腫瘍 に得られた。腫瘍により発現され、Ｔ−細胞応答を引き出した抗原は、各腫瘍に ついて異なっていることが見出された。化学癌原性物質により腫瘍を引き起こす ことの一般的教訓及び細胞表面抗原における差異について、プレーン（Ｐｒｅｈ ｎ）ら著、Ｊ。 Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃ、　１ｎｓＬ　１８ニア６９〜７７８（＋９５７）：クラ イン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２０：１５６１〜１５７２ （１９６０）　ニゲロス（Ｇｒｏｓｓ）著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３：３２ ６〜３３３（１９４３）　、バソンブリオ（Ｂａｓｏｍｂｒｉｏ）著、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、３０：２４５８〜２４６２（１９７０）を参照されたい。抗原の このクラスは、　「腫瘍特異性移植抗原」又はｒＴｓＴＡＪとして知られるよう になった。化学癌原性物質により誘発された時のそのような抗原の提示の観察に 続いて、同様の結果は、腫瘍が紫外線照射によりインヒドロにおいて誘発された 時に得られた。クリプケ（Ｋｒｉｐｋｅ）著、Ｊ、Ｎａｅｌ、Ｃａｎｃ、　１ｎ ｓｔ、　５３：３３３〜１３３６（１９７４）を参照されたい。 Ｔ−細胞媒介免疫応答が上記の腫瘍のタイプに関して観察されたが、自然発生腫 瘍は、一般的に非免疫原性であると思われていた。従って、これらは、腫瘍を保 持する患者において、腫瘍に対する応答が誘発される抗原を示さないと思われて いた。ヘライツト（Ｈｅｗｉｔｔ）ら著、Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３ ３：２４１〜２５９（１９７６）を参照されたいう ｔｕｍ　抗原提示細胞系のファミリーは、マウス腫瘍細胞又は細胞系の突然変異 誘発により得られた免疫原性変異体であり、これらはポーン（Ｂｏｏｎ）ら著、 Ｊ、　Ｅｘｐ。 ＋１１ｅｄ、　＋５２：１１８４〜１１９３（１９８０）により記載された。そ の開示は、参照文献としてここに含まれるものとする。詳論すると、ｌｕｍ−抗 原は、同系マウスにおける免疫応答を生じずに、かつ腫瘍を形成するであろう腫 瘍細胞（即ち、ｒｔｕｍ　’　Ｊ細胞）の突然変異により得られる。これらｔｕ ｍ　’細胞が突然変異を起こした時、それらは同系マウスにより拒絶され、腫瘍 を形成することができない（従ってｒｔｕｍ　ｌ）。 ボーンら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４ 　：２７２（１９７７）を参照されたい。その開示は参照文献としてここに含ま れるものとする。いくっがの腫瘍型は、この現象を示すことが示された。例えば 、フロスト（Ｆｒｏｓｔ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３：　１２５’　 （＋９８３）を参照されたい。 ｔｕｍ　変異体は、免疫拒絶プロセスを導くので、進行性腫瘍を形成できないと 思われる。この仮説を支持する証拠としては、腫瘍のｒｔｕｍ　−Ｊ変異体、即 ち腫瘍を一般的に形成しないものが、亜致死照射（ｓｕｂｌｅｔｈａｌ　１ｒｒ ａｄｉａｔｉｏｎ）により抑制された免疫系によりマウスにおいて腫瘍を形成す る能力（ファンペル（Ｖａｎ　Ｐｅ１）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ：５２８２−５２８５（１９７９）　）　；及び腹腔内注射し た肥満細胞ｆｉＰ８＋５のｊｕｍ　細胞が１２〜１５日間で指数関数的に増加し 、その後、リンパ球及びマクロファー／の流入物の中にわずか２．３日で除去さ れることを観察すること（ウィテンホノブ（Ｕ）目ｅｎｈｏｖｅ）ら著、Ｊ、　 Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５２：１１７５−１１８３（１９８０））があげられる 、さらｌ；る証拠として、免疫抑制量の放射線を細胞の次の攻撃を伴って投すし た時でさえ、同しｔｕｍ　変異体に対する続いておこる攻撃を阻止することをマ ウスに可能にする免疫メモリーをマウスが獲得するといった観察があげられる（ ブーン（Ｂｏｏｎ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　７４；　２７２−２７５（１９７７）　；ファンy ル（Ｖａｎ　Ｐｅｔ）ら著、上記文献：ウィテンホッフ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ ）ら著、上記文献）。 後の研究により、自然発生腫瘍を突然変異させた時、応答を生しる免疫原性変異 体を生じた。確かに、これら変異体は、原腫瘍に対して免疫防御応答を誘発する ことができた。ファンベル（Ｖａｎ　Ｐｅ１）ら著、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１５７：１９９２−２００１　（１９８３）を参照されたい。従って、同系拒 絶応答の標的である腫瘍において、いわゆるｒｏＩ１ｍ拒絶抗原」の提示を誘発 することが可能なことが分かった。同様の結果は、異種遺伝子を自然発生腫瘍に トランスフェクトした時に得られる。これに関してフィルソン（Ｆｅａｒｓｏｎ ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：２９７５−１９８０（１９８８）を参照 されたい。 腫瘍細胞の表面に提示され、かつ細胞障害性Ｔ＝細胞により認識され、溶解を導 く抗原のクラスが確認された。抗原のこのクラスを、以下において「腫瘍拒絶抗 原Ｊ又はｒＴＲＡ　４と呼ぶ。ＴＲＡは、抗体応答を誘発しても誘発しなくても よい。 これらの抗原が研究された範囲は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞障害性Ｔ−細 胞の特性研究、即ち、特定の細胞障害性Ｔ−細胞（以下、ｒＣＴＬ　Ｊと呼ぶ） による抗原の同定の研究を経てきた。サブセットは、発現した腫瘍拒絶抗原の認 識に基づいて増殖し、抗原を発現する細胞は溶解する。特性研究により、抗原を 発現する細胞を特異的に溶解するＣＴＬクローンが同定された。この作業の例は 、レビー（Ｌｅｖｙ）ら著、Ａｄｖ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２４：ｌ−５９ （＋９７７）；ブーン（Ｂｏｏｎ）ら著、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　＋５２＋ １１８４|１１９３ （１９８０）：ブルーナー（口ｒｕｎｎｅｒ）ら著、Ｊ、　Ｉｎｗｎｕｎｏｌ、 　１２４：１６２７−１ｆ３３４（１９８０）；マリャンスキ（Ｍａｒｙａｎｓ ｋｉ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４：１６２７−１６３４ （１９８０）　；マリャンスキ（％１ａｒｙａｎｓｋｉ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、 　Ｉｎｖｎｕｎｏｌ、　！２：４０６−４１２（＋９８２）　；パランーバＰａ ｌ　Ｉａｄ奄獅潤j ら著、Ｃａｎｃ、　Ｒｅｓ、　４７　：５０７４−５０７９（１９８７）に見出 される。このタイプの分析には、非主要組織適合抗原、雄性特異性１１−Ｙ抗原 及びｒｔｕｍ　−Ｊ抗原と呼ぼるここに述べたクラスの抗原を含む、ＣＴＬによ り認識される他のタイプの抗原が要求される。 上記の目的物質の腫瘍の例としては、Ｐ８１５が知られている。デプリーン（Ｄ ｅＰｌｅａｎ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　８５：２２７４−２２７８（１９８８）　：チコラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）迺■ AＥＭ ｔｌＯＪ　９：ｌ０１１−１０５０（ｌＱ９０）　、及びノビレ（Ｓｉｂｉｌｌ ｅ）ら著、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７２：　３５−４５（＋９９０）を参照さ れたい。この開示は参照文献としてここに含まれるものとする。 Ｐ８１５腫瘍は肥満細胞腫であり、メチルコラントレンを用いてＤＢＡ／２マウ スにおいて誘発され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの腫瘍及び細胞系の両方として培養され る。Ｐ８１５系は、突然変異誘発の後、Ｐ９１Ａ　（デプリーン著、上記参考文 献）、３５Ｂ（チコラ著、上記参考文献）及び円９８（ンビレ、上記参考文献） と呼ばれる変異体を含むいくつかのｔｕｍ　変異体を生じた。腫瘍拒絶抗原と対 照すると、ｔｕｍ−抗原は、腫瘍細胞が突然変異した後に存在するのみであり、 これが鍵となる特徴である。腫瘍拒絶抗原は、突然変異なしに所定の腫瘍の細胞 上に発現する。それゆえに、文献を参照すると、細胞系はＥ円Ｊと呼ばれる系の ようなｔｕｍ　’であってもよく、ｔｕｍ−変異体を生しるように誘発され得る 。ｔｕｍ−表現型は、親細胞系のものとは異なっているので、それらのｔｕｍ　 ’親糸と比較するとｔｕｍ−細胞系のＤＮＡは異なっていることが予期され、ｔ ｕｍ　細胞に重要な遺伝子を置くためにこの差異を利用することができる。その 結果として、Ｐ９１Ａ、３５Ｂ及び円９８のようなｔｕｍ−変異体の遺伝子は、 遺伝子のコート領域における点突然変異によりそれの正常の対立遺伝子とは異な っていることが見出された。チコラ（Ｓｚｉｋｏｒａ）及びンビレ（Ｓｉｂｉ！ Ｉｅ）著、上記参考文献、及びローキン（Ｌｕｒｑｕｉｎ）ら著、Ｃｅ１ｌ　５ ８：２９３−３０３（１９８９）を参照されたい。これは、本発明のＴＲＡを用 いたケースでないことで証明された。これらの論文により、ｔｕｍ　抗原から誘 導されたペプチドが、ＣＴＬによる認識に関するＬ″分子により提示されること が立証された。Ｐ９１ＡはＬ’により提示され、Ｐ３５はＤｌにより、円９８は に’により提示される。 加工されて提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）腫瘍拒絶抗原（以下、［腫瘍拒絶 抗原前駆体」、「前駆体分子Ｊ又はｒＴＲＡＰＪという）を形成する分子をコー ドする遺伝子は、たいていの正常な成人組織において発現しないが、腫瘍細胞に おいて発現する。そこで、ＴＲＡＰをコードする遺伝子が単離され、クローン化 された。そして、それはここに開示された本発明の一部を表すものである。 該遺伝子は、単離かっ精製される腫瘍拒絶抗原前駆体及びＴＲＡそれ自体の源と して有用であり、それらのとちらも、抗原が［マーカーＪとなる癌の治療のため 、及び腫瘍学に対する様々な診断及び監視機構アブ叶チにおいて、薬剤として使 用できるものであり、以下に論述する。例えば、ｔｕｍ　細胞を使用し、異なる ｊｕｍ　抗原を発現する細胞及びｔｕｍ　’細胞を溶解するＣ孔を生じることが 知られている。例えば、マリャンスキ（Ｍａｒｙａｎｓｋ　ｉ　）ら著、Ｅｕｒ 、　Ｊ、　１ｍｕｎｏ１１２＋４０１（１９８２）及びフ７ンデンアインド（Ｖ ａｎ　ｄｅｎ　Ｅｙｎｄｅ）ら著、Ｍｏｄｅｒｎ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｌｅｕ ｋｅｍｉａ　ＩＸ（１４１９０年６月）を参照されたい。これらの開示は参考文 献としてここに含まれるものとする。腫瘍拒絶抗原前駆体は、遺伝子によりトラ ンスフェクトされた細胞において発現されてもよく、その後使用され、対象の腫 瘍に対して免疫応答を生しる。 ヒト腫瘍における類似のケースにおいて、自己白血球−腫瘍細胞混合培養（ａｕ ｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｍ１ｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ 　ｃｕｌｔｕｒｅ）　（以下ｒＭＬＴｃ」という）はA 自己腫瘍細胞を溶解しかつナヂュラルキラーターゲット、自己ＥＢＶ−形質転換 Ｂ−細胞又は自己腫瘍細胞を溶解しない応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）リンパ球を 頻繁に生しることが観察された（アニチニ（八ｎ１ｃｈｉｎｔ）ら著、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　８：３８５−３８９（＋９８７）を参照されたい。）。 この応答は、メラノーマについて特によく研究されており、鳩汀Ｃは、末梢血細 胞又は腫瘍浸潤リンパ球のいずれかにより行われてきた。この分野における文献 の例としては、クラス（Ｋｎｕｊｈ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６：２Ｒ０１−２８０２（１９８１）：ムールシ（Ｍｕ ｋｈｃｒｊｉ）ら著、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｉ５８：２４０（＋９８３）；ヘリ ン（Ｈｅｒｉｎ）　ら著、Ｉｎｔ、　、１．　Ｃａｎｃ、　３９：３９０−３９ ６（１９８７）　：　ｈパリアン（Ｔｏｐａｌ　１ａｎ）ら■AＪ。 Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１６：８３９−８５３（１９８８）があげられる。安定（ｓ ｔａｂｌｅ）細胞障害性Ｔ−細胞クローン（以下ｒｃＴＬ　Ｊという）は、！Ｉ ＩＬＴＣ応答細胞から誘導されるものであり、これらクローンは腫瘍細胞に特異 的なものである。ムールジら著、上記参考文献、ヘリンら芹、上記参考文献、ク ラスら著、上記参考文献を参照されたい。これら自己ＣＴＩ、により腫瘍細胞」 二に認識される抗原は、新鮮な腫瘍細胞に見出されるので、これらは培養的アー チファクトを表すと思われない。トパリアン（Ｔｏｐａｌ　１ａｎ）ら著、十記 参考文献、デギオバンニ（Ｄｅｇｉｏｖａｎｎｉ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　２０：！８６５−１８６８（＋４１９０）を参照されたい。特異 的なネズミ腫瘍拒絶抗原前駆体に関する遺伝子を単離するためにここに使用した 技術と結び付けてこれらを観察すると、ヒト腫瘍に発現したＴＲへの腫瘍拒絶抗 原前駆体をコードする核酸配列が単離されることが導かれた一腫瘍拒絶抗原前９ 体をコートする核酸配列を単離することが可能となり、そのこと（す以Ｆに記載 する結果を伴う特定の腫瘍の大部分の特徴を含むが、それらに限定されるもので はない。また、以下に記載した、ヒト腫瘍拒絶抗原前駆体に関するこれらの単離 核酸配列及びそれらの適用は本発明の目的である。 本発明のこれら及び様々な他の態様は、以下の開示において詳しく述べる。 図面の簡単な説明 図１は、抗原Ｐ８１５Ａを発現するトランスフェクトントの検出を図示するもの である。 図２は、クロム放出アッセイ（ｃｈｒｏｍｉｕｍ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙ ）により測定した、様々なＣＴＬにより溶解するクローン円、ＨＴＲ，ＰＯｌＩ ＩＴＲ、ゲノムトランスフエクタントＰＩＡ、Ｔ２７１ｊびコスミドトランスフ エクタント円Ａ、　Ｔｅ３．１の感受性を示したものである。 図３は、コスミトＣＩＡ、　３．１の制限地図である。 図４は、遺伝千円への発現のノーザンプロット分析を示すものである。 図５は、遺伝千円への構造をその制限部位と共に示したものである。 図６は、細胞をＰ８１５又は正常細胞のいずれかから単離した円Ａ由来の遺伝子 を用いてトランスフェクトし、その後ＣＴＬ溶解を試験した時に得られた結果を 示すものである。 図７は、肥満細胞系ＬＩ３８．８Ａを用いた溶解研究を示すものである。 図８は、それもまた抗原を発現する、２．４ｋｂの抗原Ｅ断片配列のサブフラグ メントの地図である。 図９は、遺伝子ｍａｇｅｌ、２及び３のエクソン３の部位の相同関係を示すもの である。 図１０は、様々な組織においてＭＡＧＥ遺伝子についてノーザンプロットを行っ た結果を示すものである。 図１１は、図１３のデータを表にしたものである。 図１２は、この適用において使用した様々なヒトメラノーマ細胞系を使用したサ ザンプロット実験を示すものである。 図１３は、腫瘍及び正常組織によるＭＡＧＥ　＋、２及び３遺伝子の発現の一般 的なｔＩｉ成図である。 配列番号ｌは、遺伝千円への一部分に関するｃＤＮＡである。 配列番号２は、遺伝子円へに関するｃＤＮＡのコード領域を示すものである。 配列番号３は、３゛から配列番号２のコード領域までのＰＩＡ　ｃＤＮＡに関す る非コードＤＮＡを示すものである。 配列番号４は、ＰＩＡに関するｃＤＮＡの全配列である。 配列番号５は、円Ａに関するゲノムＯＮＡ配列である。 配列番号６は、ＰＩＡ　ＴＲＡに関する抗原性ペプチドのアミノ酸配列を示した ものである。該配列は、Ａ’Ｂ’、すなわちＡ及びＢ抗原の両方を発現する細胞 に関するものである。 配列番号７は、抗原Ｅをコードする核酸配列である。 配列番号８は、ＭＡＧＥ−１をコードする核酸配列である。 配列番号９は、ＭＡＧＥ−２に関する遺伝子である。 配列番号１０は、ＭＡＧＰ、−２１に関する遺伝子である。 配列番号１１は、！ＭＧＥ−３に関するｃＤＮＡである。 配列番号１２は、ＭＡＧＩ！−３１に関する遺伝子である。 配列番号１３は、ＭＡＧＥ−４に関する遺伝子である。 配列番号１４１は、ＭＡＧＥ−４１に関する遺伝子である。 配列番号１５は、ＭＡＧＥ−４に関するｃＤＮＡである。 配列番号１６は、ＭＡＧＥ−５に関するｃＤＮＡである。 配列番号Ｉ７は、ＭＡＧＥ−５１に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号１８は、ＭＡＧＥ−６に関するｃＤＮＡである。 配列番号１９は、ＭＡＧＢ−７に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２０は、ＭＡＧＥ−８に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２１は、ＭＡＧＥ　９に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２２は、ＭＡＧＥ−１０に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２３は、ＭＡＧＥｉ＋に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２４は、ｓｍａｇｅ−１に関するゲノムＤＮＡである。 配列番号２５は、ｓｍａｇｅ−Ｉｆに関するゲノムＤＮＡである。 好ましい態様の詳細な説明 本出願の以下に掲げる配列から分かるように、多くの異なるｒＭＡＧＥＪ遺伝子 を同定した。以下の実施例に記載したプロトコールを使用し、これらの遺伝子及 びｃＤＮＡ配列を単離した。 ここに使用したｒＭＡＧＥＪとは、ヒト細胞から単離した核酸配列をいう。頭文 字語ｒｓｍａｇｅ　Ｊは、ネズミ起源の配列を記載するために使用した。 ｒＴＲＡＰ」又はｒＴＲＡ　Ｊが腫瘍型に特異的であるとここで論議する時、こ れは、研究中の分子がその型の腫瘍に関連することを意味するが、必ずしも他の 腫瘍型を除外することを意味するものではない。 実施例Ｉ 抗原Ｐ８１５Ａをコードする遺伝子を同定及び単離するため、遺伝子トランスフ ェクションを使用した。このアプローチには、遺伝子の源及び宿主細胞系の両方 が必要である。高率でトランスフェクト可能な細胞系Ｐ１．ＨＴＲは、宿主の出 発物質であったが、認識されたＰ８１５腫瘍抗原の４つのうちの１っ「抗原Ａ」 を示すので、それをさらに処理せずに使用することはできなかった。ファンペル （Ｖａｎ　Ｐｅｔ）ら著、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１：４６ ７〜４７５（１９８５）を参照されたい。従って、抗原を発現せず、なお円、　 １（ＴＲの望ましい性質を所有する細胞系を単離するため、スクリーニング実験 を１テった。 これを行うために、腫瘍抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤについて特異的なＣＴＬを用いて 、Ｐｌ、ＨＴＲをスクリーニングした。そのようなＣＴＬはウィテンホーブ（Ｕ ｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）ら著、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　＋５７：１０４０− １０５２（１９８３）　ｉ：記載されたもノである。選別を行うために、１０＠ 個の細胞円、　ＨＴＲを、２＋ｎｌの培地の入った丸底チューブに２〜４刈０６ 個のＣＴＬクローンと共に混合し、３分間、１５０　Ｘｇで遠心分離した。３７ ℃で４時間後、細胞を洗い、ｌｏｍｌの培地に再び懸濁した。（これは、マリャ ンスキ（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２ ：４０６−４１２（１９８２）に従って行った）。ＣＴＬアッセイ及びスクリー ニングプロトコールに関する追加の情報は、一般的に、ブーンら著、Ｊ。 Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５２山８４−１１９３（１９８０）及びマリャンスキら 著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｆａｎｕｎ吐１２：４０６−４１２（＋９８２）に見出す ことができる。この開示は参照文献としてここに含まれるものとする。 これらの選別を行った時、抗原Ａ又はＢのとちらも発現しない細胞系変異体を見 出した。その後、抗原Ｃに特異的なＣＴＬを用いた追加的選別により、抗原Ｃを 欠いた変異体を生した。これらのスクリーニングの結果の概要に関して図２を参 照されたい。変異体ＰＯ，ＨＴＲは、抗原ＡＳＢ及びＣに関して陰性であり、そ れ故に、トランスフェクション実験のために選択された。 細胞系ＰＯ，ｌｌＴＲを、ブダペスト条約に従い、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ ｔｅｕｒ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　Ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ ｓ　Ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、　２８．　Ｒｕｅ　ｄｅ　Ｄｏｃ ｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ、@７５７２４パ リ、フランスに寄託した。その受託番号はｌ−１１１７であった。 この方法論は、認識された４つのＰ８１５腫瘍抗原、即ち抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ の少なくとも一つを一般的に示す細胞型の変異体である他の細胞系を獲得するの に適応できるものであり、この場合の変異体は抗原Ａ、Ｂ及びＣのどれも示さな い。 Ｐｌ、ＨＴＲは、肥満細胞腫細胞系であり、そのため、該プロトコールにより、 Ｐ８１５抗原Ａ、Ｂ及びＣのいずれも発現しないが高率でトランスフェクション 可能な、生物学的に純粋な肥満細胞腫細胞系を単離できることが分かるであろう 。他の腫瘍型をこの方法てスクリーニングし、望ましい生物学的に純粋な細胞系 を獲得してもよい。得られた細胞系は、円、　ＨＴＲのように、外来ＤＩＩＩＡ と少なくともトランスフェクション可能であるべきてあり、特異的抗原を発現し ないように選択されるベデブリーン（ＤｅＰＩａｅｎ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ １１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：２２７４−２２７８（１９８８ ）に示された先行の研究は、コスミドライブラリートランスフエクションを用い て、ｆｕｍ　抗原をコードする遺伝子を回収することの有効性を示したものであ り、それは参照文献としてここに含まれるものとする。 ウォルフエル（Ｗｏｌｆｅｌ）ら著、ｌｏｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２６：１ ７８−１８７（１９８７）の記載に従い、選択的プラスミド及びＰｉ、　ＨＴＲ のゲノムＤＮＡを製造した。トランスフェクション方法は、何点か変更したが、 コルサｏ　（Ｃｏｒｓａｒｏ）ら著、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎｅｔ７：　６０３−６１６（＋９８１）に従った。簡潔に言えば、ベルナ ート（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら著、Ｅｘｐ。 Ｃｅｌ　１．８ｉａ１．１５８：２３７−２４３（１９８５）により記載された ように、細胞ノＤＮＡ　６０　μｇ及びプラスミドｐＨＭＲ２７２のＤＮＡ　３ １１ｇを混合した。このプラスミドは宿主細胞にヒグロマイシン耐性を与え、従 って、トランスフェクタントをスクリーニングする都合のよい方法を提供するも のである。混合ＤＮＡを１ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）９４０μｌ　、０ ．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、及びＩＭ　ＣａＣｌ２３１０μｌと合わせた。溶液を 、１．２５ｍ１ノ５０ｍ１Ｊへペス、２８０　ｍＭ　ＮａＣｌ　、１．５　ｍｌ Ｊ　ＮａｚＨＰＯ＋に、一定に攪拌しながらゆっくりと加え、ＮａＯＨてｐＨ７ ，１に調節した。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱物を、室温下、３０〜４５分間 で形成した。その後、ｌグループ当たり１５グループのＰＯ，）ＩＴＲ細胞（５ 刈Ｏｓ）を、１０分間、４００ｇで遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを ＤＮＡ沈澱物を含有する培地に直接再懸濁した。この混合物を２０分間、３７℃ でインキュベートした後、この混合物を１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ 　２２．５ｍｌを含有する８ｏｃｆｆＩ２組織培養フラスコに加えた。２４時間 後、培地を元の所へ置いた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し 、計数した。トランスフェクトした細胞を、ヒグロマインンＢ（３５０ｇｇ／ｍ ｌ）を補足した培養培地を用いた集団培地において選択した。この処理により、 ヒグロマイシン耐性の細胞を選択した。 各グループに関して、４０ｍ１の培地に８　ＸＩＯ’細胞をそれぞれ含有する２ つのフラスコを準備した。トランスフェクタントの数を評価するために、各グル ープから１刈０６の細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）　、０．４％バクト アガー（ｂａ（ｔｏａｇａｒ）、及び３００ｇｇ／ｎｌヒグロマイシンＢを含む ５　ｍｌ　ＤＭＥＭにプレートした。その後、コロニーを１２日後に計数した。 ２つの独立した測定を行い、平均をとった。これに５を欠け、相当するグループ におけるトランスフエクタントの数を評価した。補正は、Ｐ８１５細胞のクロー ニング効率に関して行うべきであり、それは約０．３であることがわかっている 。 実施例３ 上記実施例２に記載したトランスフェクションの８日後、抗生物質耐性トランス フェクシントを、フィコールバーク法による密度遠心分離を用いて、死んだ細胞 から分離した。これらの細胞を１又は２日間非選択培地に保持した。細胞を２０ ０μｌの培養培地中の、９６ウエルのマイクロプレート（丸底）に、３ｏ細胞／ マイクロウエルの割合でプレートした。製造したトランスフエクタントの数によ り、１００〜４００のマイクロウェルを製造した。アガーコロニー試験による推 定値は、５００〜３０００てあった。５日後、ウェルは約６刈０′細胞を含有し ており、ウエルの１／１０をマイクロプレートに移すことによりレプリケートプ レートを製造し、その後、それを３０℃でインキュベートした。１日後、マスタ ーのプレートを遠心分離し、培地を除去し、Ｐ８１５抗原Ａに対する７５０のＣ ＴＬ（ＣＴＬ−Ｐｉ　：５）を、４０Ｕ／ｍ１　組み換えヒトＩＬ−２を含むＣ ＴＬ培養培地及び刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｌｏｒ　ｃｅｌｌ）を殺すためのＨ ＡＴ培地に、照射した同系支持（ｆｅｅｄｅｒ）牌臓細胞１０’と共に各ウェル に加えた。 ６日後、ＣＴＩ、が増殖したウェルを同定するために可視的にプレートを試験し た。 プレートがマイクロ培養物（ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）の増殖を示した場合に は、ウェルの１００μＩのアリコートを、ｆｉｔＣ，標識したＰｌ、ＨＴＲ標的 細胞を含む他のプレート（ｌウェル当たり２　ＸＩＯ’〜４　ＸＩＯ’）に移し 、４時間後にクロム放出を測定した。高いＣ乳清性を示すものに相当するレプリ ケートマイクロ培養物を、ｌＯ％ＦＣ３を含むＤＭＥＭにおいて制限した希釈液 により膨潤し、クローン化した。５日後、上記のような可視的溶解アッセイにお いて、約２００のクローンを収集し、ＣＴＬ、円：５細胞系を用いてスクリーニ ングした。これらの結果について図ＩＡを参照されたい。 これらの実験において、トランスフエクタントの１５のグループのうちの３つは 、２．３の陽性マイクロ培養物を生した。これらのマイクロカルチャーを、上記 のように円、　ｌｌＴＲに対する溶解活性について試験した。増殖が観察された ほとんどのマイクロカルチャーは、溶解活性を示した。図ＩＢに示すように、こ の活性は十分にバックグラウンド以上であった。この図は、２つのグループの細 胞（グループｒ５＋及びｒ１４１）、４００及び３００マイクロウエルに３０の ヒグロマイシン耐性トランスフェクト細胞を播種したデータをまとめたものであ る。マイクロ培養物の増殖及び復製の後、抗−Ａ　ＣＴＬ　ＰＩ　：５を添加し た。６日後、円、　ＨＴＲに対する溶解活性を試験した。図において、それぞれ の点は、単一のマイクロ培養物の溶解活性を表すものである。 幾つかの陽性ウェルに相当する復製マイクロ培養物をサブクローン化し、１％よ り多いサブクローンが、抗−Ａ　ＣＴＬにより溶解されることを見出した。従っ て、Ｐ８１５Ａを発現する３つの独立したトランスフエクタントは、３３．００ ０のヒグロマイノン耐性トランスフエクタントから得られた。以後、円Ａ、　Ｔ ２と呼ぶ、これらの系の１つをさらに試験した。 円へ、Ｔ２に関連した抗原プロフィールを図２に示す。これは、上記の型の抗− ＣＴＬアッセイにより得られたものである。 実施例４ ＰＩＡ、Ｔ２について行ったＣＴＬアッセイにより、それが抗原Ａ（ｒＰ８１５ Ａ　Ｊ　）を示したこと及びそれ故にＰｌ、ＨＴＲからの遺伝子を受けたことが 示された。その結果として、この細胞系を、以下の実験において抗原前駆体に関 する遺伝子の源として使用した。 先行の研究により、ｔｕｍ−抗原をコードする遺伝子は、コスミドライブラリー を用いて得られたトランスフエクタントから直接回収され得ることが示された。 デプリーン（Ｄｅｐｌｅａｎ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８５：２２７４−２２７８（１９８８）をQ 照されたい。この方法は、Ｐ８１５遺伝子の回収に従った。 円んＴ２のゲノムＤＮＡ全体を、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ　３Ａｌを用い て部分的に消化し、ＮａＣｌ密度勾配超遠心分離により分別し、３５〜５０ｋｂ ＤＮＡ断片に濃縮した。 これらは、グロスベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）ら著、Ｇｅｎｅｌｏ：６７１５− ６７３２（１９８２）に従って行った。これらの断片を、パッテス（Ｒａｔｅｓ ）ら著、Ｇｅｎｅ　２６：１３７−１４６（１９８３）に記載されたように、Ｃ ２ＲＢのコスミドアームに結合した。この開示は、参照文献としてここに含まれ るものとする。これらのコスミドアームは、Ｓｍａｌによる開裂及び子ウシ腸フ ォスファターゼによる処理、続いてＢａｍ１による消化により得られた。グロス ベルドらの上記文献に従い、結合したＤＮＡをλフアージコンポーネントにパッ ケージングし、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＥＤ　８７６７に滴定した。挿入したＤＮＡのμ ｇあたり約９×１０５のアンピシリン耐性コロニーを得た。 コスミドグループは、ｌｏｍＭ　ＭｇＣＩｔ中のＢＤ　８７６７２　ｍｌと３０ ．０００の独立したコスミドを混合することにより増殖させ、２０分間、３７度 でインキュベートし、２０ｍ１のルリアベルタニ（ｒＬＢ」）培地で希釈し、そ の後１時間インキュベーションした。 この懸濁液を滴定し、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍｌ）の存在するＬＢ培地１リ ットルを接種するために使用した。細菌濃度２ＸＩＯ”細胞／　ｍｌ（００ｇ。 。＝０．８）において、１０ｍ１アリコートを凍らせ、２００μｇ　／　ｍｌの クロラムフェニコールを、−晩インキユベーションするために培養物に加えた。 全ニスミドＤＮＡを、アルカリ溶解方法により単離し、ＣｓＣ１勾配において精 製した。 これらの実験において、６５０．０００コスミドのライブラリーを作製した。増 殖プロトコールは、約３０．０００コスミトの２１グループを使用することを含 んでいた。 実施例５ 」−に言及したコスミトの２１グループ、（６０ｇｇ）及び４μｇの上記のｐＨ ＭＲ２７２を用い、５ＸＩＯ＠のＰＯ，ＨＴＲ細胞のグループをトランスフエク タント宿主として使用した。トランスフェクションを、前の実験において記載し たのと同じ方法において行った。記載したようなＣＴＬアッセイを再び用い、ｌ グループ当たり平均３０００のトランスフエクタントを抗原発現について試験し た。コスミドの１グループは、約１１５．０００薬剤耐性ｌ・ランスフエクタン トの頻度において、陽性トランスフエフタンｌ−を繰り返し生成した。円Ａ、　 Ｔ２による、トランスフエクタントは、抗ＫＡ及びＢの両方の発現を示した。ト ランスフエクタント円Ａ、　Ｔｅ３．１の発現のパ々−７を図２に示す。 実施例６ 上記実施例５に示したように、Ｐ８１５Ａ抗原を提示する３つの独立したコスミ トトランスフエクト細胞を’４４１１１１１した。これらのトランスフェクタン トのＤＮＡを単離し７、λフ７−ン抽出液を用いて直接パッケージングした。こ れはデブリーンＴＤｅｆ”１ａｅｎｌ　ら著、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：２２７４−２２７８（１９８８）　Ｉ：従って行っ■B 得られた生成物を、実施例５において記載したように、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＥＤ　８ ７６７に滴定し、アニ・ピシリンによる選択を行った。同様に、コスミドの増殖 及びトランスフェクションを、ＰＯ，ＨＴＲを再ひ使用し、実施例５に従って行 った。 以Ｆの表１に記載した７ように、高頻度のトランスフェクションか観察された。 表１　直接パ、・ケーノンクにより得られたコスミドによる抗原Ｐ８１５Ａの発 現の移入 コスミトライブラリー　０．５μｇ　ＤＮＡの直接　Ｐ８１５Ａを発現するトラ ンスを用いて得られた　パッケージングにより　フエクタントの数／ＨｍＢ　” １・→ンスフエクタント　１誇られｔこコスミドの数　トランスフエクタントの 数ＴＣ３，＋　３２　８７／＋９２ ＴＣ３，２３２０００４９／３８４ コスミドを制限酵素を用いて分析し、直接パッケージしたトランスフエクタント 円Ａ、　Ｔｅ３．　Ｉが３２のコスミドを含んでおり、そのうちの７つは異なっ ていたことが見出された。これら７つのコスミトを、上記の方法において、上記 のプロトコールに従って閉、　ＨＴＲにトランスフェクトし、トランスフエクタ ントがＰ８１５Ａを示すかとうかについて研究した。４つのコスミドトランスフ エクタントはＰ８１５Ａを示し、ここに記載したすべての実験においてＰ８１５ Ｂを共に発現した。 ２つの抗原の発現を示すコスミド４つのうち、コスミドＣＩＡ、　３．１は、長 さがたったの１６．７キロ塩基であり、これを選び下記のさらなる分析を行った 。 コスミドＣＩＡ、　３．１を制限エンドヌクレアーゼ分析にかけ、図３に示す地 図を作製した。 すべてのＥｃｏＲＩ断片を、上記プロトコールを再び用いてトランスフェクトし 、７．４キロ塩基の断片のみが、抗−Ａ　ＣＴＬが溶解てきるトランスフェクタ ントを生成した。同様の実験をＰｓｔｌ断片について行い、溶解可能なトランス フエクタントを製造した７、４ｋｂ　ＥｃｏＲ１断片内に４．　ｌｋｂ断片のみ が十分に含まれていた。 この断片（即ち、４．　Ｉｋｂ　Ｐｓｔｌ断片）をＳｍａｌで消化し、２．３ｋ ｂ断片を得た。それは、トランスフェクションの後に抗原Ａ及びＢを提示する宿 主細胞を生成した。 最後に、Ｓｍａ　１．／Ｘｂａ　ｌて獲得された長さ９００塩基の断片は、これ ら二つの抗原の前駆体、即ち、抗原Ａ及び抗原Ｈの両方を提示するトランスフェ クトされた宿主細胞の発現を移入した。 寒裡吻工 上記９００塩基断片を、親細胞系Ｐ１．１ＩＴＲにおけるＰ８１５Ａ遺伝子の発 現を検出する（＋９８６）に記載のグアニンシーイソチオシアネート法を用いて 、全細胞性ＲＮ＾を、まず単離した９オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラ フイーを用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを弔離し、生成するのに使用した方法は、同し 文献を源としている。 その後、サンプルをノーサンプロット分析にかけた。ＲＮＡサンプルを、０．６ ６Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アカロースゲルにおいて分別した。ゲルを 、ニトロセルロース膜において一晩ブロンティングする前に、３０分間、ｌ０Ｘ ＳＳＣ（ＳＳＣ：０、１５Ｍ　ＮａＣｌ　；　Ｏ，０１５Ｍ　クエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７，Ｏ）で処理した。その膜を２時間、８０℃で焼き、その後１０％硫 酸デキストラン、１％ＳＤＳ及びｌ　Ｍ　ＮａＣｌを含有する溶液において、６ ０℃で１５分間プレハイブリダイズした。その後、変性したプローブ（該９００ 塩基断片）を用い、サケの精液ＤＮＡ　１００μｇ／ｍｌを一緒に用いて、ハイ ブリダイゼーションを行った。 このプロトコールを、円、　ｌｌＴＲポリＡポリ　ＲＮＡを用いて行った時、図 ４のラインｌ（６７１ｇのＲＮＡ　）に示すように１．２ｋｂのバンド及び二つ の弱いバンドが確認された。　同じプローブを使用し、細胞系のポリ−Ａ゛から 製造したｃＤＮＡライブラリーを７クリーニングした。これにより、ｌｋｂの挿 入物をもつクローンが生成され、これは５゛末端が欠損していることを示唆する ものである。 各ケースにおけるハイブリダイゼーション実験を一晩、６０℃において行った。 プロットを、室温において２ＸＳＳＣにより２回、６０℃において１％ＳＤＳを 補足した２ＸＳＳＣにより２回洗った。 ｍＴ述の実験は、配列決定をするのに十分なＰ８１５Ａ抗原前駆体を発現するＤ ＮＡを、周知のサンガージテオキノチェーンターミネーション法を用いて叙述し たものである。これを、様々な制限エンドヌクレアーゼを使用し、合成オリゴヌ クレオチドブライマーを用いた特定のプライミングを行うことにより、生したク ローンにおいて行った。遺伝子のエクソンに関する結果を、配列番号４に示した 。 実施例８ 上記ノーイン分析は、ｃＤＮＡの５°末端が欠損していることを示唆した。この 配列を得るため、ｃＤＮＡを、位１Ｆｆ３２０−３０３に相当するプライマーを 使用して円、ＨＴＲＲＮＡから作製した。その後、位Ｎ２８Ｇ−２６６に相当す る３゛プライマー及び５°プライマーを使用するポリメラーゼチェーンリアクン ヨンを用いて、配列を増幅した。これ（４、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら著 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：８９９Ｂ −９００２（１９W８） に記載されている。ササンブロノトにおいて上記の９００ｂｐ　Ｓｍａｌ／Ｘｂ ａｌ断片にハイブリダイズした、予期されたサイズ（２７０塩基）のハンドを見 出した。ｍ１３ｔｇ　１３０λＩｇ　１３１へのクローニングの後、小さな２７ ０ｂｐ断片の配列を決定した。その配列を配列番号１に示したつ 実施例７及び８に記載し、配列番号４に示した配列を獲得した後、コスミドＣ１ ＾、３１の５．７ｋｂの領域の配列を決定した。この配列が、トランスフェクト ントにおいてＰ８１５Ａを発現する９００塩基断片を含むことはわがっていた。 コスミドが開始点においてゲノムであるので、この実験は、イントロン及びエク ソンの描写を可能とした。 この遺伝子の描写した構造を図５に示す。配列番号４と共に、これらのデータに より、以後１円Ａ」と呼ばれる抗原前駆体の遺伝子が、長さ約５キロ塩基対であ り、３つのエクソンを含むことが示された。２２４アミノ酸のタンパク質につい てのＯＲＦは、エクソンｌにおいて出発し、エクソン２において終了する。抗原 Ａ及びＢの前駆体の発現を移入する９００塩基対断片は、エクソンｌを含むのみ である。プロモーター領域は、配列番号ｌに示されるようなＣＡＡＴボックス及 びエンハンサ−配列を含むものである。この後者の特徴は、ゲラ−ティ（Ｇｅｒ ａｇｈｔｙ）ら著、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ　１７＋＋　１−１８（１９９０）；キ ムラら著、Ｃｅ１ｌ　４４：　２６１−２７２（１９８６）に観察されたように 、たいていの■ＩＣクラス１遺伝子のプロモーターにおいて観察した。 リップマン（Ｌｉｐｎｕｎ）ら著、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：　１４３５−１４ ４１（１９８５）に示されたような３及び６のに−１−リプルパラメーターを用 いたフラグラムＦＡＳＴＡ　、及びＧｅｎｂａｎｋデータベースリリース６５（ １９９０年１０月）を使用し、コンピュータによる類似性の研究を行った。エク ソン！　（位置５２４−６１８）によりコードされる酸領域の一部に相当する９ ５塩基の範囲以外に相同性は見出されなかった。該範囲は、ポウアポン（Ｂｏｕ ｒｂｏｎ）ら著、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２００：６２７−６３８（１９８８） 及びンュミットーザッッマン（Ｓｃｈ＋ｎｉｄｔ−Ｚａｃｈｍａｎｎ）ら著、Ｃ ｈｒｏｍｏｓｏｍａ　９６：　４１７−４２６（１９８８）により記載されたよ うなマウス核小体タンパクＮ０３８／Ｂ２３における酸性領域をコードする配列 と同様のものである。 ９５塩基の５６は同一であった。これらの相同性がクロスハイブリダイジングの ためであるかとうかを試験するために、９００塩基断片を用いてスクリーニング したマウス牌＠ｃＤＮＡライブラリーを使用して実験を行った。クロスハイブリ ダイジングのバンドのサイズに正確に対応するｃＤＮＡクローンを得た。これら を部分的に配列決定し、２．６ｋｂ　ｃＤＮＡが、マウス小核素の報告されたｃ ＤＮ＾配列に相当し、１．５ｋｂｃＤＮ＾がマウス核小体タンパクＮ０３８／Ｂ ２３に相当することを見出した。 すＦにおいて１円＾］と呼ばれる遺伝子のヌクレオチド配列の分析により、その コート生成物が２５ｋｄの分子状塊を有することが示された。配列番号４を分析 することによ頃位置８３−１１８において大きな酸性ドメインと同しように、残 基５−９における潜在的核酸標的シグナル（ディングウオール（Ｄｉｎｇｗａｌ ｌ）ら著、Ａｎｎ。 Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｉａｌ、　２：３６７−３９０（１９８６））が示された 。上記のように、これは、門人と二つの核小体タンパクの開の相同性の領域を含 むものである。推定上のリン酸化部位は、位置＋２５（セリン）において見出す ことができる。また、第二の酸性ドメインは、１４グルタメート残基の連続した 範囲としてＣ−末端近くに見出される。同様のＣ−末端構造は、核酸の定位を有 するネズミのホメオドメイン（ｈｏｍｅｏｄｏ＋ｎａｉｎ）タンパクにおいて、 ケラセル（Ｋｅｓｓｅｌ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　８４　：　５３０６−５１１０（＋９８７）により見出された。 遺伝子円Ａの配列を四１＾、３５Ｂ及び円９８の配列と比較する研究において、 円Ａは遺伝Ｔ−及び抗原の異なるクラスを表示することが分かり、類似点は見出 されなバンドにおける円Ａプローブ及び配列を用いて、正常組織に存在する遺伝 子が、１１！瘍により発現されるものと同一であるかどうかを測定するために研 究を行った。 これを行うために、ファージライブラリーを、λｚａｐＨ１０及びＤＢＡ２ネズ ミ腎臓細胞のゲノムＤＮＡを使用して作製した。ＰＩＡをプローブとして使用し た。ハイブリダイゼーンヨン条件は上記のよってあり、ハイブリダイズしたクロ ーンを見出した。該クローンは、円Ａ遺伝子の１つ及び２つのエクソンを含有し 、図５の位置０７〜３．８に相当した。この配列の限定の後、図５の３．８〜４ ．５に相当する配列をｉｌるためにＦ’ＣＲ増幅を（１つだ。 配列分析を行ったか、正常腎臓由来の遺伝子とＰ８１５腫瘍細胞から得た円Ａ遺 伝子の間に差異は見出されなかった。 さらなる実験において、ＤＢＡ／２腎臓細胞に見出されたような遺伝子を、上記 のように、ＰＯ，１ｆｆＲにトランスフェクトした。図７に描写して示したこれ らの実験により、抗原へ及びＢが、正常腎臓細胞から単離した円Ａ遺伝子を用い たのと同しくらいに、正常腎臓細胞から単離した腎臓遺伝子によって効率的に発 現したことが示されたー これらの実験により、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする遺伝子が突然変異から得 られない遺伝子であるという結論が導かれ、むしろ、遺伝子が正常細胞に存在す るものと同しであるが、そこにおいて発現しないということが明らかにされた。 この研究成果の細部は重要であり、以下において論述する。 ここに詳論しない研究において、遺伝子の変異体は入手可能であることが見出さ れた。いくつかの細胞は、正常ｒＰＩＡ　ＪというよりもｒＰＩＡ　−Ｂ　”　 Ｊであった。 これらの間の唯一の差異は、変異体における１８番目のトリブレットコードがＶ ａｔの代わりにＡｌａであるというエクソンｌにおける点突然変異にある。 実施例ＩＩ 追加の実験を他の細胞型を用いて行った。上記のノーザンブロットハイブリダイ ゼーションについて記載したプロトコールに従って、正常肝及び牌臓のＲＮＡを 試験し、門人遺伝子の転写が見出されるか否かを測定した。ノーザンプロットデ ータを図４に示した。それから分かるように、発現の形跡は見られなかった。 ＰＩＡを甲離したネズミＰ８１５細胞系は、肥満細胞腫である。従って、肥満細 胞系を研究し、それらが遺伝子を発現するか否かを測定した。ナベル（Ｎａｂｅ ｌ）ら著、Ｃｅ１１２３・１９−２８（Ｈ）８１）に記載された肥満細胞系ＭＣ ／９及び骨髄誘導肥満細胞の短期間培養物を上記方法（ノーザンブロッテイング ）において試験したが、転写は見られなかった。一方、Ｂａ１ｂ／Ｃ誘導ＩＬ− ３依存細胞系Ｌ１３８．８Ａ（ヒュルトナ−（Ｈｕｌｔｎｅｒ）ら著、Ｊ、　Ｉ ＩＴＩＩＴｌｕｎｏｌ、　＋４２：３４４０−３４４６（１９８９））を試験し た時、強いシグナルが見出された。肥満細胞の研究を図４に示した。 ＢＡＬＤ／Ｃ及びＤＢＡ／２マウスの両方は、■−２６ハブロタイプを共有する ことが知られており、上記ＣＴＬを用いた溶解の感受性を試験することが可能で あった。図８は、これらの結果を示しており、それは、抗−八及び抗＝Ｂ　ＣＴ Ｌが細胞を激しく溶解するが、抗−〇及び抗−Ｄ系は溶解しなかったことを本質 的に示している。 さらに、池のネズミ腫瘍細胞系、即ち奇形癌細胞系ＰＣＣ４（ブーフ（Ｂｏｏｎ ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　： ２７２−２７５（１９７７）及び白血病ＬＥＣ及びＷＥＨＩ−３８に■■ て試験を行った。これらのサンプルのいずれにおいても、発現は見られなかった 。 実施例１２ １１０分子による円Ａ抗原の実際の提示は、興味深いものである。これを試験す るため、コスミドＣＩＡ、３．１を線維芽細胞系ＤＡＰにトランスフェクトし、 それは表現型旧２″を示すものである。細胞系をに″、Ｂ６、Ｌ６抗原の−っを 発現する遺伝子を用いてトランスフェクトした。コスミド及び囲Ｃ遺伝子の両方 を用いたトランスフェクションの後、ＣＴしての溶解を、再び上記のようにして 研究した。 表２にまとめたこれらの研究により、Ｌ６が円Ａ抗原Ａ及びＢの提示に要求され ることが示された。 表２．抗原Ｐ８１５Ａ及びＰ８１５Ｂの１（−２制限宿主細胞　ＣＴＬにより溶 解したクローンの数／Ｈ，Ｂ”クローンの数ＣＴＬ抗−Ａ　ＣＴＬ抗−Ｂ １）ＡＰ（ｌ（−２″　）　０／２０１１　０／１９４ＤＡｒ’＋Ｋ　’　Ｏ／ ＋６５　０／１６２ＤＡＰｉＤ　’　Ｏ／＋５７　０／１２９ＤＡＰ！４．’　 ２５ノ３３　１５ノ２０章全円Ａ遺伝子を含有するコスミドＣＩＡ、　３．１を 、示したようなト２６クラスＩ遺伝ｒてあらかしめトランスフェクトしたＤＡＰ 細胞に、トランスフェクトした。 独立薬剤耐性コロニーを、可視的アッセイにおいて抗−Ａ又は抗−Ｂ　ＣＴＬに よる溶解について試験した。 Ｉｌ！瘍拒絶抗原の提示を特異的１ｉ１１１Ｃ分子と関連つけることができる観 察を、以下に詳論するように、ヒト細胞及び１１１．へ分子を用いた実験におい て確認した。 実施例１３ ＰＩＡ遺伝子の配列及びそれらから誘導されうるアミノ酸配列を使用し、＾゛Ｂ ゛（即ち、八及びＢ抗原の両方を発現する細胞の特性）である抗原ペプチド及び Ａ−８である抗原ペプチドを確認した。該ペプチドを図１Ｏに示す。該ペプチド を、それを提示する細胞に特異的なＣＴＬ細胞系の存在において、ＰＯ，ｌｌＴ Ｒ細胞のサンプルに投与した時、このペプチドはＰＯ，ｌｌＴＲ細胞の溶解を導 き、そのことにより、該遺伝子により発現される生成物に基つくペプチドをワク チンとして使用できることか公娑と支持される。 以下にＭＺ２−ＭＥＩ、といわれるヒトメラノーマ細胞系は、クローナル細胞系 ではないっそれは、抗原ｒＤ　、　Ｅ　、　Ｆ及びＡ」として公知の自己ＣＴＬ により認識される１つの安定な抗原を発現する。さらに、２つの他の抗原ｒＢＪ 及び「ｃ」が、腫瘍のいくつかのサプライン（ｓｕｂｌ　１ｎｅ）により発現す る。これらの６つの抗原に特異的？ｊＣＴＬクローンは、ファンデンアインド（ Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｙｎｄｅ）ら著、１吐Ｊ、　Ｃａｎｅ。 ４１：６３４−６１０（１９８９）に記載されている。Ｍ７．２−ＭＥＬのうち 、認識されたサブクローンはＭＥＬ、　４３、ＭＥＩ、３．０支びＭＥＬ３．　 ｌである。　（ファンデンアインド（Ｖａｎ　ｄｅｎ　）ｉｙｎｄｅ）ら芹、［ 記参考文献）。細胞系ＭＥＬ３．　Ｉは、ｒ’８１５変異体について記載された ような上記Ｃ且研究により測定した時、抗原Ｅを発現し、そのため、それを抗原 前駆体を発現する核酸配列の源として選択した。 ＋！！瘍拒絶抗原前駆体に関連した核酸配列を単離することにおいて、上記の開 発された技術（才、宿主細胞が二つの基準に添うことが必要であることを示した ：（ｉ）宿主細胞は、通常の状態において重要なＴＲＡＰを発現してはならない こと、及び（ｉｉ）それが、関連したクラスＩ　ＩＩＬＡ分子を発現しなければ ならないこと。また、宿主細胞は、高頻度でトランスフェクションされなければ ならない、即ちそれは１よい１宿主てｔｊければならない。 そのような細胞系を獲得するために、クローナルサプライン１ＪＢ３．１を、フ ァンデンアイント著、上記参考文献に記載されたように抗−Ｅ　ＣＴＬ　８２／ ３０を用いて反復選択にかけたつ選択の反復サイクルにより、サブクローンＭＺ ２−ＭＥＬ−２，２ｉｓｃ　Ｅ　−の甲離が導かれた。このサブクローンは、Ｉ ＩＰＲＴ−（即ち、ＩＩＡＴ培地＋ｌＯ−’Ｍヒポキサンチン、３．８　ＸＩＯ ’アミノプテリン、１．６　Ｘｌ０−’Ｍ　２−デオキシチミジンに感受性）で ある。該サブクローンを、以下に簡単にｒＭＥＬ−２，２Ｊという。 寒礁例ニラ− ＋ｌ！ＥＬ３．０のゲノムＤＮＡをウォルフエル（Ｗｏｌｒｅｌ）ら著、ｌｉｗ ｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２６：１７８−１８７（１９８７）に従って製造し た。この開示は参照文献としてここに含まれるものとするッニコラス（Ｎｉｃｏ ｌａｓ）ら箸、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ、　、　Ｃａｎ（、Ｃｅｌ 　Ｉ　Ｐｒｏｌ　ｉｆ、　ＩＯ：４U９− ｌＲ５ｆ　１９Ｆ１３）により記載されたようなプラスミドｐｓＶｔｋｎｅｏβ は、ゲネチシン耐性ｆｇｅｎｅｊｉｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を与えるも のであり、そのため、この実験において、コトランスフェクンヨ／に関するマー カーとして使用することができる。 コルサオ（Ｃｏｒｓａｏ）ら著、Ｓｏｍａｊｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅ ｎｅｔ　７：　６０３−６１６（１９８１）と同様であるが、同一でない方法に 従い、全ゲノムＤＮＡ及びプラスミドをコトランスフエクトした。該ゲノムＤＮ Ａ　（００μｇ）及びプラスミドＤＮＡ　（６μｇ）を、９４０μｌのＩｍＭ　 トリスｌ＋ｃ　ｌ　（１）Ｈ７，５）、Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡにおいて混合し、 その後３１０μｌのＩＭＣａＣ＋　２を加えた。この溶液を、一定の攪拌の下で 、１．２５ｍ１の２　ｘｉ（ＢＳ　（５０ｍＭＨＥＰＥＳ　、２８０ｍ　ＮａＣ ｌ　１．５ｍＭ　Ｎａ＋１ＩＰＯイ、Ｎａ０ＩＩを用いてｐｌ＋７．１に調整し た）にゆっくりと加えた。リン酸カルシウムＤＮＡ沈澱物を、３０〜４５分間、 室温において形成させ、その後、それをＩＯ％ウン胎児血清て補ったメラノーマ 培養培地（ダルベツコ改質イーグル培地）２２．５ｍｌにあらかしめ３　Ｘ　１ ０’　ＭＥＬ２．２細胞を２４時時間積した８０ｃｍ’組織培養フラスコに加え た。２４時間後、培地を元の位置に戻した。トランスフェクションの４８時間後 、細胞を採取し、２　ｍｇ／　ｍｌのゲネチシンを補ったメラノーマ培養培地に 、８０ｃｍ：のフラスコあたり４ｘｌＯ’の細胞を播種した。ゲネチンンを選択 マーカーとして提供した。 寒梅％１１６− トランスフェクションの１３日後、ゲネチンン耐性コロニーを計数し、採取し、 ２日又は３日間非選択培地において培養した。その後、トランスフェクトした細 胞を、２０％ウノ胎児血清（Ｆｅ２）を含む培養培地２００μｍに、２００細胞 ／ウエルの割合で、９６ウエルのミクロプレートにプレートし、ウェルあたり約 ３０の成長コロニーを得た。ミクロカルチャーの数は、過剰物が得られるような ものにし、すなわち、そのために谷非依存性トランスフエクタントは少なくとも ４回表されるへきである。 １０日後、ウェル（１杓６ＸＩＯ’細胞を含んでいｔこ。これらの細胞を取り出 し、各ミクロ力ルチギーの１．′３をデュブリケートプレートに移した。６時間 後、即ち、リートヒアレンス（ｒｅａｄｈｅｒｅｎｃｅ）の後、培地を除去し、 １５００の抗−Ｅ　ＣＴＬ（ＣＴＬ　８２／３０）を、３５Ｌｌ、’ｍｌの旧２ を含むＣＴＣ培養培養培地１００中後、上澄み（５０１１１）を採取し、以下の 実施例に述へる根拠について、ＴＮＦ濃度を試験した。 実物例１７ ＩＩＩｉ乳動物のゲノムの人きさは６＼１０″ｋｂである。各薬剤耐性トランス フェクト〉トに統合されたＤＮＡの平均量としては、約２００ｋｂであることが 予期され、最小量の３０．　０００トランスフエクタントが試験に必要とされ、 抗原Ｅがトランスフェクトされるか否かを確認した。ネズミ細胞を用いた先行研 究により、ＣＴＬ刺激アッセイを使用した時、興味深い抗原を発現するたった３ ％の細胞を含有するグループを確認できることが示された。これにより、３０の 要因によるアッセイの数が減少されるべきである。上記のように、混合したＥ″ ／Ｅ−細胞において、抗−Ｅ　ＣＴＬアッセイは有用であったが、一定の結果が 得られなかったことにおいては十分ではなかった。 その結果として、代わりの方法を案出した。ＣＴＬの刺激を、ここで繰り返す必 要のない周知の方法論を使用して腫瘍壊死因子（　）ＴＮＦ　Ｊ　）の放出によ り研究した。実施例１５に記載したように、トランスフェクシントのウェル当た り１５００のＣＴＬ　８２／３０細胞を加えた。これらＣＴＬを刺激の６日後に 収集した。上記のように、各ウェルにおいて１／３の細胞を取り出し、残りの２ ／３（４　ＸＩＯ’）をリードヒアした後、ＣＴＬ及びＩＬ−２をそれに加えた 。上澄み５０μＩを２４時間後に除去し、３ＸｌＯ’ＷＩ３　（ＷＥ）ＩＩ−１ ６１クローン１３．エスペビック（Ｅｓｐｅｖｉｋ）ら著、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．　Ｍｅｔｈ．　９５：９９−１０５（＋９８６）細胞を、５０μｌのＷ１３ 培養培地（１，−アルギニン（１１６ｍｇ／Ｉ）　、Ｌ−アスパラギン（３６　 ｍｇ／Ｉ）　、Ｌ−グルタミン（２１６ｍｇ／Ｉ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０ 及び２μｇのアクチノマインン０を補った１０％ＦＣ３　）において含有するミ クロプレートに８％ＣＯ□雰囲気中３７９４において移した。細胞系ＷＩ３は、 ＴＮＦに対して感受性のあるマウス線維肉腫細胞系である。ＲＰＭＩ　１６４０ における組み換えＴＮＦ−βの希釈溶液を標的細胞のコントロールに加えた。　 ２０時間のインキュベーションの後、Ｗ１３培養物を評価し、死んた細胞の百分 率を、ハンセン（Ｉｌａｎｓｅｎ）ら著、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ。 １１９：２０３−２１０（１９８９）の比色アッセイ適応（ａｎ　ａｄａｐｔａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ’）を用いて測 定した。これは、ＰＢＳ中２．　５　ｍｇ／　ｍｌにおいて５０ｍ１の（３−（ ４．　５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２．　５−ジフェニルテトラゾリ ウムプロミドを添加することを含み、その後２時間、３７℃においてインキュベ ーションした。暗青フォルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）結晶を、１００μｍの溶 解溶液（Ｉ容量のＮ，Ｎジメチルホルムアミドを２容量の３０°６（Ｗ／Ｖ）　 Ｆデンル硫酸ナトリウムを含有する水と混合し、１．６０６酢酸凌ひ２．５％ｌ ＮｌｌＣｌを用いてｐｌ＋４．　７にした。）をＩＩ］えることにより溶解した 。プレートを３７℃で一晩インキユベートし、ＯＤを５７０ｍｎで測定し、コン トロールにおいては６５０ｎｍを使用した。死んた細胞の百分率を以下の式によ り測定した。 これは、エスベビンク（Ｅｓｐｅｖｉｋ）ら著、Ｊ、１ｍｍｕｎ吐Ｍｅｔｈ、９ ５：　９９−１０５（１９８６）に従うものである。結果は、Ｅ　’　／Ｅ　細 胞の比率がＩ／４５であるくらいに低かった時でさえ、ＴＮＦの有意な生成物が 観察されることを示し、従って、活性なＣＴＬを示すものである。これは、３０ のグループにおける薬剤耐性トランスフェクトントを試験するための解決法を導 くものである。 実施例１８ 上記実施例１７において論議したように、細胞をＴＮＦ産生について試験した。 １００グループのＥ　細胞（４Ｘ　１０’細胞／グループ）の全部を、トランス フェクションの後に試験し、ｌグループ当たり平均７００てあって、７刈０４の 非依存性ゲネチシン耐性トランスフェクタントを得た。トランスフェクト（７た 細胞のたった一つのグループをミクロカルチャーに入れ、ＴＮＦを製造するため に抗−Ｅ抗原ＣＴＬクローン８２／３０を生成した。試験したクローン３００の うち、８つが陽性であった。 その後、これらのクローンを抗−Ｅ　ＣＴＬによる溶解について、標準″’Ｃｒ 放出アッセイを用いて試験し、それらは元の「細胞系と同様に効率的に溶解する ことが見出された、ここに論議したトランスフエクタントＥ、ＴＩは、抗原Ｂ、 Ｃ，Ｄ及びＦに対するＣＴＣについてＭＥＬ２．２か行ったのと同し溶解パター ンを有した。 たった一つのトランスフエクタントか７０．０００ゲネチ／ン耐性トランスフエ クタントから抗吟を示したという現実性は、非常に低いと最初は思われたが、そ れは違う、　ＰＨ１０に関する」本紀の研究は、平均的に１／１３．０００の頻 度を示した。ヒトＤＮＡ宿主ＭＥ１２．２は、円、　ｌｌＴＲよりも５倍低いＤ ＮＡを結合すると思われる。 実施例１９ い−、たん、トランスフエクタントＦ、ＴＩか見出されたならば、分析により、 細胞集団のＥ　不純物か生じるかとうかを含む幾つかの問題が処理されなければ ならなか−・た−　１、記の抗１９提示の分析により、Ｅ、ＴＩが宿主細胞ＭＥ Ｌ２．２と同様にＢ　及びＣであることが示される。また、標準選択方法を用い て、ＨＰＲＴ−であることも見出された。しかし、ここに記載した研究に使用し たすべてのＥ＋細胞はＨＰＲＴ’であった。 ＭＥＬ２．２のＥ′復帰突然変異体はＥ、ＴＩの源であることも可能であった。 これを試験するために、コトランスフェクトされた配列は宿主ゲノムの単一の位 置において一緒に通常結合されるというペルチａ　（Ｐｅｒｕｃｈｏ）ら著、Ｃ ｅ１ｌ　２２＋３０９−３１７（１９８０）による観察を使用した。もし、トラ ンスフエクタントにおける抗原ＥがｐｓＶｔｋｎｅ。 βを用いたコントランスフエクソヨンから生じるならば、その後、配列は結合さ れるべきてあり、抗原の遺伝子欠失は、隣接のｐｓＶｔｋｎｅｏβ配列を削除す るかもしれなかった。ウォフエル（Ｗｏｆｅｌ）ら著、上記参考文献は、このこ とを真実であると示した。もし、正常Ｅ−細胞がｐｓＶｔｋｎｅｏβてトランス フェクトされるならば、その後配列は結合されるべきてあり、抗原の欠失は、隣 接のｐｓＶｔｋｎｅｏβ配列を削除するかもしれなかった。しかし、もし、ｐＳ Ｖｔｋｎｅｏβてトランスフェクトした正常Ｅ”細胞がＥ、ＴＩであるならば、 ［共遺伝子欠失（ｃｏ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）　Ｊは起こるべきてなかった。これ を試験するために、トランスフエクタントＥ、　ＴＩを上記のように、８２／３ ０を用いた免疫的選択にあてた。このＣＴＬによる溶解に抵抗した二つの抗原損 失変異体が得られた。これらのとれもゲネチンン耐性を失わなかったが、サイン ブロノト分析は、変異体における幾つかのｎｅｏ　’配列の損失を示した。これ は、Ｅ、ＴＩにおけるＥ遺伝子とｎｅｏ　’遺伝子の間の緊密な結合を示すもの であり、Ｅ、ＴＩかトランスフエクタントであることを結論として導くものであ る。 実施例２０ Ｅ”サブクローンＭＺ２−ＭＥＬ・ＩＢを、コスミドライブラリーの作製のＤＮ Ａの源として使用した。上記のコスミトトランスフエクションプロトコールに従 って、約７００、０００コスミドのこのライブラリーをＭＺ２−ＭＥＬ　２．２ の細胞にトランスフェクトしたつ λフアージコンポーネントに直接コスミトトランスフエクタントのＤＮＡをバッ ケーシングすることにより、重要な配列を含むコスミドを回収することが時々可 能である。この方法はここでは成功しなかったので、我々はコスミドベクターｐ Ｔ１．６の適切な制限断片にトランスフエクタントのＤＮＡを結合することによ りトラ１．・スフエクト配列を救済することにした。これには、二つのトランス フエクタントを用いてｔａｔｔし、これらのうちの一つが成功した。Ｂａと呼ば れる一つのコスミトをこの実験から回収し、Ｘｍａｌ又はＢａＩｎＦ１１消化に より制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、大きな１２ｋｂ　Ｘｍａｌ　トランス フェクト断片を得た。該断片をベクターｐＴｚ＋８Ｒにクローン化し、そのｌ’ ｔｌＥＬ２．２にトランスフェクトした。再びＴＮＦ産生を１１１１定し、成功 したトランスフェクションを決定した。実験により、１２ｋｂ　Ｘｍａｌ断片、 その後、＋２ｋｂのセクメントのＲａｍ旧消化物の２．４ｋｂ断片において、抗 原Ｅをトランスフェクトすることができる遺伝子配列を決定した。 ２、４ｋｂ断片を、Ｍ２２−ＭＥＬから得た２、　４ｋｂ断片及び磨者〜ＩＺ− ２ノＴ細胞クローンと・・イブリダイスし、サインブロノト（Ｂａｍｌ（ｌ／Ｓ ｍａｌ消化ＤＮＡ　）により測定した。このバンドは、図１２に見られるように ＭＺ２−ＭＥＬのＥ゛抗１ｉ；ｉ損失変異体にはないつし抗原前駆体遺伝子に関 する配列を決定した。それを以下に示すっコ・：ｌ　ＪＬ？Ｗ、ｉ−にユＧζ＾ ；−シ１−二為二？？：ゴ：？：ｉ−，ａｉｌｌ；、−−１ムーχπｈＡＧＡＧ 　ｔ−ｉＧ？ｖ−、、浴@畠！コ ２０：　Ｃ＝＝１Ｇ−、ａ　６？に１１ａ社−９ｃｌシ１コーム　為艶＝−晶入 ＝℃１ごにス＝λ：＝１ｉμケζ＝＝に二本２ｚ；！；ユニｉＪｈり一一：ｉヲ ＝フ一λ＞；ＡＯｃ？Ｇ−Ｊ−（ｒｉＣｈ−−、Ｊ−Ｌ）ｔ＝シー飄＆＝−ｉ口 に；＝ノームシー五ｔｒデｅ■H１−＝ＪＪ１−Ｃ１に＝：を為ばコζ−コ：コ １ｚ２２ｇ１１−−−に７二人Ｗ、ＧｋＧＧ６ζ＝１ＧｈＪ：ｒＯＣ７１「ｉ− ；；コこｒコ）；テつλＧ為シゴ１に：六−１にＧｙｃ’ｒ−−魔宴V；：２コ ４； 実施例２１ ２．４ｋｂゲノム断片を同定した後、「Ｅ゛」サプラインがいずれかの相同ＤＮ Ａを発現するか否かを測定する研究を行った。細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０を源 として使用し、ｃＤＮＡライブラリーを、当技術分野に公知の技術を使用して、 そのｍＲＮＡから製造した。２．４ｋｂ断片をプローブとして使用し、約１．８ ｋｂのｍＲＮＡを、ノーインブロソト分析を使用して相同性と同定した。ｃＤＮ Ａをスクリーニングした時、２．４ｋｂ断片の一部とほとんと完全に同一である ことを示すクローンを得た。従って、二つのエクソンが同一であった。２．４ｋ ｂ　Ｂａｍ旧断片の前に置いたコスミドＢ３の断片の配列を決定することによ頃 追加のエクソンをこれらの上流側に置いた。該遺伝子は、図８に示すように約４ ．５ｋｂ以上に広がっている。転写領域の出発位置は、ｃＤＮＡの５゛末端に関 するＰＣＲを用いて確実にした。３つのエクソンは、６５．７３及び１５５１塩 基対を含むものである。ＡＴＧは、エクソン３の位置６６に位置し、枠を読む８ ２８塩基対が続く。 ！部課−２− ２，４ｋｂ断片のより小さな断片が、抗原Ｅの発現を移入することができるが否 かを測定するために、当技術分野に認識された技術を用いて、より大きな遺伝子 に相当するより小さな片を作製し、Ｅ　細胞に移入した。図８は、３つの断片の 境界（ｂｏｕｎｄａｒｙ）を示しテイル。 この方法における抗原発現の移入は、この遺伝子が、抗原を活性化するタンパク 質をコードするよりもむしろ抗原前駆体についてコードすることを示している。 実施例２３ 驚くへきことに、−１二記ｃＤＮ＾のブロービングにより、二つの異なっている が緊密に関連したｃＤＮＡか示された。試験した時、これらのｃＤＮＡは、抗原 Ｅの発現を移入しなかったが、それらは第一のｃＤＮＡ断片に対する実質的な相 同性を示した。３つの断片は、「メラノーマ抗原」についてｒＭＡＧＥＪと呼ば れる、遺伝子の新しく認識されたファミリーを示すと思われる。図９において、 ｒｍａｇｅ−１１は、ＭＺ２細胞由来の抗原の発現を示している。各遺伝子の第 ３のエクソンの位置を、図９に示す、第２及び第３の配列は、第１のものよりも 互いにより緊密に関連している（第１Ｉ２０６に比へて■いに１８．１及び１８ ．９％の差異）。得られた９　ｃＤＮＡクローンのうち、同し発現を示す３つの 各タイプが得られた。以下に、使用したｒＭＡＧＥＪは、分子のファミリー及び それらをコードする核酸をいうものである。これら核酸は、一定の程度の相同性 を与え、ヒト腫瘍細胞の幾つかのタイプを含有する腫瘍細胞及びヒト腫瘍細胞に 発現する。第一のメンバーがヒトメラノーマ細胞において同定されるので、その ファミリーはＩＭＡＧＥＪといわれる。しかし、以下の実験が示すように、ＭＡ ＧＥファミリーのメンバーは、メラノーマ腫瘍に少しも限定されない、むしろ、 ＭＡＧＥは、腫瘍拒絶抗原前駆体のファミリー及びそれらをコードする核酸配列 をいう。それらから得られた抗原を、ここては、ｒＭＡＧＥ　ＴＲＡＪ又は「メ ラノーマ抗原腫瘍拒絶抗原」という。 実施例２４ マウス腫瘍を用いた実験は、Ｔ−細胞により認識された新しい抗原が、領域にお いて活性化遺伝子を改質する点突然変異から生し、それが新しい抗原ペプチドを コードすることを示した。新しい抗原を、最も正常な細胞において発現されない 遺伝子の活性化から生成することができる。抗原ＭＺ２−ＩＥに関するこの組織 を解明するために、メラノーマ細胞に存在するｍａｇｅ−１遺伝子を患者ＭＺ２ の正常細胞に存在するしのと比較した。 ？、４ｋｂ断片の第一の半分をカバーする＋３００ｂｐの長さを囲っているプラ イマーを使用して、フィトヘムアグルチニン活性化血液リンパ球のＤＮＡのポリ メラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による増幅を行った。予期されたよう に、ＰＣＲ生成物か得られたが、Ｅ−変異体のＤＮＡではなにも得られなかった 。このＰＣＲ生成物の配列は、Ｅ゛メラノーマ細胞保持される遺伝子に相当する 配列と同一であることか証明された。さらに、抗原ＭＺ２−３は、クローン化し たＰＣＲ生成物でトランスフェクトした細胞により発現したことが見出された。 この結果は、通常不活動な遺伝子の活性化が、腫瘍拒絶抗原ＭＺ２−Ｈの出現の 原因となることを示している。 実施例２５ 様々な正常及び腫瘍細胞による遺伝子ｍａｇｅ−１の発現を評価するために、第 三のエクソンのほとんとをカバーするプローブでハイブリダイズし、ノーインブ ロツ１−を行った。ヒト腫瘍細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ　３．　Ｏて観察した結果と 対照的に、患者ＭＺ２のＣＴＬクローン及び同し轡者のフィトヘムアグルチニン 活性化血液リンパ球から単離したＲＮＡてはバンドは観察されなかった。また、 他の個体の幾つかの正常組繊は陰性であった（図１０及び図１１）。他の患者の １４のメラノーマ細胞系を試験した。様々な強度のハンドを示して、ＩＩのもの か陽性であった。これらの培養細胞系の池に、メラノーマ腫瘍組織の４つのサン プルを分析した。遺伝子の発現が組織培養アーチファクトを示すという可能性を 除いて、患者ＭＺ２の転移を含む二つのサンプルが陽性を示した。肺の腫瘍を含 む他の組織学的タイプの２、．３の腫瘍を試験した。これらの腫瘍のほとんどは 陽性であった（図１Ｏ及び図１１）。これらの結果は、ＭＡＧＩ’：遺伝子ファ ミリーが幾つかのメラノーマ及びさらに他の腫瘍により発現することを示した。 しかし、遺伝子ｍａｇｅ〜ｌ、２又は３に相当するＤＮＡプローブを考えられる 範囲まで交雑ハイブリダイズしたので、３つの遺伝子がこれらの細胞により発現 されることに関しては明らかに指摘されなかった、この分析をより明らかにする ために、ＰＣＲ増幅及び高い特異性のあるオリゴ−ヌクレオチドプローブを使用 した。ｃＤＮＡが得られ、ここで論議した３つのＭＡＧＥ遺伝子と同一のエクソ ン３の配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲにより増 幅した。その後、ＰＣＲ生成物を、３つの遺伝子の一つについて完全な特異性を 承ず３つの他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするそれらの可能性につい て試験した（図９）。陰性の細胞由来のＲＮＡにおけるメラノーマＭＺ２−ＭＥ Ｌ３．　ＯのＲＮＡを希釈することにより行ったコントロール実験は、ここに使 用した条１″Ｆの丁、／グナルの強さか希釈液に比例して減少したこと及び陽性 のシグナルか１　／３００の希釈液においてちまた検出てきることを示した。Ｐ ＣＲにより試験した正常細胞（リンパ球）は、３つのＭＡＧＥ遺伝子の発現に関 して陰性であることか確証され、それ故に、ＭＺ２メラノーマ細胞系の１／３０ ０より少ない発現レベルを示すものである（図１１）。メラノーマ細胞系のパネ ルに関して、結果は、他がｍａｇｅ　２及び３を発現したのみであるのに対し、 幾つかのメラノーマかＭＡＧＥ遺伝子のｍａｇｅｌ　、　２及び、３を発現した ことを明らかに示した（図１１及び１０）。他の１１１瘍の幾つからまた、３つ すべての遺伝子を発現したのに対し、池のものはｍａｇｅ２７４び、１のみ又は ｍａｇｅ３のみを発現した。いくつかの陽性ＰＣＲ結果は、プライミンゲ支ひバ イブ１１ダイスするオリゴヌクレオチドの配列を共有する池の緊密に関連した遺 伝丁以外の３つの特徴的な〜ＩＡＧＥ遺伝子の一つの発現を示さないことを、形 式的に除外することは不可能である。ＭＡＧＥ遺伝子ファミリーは異なる腫瘍の 大きな配列により発現されること及びこれらの遺伝子はこの点について試験され る正常細胞において不活動性であることが推論できる。 実施例２６ 高率でトランスフェクトし、ＴＲＡＰを効率的に発現する配列の入手可能性は、 関連した主要組織適合抗原遺伝子（ＭＩＩＣ）クラス１分子の探索を可能にした 。患者１１１Ｚ２ツクラス！特異性は、ＩＩＬＡ−Ａｌ、Ａ２９　、Ｂａ７　、 Ｂ４４及びｃ６テある。ＭＺ２と一緒にＡ１を有する患者の４つの他のメラノー マを、２．４ｋｂ断片及びｐｓＶｔｋｎｅｏβでコトランスフエクトした。それ らのうちの３つは、ＣＤＢ＋である抗−Ｅ　ＣＴＬクローン８２／３０によりＴ ＮＦ　放出を刺激したｎｅｏｌ−ランスフエクタントを生した（図１０）。 Ｅ　トランスフェクトントは、４つの池のメラノーマにより得られず、それらの 幾つかはＭ７２と共にＡ２９　、Ｂ伺又はｃ６を共存した。これは、抗原ＭＺ２ −Ｅに関する提示分子かＨＬＡ−Ａｌであることを示唆するものである。確認と して、ＨＬＡ−ＡＩ患者の腫瘍から誘導される６つのメラノーマ細胞系の中の、 ２つが患者ＭＺ２の抗−Ｅ　ＣＴＬクローン８２／３０によりＴＮＦ放出を刺激 したことが見出された。これら腫瘍細胞系の−っであるＭＩ＋３４４３−ＭＥＬ は、これら抗−Ｅ　ＣＴＬによる溶解に高い感受性を示した。 これら２つのメラノーマは、ｍａｇｅ−１遺伝子を発現したものであった（図１ ３）。 Ａ１を含まなかった１（μハブロタイブを有する患者の８つのメラノーマを、溶 解に対するそれらの感受性及びＣＴＬによる刺激ＴＮＦ放出に対するそれらの能 力につぃて試験した。陽性のものは見出されなかった。原腫瘍と共に好適な１化 Ａ特異性を共有する同種腫瘍を溶解するいくつかのヒト抗−腫瘍ＣＴＬの能力は 、前に記載された（グロー（Ｄａｒｒｏｗ）ら著、Ｊ。１ｍｍｕｎｏ１．１４２ ：３３２９（＋９８９））　。遺伝子ｍｇｅ２及び３によりコート化された抗原 ペプチドを、）ＩＬＡ−ＡＩ又は他のクラス１分子により自己ＣＴ１．に提示す ることができることは、具体的には、上に詳説したようにネズミ腫瘍を用いて見 出された同様の結果からみて、はとんと可能である。 寒寒西芙り 上記のように、メラノーマＭＺ２は抗原Ｆ、Ｄ及びＡ′さらに抗原Ｅを発現した 。 抗原Ｅをコードする核酸配列の単離の後に、同様の実験を行い、抗原Ｆをコード する核酸配列を単離した。 これを行うために、細胞系ＭＺ２−ＭＥ１２．２の培養物、上記Ｂ−細胞系を、 抗−Ｅ　ＣＴＬクローンを用いて処理する為に記載した同し方法において、抗− Ｆ　ＣＴＬクローン７６７６を用いて処理した。これによりＦ抗原損失変異体が 単離され、その後、いくつかのラウンドの選別にかけた。得られた細胞系ｒＭＺ ２−ＭＥＬ２．２．５Ｊは、抗−Ｆ　ＣＴＬによる溶解に完全に耐性であったが 、抗−〇　ＣＴＬにより溶解することが確かめられた。 再び、抗原−Ｅ前駆体ＤＮＡの単離について示したプロトコールに従って、Ｆ− 変異体を、Ｆ′細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０由来のゲノムＤＮＡでトランスフェ クトした。実験により、９０．０００の薬剤耐性トランスフェクトントを生じた 。これらを、上記に詳述したＴＮＦ検査アンセイにおいて、３０細胞のプールを 使用することにより、ＭＺ２−Ｆ発現について試験した。一つのプールは、抗− Ｆ　ＣＴＬによりＴＮＦ放出が刺激され、クローン化された。１４５クローンの うちの５つは、抗−Ｆ　ＣＴＬを刺激することが見出された。、ｌ本紀プロトコ ールに従って行った溶解アッセイにより、（ｉ）抗原Ｆをコードする遺伝子の発 現及び（１１）抗原Ｆ自身の提示が確認された。 実施例２８ Ｆ”細胞系の同定の後、そこから得たＤＮＡを、細胞をトランスフェクトするた めに使用した。これを行うために、再び上記プロトコールを使用し、Ｆ゛細胞系 ＭＺ２−ＭＥＬ、　４３のコスミトライブラリーを作製した。ライブラリーを約 ５０．０００コスミドの１４グループに分け、各グループのＤＮＡをＭＺ２−Ｍ ＥＬ２．２．５にトランスフェクトした。その後、トランスフェクトントを、抗 −Ｆ　ＣＴ１．クローン７６７６からのＴＮＦ放出を刺激するその能力について 試験した。コスミドの１４グループのうち、１つは抗原Ｆを発現する２つの独立 トランスフェクトントを生した。　１７．５００ゲニチシン耐性トランスフエク タントのうち２つか陽性であるという収率てあった。 実施例２つ 遺伝ｒファミリーの存在を、サインブロノトにおいて観察されたパターンにより 示した（図１２）、これを行うために、抗原Ｍ２２−Ｈの発現を移入した２、４ ｋｂ　Ｂａｍ１１！断片を３２ｐで標識し、Ｅ（クローン化サブクローンＭ２２ −ＭＥＬ２．２のＢａｍ１ｌ　Ｉ消化Ｄ）Ｊへのササンブロノ］・においてプロ ーブとして使用した。ハイブリダイゼーション条件としては、５０７ｚｌ／ｃｍ ’の３．５　Ｘ５ＳＣ、ｌ　Ｘデンハーツ（Ｄｅｎｈａａｒｄｔ’　ｓ）溶液： ２５ｍＭリン酸ナトリウム緩南液（ｐＨ７，０）　、０．５％ＳＤＳ、　２　＋ ｎＭ　ＥＤＴＡを含み、ここて２．４ｋｂプローブを、［α”ｐｌｄｃＴＰ　（ ２−３０００Ｃｉ１モル）により、３　ｘ　１０’ｃｐＩＩｌ／ｎｌで標識した 。ハイブリダイゼーションを１８時間、６５℃において行った。この後、膜を６ ５℃で、それぞれ１時間、２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳにおいて４回洗い、最 後に、３０分間、Ｏ，！　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＯ３において洗った。ハイブリ ダイゼーションを確認するために、膜を、コダックＸ−ＡＲフィルム及びコダッ クＸ−オマティックファイン増強クリーンを使用してオートラジオグラフ化した 。 以下の実施例において、［ハイブリダイゼーション」という時はいつでも、使用 した厳格な条件は上記のものと同様であった。ここに使用した「厳格な条件」と は上記の条件をいい、決まりきった当技術分野に認識される改良が行われるとｍ ａｇｅ４をコードするｃＤＮＡを、ヒトサルコーマ細胞系ＬＢ２３−３ＡＲのサ ンプルから同定した。この細胞系はｍａｇｅｌ　、２又は３を発現しないことが 見出されたが、細胞系のｍＲＮＡは、ｍａｇｅｌに関する２、４ｋｂ配列にハイ ブリダイズした。さらにこれを研究するために、ｃＤＮＡライブラリーを全ＬＢ ２３−５ＡＲｍＲＮＡから作製し、その後２．４ｋｂ断片にハイブリダイズした 。ｃＤＮＡ配列を、このプローブにハイブリダイズして同定し、以後、ｍａｇｅ ４という。 実施例３１ 也者）ＭＺ２　Ｊ由来のＰＩＩＡ−活性リンパ球を使用し、実験を行った。ｒＭ Ｚ２　Ｊは上記ＩＭＺＩ細胞の源である。ｍａｇｅｌに相同性を示したが、ｍｇ ｅ２又は３には示さなかったオリゴヌクレオチドプローブをＰＨＡ活性化細胞か ら誘導したコスミドライブラリーを用いてハイブリダイズした。しかし、ハイブ リダイジングＢａｍ１−１ｔコスミト断片のサイズは４．５ｋｂてあり、それゆ えに該物質がｍａｇｅｌてなかったことを示していた；しかじ、ｍａｇｅｌ−４ に対する相同性に基づき、該断片をｒｍａｇｅ５　」と呼ふことがてきる。ＭＡ ＧＥ５の配列を配列番号１６に示す。 実施例３２ メラノーマ細胞系ＬＢ−３３−ＭＥＬを試験した。該細胞系由来の全ｍＲＮＡを 使用し、ｃＤＮＡを作製し、オリゴ（ｏｌｉｇｏ）　ＣｌＯ２：（ＡＣＴＣＡＧ ＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡ’口Ｔ）及びＣ）ｔｏ　１０　：　（ＧＡＡfＡ ＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡＧ）を用いて増幅した。これらのオリゴは、前に記載し たｍａｇｅｌ　、２及び３に共通するエクソン３の領域に相当する。 これを行うために、１８ｇのＲＮＡを全量２０μｍに、２μｇの１０　Ｘ　ＰＣ Ｒ緩衝液、２ＢＩの各１０ｍＭｄＮＴＰ　、　１．２　ｌｌｌの２５ｍＭＭｇＣ １２、Ｉμｌの８０ｍ！ｉｔの上記ＣＨＯ９溶液、２０ユニ・ｌトのＲＮＡ５ｉ ｎ及び２００ユニツトのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて希釈した。その後、これ を４０分間、４２℃でインキュベーションした。８７１１の１０　Ｘ　ＰＣＲ緩 衝液、１．８７１１の２５ｍ１ｉ！　ＭｇＣｌ＋、＋７ｚｌのＣｌｌ０ＩＯ，２ ，５ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ　ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ（ｒＴａｑ　Ｊ）ポリメ ラーゼ及び全量を１００７１１にするための水を使用して、ＰＣＲ増幅を行った 。その後、増幅を３０サイクル（１分間、９４°Ｃ１２分間、５２℃、３分間、 ７２℃）行った。その後、各反応の１０μｍをアガロースゲル上でサイズにより 分別し、その後、ニトロセルロースブロッティングを行った。オリゴヌクレオチ ドプローブＣＨＯＩ８　（ＴＣＴｒＧＴＡＴＣＣＴＧＧ八ＧＴＣＣ）と／％（ブ リへイズすルコトヲ見出シタ。 このプローブは、ｍａｇｅ２又は３てはなく、ｍａｇｅｌと同定した。しかし、 該生成物は、プローブ配列４　（ＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡ）にハ イブリダイズしなかった。このプローブは、ｍａｇｅ２及び３てなく、ｍａｇｅ ｌを結合する。これは、ＰＣＲ生成物がｍａｇｅｌ　、２及び３とは異なった配 列を含むことを示していた。この断片の配列決定は、ｍａｇｅｓ及び５に関して 差異を示した。これらの結果は、あらかじめ同定されたｍａｇｅｌ　、２．３． ４及び５とは異なる配列を示し、ｍａｇｅ６と命名した。 衷轡例ユニ ｖ７．２のｌ’１ｌＡ−活性化リンパ球由来のコスミドライブラリーを使用した 追加の実験において、２．４　ｋｂ　ｍａｇｅ　ｌ断片をプローブとして使用し 、相補的断片を単離した。 しカル、このクローンは、ｌＴｌａｇｅｌ、２．３又は４に特異的なオリゴヌク レオチドに結合しなかつたつ得られた配列は、ｍａｇｅｌのエクソン３に対して 、ある程度の相同性を示し、ｍａｇｅｌ−６とは異なるものである。以後、ｍａ ｇｅ７と呼ぶ。追加のスクリーニングによりｍａｇｅ８−１１を生成した。 実施例３１ ＴＲＡＰ及びそれらから誘導されたＴＲＡの有用性を、以下により例証する。 ｍａｇｅｌのエクソン３は、抗原Ｅの発現を移入することを示した。その結果と して、このエクソン３から誘導された合成ペプチドが、抗−Ｅ　ＣＴＬに対する 感受性を′ｊえるために使用できるかとうかを試験することにした。 これを行うために、標準プロトコールを使用して、抗−Ｅ／ＣＴＬに対して一般 的に感受性の細胞を、エクソン３．１から誘導した合成ペプチドを用いてインキ ュベートした。Ｐ８１５Ａにおける上記のＣＴＬ溶解アッセイ及び３ｍＭのペプ チド濃度を使用し、ペプチドＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ −Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｙｒがベストであることを示した。該アッセイは、抗−Ｅ 　ＣＴＬに対して感受性を与えることを示す３０％の溶解ｒｓｗｔａｇｅ　Ｊと いわれる核酸配列を、ネズミ細胞から単離した。上記プロトコールを使用して、 コスミドベクターＣ２ＲＢを使用して、コスミドライブラリーを正常ＤＢＡ／２ 腎臓細胞のＤＮＡから製造した。プローブとして、ＭＡＧＥ−１の２．４　ｋｂ 　ＢａｍＨｌ断片を使用した。ＤＮＡをナイロンフィルターにプロットし、これ らを２　Ｘ５ＳＣにおいて、６５℃で洗い、ｓｍａｇｅ物質を同定した。 実施例３６ さらに、組織サンプルを、上記プロトコールを使用して、ＭＡＧＥ遺伝子の存在 について試験した。これらの結果のいくつかを以下に示す。 ＭＡＧＥ遺伝子の発現は、脳又は腎臓の腫瘍組織には見られなかった。結腸腫瘍 組織はＭＡＧＥＩ　、２．３及び４の発現を示したが、試験したすべての腫瘍が すべての１１１ＡＧＥ遺伝子の発現を示したのではない。これは、膵臓の腫瘍（ ＭＡＧＥＩ）；非小細胞肺（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ）（ＭＡ ＧＥＩ　、２．３及び４）、前立腺（ＭＡＧＥＩ）　、サルコーマ（ＭＡＧＥＩ 、２．３及び４）、胸部ＯＭＧＢ＋、２及び３）及び喉頭（ＭＡＧＥＩ及び４） に関してもまた真実である。 実施例を含む上記開示は、当業者の支配下において極めて価値のあるいくつかの 手段を提起するものである。まず、実施例は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする 核酸分子及びそれらに相補的な核酸分子を単離するための方法論を確認し、提供 する。ＤＮＡは二重鎖の形態において存在すること及び二つの鎖のそれぞれが互 いに相補的であることが知られている。核酸ハイブリダイゼーションテクノロジ ーにより、当業者がその補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を単離することができる か又はそれを合成することができるＤＮへの鎖を与えるという点が開発された。 ここに使用した「核酸分子」とは、上記の特性を有するＤＮＡ及びＲＮＡのすべ ての種類をいう。ゲノム及び相補的ＤＮＡすなわちｒｃＤＮ＾」は両方とも特定 のタンパク質をコードし、ＭＡＧＩｌ！コード配列の単離に関する実施例が示す ように、この開示は、これらの両方をどのように獲得するかを当業者に教示する ものである。 同様に、ＲＮ＾分子、例えばｍＲＮＡを獲得することができる。 さらに、当業者に対する参考として述べると、自由にできるコード配列をいった ん持てば、ｍＲＮＡを単離するか合成することができる。 ＴＲＡＰをコードしない相補的配列、例えば［アンチセンスＤＮＡ　Ｊ又はｍＲ ＮＡは、例えば、そのコード配列のブロービング及びその発現を遮断する方法論 において有用である。 該実施例が、ＴＲＡＰ分子をコードするか発現する核酸配列でトランスフェクト された細胞系の生物学的純粋培養物の製造を示すことが明らかとされるであろう 。 そのような培養物は、例えば腫瘍拒絶抗原の源、すなわち治療法として使用する ことができる。本発明のこの態様を以下に論じる。 ＴＲＡＰコード配列でトランスフェクトした細胞を、他のコート配列によりトラ ンスフェクトしてもよい。池のコード配列の例としては、サイトカイン遺伝子、 例えば、インターロイキン（例えばＩＬ−２又はＩＬ−４）又は主要組織適合抗 原複合体（Ｍｌ（Ｃ）又はヒト白血球抗原（＋＋［、Ａ）分子があげられる。サ イトカイン遺伝子のトランスフェクションは、これらの発現により、ｉｎ　ｖｉ ｖｏにおける細胞の生物学的純粋培養物の治療効率が高められることが期待され るので、価値がある。この技術は、インターロイキントランスフエクタントを癌 状態の治療に患者に投与する治療についてよく知られている。特に好ましい態様 において、細胞は、（ｔ）　ＴＲＡＰ分子、（ｉ団ＩＬＡ／ＭＩＩＣ分子及び（ ｉｉｉ）サイトカインのそれぞれをコードする配列でトランスフェクトされる。 一定のＴＲＡが特定のＭＨＣ／ＩＩＬＡ分子によってのみ優先的に又は特異的に 発現してもよいので、！４ＩＣ／１（ＬＡコード配列を用いたトランスフェクシ ョンは望ましい。従って、宿主細胞が、ＴＲＡの提示に関連するＭＩＩＣ／ＨＬ Ａ分子をすてに発現している場合、追加のトランスフェクションは必要とされな くてもよいが、さらなる軽質転換を使用して抗原の過剰発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ）を引き起こすことができる。一方、宿主細胞が関連したＭＩＩ Ｃ／ＩＩ１．Ａ分子を一般的に発現しない時、第二の配列てトランスフェクトす ることが望ましいかもしれない。当然のことだが、一つの追加の配列によるトラ ンスフェクションは、他の配列によるさらなるトランスフェクションを妨げない ことは理解されるべきである。 ここに記載した細胞系に関して使用した［生物学的純粋」とは、他の細胞から本 質的にフリーなものを単に意味している。厳密に言えば、定義による「細胞系」 は「生物学的純粋Ｊであるが、詳説はこれを充分に証明するであろう。 細胞のトランスフェクションは、好適なベクターを使用することを要求とする。 従って、本発明は、重要なＴＲＡＰのコード配列をプロモーターに操作可能に結 合する発現ベクターを包含する。プロモーターは強力なプロモーター、例えば、 当技術分野に周知のもの、あるいは特異的プロモーター、即ち、特異的細胞型に のみ作用するものであってもよい。発現ベクターは、ウィルス性又は細菌性ゲノ ム、例えば牛痘ウィルス又はＢＣＧの全て又は一部を含んでもよい。そのような ベクターはワクチンの製造に特に有用である。 ＴＲＡＰ配列が含まれるならば、発現ベクターは、幾つかのコード配列を含んで もよい。上記のサイトカイン及び／又はＭＨＣ／ＨＬＡ遺伝子は、ＴＲＡＰ配列 と一緒に単一のベクターに含まれてもよい。これが望ましくない場合、その後発 現システムを提供してもよく、それは二つ以上の分離ベクターを使用し、各コー ド配列をプロモーターに操作可能に結合する。さらに、該プロモーターは強力な 又は特異的なプロモーターであってもよい。コトランスフエクションは周知の技 術であり、当業者は、利用のために入手可能なこの技術を持つことが期待される 。ベクターを、ＴＲＡＰ分子よりもむしろＴＲＡ分子を直接コードするように構 築してもよい。これは、翻訳後プロセッシングの必要性を排除する。 上記の論議から明らかなように、［主要拒絶抗原前駆体Ｊ　（ｒＴＲＡＰ」）を コードする配列は、その後、主要拒絶抗原（ｒＴＲＡ　Ｊ）にプロセラソングさ れる。これらのカテゴリーの両方の単離された形態を、それぞれの特異的な例を 含めてここに記載した。恐らく、それらの最も顕著な態様は、様々な癌状態を処 理するためのワクチンである。その証拠としては、腫瘍細胞上のＴＲＡの提示、 その後の免疫応答の進展及び細胞の抹消が示される。様々なＴＲＡを細胞に投与 する時、ＣＴＬ応答が高まり、提示細胞は消去される。これは、ワクチンの作用 特性であり、それゆえにＴＲＡに加工されるＴＲＡＰ　及びＴＲＡを、それ自体 又は医薬として好適な組成物において、ワクチンとして使用してもよい。同様に 、提示細胞を、単独で又は医薬組成物を生成する成分と合わせたものとして、同 じ方法において使用してもよい。ワクチンとして使用してもよい追加の物質とし ては、表面にＴＲＡ分子を提示する単離細胞（ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ）　 、及びＴＲＡＰ断片、突然変異ウィルス、具体的には活力のない形態のもの、及 びトランスフェクトした細菌があげられる。ここに使用した「断片」とは、ＴＲ Ａより小さいペプチドをいうが、上記のようなワクチンに要求される性質を有す るものをいう。他のワクチンは、ＴＲＡとＨＬＡ分子の慢合体を含むか又はそれ らからなる。ここに記載したタイプのワクチンを予防、即ち、癌状態の発症を予 防するのに十分な量を患者に投与することによって使用してもよい。 Ｔ−細胞又はＢ−細胞に関連した免疫応答の発生は、提示された腫瘍拒絶抗原の 効果に特徴的なものである。Ｂ−細胞応答に関していえば、これは、なかでもＴ ＲＡに対する抗体の発生、即ち、それらに特異的に結合するものを含む。さらに 、ＴＲＡＰ分子はそれらを免疫原性にするのに十分な大きさのものであり、それ らに特異的に結合する抗体は、本発明の一部である。これらの抗体はポリクロー ナル又はモノクローナルであってもよく、後者はここで繰り返される必要のない それらの製造に関して十分に認識された方法論のいずれかにより製造される。例 えば、ｍＡＢを動物モデル、例えばＢａ１ｂ／Ｃマウスを使用するか、あるいは 試験管内において、ＥＲＶ形質転換株を使用して、製造してもよい。さらに、抗 血清を、一定の細胞がＴＲＡを提示する癌疾患也者から単離してもよい。そのよ うな抗体は、ＴＲＡ及びＨＬＡ／ＭＨＣ分子の相互作用により定義されるエピト ープに対して生成されてもよい。 １−記の論述は、　［腫瘍拒絶抗原の提示及び認識」と呼ぶことができるシステ ムに多くの面があることを示すてあろう。これらの事象の認識は、診断に役立つ というｌ性を有する。例えば、特異的ＣＴ１．クローン又はＴＲＡに対する抗体 の存在により癌状態の診断又はモニター（以下に説明する）が可能となり、それ は患者のサンプル中のＣＴＬ　、　ＴＲＡへの抗体の結合又は患者のサンプルに 関連した抗−ＴＲＡＣＴｌ、活性をモニタリングすることによる。同様に、ＴＲ ＡＰに関する核酸分子の発現は、増幅（例えは、［ポリメラーゼチェーフリアク ション」）、アンチ−センスハイブリダイゼーション、プローブテクノロジー等 によりモニターすることができる。体液（例えば血液、血清、他の滲出液）、組 織及び腫瘍を含む様々な患者のサンプルをそのように分析してもよい。 診断の具体的な方法は、結核の診断に一般的に使用される標準「ツベルクリン試 験Ｊの適合を用いるものである。この標準皮膚試験では、診断の補助として［精 製ツベルクリンＪ即ちｒＰＰＤ　Ｊの安定した形態を投与する。同一方向の方法 においては、本発明によるＴＲＡを、診断補助又はモニタリング方法としてその ような皮膚試験に使用してもよい。 「癌状態（ｃａｍｃｅｒｏｕｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）　Ｊという語は、癌の初 発で開始し、最終的に臨床的な症状発現を生じるというすべての生理学的事象を 含むものとしてここに使用する。腫瘍は、目にみえる腫瘍として「最初から」生 じるのではなく、むしろそれには正常細胞の悪性への形質転換、それに続くバイ オマス、例えば腫瘍、転移腫瘍細胞等の成長に関連した様々な事象がみられる。 さらに、緩解は、腫瘍がめったに自然に消滅しないような「癌状態Ｊの一部の状 態と思われてもよい。 本発明の診断としての態様は、腫瘍の進行及び転移及び緩解を介して、単一の細 胞が悪性へ第一に形質転換することから生じる発癌に含まれるすべての事象を含 む。 「患者」を使用した場合、この語は、癌状態に苦しむいずれの種も含む。これに は、ヒト及び非ヒト、例えば、家畜化された動物、種部等が含まれる。 さらに、本発明には治療における態様がある。ワクチンとしてのＴＲＡＰ及びＴ ＲＡの有効量の投与効率は、すてに上述した。同様に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけ る特異的ＣＴＬを開発し、その後、患者へそれらを投与してもよい。重要なＴＲ Ａを提示する細胞に特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナルのいず れかの抗体を投与してもよい。これらの抗体を、メトトレキセート放射性ヨウ素 化合物、トキシン、例えばリシン、池の細胞増殖抑制性又は細胞溶解性の薬剤等 を含む特異的抗腫瘍剤に結合してもよいが、これらに制限されるものではない。 従って、「標的」抗体療法は、それがＣＴＬを使用して癌細胞を除去するために 適用されるものとして、ここに含まれる。 使用した語及び表現は、記載上の語句として使用したものであり、これらに限定 されるものではなく、かつ、そのような語及び表現の使用において、示しかつ記 載した性質又はその一部の相当価値のいずれをも除外することを意図するもので はなく、様々な改良が本発明の範囲内において可能であることが認識される。 （１）一般的情報・ ｆｉｌ　出　願　人　ブーン　ノイアリー、ファン　デン　アインド、ベノヮ（ ＩＯ発明の名称、腫瘍拒絶抗原前駆体、腫瘍拒絶抗原及びそれらの使用口　配列 の数　２６ ■　通信先 （ト）フエルフェ　アンド　リンチ ０３）　サード　アベニュー　８０５ （Ｃ）　ニューヨーク市 （至）ニューヨーク州 （Ｄ　郵便番号：　１００２２ Ｍ　コンピュータ読取りフオーム： 囚　メディウムタイプ、ディスケット、５．２５インチ、３６０　ｋｂ蓄積ａ３ １　コンピュータ　ＩＢＭ （Ｃ１オペレーティングシステム＋　ｐｃ−ｏｏｓ■　ソフトウェア、ワードパ ーフェクト（ロ）本件出願データ 囚　出願番号 Ｑ３）出願臼 −先願データ 囚　出願番号：０７／８０７，０４３ （Ｂ）出［日＋＋９９１年１２月１２日（社）先願データ 囚　出願番号　０７／７６４，３６４ １１ＢＩ　出願臼・１９９■年９月２３日−先願データ （〜　出願番号　０７／７２８，８３８Φ）出願臼・１９９１年７月９日 −先願データ。 囚　出願番号：０７／７０５，７０２ （Ｂ）　出願臼・１９９１年５月２３日−代理人情報・ 囚　名　前、ハンソン、ノーマン　Ｄ ［Ｆ］）登録番号　３０，９４６ （Ｃ）　参照／ドケット番号：ＬＵＤ　２５３．４（財）遠距離通信情報。 （〜　電話：　（２１２）６８８−９２００■）テレファックス：　（２１２） ８３８−３８８４ＣＴＣ（：？′ＣＴＣＴ　入丁入　ＣＣＡ　ＣＴ（：　八人Ｃ ＣＣＴ　ｋｋＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣＧＡＧ　’ｒＧτ　＾ＧＧ’ｌ’Ｇ■ @Ｓ〕６ Ｇ入＾　ｋｋＴ　ＣｅＴ　（ＡＴ　にＡＡ　ＧＡＧ　（：ＴＴ　ＧｃＡ　＾、Ｔ Ｇ　ＧＡＡ　Ｇ入ＧＧ入＾　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡf　６２４ ＧｊＩＧ　ＣＡＣＣＸＣＧＸＧ　ＧｕＧＡＧ　ＣＡＡ　ＡＴＣＧＧｋ　ＡＡＣＣ Ｑ；　ＧＡＴ　１１４ｃ　ＴＴＣＴＣＡ　Ｃ（ゴ　６７２τ八Ｇ　６７５ ＧｋＧ　ＧｋＣＧｋＣにＡＣＧｋＣＧＡＴ　ＧＣＣＴＴＣＴＡＴ　ＧＩＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　（、ＡＴ　７９１１Ｇ入Ｇ　Ｃｌｕ　ＣＡＡ　Ｇ？Ｊｋ　 ＴＴＧ　ＧＡＧ　ｋｋｃ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　Ｔ（Ｊ　 ＣＡＡ　８４０Ｇ八τ　ＧＡＧ　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＡＧＣ ＧＴＧ　ＧＡＡ　＾τＧＧＧτ　ＧＣＣＧＧ＾　１１１１２（：Ｃ”ｒ　ＣＡ（ ：　（：ＡＡ　ＡＴＣＧＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＣＧＣ’ｔ　入ＡＣπＴ　ＧＣＣτ 　９１６Ｌｅｕ　ｐｒｏ　τｙｒ　Ｌｅｕ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　 Ｐｈ５ＣＡＴＡＣＣＣＡＣＣｅＡ丁ＡｅＴＣＣＴＡ（ＪＶ：ＴＣＴＡＧ　ＧＡＧ ＣＦ、Ｃ八にＴ　ＣＪＣＧＴｋｋＴＣＧ　２２５０ｎ’ｃｃＡＴｃｃｃｃ　ＣＴ ＣＧＣ入ＣＣＣ＾　ｃｒ、ｃｃ’ｒｃｃ入＾ＧＧＣτ〒＾ｃｃｃｃｃ　＾ｃｃ入 八ＧへにＧＡ　２２００ＣＴＣＣＴｅＣｅＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＸＣＣ，ＡＧｋ 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（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　 Ｔ　９２８４−４Ｃ４８１００８３１４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　７１０６　Ｚ　８３１８−４Ｈ１３１００８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３− ４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　８３１０− ２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　８３１０−２Ｊ ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　７６４，３６４（３２）優先日　１９９１年９月２３ 日（３３）優先権主張国　米国（Ｕ　Ｓ　”）（３１）優先権主張番号　８０７ ，０４３（３２）優先日　１９９１年１２月１２日（３３）優先権主張国　米国 （Ｕ　Ｓ　）ＦＩ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。 ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵＳＤ、ＵＳ （７２）発明者　ファン　デル　プリュージャン　ピエールベルギー　ベ−１２ ００ブリュッセル　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート７４ （７２）発明者　ファン　ダン　エインド　ベノワベルギー　ベー１２００　ブ リュッセル　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート７４ （７２）発明者　ファン　ペル　アリーヌベルギー　ベー１２００　ブリュッセ ル　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート７４ （７２）発明者　ド　ブラーン　エテイアンヌベルギー　ベー１２００　ブリュ ッセル　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート　７４ （７２）発明者　ルルカン　クリストフベルギー　ベー１２００　ブリュッセル 　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート７４ （７２）発明者　ショーツ　パトリックベルギー　ベー１２００　ブリュッセル 　ニーシーエル　７４５９　アベニュー　ヒッポクラート７４ （７２）発明者　トラヴエルサリ　カティアイタリー　イー２００９９　ミラノ 　セストエツセ　ジョヴアンニ（番地なし）

Claims (172)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子又は腫瘍拒絶抗原前駆体をコ ードする核酸分子に相補的な単離核酸分子。
2. ２．単離核酸分子が腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、請求項１に記載の単離核 酸分子。
3. ３．単離核酸分子がヒト腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、請求項１に記載の単 離核酸分子。
4. ４．単離核酸分子が腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に相補的である、 請求項１に記載の単離核酸分子。
5. ５．単離核酸分子がＤＮＡである、請求項１に記載の単離核酸分子。
6. ６．単離核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の単離核酸分子。
7. ７．単離核酸分子が遺伝子である、請求項１に記載の単離核酸分子。
8. ８．ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項５に記載の単離核酸分子。
9. ９．ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項５に記載の単離核酸分子。
10. １０．ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項６に記載の単離核酸分子。
11. １１．単離核酸分子が、ストリンジェント条件下で腫瘍拒絶抗原前駆体をコード する単離核酸にハイブリダイズする、請求項４に記載の単離核酸分子。
12. １２．単離核酸分子がＭＡＧＥ抗原前駆体をコードするか又はＭＡＧＥ抗原前駆 体をコードする分子に相補的である、請求項１に記載の単離核酸分子。
13. １３．ＭＡＧＥ抗原前駆体が、ｍａｇｅ１、ｍａｇｅ２、ｍａｇｅ３、ｍａｇｅ ４、ｍａｇｅ５、ｍａｇｅ６、ｍａｇｅ７、ｍａｇｅ８、ｍａｇｅ９、ｍａｇｅ １０、ｍａｇｅ１１、ｓｍａｇｅ１及びｓｍａｇｅ１１からなる群より選ばれる 、請求項１２に記載の単離核酸分子。
14. １４．単離核酸分子が、ＭＡＧＥ抗原前駆体をコードする、請求項１２に記載の 単離核酸分子。
15. １５．単離核酸分子が、ＭＡＧＥ抗原前駆体をコードする分子に相補的である、 請求項１２に記載の単離核酸分子。
16. １６．単離核酸分子がＤＮＡである、請求項１２に記載の単離核酸分子。
17. １７．単離核酸分子がＲＮＡである、請求項１２に記載の単離核酸分子。
18. １８．単離核酸分子が遺伝子である、請求項１２に記載の単離核酸分子。
19. １９．ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項１６に記載の単離核酸分子。
20. ２０．ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１６に記載の単離核酸分子。
21. ２１．ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１７に記載の単離核酸分子。
22. ２２．図９に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の単離核酸分子。
23. ２３．単離核酸分子が、ストリンジェント条件下でＭＡＧＥ抗原前駆体をコード する分子にハイブリダイズする、請求項１５に記載の単離核酸分子。
24. ２４．肥満細胞腫に関する腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、請求項１に記載の 単離核酸分子。
25. ２５．腫瘍拒絶抗原前駆体ＰｌＡをコードする、請求項１に記載の単離核酸分子 。
26. ２６．図５のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離核酸分子。
27. ２７．請求項２に記載の核酸配列でトランスフェクトした細胞系の生物学的純粋 培養物。
28. ２８．請求項１２に記載の核酸配列でトランスフェクトした細胞系の生物学的純 粋培養物。
29. ２９．請求項２２に記載の核酸配列でトランスフェクトした細胞系の生物学的純 粋培養物。
30. ３０．ＰｌＡ．Ｔ２及びＰｌＡ・ＴＣ３，１．からなる群から選ばれる、請求項 ２７に記載の細胞系の生物学的純粋培養物。
31. ３１．少なくとも一つのＰ８１５腫瘍抗原を発現する親細胞系から誘導された、 高率でトランスフェクト可能な細胞系の生物学的純粋培養物であって、高率でト ランスフェクト可能な細胞系がＰ８１５腫瘍抗原Ａ、Ｂ及びＣのいずれも発現し ない上記培養物。
32. ３２．細胞系ＰＯ．ＨＴＲを含む、請求項３１に記載の生物学的に純粋な細胞系 。
33. ３３．腫瘍拒絶抗原前駆体がヒト腫瘍抗原前駆体である、請求項２７に記載の細 胞系の生物学的純粋培養物。
34. ３４．ヒト腫瘍抗原前駆体がメラノーマ細胞に見いだされる、請求項３３に記載 の細胞系の生物学的純粋培養物。
35. ３５．腫瘍拒絶抗原前駆体がｍａｇｅ−１であり、かつ、単離ＤＮＡが以下の核 酸配列を有する、請求項３４に記載の生物学的に純粋な細胞系。 【配列があります】
36. ３６．細胞系が、サイトカインをコードする核酸配列によりトランスフェクトさ れている、請求項２７に記載の生物学的純粋培養物。
37. ３７．細胞系がＨＬＡ分子をコードする核酸配列によりさらにトランスフェクト されている、請求項３６に記載の生物学的純粋培養物。
38. ３８．サイトカインがインターロイキンである、請求項３６に記載の生物学的純 粋培養物。
39. ３９．インターロイキンがＩＬ−２である、請求項３８に記載の生物学的純粋培 養物。
40. ４０．インターロイキンかＩＬ−４である、請求項３８に記載の生物学的純粋培 養物。
41. ４１．細胞系が、ＭＨＣ分子又はＨＬＡ分子をコードする核酸配列によりトラン スフェクトされている、請求項２７に記載の生物学的純粋培養物。
42. ４２．細胞系か、腫瘍拒絶抗原前駆体（ＴＲＡＰ）から誘導される腫瘍拒絶抗原 を示すＭＨＣ又はＨＬＡ分子を発現するものであり、該ＴＲＡＰが該細胞系にト ランスフェクトされた核酸配列によりコードされたものである、請求項２７に記 載の生物学的純粋培養。
43. ４３．培養物が非増殖性である、請求項２７に記載の生物学的純粋培養物。
44. ４４．細胞系が線維芽細胞系である、請求項２７に記載の生物学的純粋培養物。
45. ４５．請求項２に記載の核酸配列を含む、トランスフェクトされた細菌。
46. ４６．請求項２に記載の核酸配列を含む、突然変異ウイルス。
47. ４７．ブロモ−ターに操作可能に結合した請求項２に記載の単離核酸分子を含む 、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
48. ４８．プロモーターに操作可能に結合した腫瘍拒絶抗原をコードする核酸配列を 含む、細胞系をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
49. ４９．プロモーターが強力なプロモーターである、請求項４７に記載の発現ベク ター。
50. ５０．プロモーターが特異的プロモーターである、請求項４７に記載の発現ベク ター。
51. ５１．プロモーターに操作可能に結合した請求項７に記載の単離核酸分子を含む 、細胞をトランスフエクトするのに有用な発現ベクター。
52. ５２．プロモーターに操作可能に結合した請求項１３に記載の単離核酸分子を含 む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
53. ５３．プロモーターに操作可能に結合した請求項１４に記載の単離核酸分子を含 む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
54. ５４．プロモーターに操作可能に結合した請求項１８に記載の単離核酸分子を含 む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
55. ５５．プロモーターに操作可能に結合した請求項２２に記載の単離核酸分子を含 む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現ベクター。
56. ５６．ＭＨＣ又はＨＬＡをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４７に記載 の発現ベクター。
57. ５７．サイトカインをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４７に記載の発 現ベクター。
58. ５８．サイトカインがインターロイキンである、請求項５７に記載の発現ベクタ ー。
59. ５９．インターロイキンがＩＬ−２である、請求項５８に記載の発現ベクター。
60. ６０．インターロイキンがＩＬ−４である、請求項５８に記載の発現ベクター。
61. ６１．細菌ゲノム又はウイルスゲノム又はその一部をさらに含む、請求項４７に 記載の発現ベクター。
62. ６２．ウイルスゲノムが牛痘ウイルスＤＮＡであり、バクテリアゲノム又はその 一部がＢＣＧＤＮＡにあるものである、請求項６１に記載の発現ベクター。
63. ６３．（ｉ）腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子を含む第一のベクター及 び（ｉｉ）（ａ）腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導される腫瘍拒絶抗原を示すＭＨＣ 又はＨＬＡ分子をコードする核酸分子を含むベクター及び（ｂ）インターロイキ ンをコードする核酸配列を含有するベクターからなる群より選ばれる第二のベク ターを含む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現システム。
64. ６４．単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
65. ６５．単離ヒト腫瘍拒絶抗原前駆体。
66. ６６．前駆体がｍａｇｅ−１である、請求項６５に記載の単離腫瘍拒絶抗原前駆 体。
67. ６７．前駆体が抗原Ｆの前駆体である、請求項６５に記載の単離腫瘍拒絶抗原前 駆体。
68. ６８．請求項２に記載の核酸分子によりコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
69. ６９．請求項１２に記載の核酸分子によりコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体 。
70. ７０．請求項１３に記載の核酸分子によりコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体 。
71. ７１．請求項２２に記載の核酸分子によりコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体 。
72. ７２．単離腫瘍拒絶抗原。
73. ７３．単離ヒト腫瘍拒絶抗原。
74. ７４．配列番号４のアミノ酸配列を有する請求項７２に記載の単離腫瘍拒絶抗原 。
75. ７５．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｅである、請求項７２に記載の単離腫瘍拒絶抗原。
76. ７６．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｆである、請求項７２に記載の単離腫瘍拒絶抗原。
77. ７７．患者に投与した時に免疫応答を生じる腫瘍拒絶抗原前駆体を含む、癌状態 に苦しむ患者の治療に有用なワクチン。
78. ７８．腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導されるペプチド断片を含む、癌状態に苦しむ 患者の治療に有用なワクチンであって、該断片が、該腫瘍拒絶抗原前駆体から誘 導される腫瘍拒絶抗原より大きく、かつ、該腫瘍拒絶抗原前駆体よりも小さいも のであって、かつ、患者に投与した時に免疫応答を生じる、上記ワクチン。
79. ７９．ＴＲＡＰがヒトＴＲＡＰである、請求項７７に記載のワクチン。
80. ８０．前駆体がｍａｇｅ−１である、請求項７７に記載のワクチン。
81. ８１．前駆体が抗原Ｆ前駆体である、請求項７９に記載のワクチン。
82. ８２．患者に投与した時に免疫応答を生じる、請求項７２に記載の腫瘍拒絶抗原 を含む、癌患者の治療に有用なワクチン。
83. ８３．腫瘍拒絶抗原が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項８２に記載の ワクチン。
84. ８４．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｅである、請求項８１に記載のワクチン。
85. ８５．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｆである、請求項８１に記載のワクチン。
86. ８６．腫瘍拒絶抗原が、ウイルスゲノム又はその一部を含む発現ベクターの発現 生成物である、請求項７７に記載のワクチン。
87. ８７．請求項４５に記載のトランスフェクトされる細菌及び医薬として許容され 得るアジュバントを含む、癌患者の治療に有用なワクチン。
88. ８８．請求項４６に記載の突然変異ウイルス及び薬理学的に許容され得るアジュ バントを含むことを特徴とする、癌状態の治療に有用なワクチン。
89. ８９．腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ分子の複合体を含む、癌状態に苦しむ患者の治療に 有用なワクチン。
90. ９０．ペプチドが配列番号２６のアミノ酸を有する、癌状態に苦しむ患者の治療 に有用な単離ペプチド。
91. ９１．請求項２７に記載の単離細胞系及び薬理学的に許容され得るアジュバント を含むことを特徴とする、癌状態に苦しむ患者の治療に有用なワクチン。
92. ９２．請求項３７に記載の単離細胞系及び薬理学的に許容され得るアジュバント を含むことを特徴とする、癌状態に苦しむ患者の治療に有用なワクチン。
93. ９３．癌状態の腫瘍特性に特異的な腫瘍拒絶抗原前駆体をその表面に発現する非 増殖性細胞系及び医薬として許容され得るキャリヤーを含む、癌状態の治療に有 用な物質の組成物。
94. ９４．細胞系がヒト細胞系である、請求項９３に記載の物質の組成物。
95. ９５．医薬として許容され得るキャリヤーがリボソームである、請求項９３に記 載の物質の組成物。
96. ９６．癌状態の腫瘍特性に特異的な腫瘍拒絶抗原をその表面に発現する非増殖性 細胞系及び医薬として許容され得るキャリヤーを含む、癌状態の治療に有用な物 質の組成物。
97. ９７．細胞系がヒト細胞系である、請求項９６に記載の物質の組成物。
98. ９８．医薬として許容され得るキャリヤーかリポソームである、請求項９６に記 載の物質の組成物。
99. ９９．（ｉ）腫瘍拒絶抗原又は腫瘍拒絶抗原前駆体、（ｉｉ）ＭＨＣ又ＨＬＡ分 子及び （ｉｉｉ）医薬として許容され得るキャリヤーを含む、癌状態の治療に有用な物 質の組成物。
100. １００．医薬として許容され得るキャリヤーがリポソームである、請求項９９に 記載の物質の組成物。
101. １０１．腫瘍拒絶抗原前駆体に特異的に結合する抗体。
102. １０２．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０１に記載の抗体。
103. １０３．腫瘍拒絶抗原前駆体がｍａｇｅ−１である、請求項１０１に記載の抗体 。
104. １０４．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０３に記載の抗体。
105. １０５．腫瘍拒絶抗原前駆体が抗原Ｆ前駆体である、請求項１０１に記載の抗体 。
106. １０６．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０５に記載の抗体。
107. １０７．腫瘍拒絶抗原前駆体がＭＡＧＥ前駆体である、請求項１０１に記載の抗 体。
108. １０８．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０７に記載の抗体。
109. １０９．ＭＡＧＥ前駆体がｍａｇｅ１、ｍａｇｅ２、ｍａｇｅ３、ｍａｇｅ４、 ｍａｇｅ５、ｍａｇｅ６、ｍａｇｅ７、ｍａｇｅ８、ｍａｇｅ９、ｍａｇｅ１０ 、ｍａｇｅ１１、ｓｍｇｅＩ及びｓｍａｇｅＩＩである、請求項１０７に記載の 抗体。
110. １１０．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０９に記載の抗体。
111. １１１．腫瘍拒絶抗原に特異的に結合する抗体。
112. １１２．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１１に記載の抗体。
113. １１３．腫瘍拒絶抗原か配列番号４に示したものである、請求項１１１に記載の 抗体。
114. １１４．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１３に記載の抗体。
115. １１５．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｅである、請求項１１１に記載の抗体。
116. １１６．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１５に記載の抗体。
117. １１７．腫瘍拒絶抗原が抗原Ｆである、請求項１１１に記載の抗体。
118. １１８．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１７に記載の抗体。
119. １１９．（ｉ）腫瘍拒絶抗原及び（ｉｉ）ＨＬＡ分子の複合体に特異的に結合す るが、（ｉ）又は（ｉｉ）単独には結合しない抗体。
120. １２０．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１９に記載の抗体。
121. １２１．患者の癌状態の診断方法であって、患者のリンパ球含有サンプルを、癌 状態に関連した細胞に発現した腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするＤＮＡ配列でト ランスフェクトした細胞系に接触させること、及びトランスフェクトした細胞系 の溶解を該腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導した腫瘍拒絶抗原に特異的な細胞障害性 Ｔ細胞により測定することを含み、該溶解が癌状態の指標となる上記方法。
122. １２２．腫瘍拒絶抗原前駆体力ＭＡＧＥ抗原である、請求項１２１に記載の方法 。
123. １２３．癌状態の退行、進行又は発症の測定方法であって、（ｉ）腫瘍拒絶抗原 前駆体、 （ｉｉ）腫瘍拒絶抗原及び （ｉｉｉ）該癌状態に関連した腫瘍拒絶抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細胞からな る群より選はれるパラメーターに関して癌状態の患者からのサンプルをモニタリ ングすることを含み、該パラメーターの量が、癌状態の退行又は進行又は発症の 指標となる上記方法。
124. １２４．サンプルが体液である、請求項１２３に記載の方法。
125. １２５．サンプルが組織である、請求項１２３に記載の方法。
126. １２６．サンプルを、腫瘍拒絶抗原又は腫瘍拒絶抗原前駆体に特異的に結合した 抗体と接触させることを含む、請求項１２３に記載の方法。
127. １２７．抗体を、放射性標識又は酵素で標識する、請求項１２６に記載の方法。
128. １２８．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２６に記載の方法。
129. １２９．腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするＲＮＡの増幅を含む、請求項１２３に 記載の方法。
130. １３０．増幅が、ポリメラーゼチェーンリアクションを行うことを含む、請求項 １２９に記載の方法。
131. １３１．サンプルを、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするか又は発現する核酸分子 に特異的にハイプリダイズする核酸分子と接触させることを含む、請求項１２３ に記載の方法。
132. １３２．脱落した（ｓｈｅｄ）腫瘍拒絶抗原についてサンプルを分析することを 含む、請求項１２３に記載の方法。
133. １３３．患者から採ったサンプルをヒト拒絶抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細胞に ついて分析することを含み、該細胞障害性Ｔ細胞が癌状態の指標となる、癌状態 の診断方法。
134. １３４．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、（ｉ）該患者からリンパ球含 有サンプルを取り出すこと、（ｉｉ）該腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導した腫瘍拒 絶抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞の産生に好都合な条件下で、リンパ球含有サン プルを、該状態に関連した癌細胞に発現する腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする遺 伝子でトランスフェクトした細胞系と接触させ、その遺伝子を発現させること及 び （ｉｉｉ）該細胞障害性Ｔ細胞を、該細胞を溶解するのに十分な量において該患 者に導入すること を含む上記方法。
135. １３５．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、（ｉ）該状態に関連した癌細 胞に発現するＭＡＧＥ遺伝子を同定すること、（ｉｉ）該ＭＡＧＥ遺伝子の発現 産物の一部を示すＨＬＡ分子を同定すること、（ｉｉｉ）該ＭＡＧＥ遺伝子を用 いて、（ｉｉ）において同定した同じＨＬＡ分子を有する宿主細胞をトランスフ ェクトすること、（ｉｖ）該ＭＡＧＥ遺伝子を発現するために該トランスフェク トした細胞を培養すること、 （ｖ）該腫瘍に対して免疫応答を生じる能力のある該患者に所定量の該細胞を導 入すること を含む上記方法。
136. １３６．免疫応答がＢ細胞応答を含む、請求項１３５に記載の方法。
137. １３７．免疫応答がＴ細胞応答である、請求項１３５に記載の方法。
138. １３８．Ｂ細胞応答が、腫瘍拒絶抗原又は腫瘍拒絶抗原前駆体に特異的な抗体の 産生を含む、請求項１３６に記載の方法。
139. １３９．Ｔ細胞応答が、腫瘍拒絶抗原を示す細胞に特異的な細胞障害性Ｔ細胞の 生成を含む、請求項１３７に記載の方法。
140. １４０．細胞を非増殖性にするためにそれらを処理することをさらに含む、請求 項１３９に記載の方法。
141. １４１．癌状態の患者の治療方法であって、（ｉ）該腫瘍に発現したＭＡＧＥ遺 伝子を同定すること、（ｉｉ）患者と同じＨＬＡ型を有する宿主細胞を該ＭＡＧ Ｅ遺伝子でトランスフェクトすること、 （ｉｉｉ）該トランスフェクトした細胞を培養し、該ＭＡＧＥ遺伝子を発現させ ること、 （ｉｖ）該腫瘍に対して免疫応答を生じる能力のある該患者に所定量の細胞を導 入すること、 を含む上記方法。
142. １４２．該細胞を非増殖性にするためにそれらを処理することをさらに含む、請 求項１４１に記載の方法。
143. １４３．癌状態の患者の治療方法であって、（ｉ）腫瘍拒絶抗原前駆体（ＴＲＡ Ｐ）をコードする核酸配列及び（ｉｉ）該ＴＲＡＰから誘導された腫瘍拒絶抗原 を示すＭＨＣ又はＨＬＡ分子をコードする核酸配列 によりトランスフェクトした細胞の所定量を該患者に投与することを含み、ここ で該腫瘍拒絶抗原は、該癌状態を緩和することができるような癌状態に関連した 細胞により提示されるものであることを特徴とする上記方法。
144. １４４．細胞を非増殖性にするために、該細胞を処理することをさらに含む、請 求項１４３に記載の方法。
145. １４５．癌状態に苦しむ患者の治療に有用な生物学的物質の製造方法であって、 （ｉ）腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするか発現する核酸分子で宿主細胞をトラン スフェクトする工程、 （ｉｉ）細胞表面上の腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導される腫瘍拒絶抗原を提示す るＨＬＡ分子をコードする核酸分子で該宿主細胞をトランスフェクトする工程、 及び （ｉｉｉ）該核酸分子の発現及び該ヒト白血球抗原による腫瘍拒絶抗原の提示を 好都合にする条件下において該宿主細胞を処理する工程を含むことを特徴とする 上記方法。
146. １４６．腫瘍拒絶抗原の提示の後、該宿主細胞を非増殖性に処理する工程をさら に含む、請求項１４５に記載の方法。
147. １４７．宿主細胞を、サイトカインをコードするか発現する核酸分子でトランス フェクトする工程をさらに含む、請求項１４６に記載の方法。
148. １４８．サイトカインがインターロイキンである、請求項１４６に記載の方法。
149. １４９．ヒト白血球抗原がＨＬＡ−Ａｌである、請求項１４６に記載の方法。
150. １５０．インターロイキンがＩＬ−２である、請求項１４８に記載の方法。
151. １５１．インターロイキンがＩＬ−４である、請求項１４６に記載の方法。
152. １５２．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、該患者に所定量の薬剤を投与 することを含み、該薬剤は免疫応答を誘発するのに十分な量において癌細胞の腫 瘍拒絶抗原特性をその表面に発現している非増殖性細胞から本質的になるもので ある上記方法。
153. １５３．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、該患者に、該状態に関連する 癌細胞に発現した腫瘍拒絶抗原に特異的に結合する抗体を投与することを含み、 該抗体は該癌状態を治療するのに十分な量において抗癌剤に結合されている上記 方法。
154. １５４．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、該患者に、該状態に関連した 癌細胞に発現した腫瘍拒絶抗原前駆体に特異的に結合する抗体を投与することを 含み、該抗体は該癌状態を治療するのに十分な量において抗癌剤に結合されてい る上記方法。
155. １５５．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、該患者に、請求項１４２に記 載の方法により製造した生物学的サンプルを、該癌状態を緩和するのに十分な量 において投与することを含む上記方法。
156. １５６．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項７７に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
157. １５７．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項７８に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
158. １５８．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８２に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
159. １５９．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８６に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
160. １６０．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８７に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
161. １６１．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８８に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
162. １６２．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８９に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
163. １６３．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項８９に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
164. １６４．該患者の癌状態の発症を予防するのに十分な量の請求項９０に記載のワ クチンを投与することを含む、患者の癌状態の発症の予防方法。
165. １６５．癌状態に苦しむ患者の治療方法であって、（ｉ）腫瘍拒絶抗原前駆体を 発現し、細胞表面において該前駆体から誘導される腫瘍拒絶抗原を示す、該患者 由来の細胞を同定すること、（ｉｉ）該細胞のサンプルを単離すること、（ｉｉ ｉ）該細胞を培養すること、及び（ｉｖ）該細胞に対して免疫応答を生じるのに 十分な量の該細胞を該患者に導入すること、 を含む上記方法。
166. １６６．患者に該細胞を導入する前に、該細胞を非増殖性にすることをさらに含 む、請求項１６５に記載の方法。
167. １６７．癌状態に苦しむ患者の治療に有用な細胞障害性Ｔ細胞を同定する方法で あって、 （ｉ）該患者に該細胞を導入する前に、該細胞に発現した腫瘍拒絶抗原前駆体か ら誘導される、該癌状態に関連した細胞により提示される腫瘍拒絶抗原を同定す ること、 （ｉｉ）該抗原を提示している細胞を細胞障害性Ｔ細胞に接触すること、及び（ ｉｉｉ）（ｉ）該細胞障害性Ｔ細胞の増幅及び（ｉｉ）細胞障害性Ｔ細胞生成因 子の放出からなる群より選ばれるパラメーターを測定すること、ここで該パラメ ーターの増加は該癌状態の指標となることを含む上記方法。
168. １６８．因子が腫瘍壊死因子である、請求項１６７に記載の方法。
169. １６９．癌状態を緩和するためにデザインされた治療体制の以下の経過をたどる 方法であって、 （ａ）（ｉ）腫瘍拒絶抗原、（ｉｉ）腫瘍拒絶抗原を提示する細胞に特異的な細 胞障害性Ｔ細胞、及び（ｉｉｉ）第一の期間において該腫瘍拒絶抗原に特異的に 結合する抗体からなる群より選ばれるパラメーターのレベルを測定するために患 者からのサンプルを分抗すること、（ｂ）第二の期間に（ａ）において選ばれた パラメーターのレベルを分析し、それを該治療体制の効果の測定結果として（ａ ）において測定したレベルと比較すること、 を含む上記方法。
170. １７０．ＴＲＡＰ分子の発現について患者から採ったサンプルを分析すること及 び正常レベルと発現のレベルを比較することを含み、ここでそれらの間の相違が 癌状態の指標となる、癌状態の診断方法。
171. １７１．ポリメラーゼチェーンリアクションによる発現を測定することを含む、 請求項１６４に記載の方法。
172. １７２．患者において遅延型応答を生じるのに十分な腫瘍拒絶抗原の量を皮内に 投与することを含む、請求項１２３に記載の方法。