PT687180E

PT687180E - Metodos para a deteccao e o tratamento de individuos tendo celulas anormais que expressam antigenios do peptido hla-a2/tirosinase

Info

Publication number: PT687180E
Application number: PT94905393T
Authority: PT
Inventors: Thierry Boon-Falleur; Jean-Christophe Renauld; Vincent Brichard; Aline Van Pel; Etienne De Plaen; Pierre Coulie; Thomas Woelfel; Bernard Lethe
Original assignee: Ludwig Inst Cancer Res
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-14
Publication date: 2001-04-30
Also published as: DE69331813T2; JPH08506100A; ES2172287T3; AU679965B2; WO1994014459A1; HK1031994A1; CN1059466C; CA2152266C; ES2151544T3; CN1089660A; EP0687180B1; FI953093L; FI953093A0; AU5951794A; NO952385D0; EP0687180A1; NZ259985A; ATE215830T1; NO952385L; DE69329656T2

Description

68^(80

MEMÓRIA DESCRITIVA “MÉTODOS PARA A DETECÇÃO E O TRATAMENTO DE INDIVÍDUOS TENDO CÉLULAS ANORMAIS QUE EXPRESSAM ANTIGÉNIOS DO PÉPTIDO HLA-A2/TIROSINASE”

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a várias metodologias terapêuticas derivadas do reconhecimento de que certas células anormais apresentam complexos de antigénios e péptidos de leucócitos humanos derivados da tirosinase nas suas superfícies. Além disso, a invenção refere-se à capacidade para identificar aqueles indivíduos diagnosticados com condições caracterizadas por anomalias celulares cujas células anormais apresentam este complexo, os péptidos apresentados e as suas ramificações.

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR O processo pelo qual o sistema imunitário dos mamíferos reconhece e reage a materiais desconhecidos ou estranhos é um sistema complexo. Uma importante faceta do sistema é a resposta das células T. Esta resposta requer que as células T reconheçam e interajam com complexos de moléculas da superfície das células, referidos como antigénios de leucócitos humanos (“HLA”) ou complexos importantes de histocompatibilidade (“MHCs”), e péptidos. Os péptidos são derivados de moléculas maiores que são processados pelas células que também apresentam a molécula HLA/MHC. Ver a este propósito Male e col., Advanced Immunology (J.P. Lipincott Company, 1987), em especial os capítulos 6-10. A interacção da célula T e os complexos de HLA/péptido é restrita, requerendo uma célula T específica para uma combinação particular de uma molécula HLA e um péptido. Caso não esteja presente uma célula T específica, não existe resposta da célula T mesmo que o seu complexo parceiro esteja presente. De forma semelhante, não existe resposta se o complexo específico estiver ausente, mas a célula T estiver presente. Este mecanismo está envolvido na resposta do sistema imunitário a matérias desconhecidas, em patologias auto-imunes, e em respostas a anomalias celulares. Recentemente, vários trabalhos têm sido focados nos mecanismos pelos quais são processadas proteínas nos péptidos de ligação HLA. Ver, a este propósito, Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont e col., Science 257: 919 (1992); Matsumura e col., Science 257: 927 (1992); Latron e col., Science 257: 964 (1992). O mecanismo pelo qual as células T reconhecem anomalias celulares tem sido também implicado no cancro. Por exemplo, na Publicação de PCT n° WO 92/20356, depositado em 22 de Maio de 1992, publicado em 26 de Novembro de 1992, é descrita uma família de genes, que são processados em péptidos que, por sua vez, são expressos em superfícies de células, que podem conduzir à lise das células de tumor por CTLs específicas. Os genes são referidos como codificando para “precursores de antigénio de rejeição de tumor” ou moléculas “TRAP”, e os péptidos deles derivados são referidos como “antigénios de rejeição de tumor” ou “TRAs". Ver Traversari e col., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen e col., Science 254: 1643 (1991), para informação adicional sobre esta família de genes.

Na Publicação de PCT n° WO 94/05304 são descritos nonapéptidos que se ligam à molécula HLA-A1. A referência ensina que dada a especificidade conhecida de péptidos particulares para moléculas HLA particulares, deverá esperar-se que um péptido particular se ligue a uma molécula HLA, mas não outros. Este facto é importante, porque diferentes indivíduos possuem diferentes fenótipos de HLA. Como resultado, embora a identificação de um péptido particular como sendo um parceiro para uma molécula HLA específica possua ramificações diagnósticas e terapêuticas, estas são apenas relevantes para indivíduos com esse fenótipo de HLA particular. Existe uma necessidade para pesquisa adicional nesta área, na medida em que as anomalias celulares não estão restringidas a um fenótipo de HLA particular, e a terapia alvo requer algum conhecimento do fenótipo das células anormais em causa. 2 A enzima tirosinase cataliza a reacção que converte a tirosina em desidroxifenilalanina ou “DOPA” e parece ser expressa selectivamente em melanócitos (Muller e col., EMBOJ 7: 2715 (1988)). Um relatório prévio de ADNc para a enzima humana é encontrado em Kwon, Patente Norte Americana n° 4.898.814. Um relatório posterior por Bouchard e col., J. Exp. Med. 169: 2029 (1989) apresenta uma sequência ligeiramente diferente. Tem sido efectuado um grande esforço para identificar os inibidores para esta enzima, dado que ela tem sido implicada em doenças de pigmentação. Alguns exemplos desta literatura incluem Jinbiw, Pedido n° W09116302; Mishima e col., Patente Norte Americana n° 5.077.0059 e Nazzaropor, Patente Norte Americana n° 4.818.768. O especialista estará familiarizado com outras referências que descrevem matérias semelhantes.

Nenhumas destas referências descrevem ou sugerem, contudo, que a tirosinase pode ser tratada de uma forma semelhante a um antigénio estranho ou uma molécula TRAP - isto é, verificou-se que em certas anomalias celulares, tais como o melanoma, a tirosinase é processada e um péptido dela derivado forma um complexo com moléculas HLA em certas células anormais. Estes complexos são reconhecidos por células T citolíticas (“CTLs”), que assim efectuam a lise das células apresentadoras. As ramificações deste fenómeno surpreendente e inesperado são o objecto da presente invenção, que é descrita nas reivindicações anexas e na descrição seguinte.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um péptido isolado que consiste na sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.

Num segundo aspecto, a invenção proporciona um método para a determinação da presença de células T citolíticas específicas da célula de melanoma numa amostra como um diagnóstico do melanoma num indivíduo a partir do qual a referida amostra foi tirada, compreendendo colocar-se em contacto uma amostra do indivíduo de interesse contendo células sanguíneas mononucleares com células de melanoma que apresentem, na sua superfície, 3 complexos de moléculas HLA-A2 e o péptido Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, e determinando-se um de (i) proliferação de células T citolíticas na referida amostra contendo células sanguíneas mononucleares e (ii) lise das referidas células de melanoma, como uma determinação da presença de células T citolíticas especificas das células de melanoma na referida amostra, sendo a referida presença indicadora do melanoma no referido indivíduo.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para utilização num tratamento terapêutico compreendendo um péptido isolado de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição para utilização num tratamento terapêutico, compreendendo um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.

Num aspecto adicional, a invenção proporciona uma composição compreendendo células que apresentam um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu na sua superfície, em que as referidas células foram transfectadas com uma ou ambas de (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma molécula HLA e (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma tirosinase, ou uma sua parte que inclui a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.

Ainda num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método para a geração de células T citolíticas especificas para um complexo que compreende uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, compreendendo o referido método a fase de colocar-se em contacto uma amostra de células sanguíneas com células que apresentam o referido complexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 descreve, colectivamente, estudos de lise de células. Em particular: A Figura 1A mostra a lise da linha de células LB24; A Figura 1B mostra a lise da linha de células SK29-MEL; A Figura 1C mostra a lise da linha de células LB4.MEL; A Figura 1D mostra a lise da linha de células SK23.MEL; A Figura 1E mostra a lise da linha de células LE516.MEL; A Figura 1F mostra estudos de lise em NK alvo K562; A Figura 1G mostra a lise de células transformadas de EBV-B autólogas; A Figura 1H mostra a lise da variante de perda na Figura 1F após a transfecção com um gene para HLA-A2; A Figura II mostra a lise de células transformadas IEBV-β autólogas. A Figura 2 apresenta estudos de libertação de TNF de CTLIVSB. A Figura 3 apresenta estudos de libertação de TNF de CTL 210/9. A Figura 4 mostra o reconhecimento do péptido YMNGTMSQV por um clone de célula T citolítica CTL-IVSB mas não por um clone de célula T citolítica CTL 2/9. A Figura 5 mostra que o péptido YMNGTMSQV não é reconhecido pelo clone de célula T citolítica CTL 210/9. A Figura 6 mostra os resultados obtidos quando os ensaios de libertação de TNF foram realizados em várias células, incluindo aquelas que apresentam HLA-B44 na sua superfície. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS Exemplo 1

As linhas de célula de melanoma SK 29-MEL (também referida na literatura como SK MEL-29) e LB24-MEL, que estiveram disponíveis para pesquisa durante muitos anos, foram utilizadas nas experiências seguintes.

Foram tomadas amostras contendo células sanguíneas mononucleares de pacientes AV e LB24-MEL (estes pacientes foram também a fonte da SK 29-MEL e LB24-MEL, respectivamente). As linhas de células de melanoma foram postas em contacto com as amostras contendo células sanguíneas mononucleares. As misturas foram observadas para lise de linhas de células de melanoma, indicando esta lise que estiveram presentes na amostra células T citolíticas (“CTLs”) específicas para um complexo de péptido e molécula HLA apresentado pelas células melanoma. O ensaio de lise utilizado foi um ensaio de libertação de crómio de acordo com Herin e col., Int. J. Câncer 39:390-396 (1987), cuja descrição é incorporada na presente invenção por referência. O ensaio, contudo, é descrito na presente invenção. As células de melanoma alvo foram cultivadas in vitro, e em seguida re-suspensas a 107 células/ml em DMEM, suplementadas com 10 mM de HEPES e 30% de FCS, e incubadas durante 45 minutos a 37°C com 200 pCi/ml de NA(51Cr)04. Foram lavadas cclulas marcadas trcs vezes com DMEM, suplementadas com 10 mM de Hepes. Estas foram em seguida re-suspensas em DMEM, suplementadas com 10 mM de Hepes e 10% de FCS, após o que foram distribuídas alíquotas de 100 μΐ contendo 103 células em microplacas de 96 furos. Foram adicionadas amostras de PBLs em 100 μΐ do mesmo meio, e foram realizados ensaios em duplicado. As placas foram centrifugadas durante 4 minutos a 100 g, e incubadas durante quatro horas a 37°C numa atmosfera de 5,5% de C02.

As placas foram novamente centrifugadas, e foram recolhidas e contadas alíquotas de 100 μΐ de supemadante. A percentagem de libertação de 51Cr foi calculada da seguinte forma: % de libertação de51 Cr = (ER-SR) x 100 (MR-SR)

em que ER é libertação de 51 Cr observada, experimental, SR é a libertação espontânea medida incubando 103 células marcadas em 200 μΐ de meio só, e MR é a libertação máxima, obtida pela adição de 100 μΐ de Triton X-100 a 0,3% às células alvos.

As amostras sanguíneas mononucleares que mostraram elevada actividade CTL foram expandidas e clonadas através de diluição limitada, e foram novamente escrutinadas, utilizando a mesma metodologia.

Foi utilizado o mesmo método para testar as células K562 alvo. Quando foram utilizadas células EBV-B, a única alteração foi a substituição do meio DMEM pelo meio de Hank, suplementado com FCS a 5%.

Estas experiências conduziram ao isolamento do clone CTL “TVSB” do paciente AV e do clone CTL 210/9 do paciente LB24. A Figura 1 apresenta os resultados destes ensaios, nos painéis A, B, G e 1. Especificamente, verificar-se-á que ambos os CTLs efectuaram a lise de ambas as linhas de células de melanoma, e que não foi realizada lise das linhas de células K562 e EBV-B.

Exemplo 2

Os CTLs descritos foram testados contra outras linhas de células de melanoma para determinar se o seu alvo era partilhado por outras linhas de célula melanoma. Foi estudada a lise tal como descrita no Exemplo 1 para as linhas LB4.MEL, SK23.MEL (também conhecida como SK MEL-23) e LE516.MEL. A Figura 1, nos painéis C, D e E mostra que os clones não efectuaram a lise destas linhas.

As linhas testadas são conhecidas como sendo do tipo HLA-A2 e os resultados sugeriram que os CTLs são específicos para um complexo de péptido e HLA-A2. Esta sugestão foi verificada testando uma variante de SK 23-MEL que perdeu a expressão HLA-A2. A Figura 1, no painel F, mostra estes resultados. Nenhum clone efectuou a lise da variante HLA-perdida. Quando a variante foi transfectada com o gene HLA-A2 da SK29-MEL, contudo, e re-testada, foi observada a lise. Assim, pode-se concluir que a molécula apresentadora é a HLA-A2. 7

Exemplo 3

Quando a molécula HLA apresentadora foi identificada, foram realizados estudos para identificar a molécula, adiante referida como a molécula “precursora de antigénio de rejeição de tumor” ou “TRAP” que foi a fonte do péptido apresentado.

Para o efeito, foi isolado um ARN total da linha de células SK29-MEL.1, que é um sub clone da SK29-MEL. O ARN foi isolado utilizando um conjunto ligante oligo-dT, seguindo técnicas bem reconhecidas. Quando se fixou o ARN total, o mesmo foi transcrito para ADNc, utilizando novamente metodologias convencionais. O ADNc foi em seguida ligado aos adaptadores EcoRI e clonado para o local EcoRI do plasmídio pcADN-T/Amp, de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídios recombinantes foram em seguida electroporados em JM101 E. coli (condições de electroporação: 1 pulsação a 25 pfarads, 2500 V).

As bactérias transfectadas foram escolhidas com ampicilina (50 pg/ml) e em seguida dividida cm 700 combinação de 200 clones cada. Cada combinação representava cerca de 100 ADNcs diferentes, à medida que a análise mostrou que cerca de 50% dos plasmídios continham uma inserção. Cada combinação foi amplificada até à saturação, e o ADN de plasmídio foi isolado através de lise alcalina, precipitação com acetato de potássio e extracção com fenol, de acordo com Maniatis e col., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). Não foi utilizada centrifugação de gradiente de césio. Exemplo 4

Os plasmídios amplificados foram em seguida transfectados para células eucarióticas. Foram cultivadas amostras de células COS-7, a 15.000 células/furo numa cultura de tecido de microfuros de base plana, num meio Eagles modificado de Dulbeco (“DMEM”) suplementado com 10% de soro de bovino fetal. As células foram incubadas durante toda a noite a 37°C, o meio foi removido e em seguida substituído por meio DMEM a 30 μΐ/fiiro contendo 10% de soro Nu, 400 pg/ml de DEAE-dextrano, 100 μΜ de cloroquina, 100 ng de plasmídio pcADN-I/Amp-A2 e 100 ng de uma combinação da biblioteca de ADNc acima descrita. O plasmídio pcADN-I/Amp-A2 contém o gene HLA-A2 da SK29-MEL. Após quatro horas de incubação a 37°C, o meio foi removido e substituído por 50 μΐ de PBS contendo 10% de DMSO. Este meio foi removido após dois minutos e substituído por 200 μΐ de DMEM suplementado com 10% de FCS.

Após esta alteração de meio, as células COS foram incubadas durante 48 horas a 37°C. O meio foi em seguida descartado, e foram adicionadas 2000 células de ambos os clones CTL descritos, em 100 μΐ de meio Iscove contendo 10% de soro humano combinado. Quando foi utilizado o clone 210/9, o meio foi ® suplementado com 25 U/ml de IL-2. O sobrenadante foi removido após 24 horas, e o conteúdo de TNF foi determinado num ensaio em células WEHI, tal como descrito por Traversari e col., Immunogenetics 35: 145-152 (1992), cuja descrição é incorporada à presente invenção por referência.

Dos 700 furos testados com IVSB, 696 mostraram entre 0,6 e 4 pg de TNF por ml. Os restantes quatro furos continham entre 10 e 20 pg/ml de TNF. Os furos homólogos testados com CTL 210/9 mostraram valores semelhantes claramente superiores. As Figuras 2 e 3 apresentam estes dados.

Exemplo 5

Três de quatro combinações identificadas como produtores elevados φ (números “123”, “181” e “384”) foram escolhidos para experiências adicionais. Especificamente, as bactérias foram clonadas e 570 bactérias foram testadas para cada combinação. O ADN de plasmídio foi extraído dessas bactérias, transfectado para uma nova amostra de células COS na mesma forma tal como acima descrito, e as células foram novamente testadas para estimulação de CTL 210/9 e CTL IVSB. Foi encontrado um clone positivo na combinação 123 (“pl23.B2”) e outro foi encontrado na combinação 384 (“p384.C6”). Foi obtida uma prova convincente de que as células transfectadas foram reconhecidas pelos CTLs realizando um teste comparativo de células COS transfectadas com ADNc e o gene HLA-A2, e células COS transfectadas apenas com HLA-A2. Foi medida a libertação de TNF no CTL sobrenadante testando-o em células WEHI. 9

Foi medida a densidade óptica das células WEHI sobreviventes utilizando MTT. Os resultados são apresentados no Quadro 1:

Quadro 1

ADNc (123.B2) + HLA-A2ADN

Sem ADNc+ HLA-A2

Linha 1 Linha 2 0,087 0,108 0,502 0,562

Os valores de WEHI ODs correspondem a 24 pg/ml de TNF para ADNc e HLA-A2, versus 2,3 pg/ml para o controle.

Os plasmídios dos clones positivos foram removidos e sequenciados de acordo com técnicas conhecidas. Uma busca de sequências revelou que a inserção de plasmídio era quase idêntica à do ADNc para a tirosinase humana, lai como descrito por Bouchard e col., J. Exp. Med. 169: 2029 (1989), cuja descrição é incorporada à presente invenção por referência. Assim, a molécula normalmente ocorrente (isto é, a tirosinase) pode actuar como um precursor de antigénio de rejeição de tumor e ser processada para formar um antige de rejeição de tumor de péptido que é apresentado na superfície de uma célula, em combinação com HLA-A2, estimulando assim a lise por clones CTL. A sequência nucleica da molécula identificada é apresentada como SEQID NO: 1. Exemplo 6:

Um trabalho anterior descrito por Chomez e col., Immunogenetics 35: 241 (1992) mostrou que pequenos fragmentos de gene que contenham uma sequência que codifique para um péptido antigénico resultou na expressão desse péptido. Este trabalho, que é incorporado na íntegra à presente invenção por referência, sugeriu a clonagem de pequenas partes do ADNc da tirosinase humana acima descrita e na SEQ ID NO: 1. Utilizando as metodologias descritas nos exemplos 1-5, foram co-transfectados vários fragmentos de ADNc com um gene para HLA-A2 em células COS-7, e foram realizados ensaios de 10 libertação de TNF. Estas experiências conduziram à identificação de fragmento de aproximadamente 400 pares de base que, quando utilizado em experiências de co-transfecção, provocou libertação de TNF do clone CTLIVSB da célula T citolítica acima descrito, sendo assim específico para células que apresentem HLA-A2. O fragmento de 400 pares de base utilizado correspondeu às bases 711 a 1152 da SEQ ID NO: 1. Foi deduzida a sequência de amino ácidos para a qual o fragmento codifica, e esta sequência foi em seguida comparada com a informação proporcionada por Hunt e col,, Science 255: 1261 (1992) e Falk e col., Nature 351: 290 (1991), cuja descrição è integralmente incorporada na presente invenção por referência. Estas referências descrevem sequências de consenso para péptidos que apresentem HLA-A2. Especifícamente, Hunt descreve nonapéptidos, em que quer Leu quer Ile são sempre encontrados na segunda posição, sendo Leu o “resíduo dominante”. O nono resíduo é descrito como sendo sempre um resíduo com uma cadeia lateral de hidrocarbonetos alifáticos. Vai é o resíduo dominante nesta posição. Hunt descreve um sinal forte para Leu e um sinal intermédio para Met na segunda posição, um de Vai, Leu, Ile ou Thr na posição 6, e Vai ou Leu na posição 9, sendo Vai particularmente forte. Na base da comparação, foram sintetizados nonapéptidos e em seguida testados para verificar se os mesmos podiam sensibilizar células que apresentam HLA-A2. Para o efeito, foram utilizadas as linhas de células variante de perda de tirosinase SK29.MEL 1,218 e T202LB. Foram adicionadas às linhas de células concentrações variáveis dos péptidos testados, juntamente com quer o clone CTL IVSB da célula T citolítica quer o clone CTL 2/9 da célula T citolítica. O trabalho anterior, acima descrito, estabeleceu que o clone anterior efectuou a lise das células que expressam a tirosinase que apresentam HLA-A2, e que o último não o fez.

Os variantes de perda de tirosinase foram incubados durante uma hora num solução contendo 51 Cr, a 37°C, quer com quer sem o anticorpo MA2.1 anti HLA-A2. Nestes testes, as células foram lavadas quatro vezes e em seguida incubadas com diluição variáveis dos péptidos, de 100 μΜ para 0,01 μΜ. Após

i f

30 minutos, foram adicionadas células efectoras numa proporção E/T de 10/1 e quatro horas depois foram recolhidos 100 > de sobrenadante e contada a radioactividade. A Figura 4 mostra os resultados obtidos com o nonapéptido Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gin Vai (SEQID NO: 2).

Este péptido, adiante referido como SEQ ID NO: 2, corresponde aos resíduos 1129-1155 da sequência de ADNc para a tirosinase apresentada na SEQ ID NO: 1. Os complexos de HLA-A2 e este péptido são reconhecidos pelo clone CTT, de CTL IVSB.

Numa experiência paralela, mostrou-se que o clone CTL de CTL 210/9, derivado do paciente LB24, não reconheceu os complexos de HLA-A2 e o péptido da SEQ ID NO: 2, embora tenha reconhecido os complexos de HLA-A2 c um pcptido derivado da tirosinase. Assim, a tirosinase é processada para pelo menos um péptido adicional que, quando apresentados pelas moléculas HLA-A2, é reconhecido pelos clones CTL.

Exemplo 7

Numa experiência seguinte, foi utilizado um segundo fragmento de gene que não codificou o péptido da SEQ ID NO: 2. Este fragmento começou na base 1 e terminou na base 1101 da SEQ ID NO: 1 (isto é, o fragmento EcoRI-Sphl). O clone CTL 210/9 da célula T citolítica, acima descrito, foi testado contra as células COS-7 transfectadas com este fragmento na forma acima descrita. O CTL IVSB foi também testado. Estes resultados mostraram que o LB24-CTL 210/9 reconheceu um antigénio na superfície das células HLA-A2 transfectadas com este fragmento, mas o CTL IVSB não o fez. Assim, um segundo péptido antigénio de rejeição de tumor é derivado da tirosinase. 12

Exemplo 8

De forma a definir adicionalmente o antigénio de rejeição de tumor reconhecido pelo LB24-CTL 210/9, foram realizadas as seguintes experiências.

Um segundo fragmento, correspondente às bases 451-1158 da SEQ ID NO: 1, foi transfectada para as células COS juntamente com um gene para HLA-A2, e foram realizados ensaios de libertação de TNF. Esta sequência provocou libertação de TNF do clone SK29-CTL IVSB (20 pg/ml), mas não do clone LB24-CTL 210/9 (3,8 pg/ml). Estes resultados confirmaram que os dois clones CTL reconheceram diferentes péptidos, e que o péptido reconhecido pelo LB24-CTL 210/9 deverá ser codificado pela região 1-451.

Exemplo 9 O péptido derivado da tirosinase codificado pelo fragmento de ADNc 1-451 foi analisado para sequências de consenso que se sabe ligarem a HLA-A2. Os péptidos correspondentes a estas sequências de consenso foram sintetizados, e testados para a sua capacidade dc sensibilizar as células que apresentam HLA-A2. Para o efeito foram utilizadas duas linhas de células de melanoma negativas de tirosinase (isto é, NA8-MEL e MZ2-MEL 2,2 transfectadas com HLA-A2), e foi utilizada a linha de células T2, tal como descrita por Salter e col., Immunogenetics 21: 235-246 (1985).

As células foram incubadas com 51 Cr e anticorpo MA.2.1 monoclonal, que é especifico para HLA-A2, durante 50 minutos a 37°C seguido de lavagem (ver Bodmer e col., Nature 342: 443-446 (1989), cuja descrição é integralmente incorporada na presente invenção por referência). As células alvo foram incubadas com várias concentrações dos péptidos, e com um dos clones LB24-CTL 210/5 e 210/9. A percentagem de libertação de crómio foi medida após quatro horas de incubação.

Verificou-se que o péptido Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu (SEQ ID NO: 3) era activo.

Em experiências adicionais resumidas na presente invenção, o CTL-IVSB que previamente se mostrou reconhecer YMNGTMSQV, não reconhecia o péptido da SEQID NO: 3.

Os resultados são resumidos nos Quadros 2-4 seguintes:

Quadro 2

PÉPTIDO YMNGTMSQV MLLAVLYCLL (1120-1155) (25-54) SK29-CTL-IV SB + - LB24-CTL-210/5 - + LB24-CTL-210/9 - +

Quadro 3 3/93 - Lise de MZ2-2.2-A2 sensibilizada com péptidos da tirosinase pelo LB24-CTL 210/5 e 210/9 e pelo SK29-CTLIVSB.

Efectores Péptidos Dose MZ2.2.2.A2 + anti-A2* LB24-CTL MLLAVLYCLL 10μΜ 18 210/5 (LAUS 17-5) 3 17 (44:1) 1 16 YMNGTMSQV 30M 1 (MAINZ) 10 1 LB24-CTL MLLAVLYCLL 10μΜ 18 210/9 (LAUS 17-5) 3 17 (30:1) 1 15 YMNGTMSQV 30M 1 (MAINZ) 10 1 3 1 SK29-CTL. MLLAVLYCLL ΙΟμΜ 1 IVSB (LAUS 17-5) 3 1 (40:1) 1 1 YMNGTMSQV 30μΜ 68 (MAINZ) 10 68 3 62 *As células alvo foram incubadas com Cr51 e mono-Ab MA2.1 (anti-HLA-A2) durante 50 min., em seguida lavadas 3 vezes.

Elas foram incubadas com várias concentrações de péptidos durante 30 min..

As células de CTL foram adicionadas na proporção (E:T) indicada. A % específica de libertação de Cr51 foi medida após 4 h de incubação.

Quadro 4 8/93 : Teste de péptidos de tirosinase reconhecidos pelo LB24-CTL 210/5 e 210/9 ou pelo SK29-CTLIVSB. (% de libertação específica de Cr51)

Efectores Péptidos Dose NA8-MEL* MZ2-2.2: A2 T2 LB24-CTL. MLLAVLYCLL ΙΟμΜ 30 31 36 210/5 (LAUS 17-5) 3 23 27 35 1 17 20 26 (41:1) 300nM 6 17 16 100 2 8 5 30 3 5 2 0 0 0 0 LB24-CTL. MLLAVLYCLL ΙΟμΜ 14 19 21 210/9 (LAUS 17-5) 3 13 17 20 1 9 14 13 (26:1) 300nM 3 9 5 100 1 1 1 30 0 1 0 0 0 1 0 SK29-CTL. YMNGTMSQV ΙΟμΜ 46 46 59 IVSB (MAINZ) 3 38 44 52 1 27 40 46 (42:1) 300nM 14 22 34 100 3 13 21 30 1 9 10 10 1 3 3 3 0 3 4 1 0 1 0 0 0 4 0 spt. rei. 339 259 198 max-spt 2694 1693 1206 % 11 13 14 10 *As células alvo foram incubadas com Cr51 e mono-Ab MA2.1 (anti-HLA-A2) durante 50 min., em seguida lavadas 3 vezes.

Elas foram incubadas com várias concentrações de péptidos durante 30 min..

As células de CTL foram adicionadas na proporção E:T indicada. A % específica de libertação de Cr51 foi medida após 4 h de incubação.

Exemplo 10

Foram realizadas experiências adicionais utilizando o clone CTL 22/31. Este clone foi previamente mostrado como realizando a lise a sublinha MZ2-MEL.43 a linha de células de melanoma autóloga MZ2-MEL, mas não efectuou a lise de outras sublinhas, tais como MZ2-MFL 3.0 e MZ2-MEL 61.2, nem efectuou a lise de células B transformadas com EBV autólogas, ou a linha de célula letal K562 (ver Van der Eynde e col., lnt. J. Câncer 44: 634-640 (1989). O antigénio apresentado por MZ2-MEL.43 é referido como antigénio C.

No trabalho anterior incluindo o descrito na parte principal do presente pedido, verifícou-se que o gene de tirosinase codifica um antigénio reconhecido por CTLs autólogas na maior parte dos melanomas HLA-A2. A expressão deste gene nas sublinhas da linha de células MZ2-MEL foi testada por amplificação de FCR. Verificou-se que o clone MZ2-MEL.43 era positivo, enquanto que os outros clones MZ2-MEL, tal como o MZ2-MEL.3.0, eram negativos. A correlação da expressão do gene de tirosinase e do antigénio MZ2-C, sugeriu que o MZ2-C podia ser um antigénio de rejeição de tumor derivado da tirosinase, e apresentado por uma molécula HLA expressa pela MZ2-MEL. Esta linha de células não expressa HLA-A2, o que deveria indicar que se o péptido derivado da tirosinase fosse apresentado como um TRA, seria implicada uma segunda molécula HLA.

Foram realizados estudos para identificar qual a molécula HLA apresenta o antigénio C para CTL 22/31. Para o efeito, foram isolados clones de ADNc das moléculas HLA conhecidos como estando na superfície da célula, isto é, HLA-A29, HLA-B37, HLA-B 44.02, e o clone HLA-C 10 de uma biblioteca de ADNc MZ2-MEL.43, e em seguida clonado num vector da expressão pcADNI/Amp. As células COS 7 recipientes foram em seguida transfectadas com uma destas construções ou uma construção contendo HLA-A1, mais ADNc que codifica para a tirosinase (SEQ ID NO: 1). A contransfecção seguiu o método acima estabelecido. Um dia depois foi adicionado CTL 22/31 e, 24 horas depois, foi medida a libertação de TNF testando a citotoxidade na WEHI-164-13, de acordo com Traversari e col., acima. A Figura 6 mostra que o TNF foi libertado pelo CTL 22/31 apenas na presença de células transfectadas quer com HLA-B44 quer com tirosinase. A conclusão a ser retirada deste facto é que a HLA-B44 apresenta um antigénio de rejeição de tumor derivado da tirosinase.

As experiências anteriores demonstram que a tirosinase é processada como um precursor de antigénio de rejeição de tumor, conduzindo à formação de complexos dos antigénios de rejeição de tumor resultantes com uma molécula em, pelo menos, algumas células anormais, por exemplo, células de melanoma com o fenótipo HLA-A2 ou HLA-B44. O complexo pode ser reconhecido por CTLs, e efectuada a lise da célula apresentadora. Esta observação possui ramificações terapêuticas e diagnósticas que são características da invenção. Em relação às terapias, a observação de que são produzidos CTLs que são específicos para células anormais que apresentam os complexos acima mencionados, sugere várias abordagens terapêuticas. Uma tal abordagem é a administração de CTLs específicos para o complexo a um indivíduo com células f anormais do fenótipo em causa. E do conhecimento do especialista desenvolver tais CTLs in vitro. Especificamente, uma amostra de células, tais como células sanguíneas, são colocadas em contacto com uma célula que apresenta o complexo e é susceptível de provocar a proliferação de um CTL específico. A célula alvo pode ser um transfectante, tal como a célula COS do tipo acima descrito. Estes transfectantes apresentam o complexo desejado nas suas superfícies e, quando combinados com um CTL de interesse, estimulam a sua proliferação. De modo a permitir ao especialista produzir estes CTLs foram depositados vectores contendo os genes de interesse, isto é, pcADN-1/Ampl (HLA-A2), e pl23.B2 (tirosinase humana) de acordo com o Tratado de Budapeste no Instituto Pasteur, sob os Números de Acessão 11275 e 11276, respectivamente. As células COS, tal como as utilizadas na presente invenção estão bastantes disponíveis, tal como o estão outras células hospedeiras adequadas.

Para pormenorizar a metodologia terapêutica, referida como transferência adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5) : 1917 (1986); Reddel e col., Science 257 : 238 (7-10-92); Lynch e col., Eur. J. Immunol. 21 : 1403-1410 (1991); Kast e col., Cell 59 : 603-614 (11-17-89)), são combinadas células que apresentam o complexo desejado com CTLs que conduzem à proliferação dos CTLs delas específicos. Os CTLs proliferados são em seguida administrados a um indivíduo com uma anomalia celular que é caracterizada por certas células anormais apresentarem o complexo particular. Os CTLs efectuam assim a lise das células anormais, obtendo-se assim o objectivo terapêutico desejado. A terapia precedente assume que pelo menos algumas da células anormais do indivíduo apresentam um ou mais dos complexos de HLA/péptido derivado da tirosinase. Isto pode ser facilmente determinado. Por exemplo, são identificados CTLs utilizando os transfectantes acima descritos, e quando isolados, eles podem ser utilizados com uma amostra de células anormais de um indivíduo para determinar a lise in vitro. Se for observada lise, então a utilização de CTLs específicos nessa terapia pode aliviar a condição associada com as células anormais. Uma metodologia menos envolvente examina as células anormais para o fenótipo HLA utilizando ensaios convencionais, e determina a expressão da tirosinase através de amplificação utilizando, por exemplo, PCR. O facto de várias moléculas HLA diferentes apresentarem TRAs derivados da tirosinase aumenta o numero de indivíduos que são considerados pacientes adequados para as terapias descritas na presente invenção. A transferência adoptiva não é a única forma de terapia que está disponível de acordo com a invenção. Os CTLs podem também ser provocados in vivo, utilizando uma série de abordagens. Uma abordagem, isto é, a utilização de células não proliferativas que expressam o complexo, foi elaborada de acordo com a descrição acima. As células utilizadas nesta abordagem podem ser aquelas que normalmente expressam o complexo, tais como células de melanoma irradiadas ou células transfectadas com um ou mais dos genes necessários para a apresentação do complexo. Chen e col., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 110-114 (Janeiro, 1991) exemplifica esta abordagem, mostrando a utilização de células transfectadas que expressam os péptidos HPVE7 num regime terapêutico. Podem ser utilizados vários tipos de células. De forma semelhante, podem ser utilizados vectores que transportam um ou mais dos genes de interesse. São especialmente preferidos vectores virais ou bacterianos. Nestes sistemas, o gene de interesse é transportado por, por exemplo, um vinis Vaccinia ou as bactérias BCG, e materiais de células hospedeiras de “infecção”. As células que resultam apresentam o complexo de interesse, e são reconhecidas por CTLs autólogos, que em seguida proliferam. Um efeito semelhante pode ser conseguido combinando a própria tirosinase com um adjuvante para facilitar a incorporação nas células que apresentam HLA-A2. A enzima é em seguida processada para produzir o parceiro de péptido da molécula HLA. A descrição precedente refere-se a “células anormais” e “anomalias celulares”. Estes termos são utilizados no seu sentido mais amplo, e referem-se a qualquer situação em que as células em questão exibem pelo menos uma propriedade que indica que elas diferem das células normais dos seus tipos específicos. Os exemplos de propriedades anormais incluem, por exemplo, alterações morfológicas e bioquímicas. As anomalias celulares incluem tumores, tais como melanoma, perturbações auto-imunes, e assim por diante. A invenção proporciona também um método para a identificação de precursores para alvos CTL. Estes precursores são referidos como antigénios de rejeição de tumor quando as células alvo são tumores, mas deve salientar-se que quando a célula caracterizada pela anomalia não é um tumor, deverá ser de alguma forma enganador referir-se a molécula como sendo um antigénio de rejeição de tumor. Essencialmente, o método envolve a identificação de uma célula que seja o alvo de uma célula T citolítica do tipo acima descrito. Quando essa célula é identificada, o ARN total é convertido numa biblioteca de ADNc, que é em seguida transfectada para uma amostra de células susceptíveis de apresentar um antigénio que forma um complexo com a molécula HLA relevante. Os transfectantes são colocados em contacto com o CTL acima descrito, e novamente, é observado o destino pelo CTL (lise e/ou produção de TNF). Estes transfectantes que são lisados são em seguida tratados para terem o ADNc removido e sequenciado, e desta forma pode ser identificado um precursor para uma condição anormal, tal como um precursor de antigénio de rejeição de tumor.

Outros aspectos da invenção serão claros para o especialista e não necessitam de ser repetidos na presente invenção.

Os termos e expressões que foram utilizados são usados como termos de carácter descritivo e não limitativo. (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTES: Boon -Falleur, Thierry; Brichard, Vicent; Van Pel, Aline; DePlaen, Etienne; Coulie, Pierre; Renauld, Jean Christophe; Wolfel, Thomas; Lethe, Bemard

(ii) TÍTULO DA INVÇNÇÃO: MÉTODO PARA A

IDENTIFICAÇÃO DE INDIVIDUOÇ QUE SOFREM DE UMA ANOMALIA CELULAR CUJA ALÇUMAS CÉLULAS ANORMAIS APRESENTAM COMPLEXOS DE PEPTIDOS DERIVADOS DA , TIROSINASE DE ANTIGÉNIO DE LEUCÓCITOS HUMANOS, E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DOS REFERIDOS INDIVÍDUOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) MORADA PARA ÇORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Felfe & Lynch (B) RUA: 805 Third Avenue (C) CIDÃDE: Nova Iorque (D) ESTADO: Nova Iorque

(E) PAIS: EUA (F) CODTGO POSTAL: 10022 (v) FORMA LEGÍVEL PARA O COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete, 5,25 polegadas, 360 kb de capacidade 21 (vi) (B) DADOS PE PEDIDO ANTERIOR: (A) NUMERO DO PpDIDO: 08/054.714 (B) DATA DE DEPOSITO: 28 de Abril de 1993 (A) NUMERO DO PEDIDO: 994.928 (B) DATA DE DEPOSITO: 22 de Dezembro de 1992 NÚMERO DO PEDIDO: 08/081.673 DATA DE DEPOSITO: 23 de Junho de 1993 (vii) DADOS PO PEDIDO ACTUAL: (A) NUMERO DO PJEDIDO: PCT/US93/12200 (B) DATA DE DEPOSITO: 14 de Dezembro de 1993 (viii) INFORMAÇÃO DO PROCURADOR/MANDATÁRIO: (A) NQME: Hanson, Norman D. (B) NUMERO DE REQISTO: 30.946

PCT (C) REFERENCIA/NUMERO DE DOCUMENTO: LUD 299.2- (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (212) 688-9200 (B) TELEFAX: (212) 838-3884

COMPUTADOR: IBM PS/2 SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS SOFTWARE: WordPerfect INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: \: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 1906 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) N° DE ESPIRAIS: uma (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 1: 22 GACCTTGTGA GGACTAGAGG AAGA ATG CTC CTG GCT GTT TTG TAC TGC CTG 5i Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu s _ \ 5 CTG 7GS AGT TTtr CAG ACT TCC-GCT GGC -CAT • TTC-"CCT AGA GCC TGT GTC 99 Leu 10 Trp Ser Phe Gin Thr Ser 15 Ala Gly His Phe 20 Pro Arg Ala Cys Vai 25 TCC TCT AAG AAC CTG ATG GAG AAG GAA TGC TGT CCA CCS TGG AGC GGG 147 Ser Ser Lys Asn Leu 30 Met Glu Lys Glu Cys 35 Cys Pro Pro Trp ser 40 Gly GAC AGG AGT ccc TGT GGC CAG TCA GGC AGA GGT TGT CAG AAT 195 Aap Arg Ser Pro 45 Cys Sly Gin Leu Ser 50 Gly Arg Gly Ser Cys 55 Cln Asn ATC CTG TCC AAT GCA CCA CTT GGG CCT CAA TTT CCC TTC ACA GGG 243 Ile Leu Leu 60 Ser Asn Ala Pro Leu 65 Gly Pro Gin Phe Pro 70 Phe Gly GTG GAT GAC CGG GAG «V4 XVjÇ? CCT TCC GTC TTT TAT AAT AGG ACC TGC 291 Vai Asp 75 Asp Arg Glu Ser Tro 80 Pro Ser Vai Phe Tyr Asn 85 Arg «nhy Cys Cmu TGC rm, ii )i GGC AAC TTC ATG GGA ipmini^i AAC TGT GGA AAC TGC AAG TTT 339 Gin 90 Cys Ser Gly Asa Phe Met 95 Gly Phe Asn Cys 1Ò0 Gly Asn Cys Lvs Phe 105 GGC TTT TGG GGA CCA AAC TGC ACA GAG AGA CGA CTC TTG GTG AGA AGA 387 Gly Phe Trp Glv Pro 110 Asn Cys THr· Glu Aro 115 Arg Leu Leu Vai Arg Arg 120 AAC ATC TTC GAT TTG AGT GCC CCA GAG AAG GAC AAA TTT TTT GCC TAC 435 Asn lie Phe Aso 125 Leu Ser Ala Pro Glu Lys 13 0 Asp Lvs Phe Phe 135 Ala Tyr CTC ACT TTA GCA AAG CAT ACC ATC AGC -íCA GAC áAT GTC ATC CCC ATA 4 83 wâli Thr Leu 140 Ala Lys His Thr Ile 145 Ser Ser Asp Tyr Vai 150 lie Pro Ile GGG ACC TAT Gvjw CAA ATG AAA AAT GGA TCA ACA CCC ATG TTT AAC GAC 53'

Gly Thr Tyr Gly Gin Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp 1S5 160 165 ATC * « pm ATT TAT GAC CTC TTT GTC TGG ATG CAT TAT GTG TCA ATG 579 Ile Asn Ile Tyr Aso Leu Phe Vai Trp Met His Tyr Tyr Vai Ser Met 170 GAT GCA CTG CTT GGG 175 GGA TCT GAA ATw ' 180 TGG AGA GAC ATT GAT TTT 1Θ5 ’ GCC 627 Asp Ala Leu Leu Gly Gly Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala CAT GAA GCA CCA 190 GCT TTT CTG CCT TGG 195 CAT AGA CTC TTC TTG 200 TTG CGG 675 His Glu Ala Pro Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe 'Leu Leu Arg GAA CAA 205 GAA ATC CAG AAG CTG 210 ACA GGA GAT GAA AAC 215 TTC ACT ATT 723 Trp Glu Gin Glu Ile Gin Lys Leu Thr Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile CCA TAT 220 TGG GAC TGG CGG GAT 225 GCA GAA AAG TGT GAC 230 ATT TGC ACA GAT 771 Pro Tyr Trp Asp Trp Arg Aso Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp GAG 235 TAC ATG GGA GGT 240 CAG CAC CCC ACA AAT CCT 245 AAC TTA CTC AGC CCA Θ19 Glu Met Glv Gly Gin His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro 250 GCA TCA TTC TCC 255 TCT TGG CAG ATT 260 GTC TGT AGC CGA TTG GAG 265 GAG 867 Ala Ser Phe Phe Ser Ser Trp Gin Ile Vai Cvs Ser Arg Leu Glu Glu TAC AAC AGC CAT 270 CAG TCT TTA AAT 275 GGA ACG CCC GAG GGA 280 CCT TTA 915 Tyr Asn Ser His Gin Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu CGG CGT AAT 205 CCT GGA AAC CAT GAC 390 AAA TCC AGA ACC CCA 295 AGG CTC CCC 963 23 1011

1011 AAAGCCTGAC- CTCACTCTAA CTCAAAGTAA TGTCCAGGTT ATTTTTCTGT AAAGACCATT TGCAAAATTG TAACCTAATA ACTCAGGTAG AACACACCTG TCTTTGTCTT GCTGTTTTCA CCCCTAAGCC CATATGTCTA AGGAAAGGAT GCTATTTGGT ATGTGAATTA AAGTGCTCTT ATTTT

Arg Arg Asn Pro Gly Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro 300 305 3X0

TCT TCA GCT GAT G7A GAA 7TT TGC CTG AGT TTG ACC CAA TAT GAA TCT

Ser Ser Ala Asp Vai Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gin Tyr Glu Ser 315 320 325

GGT TCC ATG GAT AAA GCT GCC AAT TTC AGC TTT AGA AAT ACA CTG GAA

Gly Ser Mec Asp Lys Ala Ala Asn Phe ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu 330 335 340 345

GGA TTT GCT AGT CCA CTT ACT GGG ATA GCG GAT GCC TCT CAA AGC AGC

Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr Gly Xle Ala Asp Ala Ser Gin Ser Ser 350 35S 360

ATG CAC AAT GCC TTG CAC ATC TAT ATG AAT GGA ACA ATG TCC CAG GTA

Mec His Asn Ala Leu His Ile Tyr Mec Asn Gly Tyr Met Ser Gin Vai 365 370 375

CAG GGA TCT GCC AAC GAT CCT ATC TTC CTT CTT CAC CAT GCA TTT' GTT

Gin Gly Ser Ala Asn Aso Pro lie Phe Leu Leu His His Ala Phe vai 380 ‘ 385 390

GAC AGT ATT TTT GAG CAG TGG CTC CAA AGG CAC CGT CCT CTT CAA GAA

Asp Ser He phe Glu Gin Trp Leu Gin Arg His Arg Pro Leu Gin Glu 395 400 405

GTT TAT CCA GAA GCC AAT GCA CCC ATT GGA CAT AAC CGG GAA TCC TAC

Vai Tyr Pro Glu Ala Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr 410 415 420 425

ATG GTT CCT TTT ATA CCA CTG TAC AGA AAT GGT GAT TTC TTT ATT TCA

Mec Vai Pro Phe Ile Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser 430 . 435 440

TCC AAA GAT CTG 53C TAT GAC TAT AGC TAT CTA CAA GAT TCA GAC CCA

Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gin Ásp ser Aso Pro 445 ’ 450 ‘ 455

GAC TCT TTT CAA GAC TAC ATT AAG TCC TAT TTG GAA CAA GCG AGT CGG

Asn Ser Phe Gin Aso Tvr Ile lys Ser Tyr Leu Glu Gin Ala Ser Arg 460 465 470

ATC TGG TCA TGG CTC CTT GGG GCG GCG ATG GTA GGG GCC GTC CTC ACT

Ile Trp Ser Trp Leu Leu Gly Ala Ala Met vai Gly Ala Vai Leu Thr 475 480 485

GCC CTG CTG GCA GGG CTT GTG AGC TTG CTC TCT CCT CAC AAG AGA AAG

Ala Leu Leu Ala Gly Leu Vai Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lvs 490 495 500 505

CAG CTT CCT GAA GAA AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC

Gin Leu Pro Glu Glu Lvs Gin Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr 510 515 520 CAC AGC TTG TAT CAG AGC CAT TTA TAAAA5GCTT AGGCAATAGA 5TAG53CCAA His Ser Leu Tyr Gin Ser His Leu

CCCAGAGAAT ATCTGCTGGT CAAAGTGTAG CCTTCTTCCA CTCAGCCCTT T7AACATTTT AATGAGGAAC TGTTATTTGT 1059 1107 1155 : 1203 1251 12 99 1347 13 95 1443 i 1491 1539 1537 1641 1701 1761 1821 1881 1906 24 (2) Ρ TNFORMAÇAO PARA A SEQID NO: 2: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 amino ácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) N° DE ESPIRAIS: uma (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 2:

Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gin Vai (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: (i) CARÃCTERISTICAS DA SEQUENCIA: (Ã) COMPRIMENTO: 10 amino ácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) N° DE ESPIRAIS: uma (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 3:

Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu 5 10

Lisboa, 8 de Fevereiro de 2001.

25

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido isolado consistindo da sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
2. Método para a determinação da presença de células T citolíticas específicas das células de melanoma numa amostra como um diagnóstico de melanoma num indivíduo a partir do qual a amostra foi colhida, caracterizado por contactar-se uma amostra contendo células sanguíneas mononucleares de um indivíduo de interesse com células de melanoma que apresentem, na sua superfície, complexos de moléculas HLA-A2 e o péptido Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, e determinar-se uma das seguintes situações (i) proliferação de células T citolíticas na referida amostra contendo células sanguíneas mononucleares e (ii) lise das referidas células de melanoma, como uma determinação da presença de células T citolíticas específicas das células de melanoma na referida amostra, sendo a referida presença indicadora de melanoma no referido indivíduo.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se determinar a proliferação de células T citolíticas medindo a libertação do factor de necrose de tumores.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por se determinar a lise das referidas células medindo a libertação de crómio rádio-marcado.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4, caracterizado por as referidas células que apresentam os referidos complexos terem sido transfectadas com pelo menos um de (i) uma molécula de ácido 1 nucleico que codifica para uma molécula de HLA e (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4, caracterizado por as referidas células terem sido transfectadas com (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma molécula de HLA e com (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase.
7. Composição para utilização num tratamento terapêutico, caracterizado por compreender um péptido isolado de acordo com a reivindicação 1.
8. Composição para utilização num tratamento terapêutico, caracterizado por compreender um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
9. Composição caracterizada por compreender células que apresentam um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu na sua superfície, em que as referidas células foram transfectadas com uma ou ambas de (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma molécula HLA e (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase, ou uma sua parte que inclui a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por compreender células que apresentam o referido complexo na sua superfície.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por as células serem transfectantes.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por as referidas células terem sido transfectadas com uma ou ambas de (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma molécula HLA e (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase, ou uma sua parte que inclui a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
13. Composição de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 12, caracterizada por as células terem sido transfectadas com um ou ambos os vectores pcADN-1/Ampl e pl23.B2, depositados no Instituto Pasteur sob os números de acesso 11275 e 1 1276, respectivamente.
14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada por as células serem não-proliferativas.
15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizada por as células serem células de rnelanoma.
16. Composição para utilização num tratamento terapêutico, caracterizada por compreender um vector capaz de provocar uma resposta T citolítica às células que apresentam um complexo de uma molccula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, transportando o referido vector (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase, ou uma sua parte que inclui a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu e, opcionalmente, (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a molécula HLA.
17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizada por a referida composição ser para utilização numa terapia de tumor.
18. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o tumor ser o melanoma.
19. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 7, 8, 14 e 16, caracterizada por a referida composição ser para utilização num tratamento terapêutico envolvendo a administração da composição a um indivíduo com uma anomalia celular caracterizada por certas células anormais apresentarem um complexo de uma molécula HLA compreendendo um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada por a referida composição ser para utilização num tratamento terapêutico envolvendo o contacto de uma amostra de células sanguíneas com a composição, para gerar células T Citolíticas específicas para um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, e a administração das células T Citolíticas a um indivíduo com uma anomalia celular caracterizada por certas células anormais apresentarem o complexo.
21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 20, caracterizada por a molécula HLA ser uma molécula HLA-A2.
22. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 21 na preparação de um medicamento para utilização numa terapia de tumor.
23. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 21 na preparação de um medicamento para utilização na terapia de uma anomalia celular que é caracterizada por certas células anormais apresentarem um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
24. Utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o tumor ser o melanoma.
25. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por a terapia envolver a administração de células T Citolíticas específicas para um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
26. Utilização de acordo com a reivindicações 25, caracterizada por as células T Citolíticas serem geradas in vitro.
27. Utilização de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por a composição ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15 e as células T Citolíticas serem geradas pelo contacto de uma amostra de células sanguíneas com a composição.
28. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por a terapia envolver a geração de resposta CTL in vivo.
29. Utilização de acordo com reivindicação 28, caracterizada por o referido tratamento envolver a administração da composição a um indivíduo com uma anomalia celular caracterizada por certas células anormais apresentarem um complexo de uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
30. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizada por a molécula HLA é a molécula HLA-A2.
31. Método para gerar células T Citolíticas específicas para um complexo caracterizado por compreender uma molécula HLA e um péptido tendo a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu, compreendendo o referido método a fase de contactar-se uma amostra de células sanguíneas com o referido complexo.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a molécula HLA ser a molécula HLA-A2.
33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou a reivindicação 32, caracterizado por as células terem sido transfectadas com pelo menos uma de (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica para HLA-A2 e (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica para a tirosinase, ou uma sua parte que inclui a sequência de amino ácidos Met Leu Leu Ala Vai Leu Tyr Cys Leu Leu.
34. Método para a preparação de uma composição para utilização num tratamento terapêutico, caracterizada por compreender a realização de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o referido tratamento se aplicar ao cancro, de preferência ao melanoma. Lisboa, 8 de Fevereiro de 2001. Pela Requerente O Agente Oficial

R. D. Jcõo V, 9-2“ dr - Í250 USBOÀ 6