JPH06511149A - 免疫反応性ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −Ｃ：ウィルレスのボ１ペプチド 技１しＬ証 本発明は、一般的に、免疫反応性ポリペプチド組成物、この組成物を免疫学的な 適用において用いる方法、ならびにこの組成物を製造するための物質および方法 に関する。

Ｃ型肝炎ウィルスは、最近では、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因 となる主な因子、および集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）Ｎ ＡＮＢＨの重大な原因として同定されている。このウィルスのゲノム配列を得る ための物質および方法は、公知である。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ３９１０４６ ６９号、第Ｗ０９０／１１０８９号、および第Ｗ０９０／１４４３６号を参照の こと。

ＨＣＶゲノムの分子的特徴は、約３０１１個のアミノ酸からなるポリタンパク質 をコードする約１０．０００個のヌクレオチドを含有する正の極性のＲＮＡ分子 であるということを示す。その証拠となる数種の系は、ＨＣＶがフラピウイルス およびペスチウイルスを包含するワラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ） 科のウィルスと同様の遺伝子構成を有することを示唆する。そのペスチウイルス およびフラビウイルスの系統と同様に、ＨＣＶは、個々のウィルスのタンパク質 （構造および非構造の両者）がプロセッシングによって生じる、大きなポリタン パク質前駆体をフードすると考えられる。

ＲＮＡ含有ウィルスは、比較的高い割合の自然変異、すなわち報告によると、組 み込まれているヌクレオチドあたりおよそ１０−１から１０−１の割合で自然変 異を有する。従って、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）および遺伝子型の 流動率は［ｌＮＡウィルスでは共通であるので、多様なウィルスの単離体が存在 し得る。その単離体は、ＨＣＶ橿においてビルレントまたは非ビルレントであり 得る。

ＨＣＶの異なる単離体の多くが、現在同定されている。これらの単離体の配列は 、ＲＮＡウィルスの限定された異質性の特徴を示す。

単離体ＨＣＶＪ１．１は、以下の刊行物に記載されている：２つの独立した単離 体（ｒＨｃＶ−月およびｒＢＫＪ　”）の５゛−および３−末端の配列を加えた 完全コード配列は、それぞれ、ＫａｔＯら、およびＴａｋａｌｌｉｚａｖａらに よって記載されている。

＋Ｋａｔｏ　ら　（１９９０）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、　Ａｃａｄ−５ｃｉ、　ＵＳＡ　、［＝９５２４−９５ ２８；　Ｔａ）ｃａｍｉｚａｗａら（１５９１３，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ−、ｉｆｉ ：ｌ工。５−１１３．）（以下余白） ＨＣＶ単離体について記載されている池の刊行物は、以下。とおりである： ”ＨＣＶ−１”：　Ｃｈｏｏ　Ｃ，（１９９０１，Ｂｒ１ｅ、　Ｍｅｄ。

Ｂｕｌｌ、ｉｆＬ：４２３−４４Ｊ　Ｃｈｏｏ　ら　（１９り１）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｅｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ｊｌｉ：２４５１−２４５５；　 Ｍａｎら（１９９１）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　Ｊｉｊｌ：１７１１−１’１５；　Ｅ’ｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｅｅｎｅ 　Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎ　Ｎｏ、　３１８，２１６゜１ＨＣ−Ｊｌ”　、ｌ〒 よｙ”　”ＨＣ−Ｊ４”：　Ｏ）ｃａｍｏｅｏ　う（１９９１）　、　Ｊａｐａ ｎ　Ｊ、　ｌｃｐ、　Ｍｅｄ、　雌：１６７−１７７゜四ＨＣＴ　１８四、”Ｈ ＣＴ　２３″、τｈ″、”ＨＣＴ　２７”、ＷＥＣＩ”ａｎｄ　”Ｅｃｈｏ”： 　Ｗｅｉｎｅｒ　ら　（１９１）、Ｖｉｒｏｌ。

２鴇：８４２Ｊ１４８゜ ＠Ｐｅ４−　”ＨＣＶ−Ｋｌ”ｉよ１を曽ＨＣＶ−に２”：　Ｒｎａｍｏｅｏ　 Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｆｆｌｅｎｔ　ｏｆ工ｎセｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　 ＫａｎａｚａｗａＭｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｊａｐａｎ。

診断およびワクチンの戦略に対する典型的なアプローチ（ｉ、保存されたウィル スのドメイン（こ注目することである。し力）し、このアプローチは、可変ドメ インにおいて存在し得る重要なエピトープを無視するという不利益を生む難点が ある。

本発明の目的は、多数のＨＣｖ単離体（特にこのウィルスの異質性（ｈｅｔｅｒ ｏｇｅｎｅｏｕｓ）ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプ チド組成物を提供することである。

λ囲旦１１ 多くの重要なＨＣＶエピトープは、ウィルスの単離体の間では変化し、そしてこ れらのエピトープは、特定のドメインに位置づけられ得ることが発見された。こ の発見は、　（保存されたドメインよりもむしろ）可変ドメインに注目する免疫 学的に交差反応性のポリペプチド組成物を製造するという戦略を可能にする。

従って、本発明の１実施態様は、ポリペプチドを含む免疫反応性組成物である。

ここで、このポリペプチドは、　ＨＣＶの第一の可変ドメイン中のエピトープの アミノ酸配列を含有し、そして別個のＦＩＣＶ単離体の第一の可変ドメイン由来 の少なくとも２種の異質性アミノ酸配列が、この組成物中に存在する。

本発明の別の実施態様は、複数の抗原セットを含有する免疫反応性組成物である 。ここで、（ａ）各抗原セットは、ＨｃＶ単離体の第一の可変ドメイン中に存在 するエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからな り、そして（ｂ）１つのセットのエピトープのアミノ酸配列は、類似の配列を有 する少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列に関して異質性である。

本発明の別の実施態様は、複数のポリペプチドを含有する免疫反応性組成物であ って、ここで各ポリペプチドは次式を有する： Ｒｒ（Ｓ　Ｖ−）　ｘ　Ｒ’　ｒ・ ここで、 ＲおよびＲｏは、約１−２０００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、そ してそれらは同一であるかまたは異なり；ｒおよびｒｏは、０または１であり、 そしてそれらは同一であるかまたは異なり； Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含有するアミノ酸配列であって、ここで、該 可変ドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有し； Ｓは、１以上の整数であり、選択された可変ドメインを表し：そして ｎは、１以上の整数であり、異なるｎの値を有する少なくとも１種の他の単離体 に関して、所定のＳＶで選択された異質性ＨＣＶ単離体を表し、そしてｎは各Ｘ に対して独立して選択され；Ｘは、１以上の整数であり；そして ただし、アミノ酸配列は、Ｎ）ＩＶ＋およびＩＶ２、（ｉｔ＞ＩＶ＋および２Ｖ ２、および（ｉｉｉ）ＩＶ＋および２Ｖ＋からなる群から選択される組合せを表 す組成物中に存在する。

本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）を包含する 、ＨＣｖの処置のための免疫原性の薬剤組成物を調製する方法である： （ａ）上記免疫反応性組成物を提供すること；（ｂ）適切な賦形剤を提供するこ と；および（ｅ）Ｉ！乳動物へ投与することにより免疫原性の応答を提供する割 合で、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の賦形剤とを混合すること。

本発明のさらに別の実施態様は、上記免疫反応性組成物の有効量を哺乳動物に投 与することを包含する、抗ＨＣＶ抗体を産生ずる方法である。

本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｄ）を 包含する、生物学的試料中で）ＩＣＶに対する抗体を検出する方法である： （ａ）　）ＩＣＶに対する抗体を含有すると推測される生物学的試料を提供する こと； （ｂ）上記免疫反応性組成物を提供すること；（ｃ）抗原−抗体複合体が形成さ れるような条件下で、（ａ）の生物学的試料と（ｂ）の免疫反応性組成物とを反 応させること；および （ｄ）必要に応じて、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の生物学的試料の抗体 との間で形成される抗原−抗体複合体の形成を検出すること。

本発明の別の実施態様は、適切な容器中に入れられた上記免疫反応性組成物を含 有する生物学的試料中で、ＨＣＶに対する抗体を検出するためのキットである。

図面の簡単な説明 図１は、ＨＣｖゲノムの遺伝学的な構築を図式的に示す。

図２は、１群および１１群のＨＣｖ単離体によってコードされるＥ１タンパク質 の推定アミノ酸配列の比較を示す。

図３は、ＨＣｖ単離体の推定Ｅ２／ＮＳＩ領域のアミノ酸配列の比較図４は、推 定ＨＣｖＥ２／ＮＳＩタンハク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミン末端領 域、および旧Ｖ−ｔのｇｐ　１２０　Ｖ３超可変領域に関する抗原性プロフィー ルを示すグラフである。

図５は、ＨＣＶ　Ｅ２／ＮＳＩタンハク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミ ノ末端領域由来の所定の残基が、α−ヘリックス、β−シートまたはβ−ターン のいずれかの二次構造的特徴において見い出される確率の百分率を表す一連のグ ラフを示す。

図６は、ＨＣＶ　１ｇ　（ハネル＾−Ｃ）またはＴｈ（ハネル［）−ｆ）由来の 血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体１（ＣＴ　１ｇ（Ａ、Ｄ）、Ｔｈ（Ｂ、ＩＩ：） およびＨＣＶ　Ｊｌ（Ｃ，Ｆ）それぞれの３８４から４１５または４１６までの アミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応 性を表す棒グラフである。

図７は、ＱｌおよびＱ３の単離体に対して与えられたＥ２／ＮＳＩポリペプチド の２つの領域の推定アミノ酸配列、すなわち３８４−４１４位のアミノ酸および ５４７−６４７位のアミノ酸を示す。

図８Ａは、単離体ＨＣＶ　Ｊｌ、１およびＪｌ、２の推定アミノ酸配列の３８４ 位から６４７位のアミノ酸を示す。図８Ｂは、単離体ＨＣＴ２７およびＨＣＶＥ Ｉの推定アミノ酸配列の３８４位から６５１位のアミノ酸を示す。

図９は、単離体ＨＣＶ−１の完全ポリタンパク質配列を示す。

木光肚旦皇立悪且 本発明の実施においては、指示されない限り、当該分野の技術範囲内にある分子 生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における従来の手法が採用され る。このような手法は、文献中に詳しく説明されている。例えば、次の文献を参 照のこと：　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍ ＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ 　（第２版、１９８９）；ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、１巻オ、ｋｒＪｒ１巻（Ｄ 、Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編、　１９８５）　；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　 ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔ　１ｉＡ、１９８４）　；　ＮＵＣＬ ＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴｌＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｓおよび Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９１１４）　；　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ 　ＡＮＤ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、■ａ＋＊ｅｓおよびＳ、Ｊ、　 Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｌａ。

１９８４）　；　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒｅ ｓｈｎｅｙｉｌ！、１９８６）　；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮ Ｄ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）　；　Ｂ。

Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　ＴＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）　；ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ のシリーズ　（Ａｃａｄｅ＋ｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）；　ＧＥＮＥ　Ｔ ＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　（Ｊ 、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、Ｃａｌｏｓ編、１９ｇ？、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１５４およびＶｏｌ、１５５　（それぞれＷ ｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編 （１９８７）　；　ＩＭＭＵＮＯＣＦＩＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＦＩＯＤＳ　ＩＮ 　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、５ｃｏｐｅｓ、　（１９８７）　；　ＰＲＯＴ ＥＩＮ　ＰＩＪＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲ ＡＣＴＩＣＥ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−４ｅｒｌａ ｇ、　Ｎ、Ｙ、）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ 　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｉ　〜ｒＶ巻（Ｄ、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂ ｌａｃｋｗｅｌ１編、１９８６）；　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：　Ａ　ＰＲＡＣ ＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　（Ｄ、Ｗ、Ｃｈａｎ編、１９ｇ？）。本明細書中で述 べられる前述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物は、本明細書中に 参考として援用されている。

ＦＩＣＶは、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の新しいメンバー である。フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科には、ベスチウイルス （ブタコレラウィルスおよびウシウィルス性下痢性ウィルス）およびワラビウイ ルスが包含される。フラビウイルスの例には、デング熱ウィルスおよび黄熱病ウ ィルスがある。ＨＣＶの遺伝学的構成の図を図１に示す。フラビウイルスおよび ペスチウイルスと同様に、ＨＣＶは、ウィルスのポリタンパク質のＮ末端の基本 的なポリペプチドドメイン（ｒＣＪ）、続いて２種の糖タンパク質ドメイン（ｒ ＥＩＪ　、ｒＥ２／Ｎ５ＩＪ　）を、コードすると考えられ、これらは非構造遺 伝子ＮＳ２からＮＳ５の上流にある。この推定タンパク質ドメインのアミノ酸座 標を表１に示す。

（以下余白） ７５１−１００６　Ｎ５２ １００７−１４８８　ＮＳ３ 上記のように、多数のＨＣＶ単離体が同定されている。完全および部分ＨＣｖ配 列の比較配列分析により、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでの相同性に基づ いて、■Ｃｖ単離体が、少なくとも３つの基本群に広（細分され得ることが分か る（表２）。

Ｒｏｕｇｈ　ｔｏｎら、（１９９１）、　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１４：３８１ −３８８を参照のこと。

しかし、１１１群における単離体では、部分配列しか得られない。

それゆえ、これらの単離体の配列がより明らかになると、これらの１つまたはそ れ以上の単離体は、４番目となり得る群を含む別の群に分離されるべきである。

表３は、ヌクレオチド配列から推定される種々の■Ｃｖ単離体の個々のウィルス タンパク質の間での配列相同性を示す。同じウィルス群のタンパク質は、種々の ウィルス群によりコードされる同じタンパク質よりも高い配列類似性を示すと考 えられ得る（表３）。これに対する１つの例外は、現在まで全ての■および１１ 群のウィルス単離体配列の間で高度に保存されているヌクレオキャプシドタンパ ク質である。（表３では、記号Ｎ／Ａは、比較により得られなかった配列を示す 。）従って、本発明のためには、１群の単離体は、本明細書中で１群として分類 される単離体に対して、アミノ酸レベルで約９０％またはそれ以上の相同性であ るそれらのウィルスタンパク質、特に、ＥｌおよびＥ２／ＮＳＩタンパク質を有 する単離体として定義され得る。１１群は類似の方法で定義される。それ以上の 群については、同様に、始原型単離体に対してウィルスタンパク質の相同性によ って定義され得る。下位群はまた、所定のタンパク質、例えば、Ｅｌ、Ｅ　２／ ＮＳ　１またはＮＳ２タンパク質における相同性により、または単により高い相 同性レベルにより定義され得る。

（以下余白） ＨＣＶ−Ｉ　ＨＣＶ−Ｊｌ、ｌ　７　’Ｏ−＞　Ａ、Ｃ，Ｄ＆ＥＨＣ−ＪＩ　Ｈ Ｃ−Ｊ４　ＨＣＶ−に２　Ｔａ＆ｂ）ＨＣＴ　１８　ＨＣＶ−Ｊ ＨＣＴ　２３　ＢＫ Ｔｈ　ＨＣＶ−Ｋｌ ＣＴ２７ ＨＣＶ 工　９Ｂ−１００９４−１００Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　９９−１００ 工工　９７−９８　７７−７９　７８−８１　７５−７７９１−９２　９０−９ ３　８４−Ｂｅエエエ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　８Ｇ　７ｇ−８０７ １−７４エエエ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　Ｎ／Ａ　８４　７６　７４−７５ε １およびε２／ＮＳＩ遺伝子によりコードされた推定ウィルスエンベロープタン パク質は、１群および１１群の間で実質的なアミノ酸配列の変異を示すことを注 目すべきである。０％ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５タンパク質が全て、両群の間 でより高い配列保存性を示しているのに対し、ＮＳ２だけがかなりの割合の異質 性を示す。１群および１１群の間での推定ピリオンエンベロープタンパク質で見 られる配列変異により、２つの群間でのアミノ酸の特徴的な区別が可能になる。

この例を図２に示す。この図２では、Ｅ１遺伝子産物の配列が１群および１１群 のウィルス間で比較される。ＨＣｖの１１群および１１群のヌクレオチド配列か ら推定されたＥ１アミノ酸配列が示される。この図では、横線はＩ（ＣＶ−１と 配列が同一であることを示す。星印は、アミノ酸の酢物異的な区別を示す；酢物 異的残基は、明確に定義され得る。１群の配列は、ＨＣＶ−１、ＨＣＴｌ［１、 Ｉ（ＣＴ２３、ＨＣＴ２７、およびＨＣ−Ｊｌである。１１群の配列は、１（Ｃ −Ｊ４、ＨＣＩ／−Ｊ、Ｏｆ、Ｖ　Ｊｌ、１、およびＢにである。このようなア ミノ酸の酢物異的な区別はまた、Ｅ　２／ＮＳ　１遺伝子によりコードされたｇ ｐ７２を含む他の遺伝子産物中にも存在する。図３は、１群と１１群とを区別す るＨＣｖ単離体の推定Ｅ２／ＮＳＩ領域の比較アミノ酸配列を示す。後者のタン ノ（り質はまた、はとんどすべての単離体の間の大きな変異を示す約３０個のア ミノ酸からなるＮ−末端超可変領域（ｒＨＶＪ　）を含む。Ｗｅｉｎｅｒら（１ ９９１）、上記を参照のこと。この領域は、ＨＣＶ−１のアミノ酸番号付はシス テムを用いて、アミノ酸３８４位から４１４位までに生じる。

推定ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２／ＮＳＩは、ペスチウイルス属のｇｐ ５３（ＢＶＤＶ）／ｇｐＳ５（ブタコレラウィルス）エンベロープポリペプチド およびワラビウイルス属のＮＳＩに相当し得る。この両ポリペプチドは、これら のポリペプチドでワクチン接種した宿主に防御免疫を与える。

超可変領域（ｒＨＶＪ）と旧Ｖ−１ｇ＋）１２０　Ｖ３ドメインとの間での配列 変異度に関して著しい類似性、限定された二次構造の欠如、および推定抗体結合 に関するアミノ酸変化の予期された効果により、Ｉ（Ｖドメインが中和抗体をコ ードしていることが示唆される。

ドメインの免疫原性は、実施例に記載の抗体エビトープマ、ピング実験により示 される。これらの研究の結果により、ＨＣＶの３つの主要群に加え、さらにＩＩ Ｖ特異的部分群が存在することが示唆される。

ＨＣＶ誘導ＮＡＮＢ）ｌの個体から得た生物学的試料を分析することより、個体 は同時に２つまたはそれ以上の［ｌＣＶ変異体を保有し得ることが示される。２ つの共在ＨＶ変異体は、１つの個体ＪＩの血漿中で見い出された。さらに、肝炎 の間欠性発赤になっている慢性ＮＡＮＢＨの個体の遺伝子の部分配列決定により 、個体Ｑが２つの）ＩｃＩ／変異体（ＱｌまたはＱｌ）に感染していることが示 された。各々の変異体は、この疾患の１つのエピソード（ｅｐｉｓｏｄｅ）にの み関連していた。ＱｌまたはＱ３特異的ペプチド（アミノ酸３９６−４０７位） を用いるＥＬＩＳＡにより、Ｑは、Ｑ１ペプチドに反応する抗体を発生するが、 対応するＱ３ペプチドに反応する抗体を発生しないことが示されたので、Ｑの疾 患の再発は、ＨＶ変異体の出現のために起こることが示唆された。疾患の第２の エピソードの間、Ｑ１ペプチドに対する抗体は存在するが、Ｑ３ペプチドに対す る体液性免疫応答が欠如していることにより、Ｈｖドメインの変異が免疫選択の 圧力から生じ得ることが示唆される。アミノ酸３９６〜４０７位は、Ｈｖドメイ ンにおける最も高い選択圧にかけられて得られたと思われる。これらの発見は、 疾患に関連した高レベルの慢性度が、［ＩＣＶ感染に対する不適当な免疫宿主応 答および／または免疫回避の有効なウィルス機構に依存し得るという説を支持す る。さらに、それらは、Ｅ２／ＮＳＩ　ＲＶ領領域ウィルスエスケープ機構およ び／または不適当な免疫応答機構に含まれる遺伝子領域であることを示している 。

上記のように、ＨＣＶゲノム内にはいくつかの変異領域が存在する。これらの１ つまたはそれ以上の領域は、おそらく、ウィルスエスケープ機構および／または 不適当な免疫応答機構に含まれる。それゆえ、これらの変異体に対する免疫応答 を誘導し得るＨＣｖポリペプチドを処置するための組成物中に含まれることが望 ましい。

ゲノムのＥｌおよびＥ２／ＮＳＩ領域が推定エンベロープ型ポリペプチドをコー ドしているので、これらの領域は、免疫原性に関して特に重要である。このため 、これらの領域は、ＨＣｖ感染に対して個体を防御する免疫応答を誘導および／ または増強し、そして感染個体の疾患の慢性的な再発の予防を助けることが特に 望ましい領域の中にある。さらに、これらの領域は、感染、さらに重複感染また は２つまたはそれ以上の変異体による共感染の経過中に生じるＨＣＶ変異体を検 出することが望ましい領域の中にある。

本発明は、ＨＣＶ感染、特に慢性１（ＣＶ感染の予防のために、個体を処置する ための組成物および方法を記載している。さらに、本発明は、生物学的試料中の 抗ＨＣ■抗体の存在を検出するための組成物および方法を記載している。この後 者の方法は、免疫学的に異なる）ＩＣＶエピトープに対する応答で生じる抗［Ｉ ＣＶ抗体を同定するのに特；こ有用である。この方法はまた、感染個体内の）Ｉ ＣＶの多様な変異体の進化を研究するのに用いられ得る。本発明の考察において 、以下の定義が適用される。

「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を意味し、特定の長さの生産 物を意味しない。従って、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチド 、　およびタンパク質が包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修 飾物、例えば、グリコノル化物、アセチル化物、リン酸化物などを意味しないか 、あるいは除外する。この定義に包含されるものは、例えば、アミノ酸（例えば 、非天然のアミノ酸などを含む）の１つかまたはそれ以上の類似体を含むポリペ プチド、置換された結合ならびに当該技術分野で公知の天然に存在するおよび天 然に存在しない他の改変を有するポリペプチドである。

本明細書中で用いられるように、Ａの重量が、ＡとＢとを合わせた重量の少なく とも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少な くとも約９０％であるとき、ＡはＢから「実質的に単離される」とする。本発明 のポリペプチド組成物は、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類の組織（これには 血液、血清、細胞溶解物、細胞小器官、細胞のタンパク質などが包含される）お よび細胞培養培地を実質的に含まない。

「組換え体ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成 起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源もしくは操作によって、（１）この ポリヌクレオチドが天然で関連しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分 と関連していないもの、（２）このポリヌクレオチドが天然で連結しているポリ ヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているもの、または（３）天然 に存在しないものを意味する。

「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド（ リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）である。この用語は、分子 の一次構造のみを意味する。従フて、この用語には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖 ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語にはま た、既知の梨の改変、例えば当該分野において既知のｔｌｔｌｍ、メチル化、「 牛ヤソブ」、類似体による１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの 置換、ヌクレオチド間の改変、例えば非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホ ロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質（例えば、ヌク レアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ−リジンなど）のよう なペンダント部分を含むもの、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ｓ）　（ｆｌ’ｌえば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化 剤（例えば、金属、放射性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修 飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびに未 修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。

単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿 主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物ｊなどの用語は 、組換え体ベクターもしくは他の転移ポリヌクレオチドの受容体として使用可能 か、または使用されてきた細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の後 代が含まれる。単一の親細胞の後代は、自然の、偶発的または故意の変異によっ て、形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と、必らずしも 完全に同一でなくてもよい。

「レプリコン」には、例えばプラスミド、染色体、ウィルス、コスミッドなどの あらゆる遺伝的要素であり、それらは細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的 な単位として挙動し、すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。

「ベクター」は、オープンリーディングフレームの複製および／または発現を提 供する配列をさらに含むレプリコンである。

「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチド配列を意味し、この配列が連結して いるコード配列を発現させるのに必要なものである。このような制御配列の性質 は、宿主の生物によって異なる。このような制御配列としては、原核細胞内では 、一般に、プロモーター、リポソーム結合部位、およびターミネータ−が含まれ 、真核細胞内では、一般に、プロモーター、ターミネータ−１および場合によっ てはエンハンサ−が含まれる。「制御配列」という用語は、最小限発現に必要な すべての要素を包含し、さらに発現に有利な追加の要素、例えば分泌を制御する リーダー配列を包含し得る。

「プロモーター」は、ＤＮＡテンプレートにＲＮＡポリメラーゼを結合させるフ ンセンサス配列を含むヌクレオチド配列であり、その結合は、ｍＲＮＡの製造が 、隣接する構造遺伝子の通常の転写開始部位で開始するような方法で行われる。

「作動可能に連結された」と用語は、上記のような要素が、意図した方式で機能 し得るような関係に並置されていることを意味する。フード配列に「作動可能に 連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でこのコード配列の発現が 達成されるように、連結される。

「オーブンリーディングフレームＪ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをフードする ポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、コード配列の一部またはコー ド配列全体を意味する。

「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｍＲＮＡに転写 され、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。

フード配列の境界は、５°末端の翻訳開始フドンと、３°末端の翻訳停止コドン とによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、　ＤＮＡ（これにはｃＤＮＡ が包含される）、および組換え体ポリヌクレオチド配列を包含し得るが、これら に限定されるものではない。

本明細書中で用いられるように、「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免 疫反応性のアミノ酸配列を意味する。

一般的に、エピトープは、少なくとも３〜５個のアミノ酸で構成され、そしてよ り一般的には少な（とも約８個、またはさらには約１０個のアミノ酸で構成され ている。本明細書中で用いられるように、所定のポリペプチドのエピトープは、 その所定のポリペプチドにおけるエピトープと同様のアミノ酸配列を有するエピ トープ、およびその免疫学的な等偽物を意味する。

「抗原」は、１個またはそれ以上のエピトープを含有するポリペプチドである。

「免疫原性」とは、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を誘導する能 力を意味する。免疫原性応答は、単独で免疫反応性のポリペプチドによって誘導 され得るか、またはアジユバントの存在下または非存在下での担体の存在を必要 とし得る。

「免疫反応性」は、（１）抗体および／またはリンパ球抗原すセプターに免疫学 的に結合する能力、または（２）免疫原性である能力を意味する。

「抗体」は、特定のエピトープと結合する任意の免疫グロブリンであり、これに は免疫グロブリンの抗体およびフラグメントが包含される。この用語は、とりわ け、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含する。キメラ抗 体の例は、米国特許第４．８１６，８７号および第４．　［１１Ｇ、　５６７号 で論じられている。

「抗原セット」は、複数の実質的に同一のポリペプチドからなる組成物として定 義され、ここでこのポリペプチドは、定義されたエピトープのアミノ酸配列を含 む。

「実質的に同一のポリペプチド」とは、ポリペプチドの製造方法（例えば、組換 え体発現、化学合成、組織培養など）が原因となる、配列またはサイズの変化の 典型的な範囲に限定される変化以外は同一であるポリペプチドを意味する。この 変化は、実質的に同一のポリペプチドの組成物（例えば、この組成物は同一のポ リペプチドの組成物として免疫学的に作用する）の所望の機能的な性質を改変し ない。この変化は、例えば、このポリペプチドの移送の間の分泌過程から、化学 合成などにおいて１００％未満の効力を生じる改変によるものであり得る。

本明細書中で用いられるように、ウィルスのタンパク質の「可変ドメイン」また はｒ　ＶＤＪは、少なくとも２種のＦＩＣＶ単離体または亜集団（ｓｕｂｐｏｐ ｕｌａｔｉｏｎ＞の間で矛盾がないパターンのアミノ酸の変化を示すドメインで ある。好ましくは、このドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有する。

可変ドメインは、１個だけのアミノ酸変化により単離体から単離体へ変化し得る 。これらの単離体は、同じまたは異なったＨＣＶ群または亜群に由来し得る。可 変ドメインは、単離体中の配列の組成から容易に同定され得、そしてこれらの技 法は下記のトオりである。本発明を説明するために、可変ドメインは、図９に示 されるようにＨＣＶ−１のゲノムによってコードされるポリタンパク質のアミノ 酸番号に関して、１位で示されるイニシエーターのメチオニンと共に定義される 。別のＨＣＶ単離体における対応の可変ドメインは、任意の可変ドメイン以外の 保存ドメインを最大限に整列させる方法で２種の単離体の配列を整列させること により決定される。これは、いかなる多くのコンピューターのソフトウェアパッ ケージ（例えば、ＡＬＩＧＮｌ、０、これはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉ ｒｇｉｎｉａ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙから 入手可能である（註：　Ｄｒ、　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ））でな され得るｏ　Ｐｅａｒｓｏｎらの（１９８ｇ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　８５：２４４４−２４４８を参照のこと。特定の可変ドメインによって 定められるアミノ酸番号は、幾分主観的であり、かつ選択の問題であることが理 解されるべきである。従って、可変ドメインの開始および終止は、他に指示がな い限り、近似であり、および、ドメインまたはサブドメインと部分的に重複する ことを包含することが理解されるべきである。

エピトープは、所定のポリペプチドにおける別のエピトープに免疫学的に結合す る抗体と交差反応するとき、その所定のポリペプチドにおけるそのエピトープの 「免疫学的等個物」である。

典型的に、エピトープは、位置づけられ、少な（とも約５個のアミノ酸、時折少 なくとも約８個のアミノ酸、およびさらに、約１０個またはそれ以上のアミノ酸 を含む。

ＦＩＣＶエピトープを含むアミノ酸配列は、別のポリペプチド（例えば、担体タ ンパク質）と、共有結合によってまたは融合ポリヌクレオチドを発現させて融合 タンパク質を形成させることによって、そのいずれかにより、連結され得る。所 望ならば、アミノ酸配列は、エピトープの多数の繰り返しを挿入し得るかまたは 結合し得、および／または種々のエピトープを組み入れ得る。担体タンパク質は 、いかなる源からでも誘導され得るが、一般に比較的大きい免疫原性タンパク質 、例えば、ＢＳＡＳＫＬＨなどである。所望ならば、担体タンパク質は、実質的 に完全な長さのＨＣｖタンパク質を担体として使用し得、免疫原性エピトープの 数を増やす。あるいは、ＨＣｖエピトープ由来のアミノ酸配列は、アミノ末端お よび／またはカルボキン末端にて、非ＦＩＣＶアミノ酸配列と連結し得、従って 、このポリペプチドは、「融合ポリペプチド」となる。類似型のポリペプチドは 、他の所定のウィルスのタンパク質由来のエピトープを用いて、構築され得る。

所定のポリペプチドの「変異体Ｊとは、その所定のポリペプチドのアミノ酸配列 が、その配列において１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または 転位によって改変されたポリペプチドを意味する。変異体が生じる（例えば、組 換えによって）または変異体が作られる（例えば、部位特異性変異銹発）方法は 、当該分野において周知である。

「形質転換」とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味す る。なお、挿入法は、どんな方法でもよく、例えば、直接取込み法、形質導入法 （これにはウィルス感染が包含される）、ｆ−交配法、またはエレクトロボレー シブン法がある。外因性ポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター、例え ば、プラスミドまたはウィルスのゲノムとして保持されていても、あるいは宿主 ゲノムに組込まれていてもよい。

「個体」とは、を椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、げっ歯動物（例 えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ 、ヒツジ、および霊長類（チンパンジー、アフリカミドリザル、ヒヒ、オランウ ータン、およびヒト）を包含するが、これに限定されるものではない。

本明細書中で用いられるように、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンのよう な、感染または再感染の予防、（ｉ　ｉ）症状の低減または排除、および（Ｎｉ ）ウィルスの実質的な排除または完全な排除、のいずれをも意味する。処置は、 　（感染前に）予防として、または（感染後に）治療として行われ得る。

「有効量」という用語は、投与される個体において免疫原性応答を誘導するか、 または意図するシステム（例えば、イムノアッセイ）において別な方法で検出可 能に免疫反応を起こすのに充分なエピトープを有するポリペプチドの量を意味す る。好ましくは、この有効量は、上記のように処置をするのに充分である。必要 な正確な量は、接種により変化する。

ワクチン接種のために、またはポリクローナル抗血清／抗体の発生において、例 えば、その有効量は、種、年齢、および個体の一般的な症状、処置される症状の 重症度、選択される特定のポリペプチドおよび投与様式などに依存して変化する 。

有効量は、比較的広く、非臨界的な範囲にあることもまた、知られている。適切 な有効量は、定型の実験だけを用いて容易に決定され得る。

本明細書中で用いられるように、「生物学的試料」とは、個体から単離された組 織または液体の試料をいう。これには、例えば、血漿、血清、を髄液、リンパ液 、皮膚と呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外側部分、涙、唾液、乳、血液細胞、腫 瘍、器官、バイオプシー、およびさらに、インビトロでの細胞培養構成物（これ には細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地、例えば、Ｍａｂ産生ミ エローマ細胞、組換え細胞、および細胞成分を包含するが、それに限定されない ）の試料を包含するが、それに限定されない。

本発明の免疫反応性ポリペプチド組成物は、少なくとも１種のＨＣＶ　ＶＤ由来 の単離体特異性エピトープと酢物異性エピトープとの混合物を含有する。従って 、少なくとも２種の異質性アミノ酸配列がＨＣＶタンパク質中基質在する。この 異質性アミノ酸配列は、各々、同一かまたは実質的に同一の物理的な場所に位置 する別個のＨＣＶＩＩＩＩｉｌｉ体において見い出されるエピトープを定義する 。すなわち、各配列は、ＨＣｖゲノム／ポリポリチド内の同一の場所に位置づけ られる。これらの配列は異質性であるので、その場所は可変ドメイン（ＶＤ）と して言及される。

本発明をより良く理解するために、第一に、本発明の組成物を作り出す個別のア ミノ酸配列を説明する。次いで、本発明の組成物において見い出される複数のこ のような配列について論じる。

本発明のポリペプチドを特徴付けるアミノ酸配列は、以下のような基本的な構造 を有する： ＬシーＺ−Ｌ’　Ｖ・　（１） Ｚは、選択されたＨＣＶ単離体由来のタンパク質の領域由来のアミノ酸配列を表 す。ここで、この領域は、少なくとも１個の可変ドメインを含み、そしてこの可 変ドメインは、少な（とも１個のエピトープを含む。しおよびＬｏは、非ＨＣＶ アミノ酸配列であるかまたは可変ドメインを含まないＨＣＶアミノ酸配列配列り 、ここで、ＬおよびＬｏは、同一または異なり得る。ｙおよびｙｏは、０または １であり、これらは同一または異なり得る。

従って、式■は、ＨＣＶ　ＶＤの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、ＶＤ は、エピトープを含む。

上記のように、Ｚにおけるエピトープは、通常、最小約５個のアミノ酸、より典 型的には最小約８個のアミノ酸、およびさらに典型的には最小約１０個のアミノ 酸を含む。

Ｚの可変ドメインは、１個より多いエピトープを含み得る。

２の可変ドメインは、存在するエピトープの配列を組み合わせたサイズと少な（ とも同程度のサイズである。従って、このドメインに、ただ１つのエピトープが 存在するならば、このドメインは、典型的には最小約５個のアミノ酸で作られる 。エピトープが部分的に重複するとき、この可変ドメインにおける組み合わされ たエピトープの最小アミノ酸配列は、その個々のエピトープの配列の合計より小 さい。

２は、上記ＶＤを含むＨＣＶ単離体のアミノ酸配列である。従って、Ｚの最小の サイズはＶＤの最小のサイズである。２は、ＶＤだけに比べて多（のＨＣＶのア ミノ酸配列を含み、そして１個より多くのＶＤをさらに含み得る。Ｚの最大のサ イズは、臨界的ではないが、完全なＨＣＶのポリタン、ｆり質の長さを上回るこ と（ま明らかに不可能である。しかし、典型的には、Ｚは、完全なＨＣＶタンパ ク質（特に、Ｅｌ、Ｅ２／ＮＳＩ、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮ５５）の配 列であり、そしてより典型的にはこのようなＨＣＶタンノくり質のフラグメント である。従って、２は、好ましく（ヨ、最小約５個のアミノ酸（より好ましくは 最小約８個また（よ約１０個のアミノ酸）から最大約１１００個のアミノ酸（よ り好ましく番ヨ最大約５００個、さらに好ましくは最大約４００個、また（まさ ら１こ好ましくは最大約２００個のアミノ酸）の範囲である０　より一般的には 、式Ｉおよび／または２のポリペプチドは、それらカタ例えば、化学合成により 調製されるとき、最大約５０個のアミノ酸、より典型的には最大約４０個のアミ ノ酸、そしてさら１こ典型的には最大約３０個のアミノ酸である０ 非ＦＩＣＶアミノ配列列、ＬおよびＬｏは、それらがもし存在するならば、多く のタイプのこのような配列のいずれをも構成する。例えば、ＬおよびＬｏは、下 記のように、Ｚが組換え体発現を促進するために融合される非ＨＣＶ配列（例え ば、β−ガラクトシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インベルターゼ、 α−因子、ＴＰＡリーダーなど）を表し得る。あるいは、ＬおよびＬｏは、他の 病原体く例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ）、テタヌストキソイド、ジフテリアなど）のエピトープを表して 、多くのこれらの他の病原体に免疫反応的に関連する組成物を提供し得る。Ｌお よびＬｏは、ペプチド合成の際の固体支持体、イムノアッセイの支持体、ワクチ ン担体のタンパク質などへの結合を促進するアミノ酸配列であり得る。実際、Ｌ およびＬｏは、機能的な利点のない１種またはそれ以上の不必要なアミノ酸をさ らに含み得る。ＬまたはＬｏに対する臨界的な最大のサイズはなく、その長さは 、一般的に所望の機能によって決定される。典型的に、ＬおよびＬｏは、各々、 最大約２０００個のアミノ酸、さらに典型的には最大約１０００個のアミノ酸で ある。有用な性質を有するしおよびＬ°配列の多くは、最大約５００個のアミノ 酸である。Ｚの免疫反応性をブロックしないようにＬおよびＬｏを選択すること は、もちろん望ましい。

本発明に従って提供されるポリペプチドの組成物は、それぞれ以下の式ＩＩおよ びＩｌｌよって定義される少なくとも２種のアミノ酸配列の組成物中に、（免疫 反応的に有効量で）存在することによって特徴付けらる： Ｌｙ　Ｚ＋　Ｌ’　ｙ・　（■１） Ｌ、−Ｚ２−Ｌ’　ｙｌ　（ＩＩＩ） Ｌ％ｔ’、ｙおよびｙ゛は上記のように定義され、そしてそれらは独立して式！ ！およびＩＩＩの各々に対してもまた定義される。ＺｌおよびＺ２は、各々、上 記で２について定義されたようなＨＣＶアミノ酸配列配列り、同一の可変ドメイ ン（すなわち、物理的な場所）を含むが、ＺｌおよびＺ２の共通の可変ドメイン において少な（とも１種の異質性エピトープをそれらの間に有する異なるＨＣｖ 単離体から誘導される。例示的な実施例として、式ＩＩに従ったアミノ酸配列は 、ｚＩとして、単離体■ＣＶ−１のアミノ酸３８４−４１４位（またはさらに特 定すると３９６−４０７位または３９６−４０８位のアミノ酸）にわたる超可変 ドメインのフラグメントを有し、一方、Ｚ２は、単離体ＨＣＶ−Ｊ　１．１由来 の類似のフラグメントである。これらの２種の単離体は、このドメインにおいて 異質性であり、これらのエピトープのアミノ酸配列は、有意に変化する。

本発明の組成物は、式１に従って丁度２個より多い別個のアミノ酸配列を含み得 、モして２の配列は異なる可変ドメインを含む群に分割され得ることが理解され るべきである。例えば、本発明に従う組成物は、　（式Ｉに従うアミノ酸配列と 共に）ＨＣＶ配列の群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ ｌ。

１、ＩＣ−Ｊｌ、ＩＣ−Ｊ４などに由来するアミノ酸３ｇ４−４１１位のところ で超可変ドメインを含む。この組成物はまた、　（式■に従うアミノ酸と共に） 　）ＩｃＶ配列のさらなる群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣ Ｖ−Ｊｌ、１．　ＩＣ−Ｊｌ、Ｉ（Ｃ−Ｊ４などニサラニ由来スルアミノ酸２１ ５−２５５位のところで可変ドメインを含む。従って、本発明の組成物の関係に おいては、式Ｉの配列は以下のようにさらに定義され得る： ＳＶ、　（ｍ Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、この可変 ドメインは、少なくとも１種のエピトープ；すなわち、式１を含む。Ｓおよびｎ は、１またはそれ以上の整数である。Ｓは特定の可変ドメインを表し、そしてｎ は特定の単離体を表す。例えば、Ｓ＝ｔはアミノ酸３８４−４１１位における可 変ドメインを表し得；Ｓ＝２はアミノ酸２１５−２５５位における可変ドメイン を表し得；そしてｎ＝Ｌ　２．３および４は、それぞれ、単離体ＨＣＶ−１、Ｈ ＣＶ−Ｊｌ、１、ＩＩｃ−ＪｌおよびＨＣ−Ｊ４を表し得る。従ッテ、上記の２ つの群の配列は以下のように表され得る：群１　：　ＩＶＩ、　ＩＶ２、ＩＶ３ およびＩＶ４群２・２Ｖ＋、２Ｖ２．２Ｖ３および２Ｖａ本発明に記載の組成物 には、式１ｖの少なくとも２種の別個の配列がある。すなわち、この組成物は、 式＋Ｖに従う２種の異なる配列を含有し、ここでＳおよびまたはｎの値は異なる 。

例えば、少なくともＩＶＩおよびＩＶ２が存在し、または少なくともＩＶ’＋お よび２Ｖ２が存在し、または少なくともＩＶＩおよび２Ｖ＋が存在する。

式ＩＶ中に含まれる別個の配列は、同一または異なるポリペプチド分子のいずれ かにおける組成物中に存在する。ＩＶＩおよびＩＶ２の最小の組み合わせを用い て、これらの２種の配列は、同一のポリペプチド分子（例えば、ＩＶＩ−ＩＶ２ ）または分離した分子中に存在し得る。本発明の組成物のこの特徴は、以下のよ うなポリペプチドの組成物として記載され得る：Ｒ，−（ＳＶ、）、−Ｒ’　、 −（Ｖ）ここで、ＳＳｖおよびｎは、上記で定義のとおりであり；ＲおよびＲｏ は、約１−２０００個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、そして同一または異な り；ｒおよびｒｏは、０または１であり、そして同一または異なり；Ｘは、１以 上の整数であり；ｎは、各Ｘに対して独立して選択され；ただし、これらのアミ ノ酸配列は、（ｉＮＶ＋およびＩＶ２、（ｉｔ）ＩＶＩおよび２Ｖ２、および（ ｉｉｉＨＶ＋および２Ｖ＋からなる群より選択される組み合わせを表す組成物中 に存在する。式１ｖの別個の配列が異なるポリペプチド内にある実施態様におい ては、Ｘは１であり得るが、所望であるなら１をさらに越え得る；例えば、ポリ ペプチドＩＶＩ−ＩＶ２とＩＶＩ−２Ｖ２との混合物。Ｘが１であるとき、ｒお よびｒｏは好ましくは共１こ０であり、Ｌ、およびＬ′ν・の重複を避ける。こ れは、■が式■こよる好ましい実施態様によって記載され得るからである。Ｘ力 （１より大きいとき、Ｒとその隣接するＬとを組み合わせた長さ、およびＲｏと その隣接するＬｏとを組み合わせた長さは、好ましく番マ、ＬおよびＬｏに関し て上記の典型的な最大長より長く（よな（１゜この組成物の別個のＶ配列中に含 まれるＨＣＶのアミノ配列ダ１ｊの選択は、この配列の意図する適用に依存し、 そして本発明の開示による当業者の範囲内である。第一に、本発明に関するＨＣ Ｖエピトープは、２種のタイプに分かれ得ることが認められるべきである。エピ トープの第一のタイプは、「酢物異性」であるものであり、すなわち、■ｃｖ単 離体の群中の全てのまたは実質的に全ての単離体における対応のエピトープは、 互いに免疫学的に交差反応性であるが、他の群の実質的に全ての単離体の対応す るエピトープを有しない。好ましくは、酢物異性のクラスにおけるエピトープは 、この群内に実質的に保存されるが、この群間またはこの群中には保存されない 。エピトープの第二のタイプは、「単離体特異性」であるものであり、すなわち 、このエピトープは、実質的に同一の単離体と免疫学的に交差反応し、そして全 てのまたは実質的に全ての別個の単離体とは交差反応しない。

これらの酢物異性エピトープおよび単離体特異性エピトープは、本発明の開示に よって容易に同定され得る。第一に、数種のｎｃｖ単離体の配列が、本明細書中 に記載されているように、比較され、そして配列異質性の領域が同定される。通 常、異質性のパターンは、酢物異性または単離体特異性を示す。

同定された領域が１個またはそれ以上のエピトープを含むことが周知であるなら ば、次いで、所望のエピトープを含むのに充分なサイズの配列は、本発明の組成 物に含まれ得る可変ドメインとして選択される。所定の異質性領域の免疫反応性 が周知でないならば、種々の１（ＣＶ単離体のその領域内に見い出される配列を 表すペプチドは、調製され得、そしてスクリーニングされ得る。スクリーニング は含まれ得るが、抗ＨＣＶ抗体の種々の源（例えば、患者の血清、中和化Ｍａｂ ｓなど）によるイムノアッセイまたは抗体の発生、およびインビトロでウィルス を中和するためのそのような抗体の能力、に限定されない。あるいは、下記のよ うなスクリーニングのプロトコールで同定されるエピトープの遺伝子座は、種々 の単離体の異質性およびスクリーニングされた対応の異質性配列の免疫学的な性 質について試験され得る。

ワクチンの適用には、Ｅｌおよび／またはＥ　２／ＮＳ　１ドメイン由来の可変 ドメインが、特に重要であると考えられる。特に、アミノ酸２１５−２５５内の Ｅｌ可変ドメイン（図２参照）、およびアミノ酸３ｇ４−４１４内のＥ２／ＮＳ 　１可変ドメイン（図３参照）は、重要な免疫反応性ドメインであるとして同定 されている。予備的な証拠により、これらのドメインの片方または両方が、慢性 ＨＣＶ感染に通じるエスケープ変異体に反応し得る異質性の遺伝子座であり得る ことが示唆される。従って、■の可変ドメインがこれらの可変ドメインの片方ま たは両方であるような、上記のようなポリペプチド組成物は、特に好ましい。さ らに、本発明のポリペプチド組成物は、特に可変ドメイン中の一般的な線形エピ トープに関連するが、配座エピトープもまた含有し得る。例えば、この組成物は 、組換え体系（例えば、昆虫または哺乳動物細胞）で発現される、　（異なる単 離体の可変ドメインを示す）組換え体Ｆ、１および／またはＥ２／ＮＳＩタンパ ク質の混合物を含み得る。この組換え体系は、可変ドメインの内側または外側の いずれかに配座エピトープを維持している。あるいは、配座エピトープを維持す る単一の単離体由来のＥｌおよび／またはＥ２／ＮＳＩサブユニット抗原が、本 発明に従って、ポリペプチド組成物と組み合わされ得る（例えば、合成ペプチド または変性させた組換え体ポリペプチドの混合物）。ワクチンに対する別の好ま しい適用では、本明細書中に記載のポリペプチド組成物を他のＨｃｖサブユニッ ト抗原と組み合わせ得る。例えば、同一人の所有する米国特許出願第一号に記載 の抗原である。この出願のタイトルは、Ｒｏｂｅｒ　ｔＯ，Ｒａ１ｓｔｏｎ、　 Ｆｒａｎｋ　Ｍａｒｃｕｓ、　Ｋｅｎｔ　Ｂ、　Ｔｈｕｄｉｕｍ、　Ｂａｒｂａ ｒａ　Ｇｅｒｖａｓｅ、　およびＪｏｈｎ　Ｈａｌｌにより、「ｃ型肝炎つィル スアシアロ糖タンパク質」（アトー二イドヶット番号０１５４．００２）であっ て、本願と共に同日で出願しており、本明細書中に参考として援用されている。

診断の適用には、抗原として本発明の組成物を用い、それにより、別個のＨＣｖ 単離体に対する抗体を検出する能力を改善するのに有用であり得る。典型的には 、このポリペプチド混合物は、均質なまたは不均質なイムノアッセイ形式におい て直接用いられ得、後者では、好ましくは、ポリペプチドを固体基質（例えば、 マイクロタイタープレートウェル、プラスチックビーズ、ニトロセルロースなど ）上に固定することを包含する。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０８９　 ；欧州公開公報第３６０、０１１８号；　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：　Ａ　ＰＲ ＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ、上記を参照のこと。あるいは、本発明のポリペプ チド組成物を作り出す実質的に同一の各ポリペプチドを別個の遺伝子座で同一の 支持体上に固定し得、それにより抗体が産生される単離体または群についての情 報が提供される。このことは、種々の単離体が、肝炎、癌、または種々の臨床予 後を必要とする他の疾患を引き起こすならば、診断に特に重要である。好ましい 形式は、Ｃｈｉｒａｎ　ＲＩＢＡ”　ストリップイムノアッセイ形式であり、こ れは、同一人の所有する米国特許出願第０７／１３８，８９４号および米国特許 出願第０７７４５６．６３７号に記載されており、その開示内容は本明細書中に 参考として援用されている。

本発明の組成物の製造に有用なポリペプチドは、組換えによって、合成によって 、または組織培養中で、製造され得る。

切形型ＨＣＶ配列または全長ＨＣＶタンパク質を含む組換え体ポリペプチドは、 ＨＣｖ配列（１個またはそれ以上のエピトープ、隣接しているかまたは隣接して いないかのいずれかである）、または融合タンパク基質の配列から完全に製造さ れ得る。融合タンパク質では、有用な異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）配列は 、組換え宿主からの分泌を提供するか、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を高める か、またはポリペプチドの支持体またはワクチン担体への結合を促進する配列を 包含する。例えば、欧州公開公報第１１６．２０１号：米国特許第４．７２２８ ４０号；欧州公開公報第２５９．１４９号；米国特許第４．６２９．７８３号を 参照のこと。これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。

全長ポリペプチド、および切形型ＨＣＶ配列を含むポリペプチド、およびそれら の変異体は、化学合成によって調製され得る。化学合成によってポリペプチドを 調製する方法は、当該分野において周知である。それらはまた、組換え技術によ っても調製され得る。ＨＣＶ−１をコードするＤＮＡ配列、および他のＨＣｖ単 離体由来の可変領域のＤＮＡ配列が、本明細書中に記載および／または参照され ている。これらの配列の入手により、ＨＣＶポリペプチドの免疫反応性領域をコ ードするポリヌクレオチドの構築が可能である。

ＨＣｖの可変ドメイン由来の１個またはそれ以上の免疫反応性ＦＩＣＶエピトー プを含む所望のポリペプチドをフードするポリヌクレオチドは、化学的に合成さ れるか、または単離され、そして発現ベクター中に挿入され得る。このベクター は、β−ガラクトシダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のよ うな融合配列の部分を含み得るか、または含み得ない。ＳＯＤの融合配列を含む ポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは、１９８６年１０月１日に公 開された欧州公開公報第０１９６０５６号に記載されている。

所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合または成熟形態のどちらであっ ても、そして分泌を可能にするシグナル配列を含有するかまたは含有しなくても 、任意の都合のよい宿主に対して適切な発現ベクター内に連結され得る。次いで 、宿主は、発現ベクターで形質転換される。原核宿主細胞系および真核宿主細胞 系の両方が、現在、組換え体ポリペプチドを形成するのに用いられており、そし てより一般的な制御系および宿主細胞系の要約を以下に示す。宿主細胞は、所望 のポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートされる。

次いで、このポリペプチドは、溶解細胞または培地から単離され、その意図され た用途に必要な程度まで精製する。

ウィルス由来のＨＣＶゲノムの抽出、ＤＮＡライブラリーの調製および探索、ク ローンの配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、免疫学的アッセイ（ 例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ）の実施、培養中 の増殖細胞において用いられる一般的な方法は、当該分野において周知である（ 例えば、上記「背景」の部に引用された文献、および上記のこの「発明の実施態 様」の部の初めに引用された文献を参照のこと）。

所望の配列を含むベクターの適切な宿主内への形質転換は、宿主細胞にポリヌク レオチドを導入する周知のいずれの方法によっても行われ得、この導入方法には 、ウィルス中のポリヌクレオチドのパッケージング、および、ウィルスによる、 またはポリヌクレオチドの直接取り込みによる宿主細胞の形質導入が包含される 。用いられる形質転換の方法は、形質転換される宿主に依存する。直接取り込み による細菌の形質転換は、一般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる 処理を使用し得る（Ｃｏｈｅｎ　（１９７２）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ■：２１１０）。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら 、（１９７Ｂ＞、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｓｅ　Ｒｅｇ、　Ｚ：１９２９の 方法を用いて行われ得る。直接取り込みによる哺乳動物の形質転換は、Ｇｒａｈ ａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７８）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２： ５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の周知の改変法を用いて行わ れ得る。細胞（特に、哺乳動物細胞）内への組換え体ポリヌクレオチドの導入に 対して、当該分野において周知である他の方法は、デキストラン仲介トランスフ ェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トラ ンスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソー ム中のポリヌクレオチドの被包化、および核内へのポリヌクレオチドの直接マイ クロインジェクションを包含する。

所望のコード配列の発現を得るために、宿主細胞は（発現ベクターであり得る） ポリヌクレオチドで形質転換される。

このポリヌクレオチドは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御配列か らなる。この制御配列は、所定の宿主に適合し得る。原核宿主の間では、Ｅ、　 ｃｏｌｉが最もよく用いられる。原核生物の発現制御配列は、プロモーター、必 要に応じて含有されるオペレータ一部位、およびリポソーム結合部位を含む。原 核宿主に適合し得る転移ベクターは、一般に、例えば、ｐＢＲ３２２（アンピン リンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミド）、およ び種々のｐＵＣベクター（抗生物質耐性マーカーを付与する配列をまた含む）か ら得られる。プロモーター配列は、天然に存在する、例えば、β−ラクタマーゼ （ペニシリナーゼ）　（Ｗｅｆｓｓｍａｎ　（１９８１）、　１ｎｔｅｒｆｅｒ ｏｎ　３　（１，Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中のｒＴｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　１ ｎｔｅｒｆｅｒａｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍ１ｓｔａｋｅｓＪ　）、ラクトー ス（ｌａｃ）　（Ｃｈａｎｇら、（１９７７）、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０ ５６）およびトリプト７７ベｔｒｐ）　（Ｇ。

ｅｄｄｅｌら、（１９８０）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０ ５７）、およびλ由来ＰＬプロモーター系およびＮ遺伝子リボゾーム結合部位（ Ｓｈｉｓ＋ａｔａｋｅら、（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２Ｂ）で あり得る。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモータ ーとして機能する。例えば、１つのプロモーターの転写活性化配列は、他のプロ モーターのオペロン配列に結合して、合成ハイブリッドプロモーターを形成し得 る（例えば、ｔａｃプロモーター（これは、ｍおよび出プロモーターの配列由来 である）　（Ｄｅ　Ｂｏｅｒら、（１９８３）、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８０：２１）。上記の系は、特にＥ、　刈■に適合 し得る；所望であれば、他の原核宿主（例えば、バチリス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株が、対応する制御配 列で用いられ得る。

真核宿主は、培養系における酵母および哺乳動物細胞を包含する。Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅおよび５ａｃｃｈａｒｏ＋ｎ■ｅｓ　ｃ ａ■吐肛■皿ｎは、最も一般的に用いられる酵母宿主であり、そして好都合な菌 類宿主である。酵母適合性ベクターは、一般に、栄養要求性突然変異体に原栄養 性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）を、または野生株に重金属耐性を付与することによ り、生育した形質転換体の選別を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベク ターは、２ミクロンの複製起点（Ｂｒｏａｃｈら　（１９８３）、　Ｍｅｔｈ、 　Ｅｎｚ、　ｌｊ；ｉ：３０？）、ＣＥＮ３およびＡＲＳＩの組合せ、または複 製を確実に行うような他の手段（例えば、宿主細胞ゲノムに適切なフラグメント を取り込ませ得る配列）を用い得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野にお いて周知であり、解糖系酵素の合成のプロモーターを含む（Ｈｅ５ｓら　（１９ ６Ｂ）、　Ｊ、　Ａｄｖ。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、ヱ：１４９）；例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ ＡＤＦＩ）　（欧州公開公報第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ 、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ ドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキ ナーゼ、３−グリセロリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　 （欧州公開公報第３２９３０３号）。

酵母ＰＩ（０５遺伝子（これは酸ホスファターゼをコードする）もまた、有用な プロモーター配列を提供する。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもま た、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流 活性化配列（ＵＡＳ）は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域に連結され得 、合成ハイブリッドプロモーターを創製する。このようなハイブリッドプロモー ターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列（米国特許第４， ８７６、１９７号および第４．８８０．７３４号）を包含する。ハイブリッドプ ロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素の転写活性化領 域と結合したＡＤＦＩ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬＩＯｌまたはＰＨ０５遺伝子のいず れかの制御配列からなるプロモーターであって、プロモーターを包含する（欧州 公開公報第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、適当な転写開始の ための酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合する能力を有する、酵母以外の起源の天然 に存在するプロモーターを包含する。

酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御要素には、ターミネータ−（例えば、Ｇ ＡＰＤＨ由来、およびエノラーゼ遺伝子由来（Ｈｏｌｌａｎｄ　（１９８１）、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｔ　２５６：１３８５）、およびリーダー配列があ る。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からタンパク質を分泌させ る疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列 をコードするＤＮＡは、分泌酵母タンパク質に対する遺伝子（例えば、酵母イン ベルターゼ遺伝子（欧州公開公報第１２．８７３号）およびα−因子遺伝子（米 国特許第４．５８８．６８４号））に由来し得る。

あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）もまた 、酵母における分泌を提供する（欧州公開公報第６００５７号）。分泌リーダー の好ましいクラスは、酵母α−因子遺伝子のフラグメントを使用し、このフラグ メントは、「ブレ（ｐｒｅ）Ｊ　シグナル配列と［プロ（ｐｒｏ）Ｊ領域との両 方を含んでいる。用いられ得るα−因子フラグメントのタイプは、完全長プレー プロα−因子リーダー、および不完全α−因子リーダー（米国特許第４．５４６ ．０８３号および第４．１１７０．００８号；欧州公開公報第３２４２７４号） を包含する。分泌を提供するα−因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダ ーは、第２の酵母α−因子由来のブロー領域ではなく、第１の酵母のプレ配列で 作られたハイブリッドα−因子リーダーを包含する（例えば、Ｐ、Ｃ，Ｔ、　Ｎ ｏ　８９１０２４６３を参照のこと）。

染色体外レプリコンまたは組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｖａｃｔ ｏｒ）である発現ベクターが、多種の酵母中への形質転換用に開発されている。

例えば、発現ベクターは、以下の種に用いるために開発されている；　Ｃａｎｄ ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら、（１９８６）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、６：１４２）、のｌ止ｕ１ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら、（１９ ８５）　Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ｉｉ：１４１）、ｎＭｌ匪 ｎ匹ｎ鮫■ｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、（１９８６）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、１３ユニ３４５９）、■ｕ　ｖｅｒＯ鴨　ＣｅＳ　むｌ直上１ｓ（Ｄａ ｓら、　（１９ｇ４）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、月１：１１６５）、口１Ｅ個 工す■罎シｂＫ１Ｂ（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、　（１９８３）。

Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１５４ニア３７）、Ｐｉｃｈｉａ　ｕｉｌｌｅｒｉｍ ｏｎｄｉｉ、ＣＩ［ｕｎｚｅら、（１９８５）、上記）、Ｐｉｃｈｉａ　■１旺 ｎ（Ｃｒｅｇｇら、（１９８５）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｉ： ３３７６；米国特許第４．８３７．１４８号および第４．９２９゜５５５号）） 、Ｓｈ’ｚｏｓａｅｅｈａｒｏ＋ｓ　ｃｅｓ　凹ｙ狸（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒ ｓｅ（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０６）、およびＹａｒｒｏｖｉ ａ旦眩ｎ葺」（Ｄ　ａ　ｖ　ｉ　ｄ　ｏ　ｖら、　（１９８５）、Ｃｕｒｒ、Ｇ ｅｎｅｔ、１０：３９）。

発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当該分野で周知であり、／ｖｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）か ら入手可能な多種の不死化された細胞系、例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＩＩＯ）細胞、シリアンノ＼ムスター腎（ＢＩＩＫ）細胞、Ｃ ＯＳサル細胞、および多数の他の細胞系を含む。

当該分野において、哺乳動物細胞に対して適切なプロモーターが周知であり、そ れらは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、 アデノウィルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）に由来するよう なウィルスプロモーターを含む（適切なプロモーターの例は、Ｓｓ■ｂｒｏｏｋ （１９ｇ９）を参照のこと）。哺乳動物細胞は、ターミネータ−配列およびポリ Ａ付加配列を必要とし得；発現を増大するエンハンサ−配列をもまた含まれ得、 そして、遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた望ましくあり得る。これらの配列 は、当該分野で周知である。

哺乳動物細胞で複製に適するベクターが、当該分野で周知であり、そして、それ らは、ウィルスのレプリコン、または所望のポリペプチドをコードする適切な配 列の宿主ゲノム中への組込みを確実にする配列を含み得る。

外来ＤＮＡの発現に使用され、ワクチン調製において使用され得るベクターは、 ワクシニアウィルスである。この場合、異Ｎ　（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）Ｄ ＮＡがワクシニアゲノム中へ挿入サレル。ワクシニアウィルスゲノム中へ外来Ｄ ＮＡを挿入する技術は、当該分野で周知であり、例えば相同的組換えを利用する 。異種ＤＮＡは、一般的に、選択マーカーの提供も行うチミジンキナーゼ遺伝子 （ロ）のような、天然には非必須の遺伝子中に挿入される。組換えウィルスの構 築を非常に容易にするプラスミドベクターが、記載されている（例えば、Ｍａｃ ｋｅｔｔら、（１９８４）、「ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎｇＪ　Ｖｏｌ、Ｉｌ、ＩＲ Ｌ　Ｐｒｅｓｓ、１９１頁中、Ｃｈａｋａｒａｂａｒｔｉら、　（１９８５）、 Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５：３４０３；　Ｍｏ５ｓ、（１９ｇ？）、　 ｒＧｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ 　Ｃｅ１ｌｓＪ　（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１０頁）を参照のこと） 。次いで、免疫反応性領域を含む所望のポリペプチドの発現が、生存している組 換えワクシニアウィルスで感染しおよび／または免疫化された細胞または個体で 起こる。

ポリペプチドの発現のための他のシステムは、昆虫細胞およびこれらの細胞中で の使用に適切なベクターを含む。これらのシステムは、当該分野で周知であり、 例えば、バキュロウィルス組組肛■ｈＣａｌｉｆＯｒｎ′Ｃａ核ポリへドロシス ウィルス（ＡｅＮＰＶ）由来の昆虫発現転移ベクターを含む。このベクターは、 ヘルパー非依存ウィルス発現ベクターである。このシステムから得られる発現ベ クターは、通常、強力なウィルスポリヘドロン遺伝子プロモーターを用いて、異 種遺伝子の発現を起こす。現在、ＡｅＮＰＶ中へ外来遺伝子を導入するために最 も一般的に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多 種の他のベクターもまた、発現を増進するために設計されている。これらは、例 えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリへドロン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変 更し、そして、ＡＴＴから３２塩基対の下流にＢａ１ｌ旧クロ一ニング部位を導 入する；　ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ＋ｓｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　１７：３１を参照のこと）を含む。非融合外来タンパク質の良好な発現は、 通常、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前方に適切な翻訳開始シグナルを含む短 いリーダー配列を有する外来遺伝子を必要とする。プラスミドは、Ｌｃｏｌｔ中 での選択および増殖のために、ポリへドロンポリアデニル化シグナルおよびアン ピリジン抵抗性（瓜）遺伝子および複製起点をも含む。

異種ＤＮＡをバキュロウィルスの所望の部位に導入する方法は、当該分野で周知 である（以下を参照のこと：　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ■ｉｔｈ、　ＴｅＸａＳ 　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌ ｌｅｔｉｎ　Ｎ。

、１５５５；　Ｊｕら（１９＋１７）、　ｒＧｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅ ｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｔａｎ　Ｃｅ１ｌｓＪ　（Ｍｉｌｌｅｒおよ びＣａ１ｏｓｉｌ）中に記載；　Ｓｍ１ｔｈら（１９８３）、Ｍｏ１．　＆　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕ＋ｕ＋ ｅｒｓ（１９８９）、上記）。例えば、この挿入は、相同的組換えにより、ポリ へドロン遺伝子のような遺伝子中に行われ得；所望のバキュロウィルス遺伝子中 に作られた制限酵素部位中にもまた行われ得る。挿入される配列は、可変ドメイ ン由来の少なくとも１つのエピトープを含む所望のＨＣＶポリペプチドのすべて のまたは様々のセグメントをコードするものであり得る。

シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような、翻訳 後改変のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されると考えられる。また、分 泌および核での蓄積（ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）に必要なシ グナルは、無を推動物とを推動物細胞との間で保存されていると考えられている 。

無を推動物の細胞中で有効なを推動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野 で周知である。例えば、昆虫細胞中では、ヒトインターロイ牛ン２シグナル（ｌ Ｌ２）は、細胞が認識されると外部へ輸送するシグナルとなり、完全に除去され る。

上記宿主細胞およびベクターを用いて調製されたポリペプチドは、しばしば、融 合ポリペプチドであることが望ましい。

非融合ポリペプチドと同様に、融合ポリペプチドは発現後に細胞内に留まり得る 。あるいは、融合ポリペプチドが、リーダー配列フラグメントを含む場合、この 融合ポリペプチドはまた、細胞から増殖培地中に分泌され得る。好適には、外来 遺伝子のリーダーフラグメントと残りの部分との間ニ、インビボまたはインビト ロで切断され得るプロセシング部位がある。

ＨＣＶの処置に組成物が使用される場合、その組成物は免疫原性であることが望 ましい。合成ポリペプチドは、正しいエピトープを提供するために正しく構造化 されるが、免疫原性になるには小さすぎる場合、ポリペプチドは適切な担体に結 合され得る。このような結合を得るための多数の技術が、当該分野で周知であり 、これらには、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネー ト（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ へ牛サンー１−カルボキシレー１−　（ＳＭＣＣ）　（ペプチドにスルフヒドリ ル基がなければ、システィン残基の付加により提供され得る）を用いるジスルフ ィド結合の形成が含まれる。これらの試薬は、その試薬自身とあるタンパク質中 のペプチドシスティン残基との間にジスルフィド結合を形成し、そして、リジン のε−アミ７基または他のアミノ酸の他の遊離アミン基にょるアミド結合を形成 する。このような種々のジスルフィド／アミド−形成剤が知られている。

例えば、ｌｍ５ｕｎ、　Ｒｅｖ、　（１９８２）　６２：１１１５を参照のこと 。他の二宮能カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテル結 合のためである。これらのチオエーテル形成試薬の多くは、市販で入手可能であ り、６−マレイミドヘキサン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ− マレイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボン酸などの反応性エステルを含 む。これらのカルボキシル基は、そのカルボキシル基をコハク酸イミドまたは１ −ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と組み合わせるこ とで、活性化され得る。抗原をカップリングするためのさらなる方法には、欧州 公開公報第２５９．１４９号に記載のロタウィルス／「結合ペプチド」システム が用いられる。上記の列挙は、それがすべてであるわけではなく、列挙された化 合物の改変物もまた、明らかに使用され得る。

担体としては、宿主に対して有害な抗体の産生をそれ自体が引き起こさなければ 、どのような担体でも使用され得る。

適切な担体は、典型的には、タンパク質のような大きくて徐々ニ代ｓ１される高 分子；ラテックス機能付与セファロース、アガロース、セルロース、セルロース ビーズなどのようす多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような重合ア ミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性ウィルス粒子（以下を参照のこと）で ある。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンベットヘ モシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、テタヌ ストキンン、および当業者に良く知られた他のタンパク質である。

ＨＣｖ可変ドメイン（特にＥｌおよびＥ２／Ｎ５Ｉ）のエピトープの免疫原性は 、粒子形成タンパク質（例えば、Ｂ梨肝炎表面抗原に関連するタンパク質）と融 合されたまたは組み立てられた真核細胞系において、それらを調製することによ っても増強され得る。例えば、米国特許第４，７２２，８４０号を参照のこと０ 可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドが粒子形成タンパ ク質コード配列に直接結合する構築物は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性で あるハイブリッドを生成する。

さらに、調製したすべてのベクターは、例えば、プレーＳペプチドのような種々 の程度の免疫原性を有し、１（ＢＹに特異的なエピトープを含む。このように、 粒子形成タンパク質から構築され、ＨＣＶ配列を含む粒子は、ＦＩＣＶおよび１ （ＢＹに関して免疫原性である。

肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）が、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕ ｅｌａら（１９１１２＞、Ｎａｔｕｒｅ　２９８＋３４４）、および、例えば哺 乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９１１４）、「Ｂ型肝炎」、Ｍｔｌｌ ＋ｍａｎ　１．ら編に記載）中で形成され、そして粒子に組み立てられることが 示されている。

このような粒子の形成は、モノマーサブユニットの免疫原性を増強することが示 された。構築物はまた、プレ表面（プレーＳ）領域の５５のアミノ酸を含むＨＢ ＳＡｇの免疫優性エピトープを含み得る。１ｌｅｕｒａｔｈら（１９８４）。酵 母中で発現され得るプレーＳ−ＨＢ５Ａｇ粒子の構築物は、欧州公開公報第１７ ４．４４４号に開示されている；酵母での発現のための異種ウィルス配列を含む ハイブリッドは、欧州公開公報第１７５，２６１号に開示されている。これらの 構築物は、５Ｖ４０−ジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いて、ＣＩＯ細胞のよ うな哺乳動物細胞中でも発現され得る（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。

さらに、粒子形成タンパク質コード配列の一部は、ＨＣＶ可変ドメイン由来のエ ピトープをコードするコドンで置換され得る。この置換において、酵母または哺 乳動物で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するのに必要とされない領域 が削除され得、このようにして、ＦＩＣＶエピトープと競合する部分から余分な ＨＢＶ抗原部位を除去する。

活性成分として免疫原性ポリペプチドを含むワクチンの調製は、当業者に公知で ある。典型的には、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかと して、注射可能なように調製される；注射前に、液体に溶解または懸濁させるの に適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた、乳化すること も可能であり、すなわち、リポソーム中でカプセル化されたポリペプチドであっ てもよい。この活性免疫原性成分は、薬学的に受容され得る賦形剤であって、こ の活性成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。

適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノー ルなど、およびそれらの組合せである。

さらに、必要であれば、このワクチンには、少量の補助物質が含まれ得る。この 補助物質としては、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチン の効果を増強するアジ二バントが挙げられる。効果的なアジュバントの例は、以 下を含むが、それだけには限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル− ムラミル−し−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−７セ チルーノルームラミルーし一アラニルーＤ−イソグルタミン（（ＣＧＰ　１１６ ３７）、ツルーＭＤＰと呼ばれる）、ドアセチルムラミル−し−アラニル−Ｄ− イソグルタミニルーム−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−５ｎ− グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ　１９８ ３５Ａ、　ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩ８１゜ここで、ＲＩＢ＋は、 ２％スクアレン／Ｔｖｅｅｎ８０乳濁液中に、細菌から抽出される３成分、すな わちモノホスホリルリピドＡ、）レバロースシミコレートおよび細胞壁骨格（Ｍ ＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含んでいる。アジユバントの効力は、可変ドメイン由 来のＨＣＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定する ことにより決定され得る。この抗体は、種々のアジュバントもまた含むワクチン 中でこのポリペプチドを投与することによって生じる。

タンパク質は、中性または塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に受容さ れ得る塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミ７基と共に形成される）が含まれ 、この塩は、無機酸く例えば、塩酸、リン酸）、または有機酸（酢酸、シ二つ酸 、酒石酸、マレイン酸など）を用いて形成される。　遊離カルボ牛シル基と共に 形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸 化アンモニア、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（イソ プロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン 、プロ力インなど）からも誘導され得る。

ワクチンは、従来、非経口的に投与され、その形態は、例えば、皮下または筋肉 注射である。他の投与形態に適したさらなる処方物には、坐剤があり、場合によ っては経口処方物を含む。坐剤には、従来のバインダーおよび担体は、例えば、 ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る；このような坐剤は 、活性成分を含む混合物から０．５％〜１０％、好適には１％〜２％の範囲で形 成され得る。経口処方物には、通常用いられる賦形剤が含まれており、この賦形 剤には、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ス テアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウ ムなどがある。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性 処方物または粉末の形態をとり、そして１０％〜９５％の、好適には２５％〜７ ０％の活性成分を含む。

上記に加えて、ＨＣＶ抗原セ、）の組換えポリペプチドを発現する弱毒化微生物 の生ワクチンを調製することも可能である。

適切な弱毒化微生物が、当該分野で周知であり、例えばウィルス（例えば、ワク シニアウィルス）および細菌を含む。

ワクチンは、投薬処方と適合する様式で、そして予防効果および／または治療効 果が得られる量で投与される。投与されるべき量は、一般的に１回の投与当り抗 原５μｇ〜２５０μｇの範囲であるが、処置される個体、この個体の免疫系が抗 体を合成する能力、および望まれる保護の程度に依存する。投与に必要とされる 活性成分の正確な量は、医師の判断によるものであり、各個体に特有であり得る 。

ワクチンは、１回の投与スケジュールで与えられるか、または好適には複数回の 投与スケジュールで与えられ得る。複数投与スケジュールでは、最初のワクチン 投与は、１〜１０回に分けて行われ、以後の投与は引続き免疫応答を維持および ／または増強するために必要とされる時間間隔で行われ得る。

例えば、２回目の投与では１〜４力月で行われ、そして必要であれば数カ月後に 引続き、投与が行われ得る。投与法は、少なくとも部分的にはは、個体の必要量 よっても決定され、医師の判断による。

さらに、上述の）ＩＣＶポリペプチドを含む抗原セ、２トを含むワクチンは、他 の免疫制御剤、例えば免疫グロブリンと共に投与され得る。

本発明の組成物は、個体に投与されて、多数の用途に使用され得る（従来技術を 用いて、血清から精製または単離された）ポリクローナル抗体を生成し得る。例 えば、ポリクローナル抗体は、個体を受動免疫化することに、または免疫化学試 薬として用いられ得る。

本発明の他の実施態様では、複数の■Ｃｖ抗原セ・、）を含む上記の免疫反応性 組成物が、例えば血液または血清試料を含む生物学的試料中の抗−ＨＣＶ抗体を 検出するために用いられる。

イムノアッセイの設計は、変化に富み、多様なものが当該分野で周知である。し かしながら、イムノアツセイは抗原セ・ットを用い、ここで各抗原セｙ）は、Ｕ ＣＶ単離体の第１可変ドメイン中にエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質 的に同一のポリペプチドからなり、１セツトのアミノ酸配列は、少なくとも１つ の他のセットのアミノ酸配列について異質性である。イムノアッセイのプロトコ ルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アツセイに基づき 得る。

このプロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降法によ るものであり得る。はとんどのアッセイは、１１８ａ化抗体またはポリペプチド の使用を含む；この標識は、例えば、蛍光性、化学発光性、放射性、または染料 分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた知られてい る；それらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、およびＥＬＩ ＳＡア２セイのような、酵素補職されそして酵素に介されるイムノアッセイであ る。

免疫学的診断に適し、そして適切な標識試薬を含むキットが、可変ドメイン由来 のＨＣｖエピトープを含有する本発明の組成物を含む適切な材料を、アッセイの 実施に必要とされる残りの試薬および材料（例えば、適当な緩衝液、塩類溶液な ど）および適当なアッセイの説明書のセ・ントと共に、適当な容器中にパッケー ジすることで構成される。

以下の記載は本発明の実施例であり、説明の目的のためにだけ提供するもので、 本発明の範囲を限定するものではない。

本開示を考えると、請求の範囲内で非常に多数の実施例が当業者に明らかである 。

支胤桝 実施例において、以下の材料および方法を用いた。

・およびＨの 無症候性のＦＩＣＶ保菌者である１（ＣＴＬＩＩおよびＨＣＩ／Ｊｌ、および慢 性的に感染しているｎｃｖ被験体のＴｈは、Ｗｅｉ　ｎｅｒら（１９９１）Ｖｉ ｒｏｌ。

１！ｔｏ　：８４２−８４８中に、以前に記載されている。被験体Ｑは、肝臓バ イオプシーに基づいて、慢性活性肝炎であると診断され、６ケ月間、アルファー ２ｂインターフエロン治療を施された（毎週３回、３百万単位）。製造者により 示されるように１０Ｂｇ／ｍｌのＭＳ２保菌者ＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　１６５−９４８）を含むＲＮＡｚｏｌ’１Ｂ試薬（Ｃｔｎ ｎａ／旧ｏｔｅｃｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣｈｏｍｃｙｎｓｋ ｉおよび５ａｃｃｈｉ、（１９８７）　Ａｎａｌ、　Ｂ［ｏｃｈｅｍ、　１６２ ：１５６−１５９の方法に従い、ＲＮＡを血漿０，２■ｌから抽出した。ＲＮＡ を、蒸留水で処理したジエチルピロカーボネート２００μｌ中に再懸濁し、そし て、最終濃度０．２Ｍの酢酸ナトリウムおよび２．５倍容量の１００％エタノー ル（−２０″Ｃ）中で再沈澱させた。

ｃＤＮＡおよびポリメラーゼ　１ すべての反応を、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ　３３５：１−５に 従い実施した。Ｍ１３配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９ｇ３＞、　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｌＪ：Ｚ（１−３７に従い実施した。少 なくとも４つのクローン化挿入フラグメントの共通配列が、２つのクローン由来 の■ＣＶ　Ｊｌ、２　Ｅ２／ＮＳＩ配列を除いて与えられた。

！（（：ＴＬｇおよびＴｈのクローニングおよび配列決定を、上記のＷｅｉｎｅ ｒら（１９９１）の報告の通りに行った。被験体ＱのＥ２／ＮＳＩのアミノ末端 セグメントおよびカルボキン近位セグメントをクローニングするために用いた組 み込まれたＰＣＲプライマーは以下Ｘ　（Ｅ２　）１４　ＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴ ＧＧＧＧＡＧＴＣＣＴ　＋１３６７−１３　Ｅ１６　）　ＳＸ　（Ｅ２１１８Ｊ 　ＣＡＴＴＧＣＡＧＴｒＣＡα石ＣＣＧＴＧＣＴＡ（１６０８４５８８１Ａ。

ＰＯエエ Ｘ　（Ｅ２１４　ＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣ（１４０６−１４ ２５）　ＳＸ　（Ｅ２１１９．Ｔ　ＴＧＣＣＡＡｍα：ＡＴｒＧＧＴｌｌｌｌ； ’Ｉτ（１５８２４５ｇ２）Ａ。

ＰＣＲ工 Ｘ（Ｅ２）１４　（上記）Ｓ ’　ＪＬｒｃ１２　ＴＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＡ（２３１３−２２９ ６）ＡＰＣＲ１工 ＵＳ　（Ｅ２　）　５　ＣＡＡＴｒＧＧＴＴαＺＴＴＧＴＡＣＣ（１９６０４９ ７Ｂ）Ｓ、Ｊ１ｒｃ１３　ＣＧＴＣＣＡＧＴＩ℃ＣＡＧＧＣＡＧＣ’ｒＴＣ（２ ２６０−２２４０）Ａ。

１（ＣＶ　ＪＩ　Ｅ２／ＮＳＩ遺伝子をクローニングするために用いたＰＣＲプ ライマーは以下であった： ＰＣＲ工 ’　ＪＬ（Ｅ２＋１４　（上１己）Ｓ ＪＬ　（Ｅ２１　ｒｃ３０”　ＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＴＣｆ２ ３４９−２３３０）　ＡＪ１工ｚ−２゛’ｒＧＡＧＡＣＧＧＡＣＧＴＧｃＴＧＣ ＴＣＣＴ（１９６０：１９７８）ＳＪｌ（Ｅ２　）　ｒｃ３２”　Ｔ″ｒ′ＴＧ ＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡ　（２６５Ｂ　−２６３６１。

■１エニーＥ２３８４．５” 印ど口＄＝芯ＣココにＣα２−ワロ刀αｈ印σニａユ（１４６９１４９５）Ｓ ＤＳＣＯＮＩＪＢＸ’ ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴｒＡＣＴＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣ ＣＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡ（２２７２−２３０１）Ａ 、Ｔ１工Ｚ−１’　０ＡＣｒＧＧＴＴＣＧＧＣＴＧＴＡＣＡ（１９ｉｓ−１９３ ５）Ｓ、ｎ（Ｅ２）ｒ（３１’″”　（２５６６−２５４６）Ａ。

゛は、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、（１９９０）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１８：４６２６からのｎｔ配列である；°°は、Ｋａ　ｔｏら、（１９８９） 　Ｐｒｏｃ、　Ｊｐｎ、　Ａｃａｄ、　６５Ｂ：２１９−２２３からのｎｔ配列 である。センス（Ｓ）またはアンチセンス（Ａ）ＰＣＲプライマーを、参考文献 中のヌクレオチド番号（こ従い、５°から３°の向きに示した。

ビオチン　ペプチドの４ １（ＣＶの３つの株の超可変領域に対する重複オクタペプチド（８ペプチド）を 、切断再能なリンカ−上で合成し、誘導し、ポリエチレンのピンを、本質的にＭ ａｅｊ　ｒら、（１９９０）　Ｊ、Ｉａｕ＋ｕｎｏ１Ｍｅｔｈｏｄｓ　１３４： ２３−３３による記載のように、各ペプチドのＮ−末端にカップリングした。最 後に、　４０＋ｉＭのビオチン、４ｈＭの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ ＨＯＢｔ）、４０ｍＭのベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロ リジノ−ホスホニウムへキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ、　Ｎ０１／Ａ ＢＩＯＣＩ（ＥＭ）および６０ｍＭのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を含む１ ５０μｌのジメチルホルムアミド溶液を用いて一晩２０℃で反応させ、ビオチン をＮ−末端に力、ツブリングした。

ビオチン化の後、ペプチドの側鎖を脱保護し、洗浄し、そして各ビンから得られ るペプチドを、２００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中で切断した 。切断ペプチド溶液を含むマイクロＣタイタープレートを、必要とされるまで一 ２０℃で貯蔵した。

ビオチン　ペプチドのＥＬ　Ｉ　ＳＡ ポポリチレンプレート（Ｎｕｎｅ　ｊｍ＋ａｕｎｏ　ｐｌａｔｅ　ｍａｘｉｓｏ ｒｂ　Ｆ９１ｉ）を、−晩４℃で、０．１ｍｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌストレプ トアビジン（Ｓｉｇｍａカタログ番号５４７６２）溶液と共に、ｐＨ９，６の０ ．１Ｍ炭酸緩衝液中でインキコベートすることにより、ストレプトアビジンでコ ートした。ストレプトアビジン溶液除去の後、ウェルを、ＰＢＳ中のＴｖｅｅｎ ２０の０．１％溶液で４回洗浄した。ＰＢＳ中で、０．２冒１の２％ＢＳＡと共 に１時間２０”Ｃで、各ウェルをインキュベートすることにより、非特異的結合 を遮断した。ウェルを、再びＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎ　２０で４回洗浄した。プレー トを風乾し、要求されるまで、４℃で貯蔵した。各ウェル中のストレプトアビジ ンを、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に０．１％のＢＳＡを伴う切 断ペプチド溶液の１＋ｌＯＯ希釈液１００μｌと、２Ｇ”Ｃで１時間のインキュ ベートすることにより、切断されたペプチドに力、プリングした。インキュベー ションの後、プレートをＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎ　２０で４回洗浄した。各ウェルを 、血清の適切な希釈液（０，１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の２％ＢＳ Ａで希釈）１００μｌと共に、２０℃で１時間または４°Ｃで一晩インキュベー トした後、ＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎ　２０で４回洗浄した。結合した抗体を、コンジ ユゲート０．１ｍｌ中で、２０℃で１時間反応させることにより検出した。これ は、ＣＡＳＳ（０，１ＭのＰＢＳ中に希釈した０、１％ヒツジ血清、０．１％Ｔ ｖｅｅｎ　２０．０．１％ナトリウムカゼイネート、ｐＨ７，２）中の西洋ワサ ビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ ｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）０ ．２５ｍ１／ｌ（飽和レベル）から構成されていた。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｖｅ ｅｎ　２０で２回洗浄し、引続きＰＢＳだけで２回洗浄した。酵素の存在は、ｔ ｏｏｌの０．１Ｍリン酸１０．０８Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４，０中に５０■ｇ のアンモニウム２．２−アジノービス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル ホネー）　（ＡＢＴＳ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ｍカタログ 番号１２２６６１）および０．０３■ｌの３５％（Ｖ／Ｗ）過酸化水素溶液を含 む０．１■ｌの新たに調製された溶液と、２０°Ｃで４５分間反応させることに より検出した。発色を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣプレート リーダー中で、４９２ｎｉの対照波長に対して４０５０■のデュアル波長モード で測定した。

コンピューターで　された　プロフィールＨＣＶ　Ｅ２／ＮＳＩタンハク質およ び［ＩＩＶ−１ｇｐ１２０超可変領域ｖ３　（ａａ３０３−３３８）に対する抗 原性プロフィールを、Ｋａｂａｔ［免疫学的に重要なタンパク質の配列、米国厚 生省（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａ ｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ）、公共保健サービス（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ ｅｒｖｔｃｅ）、国立衛生研究所（１９８３）］により最初に提案されたように して、配列変異の程度に基づいて、コンビ島−タープログラムから誘導した。こ の抗原性プロフィールを用いて、各々の可能な対をなすアミノ酸に対して抗体結 合が保持される個々の確率の平均を乗じて免疫グロブリンの超可変ループを同定 した。与えられたアミノ酸の変化に関連する抗体結合の保持の確率は、１０３個 の特徴化された線形エピトープに対するすべての可能なアミノ酸置換基の抗体結 合における効果を評価することにより、実験的に決定される値であった。

Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８８）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｅｃ、　１：３２−４１゜ このようにして、このアルゴリズムは、変異指数に加重価を与え、抗体の結合に 大きな影響があると考えられるアミノ酸の変化により重みを与えた。すなわち、 保存的なアミノ酸の変化に対して補正を行ツタ。１５ノＨＣｖ配列［ＨＣｖ−１ ，Ｑ３．２．＋ｌＣＴ　２３．　ＥＣｌ０．　）Ｉｃ−Ｊｌ、Ｉ（ＣＶＥＩ、Ｔ Ｈ，Ｉ（ＣＴ　２７．　Ｑｌ、２．　ＨＣＴ１８．　）Ｉｃ−Ｊ４．　ＨＣＶ　 Ｊｌ、２／ＨＣＶＪ１．１．　ＦＩＣＶ　Ｊ、　ＨＣＶ　ＢＫＩをｎｃｙ＋＝対 する抗原性ブｏフィーＪｌ／（Ｄ測定に用いた。ＨＩＶ−Ｉ　Ｖ３プロフィール を、ユニーク旧Ｖ−１配列のより多数のデータベースからランダムに選択した１ ５配列の２４２の個プロフィールを平均することで得た。ＬａＲｏｓａら、（１ ９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９＋９３２−９３５およびＣｏｒｒｅｃｔｉｏ ｎ　ｉｎ　５ｅｉｅｎｃｅ　（１９９１）８１１頁。これらの単離体のいくつか のａａ３８４と４２０との間のアミノ酸配列を図３に示す。

コンビニ−−で　される２゛６ アミン末端領域（３８４−４２０＞がαへり・ノクス、βシート、βターン２次 構造を含む確率は、３つの上記２次構造特徴のそれぞれに対する確率を、各残基 に割り当てるアルゴリズムを用（１て決定し得る。アルゴリズムに用いられる係 数は、構造データベースの残基のすべての対合様式の組合せに対して得られた。

ＬｅｖｉｔｔおよびＧｒｅｅｒ、（１９７？）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１ １４：１８１−２９３゜これらの係数から得られた予想ノくラメ−ター（よ、与 えられた残基が３つの定義された２次構造特徴の１つに見出される確率を得るた めにアルゴリズムをデータベースに適応し直して、観察結果と合致させた。

実施例１ ＨＣＶ　Ｅ２　ＮＳＩ　ＨＶおよびＨＩＶ−１１２０）’メイ７（７）２　°お よびアミノ　１　の １５のＩ（ＣＶおよび旧Ｖ−１単離体由来のアミノ酸配列を、ＨＣＶ　Ｅ２ＭＶ ドメインまたは旧Ｖ−１ｇｐ１２０　Ｖ３ドメイン中でアミノ酸配列の異質性が 観察された位置の数について比較した（それぞれ、図４、ＡおよびＢ）。アミノ 酸の異質性は、Ｅ２　ＨＶ領領域は３゜のアミノ酸位置のうち２５の位置、そし て、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０　Ｖ３ドメインでは３５のアミノ酸位置のうち２３の 位置で生じていた。

図４ＡおよびＢのＸ軸上のダッシュは、可変アミノ酸残基が生じるアミノ酸位置 を表し、そして、非変異アミノ酸は１文字のアミノ酸コードで示している。図４ 中に示された抗原性プロフィールにより、）１１ｖ−Ｉ　ＧＰＩＺＯタンパク質 のｖ３ループ（図４Ｂ）と同様に、ＨＣＶ　ＥＺ中の１ブロツクのアミノ酸残基 （図４Ａ中のアミノ酸３８４−４１４）において、その変異は抗体結合における 予想通りの逆の効果を有することが認められたことが示される。図４中のデータ により、ＨＣＶ　Ｅ２ドメインは、ウィルス中和エピトープをコードすることで 知られる旧Ｖ−１ｇｐ１２０ｖ３ドメインと、観察されたアミノ酸変異の程度お よび期待重みの両方において類似することが示され、Ｅ２　ＢＹドメインは、ｇ ｐ１２０　Ｖ３ドメインと同様の機能を有し得ることが示唆される。

線形エピトープは、タンパク質（特にタンパク質の末端）のあまり構造化されて いない領域に、または伸長した表面ループに、より関連していると思われる。コ ンピューター分析を用いて、個々の残基が残基３８４〜４２０間の１５のＥ２　 ＨＶアミノ酸配列についての定義された２次構造特徴に関連する確率を予測した 。図４から、Ｅ２アミノ末端残基３８４と、非常に期待され顕著に保存されたβ ターン（残基４１５−４１８）との間の領域は、αヘリックス、βシート、βタ ーンの確率が５０％以下であることから示されるように、比較的構造化されてい ないことが示される。Ｅ２　）ＩＶドメイン中の期待構造の欠如は、単離体間で みられる広範囲の配列変異に対する許容性と一致し、タンパク質の３次元的折り 畳みに寄与する顕著に構造化された領域と対照的である。ｖ３は、ＨＩＶ−１ｇ ｐ１２Ｇの主要中和ドメインであり、β鎖−１１盟βターン−β鎖−αヘリック ス特徴を含むことが報告されており、アミノ酸の変異において、ＢＣＶ　Ｅ２Ｈ Ｖドメインよりも強い構造的制限を有し得る。ＨＣＶ　Ｅ２　）ＩＶドメインは 、このｖ３よりも構造化されていないようにさえ見える。まとめると、この事実 は、２２　ＨＶドメインが、線形中和エピトープと考えられる部位を含むタンパ ク質ドメインに特徴的な特性を有するように思われることを示唆する。

実１旦」工 ＨＣＶ　Ｅ２　ＮＳ　ＩＩＶドメインのエピトープマノピング１（ＣＴＩＩＩ　 （Ａ、　Ｉ））、ｒｈ（ａ、　Ｅ）およびＨＣＶ　Ｊｌ（Ｃ，Ｆ）１７）Ｅ２／ ＮＳＩ　ＩＩＶドメイン（アミノ酸３８４〜４１６位）に対応し、そしてそれを 越えて伸長する重複ビオチン化８量体ペプチドを、ストレプトアビジンでコート したプレートに結合し、ＨＣＴ　１ｇ（Ａ−Ｃ）またはＴｈ　（Ｄ−Ｆ）のいず れかに由来の血漿と反応させた。ＨＣＶ単離体ＨＣＴ　１８（図６Ａおよび６Ｄ ）、Ｔｈ（図６Ｂおよび６Ｅ）、およびＨＣＶ　ＪＨ図６Ｃおよび６Ｆ）につい ての結果を図６に示す。ＯＣＴ　１８血漿を１＋２００ニ希釈し、Ｔｈ血漿を１ ：５００１ｉｎ希釈した。ＨＶＥ−１、−２、−３、−４、および−５は単離体 に特異的なエピトープを示す。

図６から分かるように、ＨＣＴ　１８配列（図６Ａ中の）ＩＶＥ−１）から誘導 されたペプチドで試験すると、０ＣＴ１８血漿は線形エピトープ（”７ＰＫＱＮ Ｖ’■）を同定したが、２つの異なる株ＴｈおよびＨＣＶＪｌのＨＶドメインに 対応するペプチドとは反応しなかったく図６Ｂおよび６Ｃ）。対照的に、Ｔｈ血 漿は、ＴｈのＩｎドメイン中の線形エピトープ１（ＷＥ−ＩＶ（”’ＱＮＩＱＬ Ｉ”’、図６Ｅ）を同定し、そして株ＦＩＣ７１ｇ（”９１ＶＲＦＦＡＰ″’、 図６Ｄ）およびＨＣＶ　Ｊｌ中ノエヒトーブをもまた同定した。ＩＶの薬剤の使 用者であるＴｈは、ＨＣＶの複数の株に対して感染可能状態に置かれ得た。

Ｔｈ血漿およびＨＣＴ　Ｉ１１血漿は両方とも、Ｅｌ、ＩＳＡにおいて各単離体 由来のビン合成された重複８量体ペプチドと共に使用された場合、３つの単離体 すべてに共通なエピトープ（アミノ酸４１３−４１９位）とそれぞれ反応した（ データを示していない）。

抗体結合の特異性を確認するために、アミノ酸４０３−４０７位を含むビオチン 化ペプチドに結合している抗体を評価し、これを用いて、ＨＣＴ　Ｉｌｌ血漿の 反応性を、ＨＣＴ　１８　ＨＶドメインに対する重複８量体を含むピンで遮断し た。これらのデータにより、以下のことが示される：　１）Ｅ２／ＮＳＩ　［ｌ Ｖドメインが免疫原性であること、２）この領域をマツプする複数のエピトープ があること、そして、３）■Ｖドメイン中のエピトープのサブセット（図６中の ＲＹＥ−１、−２、−３、−４または−５）が単離体特異的であること。

実ｍ 口　Ｅ２ＮＳ１■ｖドメインが　：の　、と　°　し′ることの汲亙 慢性ＨＣｖ感染にしばしば見出される肝炎の間欠性発赤に関連するＨＣＶ変異体 を発見する可能性を調べるために、慢性肝炎の被験体Ｑから、約２年間隔の肝炎 の２つの別個のエピソード（それぞれ、ＱｌおよびＱ３）の際に得たＥ２／ＮＳ Ｉ遺伝子を部分的に配列決定した。肝炎の第２のエピソードは、インターフェロ ン治療を終了して１年半後に起こった。

ＱｌおよびＱ３のＥ　２／ＮＳ　１領域の推定アミノ酸配列の差異は、３９１− ４’０８の間でだけ著しく異なっており、８つの変化のうち７つをアミノ酸３９ ８と４０７との間に生じていたく図７）。図７は、ＱｌおよびＱ３単離体のＥ２ ／ＮＳＩポリペプチドの２つの領域、つまりアミノ酸３８４−４１４および５４ ７−６４７の推定アミノ酸配列を示す。

Ｑ１配列上のアミノ酸（Ｅ）が、４つの０１クローンのうちの１つに見出された 。ボックスで囲まれたアミノ酸は、Ｑｌ　）ＩＶＥまたはＱ３　ＲｖＥの１２量 体ペプチドの位置を表す。Ｑｌと０３との間に見出されるアミノ酸配列の相違は 、太字で示した。

ＱｌおよびＱ３のＥ２／ＮＳＩポリペプチドのアミノ酸５４７と６４７との間で は、アミノ酸異質性が１カ所でだけ観察された（図７）。

ＱｌおよびＱ３のＥ２１１Ｖドメイン中に観察されるアミノ酸置換の抗体結合に おける効果を調べるため、アミノ酸３９６から４０７（図７８の１ｉＶＥ　Ｑｌ またはＱ３）をもとにＱｌおよびＱ３に特異的な１２量体ペプチドを合成し、Ｅ ＬＩＳＡにおいてＱｌおよびＱ３の血漿と各ペプチドとを別々に反応させた。図 ４がら、Ｑｌおよび。３の両血漿中の抗体は、Ｑｌペプチドと反応したが、Ｑ３ ペプチドとは反応しないことが示される。統計解析（スチューデントの検定）に より、Ｑｌ／Ｑ３血漿のＱ１ペプチドへの結合は、これらの血漿のランダムに選 択された１区画の１２の対照ペプチドに対するバックグラウンド結合を有意に越 えているＣＰ＜０．００１）ことが示されたが、一方Ｑ１またはＱ３の血漿のＱ ３ペプチドへの結合は、統計上有意ではなかった。このデータは、被験体Ｑは、 ＨＣＶ　ＱＩ　ＥＶドメインに対する抗体を発生し、この抗体は、２年後の。３ 時点でもまだ検出し得たが、検出し得る体液性応答は、肝炎の第２のエピソード の間に優性であるＱ３　Ｅ２　ＨＶ変異体に対して全く発生されなかったことを 示している。

表４ １２　ペプチドの　ｓａの Ｑ：ｌ：　１．１５Ｂ　０．１３４　０．６９１　０．’Ｌ２３Ｑ３　１．０２ ２　０．１２３　０．＝９３　０．０３６１立五工 ＨＣＶ、　にお（る　なる　Ｎ５ｌｖドメインを　。

Ｅ２ＮＳ１の 図８Ａは、日本人のボランティアの供血者ＨＣＶ　Ｊｌの１つの血漿試料からク ローニングしたＨＣＶ　Ｊｌの２つ＋７１単１１体（Ｊｌ、１およびＪｌ、２） から推定されたアミノ酸配列を示す。Ｋｕｂｏら、（１９８９）　Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ＬＺ：１０３６７−１０３７２゜ＨＣＶ　Ｊｌ、１とＨＣＶ 　Ｊｌ。

２との間の全部で２３のアミノ酸の変化のうち、太字で示した９つの相違が、３ ０のアミノ酸のＥ２／ＮＳＩ　［ｌＶドメインに集中している。Ｅ２／ＮＳＩ　 ［ドメイン中の９つのアミノ酸の置換のうち５つは、非保存的アミノ酸変化を表 す。）ＩＣＶ　Ｊｌは、本発明者らの実験室でクローニングされた唯一の１１群 ［ＩＣＶゲノムであるため、これらの相違がＨＣＶ　Ｊｌ血漿の交叉汚染による ものではないと考えられる。２つの別個のＰＣＲ反応から作製した７つのクロー ン化配列から、２つのＥ２／ＮＳＩ　ＨＶ変異体配列だけが同定されたので、Ｉ ＩｃＶ　Ｊｌ、２配列は、ＨＣＶ　Ｊｌの血液中の少数配列（ｓｔｎｏｒｉｔｙ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を表す。

興味深いことに、ＨＣＴ２７単離体および１（ＣＶ　Ｅｌ単離体は、これらは異 なる実験室で配列決定され、おそらく無関係な個体から得られたが、両者を比較 することにより、これらの単離体中のＥ２／ＮＳＩ　ＨＶトドメイン中アミノ酸 の相違の数が、同一個体由来の単離体の間で観察された相違の数より少ないこと が示された（図８Ｂ）。

上記の結果により、個体および個体群中でＨＣＶゲノムが急速に進化していると いう示唆が導かれる。

爽立皿玉 ワクチンの　と ジフテリアトキソイド　ンバク　のＭＣＳへの力・プ嘗ングＬ１象林旦 エチレンシアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　Ｎａ２．２Ｈ２０）（ＭＷ　３７２＞６− マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣ３）　（Ｓ ｉｇｍａ）−純度９５％リン酸二水素−ナトリウム（Ｎａ）Ｉ２ＰＯｎ）窒素 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水 ５■Ｍ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，６６）０、１Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ８，０） ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） コハク酸ナトリウム［（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２．６Ｈ２０］システイン 塩酸（２％溶液） ０．１Ｍコハク酸ナナトリウム１０．ＩＥＤＴＡ、　ｐｎｓ、６精製されたジフ テリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｖｉｃｔｏｒｉａ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ＞を、以下に記載の方法 によりＭＣ３にカップリングした：　Ｌｅｅら、（１９１１０）　Ｍｏ１．　Ｉ ｍｍｕｎｏ１１７：７４９；　Ｐａｒｔｉｓら、　（１９ｇ３）　Ｐｒｏｔ、Ｃ ｈｅｗ、２：２６３；　Ｐｅｅｔｅｒｓら、（１９８９）　Ｊ、ｍｖｕ　ｏｆ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２０：１３３；　Ｊｏｎｅｓら、　（１９８９）　ＬＩｍｍ ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２３：２１１ｏ　１０ｈｌのジフテリアトキソ イドをＧ２５セフアデツクスカラム（１７ｃｍｘ　４ｃｍ）に通し、チオメルサ ールを除去した。トキソイドを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０）で溶出 し、溶出液のタンパク質容量をＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い てアッセイした。得られた溶液を、Ａ＋５ｉｃｏｎ限外濾過二二、トを用いて、 最終濃度１０ｍｇ／Ｉ１１に濃縮した。

１ｍｌのトキソイド溶液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０＞で透析し、次 いで２００μＩＤＭＦ中の１．５ｍｇＭＣ５の溶液と混合した。得られた溶液を 、暗所において室温で１時間時々攪拌しながらインキュベートした。ＭＣＳ　ト キソイドからカップリングされていないＭＣＳを分離するため、溶液を、Ｏ，１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，６６）で平衡化されたセファデックスＰＤＩＯカラム に通過させ、タンパク質画分を採集した。

力、ブリングされたマレイミド基の担体分子当りの数を、そこにＨＣＶペプチド がカップリングする前に測定した。３０ｍ１のコハク酸／ＥＤＴＡ緩衝液に窒素 を２分間吹き込んだ。５ＩＩ１ｇのシスティンを、２５ｍ１メスフラスコ中に移 し、最終体積が２５ｍ１である吹き込まれた緩衝液中に溶解した。表５中に示し た溶液の分量を、２組で（ｉｎ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）、２５ｍ１スクリユーキ ヤツプボトルに移した。別々のピペットを用いて、各分量中へ窒素を通気した。

次いで各ボトルを密封し、暗所において室温で４０分間時々かきまぜながらイン キュベートした。

表１ 血液　区赳上道Ｕ　標」は（ひ　ズユ２ン’１ｊＡｌ活性化担体　０．３ リン酸緩衝液　０・３　°・３ ンステイン溶液　１．６　１．０　− コハク酸緩衝液　１．０ ＊３溶液のそれぞれのＯ，１ｍ１分量を、エルマンの測定法に用いるために採取 した。

スルフヒドリルの　１　のためのニルマン必１」１１料 リン酸緩衝液、ｐＨ８，０ １５、６ｇのＮａ１（２ＰＯ＊または１２．０ｇのＮａＨ２ＰＯａ無水物を、約 ７００ｍ１〕Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水に溶解する。５０％ＮａＯＨを用いｒｐＨを８． ０ニ調節する。Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水を最終体積が１０１００Ｏニなるように加え、 次いで必要に応じてｐｌを調整する。

エルマン試薬 １０．０■ｇの５．５°−ジチオビス−２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を、２ ．５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）中に溶解する。

０．１１のエルマン試薬を、上記のように調製した溶液、すなわち試料、標準溶 液、およびブランク溶液のＯ，１ｍ１分量のそれぞれに加えた。次いで、５ｍｌ のリン酸緩衝液（ｐｌ（８，０）を、各分量に加えてよく混合し、１５分間その ままおいた。各分量の吸光度を１ｃｍ路長（ｐａｔｈ　ｌｅｎｇｔｈ）のセル中 で４１２ｎｍで測定した。

担体タンパク質上に存在するマレイミド基の数を、次の方法によって測定した。

ＩＩｌ当り０．０１μモルの−ＳＨの溶液は、１ｃｍ光路において４１２ｎ１１ で０．１３６の吸光度を生じた。標準または試料（Ａ）の吸光度は、活性化担体 タンパク質上のカップリングされたマレイミド基と反応したシスナインの量と等 しかった口１モルの有効な−ＳＨが、１モルのマレイミドと反応するので、試験 された分量中に存在するマレイミド基のμモルにおける濃度は、Ａ（０，０１） １０．１３６μモル／ｍｌである。溶液の全体積は、５゜２ｅｌであった。その ため、存在する総μモル数は、Ａ（０，０１）（５２）１０．１３６であった。

試料溶液は、全体積が１．３１であり、その内０．３ｍｌが活性化担体タンパク 質から構成された。試料溶液中に存在するマレイミド基の量は、Ａ（０，０１） 　（５，２）（１，３）／（０，１３６）（０，１＞（０，３）　−Ａ（１６， ５７）μモル／■！であると計算された。ＭＣ３活性化担体タンパク質は、−２ ０℃で貯蔵した。

ＣＶペプチドの　− ＨＣｖペプチドをＭＣＳ活性化担体タンパク質にカップリングする前に、ペプチ ドを還元し、ペプチド上に存在するチオール基が完全に還元されたーＳＨ形であ ることを確実にした。

Ｕ象狂丑 ジチオトレイトール（ＤＴＴ） 炭酸水素アンモニウム（ＮＨａＨＣＯｉ）メタノール ５ＥＰ−ＰＡＫｓ　（Ｃ１８カートリッジ、水）、各８＋＊ｇのペプチドに１カ ートリ、ジ ｏ、ｔｙ炭酸水素アンモニウム緩衝液 ＩＬ　Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水中に７．９ｇのＮＨＡＨＣＯ３を溶解緩衝液Ａ、　Ｍｉ ｌｌｉ　Ｑ水中、０．１％　Ｖ／Ｖ　）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液Ｂｓ　 Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水中、６０％　Ｖ／ｌ／　７セ）　二）　ＩＪ　／ｌ／、０．１ ％　Ｖ／Ｖ　ＴＦＡ ＨＣＶポリポリパク質のアミノ酸３８４−４１１および２２５−２６０にそれぞ れ対応する２つの各）ＩＣＶペプチド１５ｍｇを、１０倍過剰量のＤＴＴを含む ２．５１の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに加えた。生成した溶液をペプチドが 溶解するまで攪拌し、次いで室温で１時間そのままおいた。２対の５ＩＪ−ＰＡ Ｋｓを連結し、約２０ｍ１のメタノール、次いで２０１の緩衝液Ａを多対の５Ｅ Ｐ−ＰＡＫｓに通すことにより活性化した。各ペプチド／ＤＴＴ試料を、ゆっく りと１対の５ＥＰ−ＰＡＫｓに通した。ＤＴＴを２０ｍ１の緩衝液Ａで溶出した 。還元されたペプチドを、７ｉ１の緩衝液Ｂで事前に重さを量ったボトル中に溶 出し、次いで一晩凍結乾燥した。次いでこのボトルの重さを量り、回収されたポ リペプチドの量を測定した。次いで、還元されたペプチドを、ＭＣＳ活性化担体 タンパク質に即座にカップリングした。

ＨＣｖベフチドのＭＣ３′　ンパク　への力・ブ１ング５ｍＭのＥＤＴＡを伴う 約１００ｍ１のＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，６６）を、真空下で脱気し、次 いで１０分間窒素を吹き込んだ。ＭＣＳ活性化担体タンパク質の１０■ｇ／ｍ　 Ｉ溶液２０■ｌに、過剰の発泡を防ぐために窒素を注意深（吹き込んだ。各５■ ｇの還元ペプチドを、約０．２ｅｌの脱気され吹き込まれたリン酸／ＥＤＴＡ緩 衝液＜＋）０６．６６）中に溶解し、次いでＭＣＳＣＳ活性化担体タンバク酸溶 液合した。

得られた混合物を、スクリューキャップボトル中に移し、次いで窒素を充満させ 密封した。この溶液を、Ｂｒａｎｓｏｎ　２００ＯＲ音波処理バス中に２分間お いてさらに脱気した。このボトルを、アルミホイルで被い、振とうテーブル上で 緩やかに攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。

得られたコンジュゲートは可溶性であり、カップリングされなかったペプチドは 、この混合物をリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＦＩ６．６６）で平衡化したセファ デックスＰＤＩＯカラムに通すことにより除去した。タンパク質画分を採集した 。担体タンパク質に結合したペプチドの量を、アミノ酸分析により測定した。

コンジュゲートおよび担体タンパク質の両方の１５０μｍ分量のアミノ酸分析を 行った。担体タンパク質だけの寄与によるアミノ酸のレベルの平均割合を測定し 、生成した結合ペプチドの量を計算した。セリン、スレオニン、トリプトファン 、メチオニン、チロシンおよびシスティンは、標準加水分解条件下で改変される ので、これらのアミノ酸のレベルは、測定されなかった。これらの計算で得られ た典型的な結果を、表６中に示す。

く以下余白） 一シ辷−玉 コンジュゲートの太字の値は、ペプチド中にも存在して−またアミノ酸である。

アラニンおよびプロリンを含むコンジュゲートについては、結果を標準化するた め（こ、因子（１９３＋　１７９　＋　１８０　＋　５６）／（２１２）　＋　 １９４　＋　１５３　＋　６０−０．８６５９ζこ、アミノ酸レベルの量を掛け である。

ワクチン　の 注射組成物は、上記のように調製されたＭＣＳ活性化ジフテ＋７アトキソイド担 体タン、４り質に結合したＨＣＶペプチド、および本明細書中に参考として援用 された１９９０年１２月１３日に公開されたＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ９０１４ ｇ３７号に記載のサブミクロンの水中油乳化型アジユバントを構成成分とした。

さらに、■Ｃｖ結合ペプチドおよびアラニンくントに加え、免疫賦活剤である親 油性ムラミルペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ％ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ、　Ｂａ５ｅｌ、 　５ｖｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む注射組成物を調製した。ワクチン組成物（よ 、一般的に５０％のタンノくり質および５０％の免疫賦活剤力）ら構成された。

肛ヒｍ亘ユＬヱヱ亙底璽二処１ 注射ワクチン組成物１０■ｌの調製： ２、５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ■１ｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　 Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、）０．２５ｍ１　Ｔｖｅｅｎ　８０　（Ｓｉｇｗ＋ａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）０．２５ｓｌ　５ＰＡＮ　８５　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）１０００μｇ　ＭＴＰ−ＰＥ １０００μｇ　ＭＣ５−活性化ジフチリアトキソイド担体タンノ（り質（こ結合 したＨＣＶペプチド ＴＰ−ＰＥを　ないワクチン　の 注射ワクチン組成物１０鵬１０）調製：２、５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、）０．２５ｍ１　 Ｔｖｅｅｎ　８０　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）０．２５ｍ１５ ＰＡＮ　８５　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）１０００μｇ　ＭＣ ３−活性化ジフチリアトキソイド担体タンノ（り質書こ結合したＨＣＶペプチド 爽立五エ ワクチン　の　についての 実施例５の方法により調製したワクチンを、毒性につ％ｓて小動物で試験した。

１ｋｇ当り５ｏｄｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹腔内注 射して投与した。アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチンを投 与した。

アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の半数（こ（ま、５μｇ／ｋｇで投与した が、一方他の半数には、５ｏｄｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動物に は、ウィルスペプチドを含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物 を注射した。

各動物を、毒性物質に対する反応を示す症状についてモニターした。より詳細に は、研究で用いた各動物を、発熱、傾眠、体重の減少、食餌習性の変化を含む症 状について、および注射部位の外傷、腫脹および圧痛について隔週ごとに検査し た。注射部位に近位のリンパ節もまた、腫脹および／または徘膿について検査し た。動物は、数カ月間、隔週ベースでモニターした。

支胤見Ｌ ワクチン　にお（る　の　の−日 実施例５の方法により調製したワクチンを、ワクチン投与した被験体におけるウ ィルス中和抗体の産生を誘起するワクチンの効果を測定するために、チンパンジ ーで試験した。チンパンジーに、実施例５の方法により調製したワクチンを５μ ｇ／ｋｇの投与量で、６力月の期間にわたり０．１．３、および６力月の間隔を おいて投与した。対照のチンパンジーには、ウィルスペプチドを含まないワクチ ンの成分からなる同等量の組成物を注射した。最後のワクチン投与を行ってから ２週間後、試験および対照の各チンパンジーに、１０　ＣＩＵｓｅ（チンパンジ ー感染単位）の投与量のＣＤＣ／９１０血漿接種材料で刺激した。ウィルス刺激 の１週間後から始めて、各チンパンジーを、ウィルス血症について毎週ベースで モニターした。

ウィルス血症を検出するために、血液試料および肝臓バイオプシー標本を、数カ 月間毎週ベースで、対照および試験動物から採取した。肝臓バイオプシーにより 採取された組織を、壊死および／または炎症の徴候について組織学的に検査した 。

さらに、バイオプシー材料由来の肝細胞を、ＨＣｖ感染に特有の細管の存在につ いて電子顕微鏡で検査した。血液試料はまた、ワクチンの調製に使用されなかっ たウィルスポリペプチドのセグメントに対する抗体の存在について、上記のＥＬ ＩＳＡアツセイによっても分析された。特に、各血液試料を、ＮＳ３、ＮＳ４、 およびＮＳｓペプチドに対する抗体の存在について、ＥＬＩＳＡによリスクリー ニングした。チンパンジーの血清中におけるこれらのペプチドに対する抗体の存 在は、ＨＣＶ感染を示した。

以下の方法を用いて、チンパンジーから採取した血漿中に循環するまたは肝臓バ イオプシー組織中に存在するウィルスＲＮＡを検出した。

オヨび　゛　ｆ）ＨＣＶ　ＲＮＡを　るＣＣＲｃＰｃＲアッセイにおいて、試料 中の推定ウィルスＲＮＡヲ、逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転写し、次いで、得られ たｃＤＮＡのセク゛メントを、５ａｊｋｉら（１９１１６）により記載のＰＣＲ 技術の改変法を用（λで増幅する。ｃＰｃＲ法に用いるプライマーは、ＨＣｖＲ ＮＡから誘導する。これは本明細書で提供されるＨＣＶ　ｃＤＮＡのファミリー により同定され得る。Ｉ（ＣＶ−ＲＮＡに対応する増幅生成物を、本明細書で提 供されるＨＣＶ　ｃＤＮＡのファミリーから誘導されるプローブを使用して検出 する。

これらの研究に用いたｃＰｃＲ／ＨＣＶアッセイは、ＲＮＡの調製、ＲＮＡのｃ ＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲによるｃＤＮＡの特異的セグメントの増幅、およびＰ ＣＲ生成物の分析のための以下の方法を使用して実施した。

全ＲＮＡ’＆Ｉｉ製するために、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のグア ニジウムインチオシアネート法を使用して、ＲＮＡを肝臓から抽出した。

全ＲＮＡを血漿から単離するために、血漿をＴＥＮＢ（０，１Ｍ　ＮａＣｌ、５ ｏｄ）リス−ＦＩＣＩ（＋）Ｈｌｔ、　Ｏ）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で５〜１０ 倍に希釈し、そして、ブロティナーゼに／ＳＤＳ溶液（０，５％ＳＤＳ、１　ｍ ｇ／ｇｌプロテイナーゼＫ、２０マイクログラム／１ポリＡ担体）中で６０〜９ ０分間３７°Ｃでインキュベートした。試料を、フェノール（ｐＨ６，５）で１ 回抽出し、得られた有機相を０．１％ＳＤＳ含有ＴＥＮＢで再び１回抽出し、そ して、両抽出の水相をプールして、同体積のフェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミ ルアルコール［１：１（９９：１）］で２回抽出した。得られた水相を、同体積 のＣ［ＩＣｌ３／イソアミルアルコール（９９：１）で２回抽出し、そして、０ ．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，５）、および２．５倍容量の１００％エタノー ルを用いてエタノール沈澱した：沈澱は、−２０°Ｃで一晩行った。

ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用したｃＤＮＡは、対応するＣＤＮＡの調製 のために選抜された試料を使用して調製した。各ＲＮＡ試料（２マイクログラム のチンツインジー肝臓の熱変性全ＲＮＡまたは２マイクロリツトルの血漿から得 たＲＮＡを含む）を、１マイクロモルの各プライマー、１ミリリ／トルの各デオ キシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＳＯミリモルのトリス−ＭＣＩ（ ｐＨ８４）、５！リモルのＭｇＣ＋２．５ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴ Ｔ）、７３ミリモルのＫＣｌ、　４０単位のＩｉＮアーゼインヒビター（ＲＮＡ ＳＩＮ）、および５単位のＡＭ’／逆転写酵素を含む２５マイクロリ、。

トル反応物中でインキュベートした。このインキュベーションは、３７℃で６０ 分間行った。ｃＤＮＡ合成に続いて、反応物を５０マイクロリツトルの脱イオン 水（ＤＩＮ）で希釈し、１０分間沸騰し、水上で冷却した。

ＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメントの増幅は、それらの配列がＨＣＶ　ｃＤＮＡクロ ーン３６（アンチ−センス）および３７ｂ（センス）から誘導される２つの合成 オリゴマ−１６量体プライマーを使用して実施した。クローン３６由来のプライ マーの配列は以下であった：５１　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　 Ｔ　３１クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は以下であった；５’ＡＣＡ　 入τ入　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｃ３１各プライマーは、最終濃度１マイクロ モルで用０た。プライマーに隣接するＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメントを増幅する ため（こ、ｅＤＮＡ試料を、０．１マイクログラムのＲＮアーゼＡおよびＰｅｒ ｋｉｎ　Ｅ１＋＊ｅｒＣｅｔｕｓ　ＰＣＲキｙ　）　（Ｎ８０１Ｊ０４３または Ｎ１１０１−００５５＞のＰＣＲ反応物を用いて、製造者の指示に従ってインキ ュベートした。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮ＾ 熱サイすラーテ、３０サイクルまたは６０サイクルいずれかで実施した。各サイ クルは、９４℃１分での変性段階、３７℃２分でのアニーリング段階、および７ ２°Ｃ３分での伸長段階で構成された。しかしながら、最終サイクル（３０また は６０）における伸長段階は、３分ではなく７分であった。増幅後、試料を同体 積のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、次いで同体積のクロロホル ムで抽出し、次いで試料を０．２Ｍの酢酸ナトリウム含有エタノールで沈澱させ た。

ｃＰｃＲ生成物を、次のようにして分析した。生成物を、Ｍｕｒａｋａｖａら（ １９８８）に従って１．８％アルカリ性アガロースゲル電気泳動にかけ、そして 、０．４ＭのＮａＯＨ中でゲルを一晩ブロッティングすることにより、ＺＥＴＡ ＠Ｐｒｏｂｅ紙（ＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐ、）上に移した。

プロットを、２ｘ　５ＳＣ（ｌｘ　ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１ ５Ｍのクエン酸ナトリウム）中で中和し、０．３ＭのＮａＣ１，１５＋ｓＭのリ ン酸ナトリウム緩衝液、ｐ）１６．＋１．１５５ＭのＥＤＴＡ、　１．０％のＳ ＤＳ、　０．５％（Ｄ脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　Ｃｏ、）、および０．５ｘ ｇ／ｍｌの超音波処理され変性されたサケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイズし た。ＨＣＶ　ｃＤＮＡフラグメントについて分析すべきプロットを、米国出願番 号０７／４５６．６３７に記載のクローン３５のＦＩＣＶ　ｃＤＮＡ挿入配列の ニックトランスレーションにより生成された３２量ｍ識化プローブに、ハイブリ ダイズした。ハイブリダイゼーシ璽ンの後、プロットを１×５ＳＣ（Ｉ　Ｘ　Ｓ ＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣ＋、０．ＯＩＭのクエン酸ナトリウム）中で６５° Ｃで洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフを記録した。生成物の期待サイ ズは、５８６ヌクレオチド長である；プローブとハイブリダイズされて、このサ イズの範囲でゲル中ヲ移動した生成物は、ウィルスＲＮＡについて陽性であると 評価された。

分析される各試料中のＲＮＡの存在を立証するため書こ、対照として、アルファ ー１抗トリプシンｍＲＮＡを増幅するため（こ設言干されたｃＰｃＲプライマー を用いるｃＰｃＲを実施した。アルファー１抗トリプシン遺伝子のコード領域は 、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４）中１こｇ８載されている。アルファー１抗 トリプシン遺伝子のコード領域の３６５ヌクレオチドのフラグメントを増幅する ため（こ設に十された合成オリゴマ−１６量体プライマーを、ヌクレオチド２２ −３７位（センス）およびヌクレオチド３７２−３８７位（アンチセンス）力） ら誘導した。ｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー配列の間にある力ｆそれを含まない３ ２ｐ二１クトランスレーシヨンブローブを用ｔ）で、ＰＣＢ生成物を検出した。

ＰＣＢ反応の極悪受性のため、すべての試料を少なくとも３回試みた。次の予防 措置を取ってあらゆる偽陽性シグナルを取り除いた：１）０−りングゴム栓を有 するスフ１Ｊユーキヤ・ノブ管を用いてエアロゾルを除去；２）ディスポーザブ ルピストン／キャピラリーを有するＲａｎ１ｎ　ＭＩＣＲＯＭＡＭ’の陽圧ピペ ・フタ−＜ｐ。

５ｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｐｉｐｅｔｔｅｒｓ）でピペ’ｙテ ィング；および３）２つの非連続的ｃＤＮＡクローンからのｃＤＮＡおよびＰＣ Ｒプライマーに対するオリゴヌクレオチド配列の選択。

Ｌ菓二立肌里ユ丘並 本発明の免疫反応性組成物は、例えば、ＨＣＶ感染、特に慢性１４Ｃ’／感染に 対する個体の処置にも使用し得るワクチンのような材料の調製において有用であ る。さらに、この組成物は、生物学的試料におけるＨＣｖの多数の変異体の検出 に用いる材料を調製するために使用し得る。例えば、本発明の免疫反応性組成物 は、１つ以上のＨＣＶ単離体を認識するポリクローナル抗体組成物を生成するた めに使用され得、または抗ＨＣＶ抗体イム／アッセイの抗原として使用され得る 。後者の方法は、血液生成物をＨＣＶ汚染の可能性についてスクリーニングする ために使用され得る。ポリクローナル抗血清または抗体は、個体の受動免疫のた めに使用され得る。

アミ／（へ）登！ｂ己 ７ミ／Ｖ：Ｊ発奮ろ ア紡Ｆ３豪もう Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ｌｙｓ　丁ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

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ＦＩＧＵＲＥ　９−１４ 丁ｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｕ　５ａｒ　＾ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌ■ ＧＬｕ　ＡＬａ　ｒｌｅ　Ｔｙｒ　ＧＬｎ　Ｃｙｓ　Ｃｙｍ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ１１ｅ　Ｌｙｓ　Ｓ ａｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＳｉｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ａｓ ｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ＾ｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ＾ｒｇ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　 Ｇｌｙ　Ｖａ１Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＣＹ＃　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｑ２フ ０５　２フ１０　２７１５　２７２０Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＡＬａ 　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＭｅしＬｅｕ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ２フ２５　２７３０　２７３５ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＡｌａ　ＡＬａ　Ｓ ＠ｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅセ　Ｔ ｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　＾１ａ２フ５５　２７６０　２７６５ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　にｌｙ　Ａ！ＩＰ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ 　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｍｕ　Ａｌａ　Ｔｈ■ ２７７０　２７フＳ　２７８０ Ｓｕｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　 ＨＬｍ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ２７８５２フ、９０ ２７９５２８００ Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ａｒｑ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌ、ａｕ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　ｌｌ５Ｃｙｓ　ＧＬｕ　Ｈ ｌｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｃｙｓτｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ 　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

ＦＩＣＩＪＲＥ　９−１７ 丁ｒｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｔｉｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＦＩＧＵＲＥ　９− １８ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１５１　 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２Ｊ３３１５７６　Ｚ　８３１０−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｑ　１／７０　７８２３−４ＢＩ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリペプチドを含む免疫反応性組成物であって、該ポリペプチドが、Ｃ型肝 炎ウイルス（ＨＣＶ）の第一の可変ドメイン中に存在するエピトープのアミノ酸 配列を含有し、そして別個のＨＣＶ単離体の該第一の可変ドメイン由来の少なく とも２種の異質性アミノ酸配列が、該組成物中に存在する、組成物。
2. ２．複数の抗原セットを含有する請求項１に記載の免疫反応性組成物であって、 （ａ）各抗原セットが、ＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン中に存在するエピト ープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからなり、そして （ｂ）１つのセットの該エピトープの該アミノ酸配列が、類似の配列を有する少 なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列に関して、異質性である、組成物。
3. ３．前記第一の異質性アミノ酸配列が、ＨＣＶＩ群単離体由来であり、そして第 二の異質性アミノ酸配列が、ＨＣＶＩＩ群単離体由来である、請求項１に記載の 免疫反応性組成物。
4. ４．前記可変ドメインが、Ｅ２／ＮＳ１タンパク質中に存在する、請求項１に記 載の免疫反応性組成物。
5. ５．前記可変ドメインが、該ＨＣＶポリタンパク質の約３８４位のアミノ酸から 約４１１位のアミノ酸までコードされている、請求項４に記載の免疫反応性組成 物。
6. ６．前記可変ドメインが、Ｅ１タンパク質中に存在する、請求項１に記載の免疫 反応性組成物。
7. ７．前記可変ドメインが、該ＨＣＶポリタンパク質の約２２５位のアミノ酸から 約２６０位のアミノ酸までコードされている、請求項６に記載の免疫反応性組成 物。
8. ８．前記ポリペプチドが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の第二の可変ドメイン中 に存在するエピトープのアミノ酸配列をさらに含有し、そして別個のＨＣＶ単離 体の該第二の可変ドメイン由来の少なくとも２種の異質性アミノ酸配列が、該組 成物中に存在する、請求項１に記載の免疫反応性組成物。
9. ９．前記第一の可変ドメインが、Ｅ２／ＮＳ１タンパク質中に存在し、そして前 記第二の可変ドメインが、Ｅ１タンパク質中に存在する、請求項８に記載の免疫 反応性組成物。
10. １０．複数のポリペプチドを含有する請求項１に記載の免疫反応性組成物であっ て、各ポリペプチドが次式を有する、組成物： Ｒｒ−（ＳＶｎ）ｘ−Ｒ′ｒ′ ここで、 ＲおよびＲ′は、約１−２０００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、そ してそれらは同一であるかまたは異なり；ｒおよびｒ′は、０または１であり、 そしてそれらは同一であるかまたは異なり； Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含有するアミノ酸配列であって、ここで、該 可変ドメインは、少なくとも一個のエピトープを含有し； Ｓは、１以上の整数であり、選択された可変ドメインを表しそして ｎは、１以上の整数であり、異なるｎの値を有する少なくとも１種の他の単離体 に関して、所定のＳＶで選択された異質性のＨＣＶ単離体を表し、そしてｎは各 ｘに対して独立して選択され；ｘは、１以上の整数であり；そして ただし、アミノ酸配列は、（ｉ）１Ｖ１および１Ｖ２、（ｉｉ）１Ｖ１および２ Ｖ２、および（ｉｉｉ）１Ｖ１および２Ｖ１からなる群から選択される組合せを 表す組成物中に存在する。
11. １１．前記ポリペプチドの式が、 Ｒｒ−１Ｖ１−１Ｖ２−Ｒ′ｒ′ である、請求項１０に記載の免疫反応性組成物。
12. １２．前記ポリペプチド組成物が、次式のポリペプチドの混合物を含有する、請 求項１０に記載の免疫反応性組成物：Ｒｒ−１Ｖ１−Ｒ′ｒ′および Ｒｒ−１Ｖ２−Ｒ′ｒ′
13. １３．以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、ＨＣＶの処置のための免 疫原性の組成物を調製する方法；（ａ）請求項１に記載の免疫原性組成物を提供 すること；（ｂ）適切な賦形剤を提供すること；および（ｃ）（ａ）の該免疫原 性組成物と（ｂ）の該賦形剤とを混合すること。
14. １４．請求項１に記載の免疫反応性組成物の有効量を哺乳動物に投与することを 包含する、抗ＨＣＶ抗体を産生する方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法によって製造される、ポリクローナル抗体組成物 。
16. １６．以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を包含する、生物学的試料中 でＨＣＶに対する抗体を検出する方法；（ａ）ＨＣＶの複数の株に対する抗体を 含有すると推測される生物学的試料を提供すること； （ｂ）請求項１に記載の免疫反応性組成物を提供すること；（ｃ）抗原−抗体複 合体が形成されるような条件下で、（ａ）の該生物学的試料と（ｂ）の該免疫反 応性組成物とを反応させること；および （ｄ）必要に応じて、（ａ）の該抗原と（ｂ）の該生物学的試料の該抗体との間 で形成される複合体の形成を検出すること。
17. １７．適切な容器中に入れられた請求項１に記載の免疫反応性組成物を含有する 、生物学的試料中のＨＣＶの複数の株に対する抗体を検出するためのキット。
18. １８．別個のＨＣＶ単離体の同一の可変ドメイン由来の２種の異質性アミノ酸配 列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
19. １９．請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
20. ２０．前記ＤＭ分子が、該ポリペプチドの発現を引き起こし得る制御配列を含む 、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. ２１．前記ポリペプチドの発現を提供する条件下で、請求項２０に記載の宿主細 胞群を増殖させることを包含する、組換え体タンパク質を製造する方法。