JPH0653677B2 - 共有結合によって酵素と抗体をカップリングさせた新規共軛体 - Google Patents
共有結合によって酵素と抗体をカップリングさせた新規共軛体Info
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- JPH0653677B2 JPH0653677B2 JP58043276A JP4327683A JPH0653677B2 JP H0653677 B2 JPH0653677 B2 JP H0653677B2 JP 58043276 A JP58043276 A JP 58043276A JP 4327683 A JP4327683 A JP 4327683A JP H0653677 B2 JPH0653677 B2 JP H0653677B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、高等動物の器官内で十分に耐忍される天然の
基質からアンモニウムイオンを生成できる酵素と、抗
体、もしくは標的細胞が有する抗原を認識する能力を保
持した抗体断片とを共有結合によって化学的にカップリ
ングさせることによって生じる、新しい免疫酵素共軛体
に関する。
基質からアンモニウムイオンを生成できる酵素と、抗
体、もしくは標的細胞が有する抗原を認識する能力を保
持した抗体断片とを共有結合によって化学的にカップリ
ングさせることによって生じる、新しい免疫酵素共軛体
に関する。
また本発明は、これら共軛体の製造方法にも関するもの
である。
である。
該共軛体は免疫毒素との医薬会合体における免疫毒素の
作用増強剤として有用である。
作用増強剤として有用である。
この発明が関するのは、次の事柄にたいしてである。
−共有結合によって酵素と抗体、もしくは抗体断片を結
合させた共軛体である新物質、 −上述の新しい物質を含んだ、免疫毒素との医薬会合
体。
合させた共軛体である新物質、 −上述の新しい物質を含んだ、免疫毒素との医薬会合
体。
従って本発明による新しい物質は、特定の酵素と標的細
胞に含まれた抗原に向けられた抗体、もしくは抗体断片
の共有結合によって得られる共軛体である。
胞に含まれた抗原に向けられた抗体、もしくは抗体断片
の共有結合によって得られる共軛体である。
こうした化合物は、以後ここでは免疫酵素共軛体とよば
れる。
れる。
こうした免疫酵素共軛体は、酵素と標的細胞に含まれて
いる抗原に向けられる抗体もしくは抗体断片とを共有結
合によって結合させた、一個の化合物を示すものであ
る。
いる抗原に向けられる抗体もしくは抗体断片とを共有結
合によって結合させた、一個の化合物を示すものであ
る。
使用される酵素は既知の化合物である。使用される抗体
は、それが動物にたいして行なわれる従来の免疫処置に
よって得られる場合には、ポリクローナルな性質のもの
で、リンパ球と骨髄腫細胞間の融合によつて得られる雑
種細胞のクローンによって生成される場合にはモノクロ
ーナルの性質のものとなる。この抗体は、特定の抗原を
認識する能力を有する免疫グロブリンの全分子として
も、あるいはこれら免疫のグロブリンの、特定の抗原を
認識する能力を保持した断片、とくにＦ（ab′）2、Ｆa
b、Ｆab′として知られる断片としても使用され得る。
は、それが動物にたいして行なわれる従来の免疫処置に
よって得られる場合には、ポリクローナルな性質のもの
で、リンパ球と骨髄腫細胞間の融合によつて得られる雑
種細胞のクローンによって生成される場合にはモノクロ
ーナルの性質のものとなる。この抗体は、特定の抗原を
認識する能力を有する免疫グロブリンの全分子として
も、あるいはこれら免疫のグロブリンの、特定の抗原を
認識する能力を保持した断片、とくにＦ（ab′）2、Ｆa
b、Ｆab′として知られる断片としても使用され得る。
酵素と抗体（または抗体断片）の化学的カップリング
は、以下の条件が満されるならば、多くの方法によって
達成できる。
は、以下の条件が満されるならば、多くの方法によって
達成できる。
−その方法が、共軛体の２つの構成分である酵素と抗体
のそれぞれの生物学上の活性を保持できる、 −用いるプロセスの満足しうる再現性と、良好なカップ
リング収率が保証できる、 −結果として得られる共軛体中の酵素と抗体の比率の値
を制御できる、 −安定した水溶性の生成物が得られる。
のそれぞれの生物学上の活性を保持できる、 −用いるプロセスの満足しうる再現性と、良好なカップ
リング収率が保証できる、 −結果として得られる共軛体中の酵素と抗体の比率の値
を制御できる、 −安定した水溶性の生成物が得られる。
こうした必要条件を満たしている方法の中でも最も都合
のよいのは、２つの蛋白質間の結合を得るために、チオ
ール基をひとつまたはそれ以上利用する方法である。こ
れらチオール基は、結合される蛋白質の一方に均等に属
することが可能であり、あるいは一方のまたはチオール
を天然に含有していない他の蛋白質に人工的に導入され
ることも可能である。
のよいのは、２つの蛋白質間の結合を得るために、チオ
ール基をひとつまたはそれ以上利用する方法である。こ
れらチオール基は、結合される蛋白質の一方に均等に属
することが可能であり、あるいは一方のまたはチオール
を天然に含有していない他の蛋白質に人工的に導入され
ることも可能である。
このようにしてひとつまたはそれ以上のチオール基を、
蛋白質の一方に人工的に導入する場合には、蛋白質のア
ミノ基の幾つかをアシル化することができるＳアセチル
メルカプトコハク酸無水物の、蛋白質にたいする作用を
利用して行なえる。Archives of Biochemistry and Bio
hysics，１１９，４１−４９，（１９６７）に述べられ
ているごとく、この後チオール基は、ヒドロキシルアミ
ンの作用による保護アセチル基の除去によって遊離させ
うる。透析によって過剰の試薬や低分子量の反応生成物
を除去しうる。参考文献中に述べられているその他の方
法も、結合される一方の蛋白質にチオール基を導入する
のに使用できる。
蛋白質の一方に人工的に導入する場合には、蛋白質のア
ミノ基の幾つかをアシル化することができるＳアセチル
メルカプトコハク酸無水物の、蛋白質にたいする作用を
利用して行なえる。Archives of Biochemistry and Bio
hysics，１１９，４１−４９，（１９６７）に述べられ
ているごとく、この後チオール基は、ヒドロキシルアミ
ンの作用による保護アセチル基の除去によって遊離させ
うる。透析によって過剰の試薬や低分子量の反応生成物
を除去しうる。参考文献中に述べられているその他の方
法も、結合される一方の蛋白質にチオール基を導入する
のに使用できる。
本発明によると、チオール基をひとつまたはそれ以上有
している方の蛋白質を、３０℃を越えない温度下で５〜
９のpHで水性媒質中でチオールと反応しうるひとつもし
くはそれ以上の基を前もって与えられたもう一方の蛋白
質と反応させて、安定した特殊な共有結合を生じさせ
る。この共有結合は特に、ジスルフィド結合、あるいは
チオエーテル結合である。以後、２つの蛋白質のうちチ
オール基を有する方をＰ1と呼び、カップリングさせる
もう一方の蛋白質をＰ2と呼ぶ。
している方の蛋白質を、３０℃を越えない温度下で５〜
９のpHで水性媒質中でチオールと反応しうるひとつもし
くはそれ以上の基を前もって与えられたもう一方の蛋白
質と反応させて、安定した特殊な共有結合を生じさせ
る。この共有結合は特に、ジスルフィド結合、あるいは
チオエーテル結合である。以後、２つの蛋白質のうちチ
オール基を有する方をＰ1と呼び、カップリングさせる
もう一方の蛋白質をＰ2と呼ぶ。
１）ジスルフィド結合の場合： 共軛体の製造は次のように表すことができる： Ｐ1−ＳＨ＋Ｐ2−Ｓ−Ｓ−Ｘ→ Ｐ1−Ｓ−Ｓ−Ｐ2＋ＸＳＨ この場合： −Ｓ−Ｓ−Ｘは活性化された混成ジスルフィド基であ
り、この中のＸは活性体基である。
り、この中のＸは活性体基である。
活性化された硫黄原子で置換された蛋白質Ｐ2はそれ自
体で活性化された硫黄原子のキャリヤーである試薬の助
けを借りて置換を行なうことによって、蛋白質Ｐ2それ
自体か下式により得らる。
体で活性化された硫黄原子のキャリヤーである試薬の助
けを借りて置換を行なうことによって、蛋白質Ｐ2それ
自体か下式により得らる。
Ｐ2＋Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ→ Ｐ2−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ ここでＰ2は置換されるべき蛋白質である。Ｙは、蛋白
質に試薬を共有固定させる基を表わす。Ｒは置換基Ｙと
−Ｓ−Ｓ−Ｘを同時に有している基を表し、Ｘは活性体
基である。
質に試薬を共有固定させる基を表わす。Ｒは置換基Ｙと
−Ｓ−Ｓ−Ｘを同時に有している基を表し、Ｘは活性体
基である。
官能基Ｙは、置換されるべき蛋白質を構成しているアミ
ノ酸の側鎖につながれている基のうちのひとつと、共有
結合できる基である。これらの中から、蛋白質に含まれ
ているリシル基の末端アミノ基が、特に示される。この
場合、Ｙは特に次のものを表す： −カルボジイミドのような、特に１−エチル３−（３−
ジエチル−アミノプロピル）カルボジイミドなどの水溶
性の誘導体のようなカップリング剤の存在下に、蛋白質
のアミノ基と結合できるカルボキシル基、 −アミノ基と直接反応して、それをアシル化できるカル
ボン酸の塩化物 −オルト−またはパラ−，ニトロ−，またはジニトロ−
フェニルエステル、あるいはアミノ基と直接反応して、
それをアシル化するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエ
ステルなどの、いわゆる「活性化」エステル、 −たとえばアミノ基と自然に反応して、アミド結合をつ
くりだす無水コハク酸のようなジカルボン酸の分子内無
水物、 （ここでＲ1はアルキル基である） これは の反応に従って蛋白質のアミノ基と反応する。基−Ｓ−
Ｓ−Ｘは、遊離チオール基と反応することが可能な、活
性化されタ混成ジスルフィドを表す。特にこの混成ジス
ルフィドにおいては、Ｘはひとつまたはそれ以上のアル
キル基、ハロゲン基、カルボキシル基によって置換され
ていることもある２−ピリジルまたは４−ピリジル基を
表すこともある。またＸは、好ましくはひとつもしくは
それ以上のニトロ基またはカルボキシル基によって置換
された、フェニル基を表すこともある。さらにまたＸ
は、メトキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル
基を表わすこともある。
ノ酸の側鎖につながれている基のうちのひとつと、共有
結合できる基である。これらの中から、蛋白質に含まれ
ているリシル基の末端アミノ基が、特に示される。この
場合、Ｙは特に次のものを表す： −カルボジイミドのような、特に１−エチル３−（３−
ジエチル−アミノプロピル）カルボジイミドなどの水溶
性の誘導体のようなカップリング剤の存在下に、蛋白質
のアミノ基と結合できるカルボキシル基、 −アミノ基と直接反応して、それをアシル化できるカル
ボン酸の塩化物 −オルト−またはパラ−，ニトロ−，またはジニトロ−
フェニルエステル、あるいはアミノ基と直接反応して、
それをアシル化するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエ
ステルなどの、いわゆる「活性化」エステル、 −たとえばアミノ基と自然に反応して、アミド結合をつ
くりだす無水コハク酸のようなジカルボン酸の分子内無
水物、 （ここでＲ1はアルキル基である） これは の反応に従って蛋白質のアミノ基と反応する。基−Ｓ−
Ｓ−Ｘは、遊離チオール基と反応することが可能な、活
性化されタ混成ジスルフィドを表す。特にこの混成ジス
ルフィドにおいては、Ｘはひとつまたはそれ以上のアル
キル基、ハロゲン基、カルボキシル基によって置換され
ていることもある２−ピリジルまたは４−ピリジル基を
表すこともある。またＸは、好ましくはひとつもしくは
それ以上のニトロ基またはカルボキシル基によって置換
された、フェニル基を表すこともある。さらにまたＸ
は、メトキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル
基を表わすこともある。
基Ｒは、置換基ＹとＳ−Ｓ−Ｘを同時に含むことが可能
な基を表す。これは、その後の反応中に、使用される試
薬や合成される物質を妨害するような機能を含まないよ
うに選ばれなければならない。特に基−Ｒは、ｎが１な
いし１０である基−（ＣＨ2）ｎ、または、 という基であることがあり、 後者においてはＲ4は水素または１〜８の炭素原子を含
んだアルキル基を表し、Ｒ3は、カルバメート基 などの、後から用いられる試薬にたいして不活性である
置換基であり、ここでＲ5は１〜５個の炭素原子を含ん
だ直鎖または枝分れ鎖のアルキル基、特に第３ブチル基
を表す。
な基を表す。これは、その後の反応中に、使用される試
薬や合成される物質を妨害するような機能を含まないよ
うに選ばれなければならない。特に基−Ｒは、ｎが１な
いし１０である基−（ＣＨ2）ｎ、または、 という基であることがあり、 後者においてはＲ4は水素または１〜８の炭素原子を含
んだアルキル基を表し、Ｒ3は、カルバメート基 などの、後から用いられる試薬にたいして不活性である
置換基であり、ここでＲ5は１〜５個の炭素原子を含ん
だ直鎖または枝分れ鎖のアルキル基、特に第３ブチル基
を表す。
化合物Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘと蛋白質Ｐ2の反応は、均一
系液相、ほとんどの場合水または緩衝液中で行なわれ
る。試薬の溶解度によってこれが必要な場合には、反応
媒質にたいして、アルコール特に第３ブタノールなどの
水と混和性の有機溶剤 を容量にして２０％まで加える
ことが可能である。
系液相、ほとんどの場合水または緩衝液中で行なわれ
る。試薬の溶解度によってこれが必要な場合には、反応
媒質にたいして、アルコール特に第３ブタノールなどの
水と混和性の有機溶剤 を容量にして２０％まで加える
ことが可能である。
反応は２・３時間〜２４時間までの時間の間、周囲温度
で行なわれる。その後透析によって低分子量の物質や過
剰の試薬を除くことができる。このプロセスによって、
蛋白質１モルにつき、いくつかの普通１〜１５の置換基
を導入することが可能となる。
で行なわれる。その後透析によって低分子量の物質や過
剰の試薬を除くことができる。このプロセスによって、
蛋白質１モルにつき、いくつかの普通１〜１５の置換基
を導入することが可能となる。
こうした化合物を用いて、水溶液中に２つの蛋白質を、
３０℃以下の温度で２・３時間〜１日の間混ぜ合わせる
ことによって、蛋白質Ｐ1とのカップリングが行なわれ
る。この溶液は透析されて、低分子量の物質が除かれ、
次に様々な既知の方法によって共軛体が精製されうる。
３０℃以下の温度で２・３時間〜１日の間混ぜ合わせる
ことによって、蛋白質Ｐ1とのカップリングが行なわれ
る。この溶液は透析されて、低分子量の物質が除かれ、
次に様々な既知の方法によって共軛体が精製されうる。
２）チオエーテル結合の場合 Ｐ1−ＳＨと前もってマレイミド基を導入された蛋白質
Ｐ2を反応させることによって、共軛体が得られる。
Ｐ2を反応させることによって、共軛体が得られる。
反応は次のように表される： ここではＺは、１〜１０炭素原子を有する脂肪族または
芳香族の隔て構造（spacing structure）である。
芳香族の隔て構造（spacing structure）である。
マレイミド置換蛋白質Ｐ2は、それ自体がマレイミド基
のキャリヤーである試薬の助けを借りて、蛋白質のアミ
ノ基の置換を行なうことによって、蛋白質Ｐ2自体から
得られる。これを反応式で表すと： ここではＹ1は： −カルボキシル基；この場合、カルボジイミド特に１−
エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドのよな水溶性誘導体などのカップリング剤を用いた
カルボキシル基の活性化の後で、反応が行なわれる。
のキャリヤーである試薬の助けを借りて、蛋白質のアミ
ノ基の置換を行なうことによって、蛋白質Ｐ2自体から
得られる。これを反応式で表すと： ここではＹ1は： −カルボキシル基；この場合、カルボジイミド特に１−
エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドのよな水溶性誘導体などのカップリング剤を用いた
カルボキシル基の活性化の後で、反応が行なわれる。
−または、オルト−またはパラ−、ニトロ−またはジニ
トロフェニルエステル、あるいはアミノ基と自然に反応
してアシル化させるＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエ
ステルなどの、いわゆる「活性化された」エステル。
トロフェニルエステル、あるいはアミノ基と自然に反応
してアシル化させるＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエ
ステルなどの、いわゆる「活性化された」エステル。
こうした試薬の調製法は、Helvetica Chimica Acta ５
８，５″１−５４１，（１９７５）に述べられている。
同じ類のその他の試薬も市販されている。
８，５″１−５４１，（１９７５）に述べられている。
同じ類のその他の試薬も市販されている。
と蛋白質Ｐ2の反応は、均一系液相、ほとんどの場合水
または緩衝液中で行なわれる。試薬の溶解度によってこ
れが必要な場合には、アルコール特に第３ブタノールな
どの水と混和性である有機溶剤を、容量にして２０％ま
で反応媒質に加えることが可能である。
または緩衝液中で行なわれる。試薬の溶解度によってこ
れが必要な場合には、アルコール特に第３ブタノールな
どの水と混和性である有機溶剤を、容量にして２０％ま
で反応媒質に加えることが可能である。
反応は２・３時間〜２４時間の間、周囲温度で行なわれ
る。その後、透析によって低分子量の物質や過剰の試薬
を除くことができる。このプロセスによって、蛋白質１
モルにつき、いくつかの（普通１〜１５の）置換基を導
入することが可能となる。
る。その後、透析によって低分子量の物質や過剰の試薬
を除くことができる。このプロセスによって、蛋白質１
モルにつき、いくつかの（普通１〜１５の）置換基を導
入することが可能となる。
こうした化合物を用いて、水溶液中に２つの蛋白質を、
３０℃以下の温度で２・３時間〜１日の間混ぜ合わせる
ことによって、蛋白質Ｐ1とのカップリングが行なわれ
る。この溶液は透析されて、低分子量の物質が除かれ、
次に様々な方法によって共軛体が精製されうる。
３０℃以下の温度で２・３時間〜１日の間混ぜ合わせる
ことによって、蛋白質Ｐ1とのカップリングが行なわれ
る。この溶液は透析されて、低分子量の物質が除かれ、
次に様々な方法によって共軛体が精製されうる。
こうした免疫酵素共軛体は、どのような酵素からもつく
り出せる。しかしながら、後で述べるこの共軛体の場合
に目的とされる薬としての用法のためには、高等動物の
器官内で十分に耐忍される天然基質から、アンモニウム
イオンを脱離させることができる酵素が望ましい。
り出せる。しかしながら、後で述べるこの共軛体の場合
に目的とされる薬としての用法のためには、高等動物の
器官内で十分に耐忍される天然基質から、アンモニウム
イオンを脱離させることができる酵素が望ましい。
M.Florkin，E.H.Stortz著の"Comprehensive Biochemist
ry"第３版（１９７３）第１３巻に記載さているような
国際的分類法によると、この発明に使用される薬剤的に
適切な酵素は、主として次に挙げるものの中にある： −グループ１（オキシドレドクターゼ）特にアミノ酸−
ジヒドロゲナーゼとアミノ−オキシダーゼを含んだサブ
グループ１−４； −グループ３（ヒドロラーゼ）特にアミド，アミジン，
および他のＣ−Ｎ結合（ペプチド結合を除く）を加水分
解する酵素を含んだサブグループ３−５； −グループ４（リアーゼ）特に不飽和化合物の生成を伴
なう分解反応を触媒する酵素を含んだサブグループ４−
２と４−３。
ry"第３版（１９７３）第１３巻に記載さているような
国際的分類法によると、この発明に使用される薬剤的に
適切な酵素は、主として次に挙げるものの中にある： −グループ１（オキシドレドクターゼ）特にアミノ酸−
ジヒドロゲナーゼとアミノ−オキシダーゼを含んだサブ
グループ１−４； −グループ３（ヒドロラーゼ）特にアミド，アミジン，
および他のＣ−Ｎ結合（ペプチド結合を除く）を加水分
解する酵素を含んだサブグループ３−５； −グループ４（リアーゼ）特に不飽和化合物の生成を伴
なう分解反応を触媒する酵素を含んだサブグループ４−
２と４−３。
以下に挙げるのは、この発明による免疫酵素共軛体をつ
くるのに適していると考えられる酵素のリストである。
各場合に、国際的命名法でこれら酵素を示すのに用いら
れるコードも記されている。
くるのに適していると考えられる酵素のリストである。
各場合に、国際的命名法でこれら酵素を示すのに用いら
れるコードも記されている。
１−４−１−１：アラニン ジヒドロゲナーゼ １−４−１−３：グルタメート ジヒドロゲナーゼＮＡ
Ｄ（Ｐ）+ １−４−１−５：Ｌ−アミノ酸 ジヒドロゲナーゼ １−４−３−２：Ｌ−アミノ酸 オキシダーゼ ３−５−１−１：アスパラギナーゼ ３−５−１−２：グルタミナーゼ ３−５−１−４：アミダーゼ ３−５−１−５：ウレアーゼ ３−５−３−６：アルギニン ジアミナーゼ ３−５−４−４：アデノシン ジアミナーゼ ３−５−４−６：アデノシン モノリン酸塩 ジアミナ
ーゼ ３−５−４−２１：クレアチニン ジアミナーゼ ４−２−１−１３：Ｌ−セリン ジヒドラターゼ ４−２−１−１６：Ｌ−テオニン ジヒドラターゼ ４−３−１−１：アスパルテートアンモニア−リアーゼ （またはアスパルターゼ） ４−３−１−３：ヒスチジン−アンモニア−リアーゼ （またはヒスチダーゼ） ４−３−１−５：フェニルアラニン−アンモニア−リア
ーゼ この発明の第２の局面は、こうした免疫酵素共軛体の人
体の治療における使用に関するものである。
Ｄ（Ｐ）+ １−４−１−５：Ｌ−アミノ酸 ジヒドロゲナーゼ １−４−３−２：Ｌ−アミノ酸 オキシダーゼ ３−５−１−１：アスパラギナーゼ ３−５−１−２：グルタミナーゼ ３−５−１−４：アミダーゼ ３−５−１−５：ウレアーゼ ３−５−３−６：アルギニン ジアミナーゼ ３−５−４−４：アデノシン ジアミナーゼ ３−５−４−６：アデノシン モノリン酸塩 ジアミナ
ーゼ ３−５−４−２１：クレアチニン ジアミナーゼ ４−２−１−１３：Ｌ−セリン ジヒドラターゼ ４−２−１−１６：Ｌ−テオニン ジヒドラターゼ ４−３−１−１：アスパルテートアンモニア−リアーゼ （またはアスパルターゼ） ４−３−１−３：ヒスチジン−アンモニア−リアーゼ （またはヒスチダーゼ） ４−３−１−５：フェニルアラニン−アンモニア−リア
ーゼ この発明の第２の局面は、こうした免疫酵素共軛体の人
体の治療における使用に関するものである。
初期のフンス特許出願NO.７８２７８３８，７９２４６
５５，８１０７５９６，８１２１８３６（これら出願の
フランス特許公開公報番号はそれぞれ２４３７２１３，
２４６６２５２，２５０４０１０，２５１６７９４であ
る）において出願人が述べていたのは、リシンの鎖Ａ
と、破壊されるべき細胞に含まれた抗原に向けられる抗
体、もしくは抗体断片とを、共有結合によってカップリ
ングさせて得られる、いわゆる共軛抗ガン物質の製造法
であった。この種の物質は、本願においては、免疫毒素
（イムノトキシン）という総称的名称で呼ばれている。
５５，８１０７５９６，８１２１８３６（これら出願の
フランス特許公開公報番号はそれぞれ２４３７２１３，
２４６６２５２，２５０４０１０，２５１６７９４であ
る）において出願人が述べていたのは、リシンの鎖Ａ
と、破壊されるべき細胞に含まれた抗原に向けられる抗
体、もしくは抗体断片とを、共有結合によってカップリ
ングさせて得られる、いわゆる共軛抗ガン物質の製造法
であった。この種の物質は、本願においては、免疫毒素
（イムノトキシン）という総称的名称で呼ばれている。
フランス特許出願NO.８１２１８３６はまた、こうした
免疫毒素の細胞毒性の作用を効果的に増強するアンモニ
ウムイオン（アンモニウム塩特に塩化物の形での）の性
質について述べている。
免疫毒素の細胞毒性の作用を効果的に増強するアンモニ
ウムイオン（アンモニウム塩特に塩化物の形での）の性
質について述べている。
免疫毒素の選択的細胞毒性の活性を増強するアンモニウ
ム塩の性質は、以下に挙げる２つの場合において、多く
の利点をもたらす。
ム塩の性質は、以下に挙げる２つの場合において、多く
の利点をもたらす。
a)標的細胞を破壊するための選択的細胞毒性作用物とし
て試験管内で免疫毒素が用いられる場合は必らず 治療学的には、フランス特許出願NO.８１２１８２６に
述べられているようにたとえば白血病患者の骨髄の治療
に、免疫毒素が細胞毒性作用剤として用いられて、その
ようにして治療された骨髄が後から移植されるという場
合には、このケースがあてはまる。
て試験管内で免疫毒素が用いられる場合は必らず 治療学的には、フランス特許出願NO.８１２１８２６に
述べられているようにたとえば白血病患者の骨髄の治療
に、免疫毒素が細胞毒性作用剤として用いられて、その
ようにして治療された骨髄が後から移植されるという場
合には、このケースがあてはまる。
b)免疫毒素が治療用として人間の生体内で用いられる場
合：−これは前述の特許出願で述べられたごとくの免疫
毒素の効果の増強を保証するために、免疫毒素投与の前
に、または同時に、あるいは後に、アンモニウム塩を患
者にたいして用いることができることが条件である。
合：−これは前述の特許出願で述べられたごとくの免疫
毒素の効果の増強を保証するために、免疫毒素投与の前
に、または同時に、あるいは後に、アンモニウム塩を患
者にたいして用いることができることが条件である。
しかしながらb)のように免疫毒素が生体内で用いられる
場合、増強効果を利用するためにアンモニウム塩を同じ
く生体内で使用することについては、アンモニウムイオ
ンの実際の毒性や、患者の体内の生理的液体中で長時間
にわたって十分な濃度を保つことは比較的難しいという
事実を考えると、ある程度の制限がある。
場合、増強効果を利用するためにアンモニウム塩を同じ
く生体内で使用することについては、アンモニウムイオ
ンの実際の毒性や、患者の体内の生理的液体中で長時間
にわたって十分な濃度を保つことは比較的難しいという
事実を考えると、ある程度の制限がある。
出願人によって行なわれた研究によって、アンモニウム
イオンの使用に関する制限がかなりに減じられ、しかも
細胞毒性の活性の増強や、こうしたイオンによる免疫毒
性の働きの力学の利点が維持できるようになっている。
こうした研究によって明らかにされたことは、適度な濃
度のアンモニウム塩を免疫毒素に加えることによって得
られる増強と加速化の効果はまた、酵素反応によって、
標的細胞に天然に存在している、あるいは人為的に導入
された毒性のない基質から、アンモニウムイオンがそう
した細胞のすぐそばにつくられる場合にも、同様に得ら
れるということがある。
イオンの使用に関する制限がかなりに減じられ、しかも
細胞毒性の活性の増強や、こうしたイオンによる免疫毒
性の働きの力学の利点が維持できるようになっている。
こうした研究によって明らかにされたことは、適度な濃
度のアンモニウム塩を免疫毒素に加えることによって得
られる増強と加速化の効果はまた、酵素反応によって、
標的細胞に天然に存在している、あるいは人為的に導入
された毒性のない基質から、アンモニウムイオンがそう
した細胞のすぐそばにつくられる場合にも、同様に得ら
れるということがある。
また同じくこうした研究によって明らかにされたこと
は、この結果が特に効率よく得られるのは、アンモニウ
ムイオンを生み出す反応に接触作用を及ぼす酵素が、標
的細胞の表面に存在する抗原を認識できる抗体（もしく
はその断片）とカップリングされる場合であるというこ
とである。
は、この結果が特に効率よく得られるのは、アンモニウ
ムイオンを生み出す反応に接触作用を及ぼす酵素が、標
的細胞の表面に存在する抗原を認識できる抗体（もしく
はその断片）とカップリングされる場合であるというこ
とである。
この方法をとれば、かなりの利点が得られるがそのうち
の幾つかを以下に挙げる： a)標的細胞の膜に存在する抗原にたいする抗体（もしく
は抗体の断片）の親和力のため、使用される酵素がその
膜に集中する。その結果、酵素反応による産物としての
ＮＨ4 4イオンの脱離が、標的細胞の膜のすぐそばでのみ
起こり、それによって、アンモニウムイオンの一般的毒
性に関連した危険性が減じられ、またアンモニウムイオ
ンと標的細胞の相互作用が助長される。この相互作用
は、増強作用に必要なものである。
の幾つかを以下に挙げる： a)標的細胞の膜に存在する抗原にたいする抗体（もしく
は抗体の断片）の親和力のため、使用される酵素がその
膜に集中する。その結果、酵素反応による産物としての
ＮＨ4 4イオンの脱離が、標的細胞の膜のすぐそばでのみ
起こり、それによって、アンモニウムイオンの一般的毒
性に関連した危険性が減じられ、またアンモニウムイオ
ンと標的細胞の相互作用が助長される。この相互作用
は、増強作用に必要なものである。
b)基質が存在する限り、酵素反応によって連続的にＮＨ
4 +イオンが生みだされ、またこの基質は、毒性がないこ
とを条件として選ばれるというこのプロセスによって、
増強メカニズムの利用に大幅な融通性が与えられる： ・基質が内因性であり、十分な濃度のものであるなら
ば、各患者ごとに定められた最適条件に従って、免疫毒
性を投与する前に、またはそれと同時に、あるいはその
後に、増強作用を有する免疫酵素共軛体を投与すること
ができる。
4 +イオンが生みだされ、またこの基質は、毒性がないこ
とを条件として選ばれるというこのプロセスによって、
増強メカニズムの利用に大幅な融通性が与えられる： ・基質が内因性であり、十分な濃度のものであるなら
ば、各患者ごとに定められた最適条件に従って、免疫毒
性を投与する前に、またはそれと同時に、あるいはその
後に、増強作用を有する免疫酵素共軛体を投与すること
ができる。
・さらに、酵素がその基質が血液中や細胞体液中に、一
定以上の濃度で存在しないように選択され、従ってこの
基質を患者に与えねばならない場合に、この薬の使用の
適合性が最大に現れる。なぜなら各患者の治療のために
定められた最適な条件に従って、免疫毒素、免疫酵素共
軛体、および基質という３つの投与成分の投与時間、そ
の継続期間、量は、それぞれ別々に自由に調節できるか
らである。
定以上の濃度で存在しないように選択され、従ってこの
基質を患者に与えねばならない場合に、この薬の使用の
適合性が最大に現れる。なぜなら各患者の治療のために
定められた最適な条件に従って、免疫毒素、免疫酵素共
軛体、および基質という３つの投与成分の投与時間、そ
の継続期間、量は、それぞれ別々に自由に調節できるか
らである。
c)上記の条件において、期待される結果を得るために必
要な少なくとも２つのエフェクター物質が標的細胞に選
択的に向けられることになる： ・ひとつはいわゆる免疫毒素共軛体に含まれている細胞
毒性エフェクターであるリシンの鎖Ａであり； ・もうひとつは、増強作用系に必須の成分であり、免疫
酵素共軛体に含まれている酵素である。
要な少なくとも２つのエフェクター物質が標的細胞に選
択的に向けられることになる： ・ひとつはいわゆる免疫毒素共軛体に含まれている細胞
毒性エフェクターであるリシンの鎖Ａであり； ・もうひとつは、増強作用系に必須の成分であり、免疫
酵素共軛体に含まれている酵素である。
これらのエフェクター物質は、標的細胞に向けられ、そ
こに選択的に固着される目的で、あらゆる場合におい
て、標的細胞の表面に存在する抗原を認識する抗体（も
しくは抗体断片）とカップリングさせる。使用される抗
体が、破壊されるべき細胞集団に厳密に特異な抗原を認
識できるならば、その同じ抗体を異なったエフェクター
とのカップリングにも使用できる。しかしより一般的な
場合においては、標的細胞に存在する異なった抗原を認
識するそれぞれに異なった抗体を用いるのが望ましい。
たとえ個々の抗原が標的細胞に厳密に特異なものでない
にしても、選択された２つの抗原が、標的でない細胞に
両方とも存在するということは、ほとんどあり得ないこ
とであり、我々は免疫毒素の細胞毒性の特殊な性質をさ
らに強めるための、非常に効果的手段を有している。
こに選択的に固着される目的で、あらゆる場合におい
て、標的細胞の表面に存在する抗原を認識する抗体（も
しくは抗体断片）とカップリングさせる。使用される抗
体が、破壊されるべき細胞集団に厳密に特異な抗原を認
識できるならば、その同じ抗体を異なったエフェクター
とのカップリングにも使用できる。しかしより一般的な
場合においては、標的細胞に存在する異なった抗原を認
識するそれぞれに異なった抗体を用いるのが望ましい。
たとえ個々の抗原が標的細胞に厳密に特異なものでない
にしても、選択された２つの抗原が、標的でない細胞に
両方とも存在するということは、ほとんどあり得ないこ
とであり、我々は免疫毒素の細胞毒性の特殊な性質をさ
らに強めるための、非常に効果的手段を有している。
以下に挙げる例は、非限定的に本発明を説明するもので
ある。
ある。
例１ 活性化されたジスルフィド基によって置換された抗ジニ
トロフェニル抗体と、植物起源のウレアーゼを反応させ
て得られる免疫酵素共軛体。
トロフェニル抗体と、植物起源のウレアーゼを反応させ
て得られる免疫酵素共軛体。
a)抗ジニトロフェニル抗体（抗・ＤＮＰ） この抗体はハイブリドーマＦ９を移植したBalb／Ｃ系統
のマウスの腹水中の液体から、従来のテクニックを用い
て精製したモノクローナル抗体である。
のマウスの腹水中の液体から、従来のテクニックを用い
て精製したモノクローナル抗体である。
このハイブリドーマ自体は、従来のテクニックに従っ
て、前もって１モルあたり２０のＤＮＰ基を与えられた
牛のγ−グロブリンで免疫化されたBalb／Ｃ系統のマウ
スの脾細胞と、ねずみのＮＳ１骨髄腫の細胞を融合し、
次にクローニングによって分離することによって得られ
る。その結果できた抗体は、クラスＧ、イソタイプ２ｂ
の免疫グロブリンで、その親和力（配位子ε−ＤＮＰ−
リシンで測定）の定数は１．８×１０8Ｍ-1である。
て、前もって１モルあたり２０のＤＮＰ基を与えられた
牛のγ−グロブリンで免疫化されたBalb／Ｃ系統のマウ
スの脾細胞と、ねずみのＮＳ１骨髄腫の細胞を融合し、
次にクローニングによって分離することによって得られ
る。その結果できた抗体は、クラスＧ、イソタイプ２ｂ
の免疫グロブリンで、その親和力（配位子ε−ＤＮＰ−
リシンで測定）の定数は１．８×１０8Ｍ-1である。
b)活性化された抗−ＤＮＰ抗体 この物質は、以前に提出された出願NO.７８２７８３８
と追加出願７９２４６５５、およびNO.８１０７５９６
と８１２１８３６で述べられているのと同様のテクニッ
クによって前出の抗体から得られる。こうして得られた
抗−ＤＮＰ抗体２０mgは、１モルあたり１．２の活性体
基を含んでいる。
と追加出願７９２４６５５、およびNO.８１０７５９６
と８１２１８３６で述べられているのと同様のテクニッ
クによって前出の抗体から得られる。こうして得られた
抗−ＤＮＰ抗体２０mgは、１モルあたり１．２の活性体
基を含んでいる。
c)ウレアーゼ 使用される酵素は、mgあたり１７０単位と検定されたＳ
ＩＧＭＡからの（タイプVII，Ｕ０３７６）ウレアーゼ
である。１単位は、２０℃，pH７．０で１分あたり１マ
イクロモルのＮＨ4 +をウレアから脱離させるのに必要な
酵素の量である。
ＩＧＭＡからの（タイプVII，Ｕ０３７６）ウレアーゼ
である。１単位は、２０℃，pH７．０で１分あたり１マ
イクロモルのＮＨ4 +をウレアから脱離させるのに必要な
酵素の量である。
この酵素は、分子量４８０．０００の１モルあたり２７
のチオール基を天然に有している。エルマン（ＥＬＬＭ
ＡＮ）法によって検定できるこのチオール基の全部が酵
素作用に必要なわけではない。従って、若干は活性化さ
れた抗体とのカップリングに用いうる。
のチオール基を天然に有している。エルマン（ＥＬＬＭ
ＡＮ）法によって検定できるこのチオール基の全部が酵
素作用に必要なわけではない。従って、若干は活性化さ
れた抗体とのカップリングに用いうる。
d)抗体と酵素のカップリング ５mgのウレアーゼを、０．１２５Ｍ，pH７．０のリン酸
塩緩衝液中の７．２mg／mlの活性化された抗体溶液０．
６２５ml（つまり活性化された抗体は４．５mg）の中に
溶解する。培養は２５℃で１４時間続けられる。
塩緩衝液中の７．２mg／mlの活性化された抗体溶液０．
６２５ml（つまり活性化された抗体は４．５mg）の中に
溶解する。培養は２５℃で１４時間続けられる。
反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液（リン酸塩１０ｍＭ，塩化
ナトリウム１４０ｍＭ，pH７．４）中で均衡を保ったSe
pharose ６Ｂ（Pharmacia）ゲルカラムでクロマトグラ
フィにかける。２８０nmで光学濃度を測定し、サマー
（ＳＵＭＭＥＲ）の方法（Methods in Enzymology、第I
I巻、３７８頁、S.B.Colowick.N.O.Kaplan編、Academic
出版、１９５５）に従ってウレアーゼ活性を測定するこ
とによって、溶出を制御する。
ナトリウム１４０ｍＭ，pH７．４）中で均衡を保ったSe
pharose ６Ｂ（Pharmacia）ゲルカラムでクロマトグラ
フィにかける。２８０nmで光学濃度を測定し、サマー
（ＳＵＭＭＥＲ）の方法（Methods in Enzymology、第I
I巻、３７８頁、S.B.Colowick.N.O.Kaplan編、Academic
出版、１９５５）に従ってウレアーゼ活性を測定するこ
とによって、溶出を制御する。
最も強いウレアーゼ活性を含んだフラクションを再びま
とめて６．５単位／mlの共軛体の溶液８mlをうる。
とめて６．５単位／mlの共軛体の溶液８mlをうる。
この溶液のアリコート部分を、１モルあたり６個のＤＮ
Ｐ基で置換され、前もって臭化シアンによって活性化さ
れたSepharose４Ｂのマトリックス上で不溶性にされた
牛のアルブミン血清のコラムに吸収させると、ウレアー
ゼ活性は完全にコラムに吸収されたことが見出される。
このことはまた、共軛体に存在する抗体がＤＮＰハプテ
ンを認識する能力を維持していることおよびウレアーゼ
活性が実際に抗体とカップリングしたことを示すもので
ある。
Ｐ基で置換され、前もって臭化シアンによって活性化さ
れたSepharose４Ｂのマトリックス上で不溶性にされた
牛のアルブミン血清のコラムに吸収させると、ウレアー
ゼ活性は完全にコラムに吸収されたことが見出される。
このことはまた、共軛体に存在する抗体がＤＮＰハプテ
ンを認識する能力を維持していることおよびウレアーゼ
活性が実際に抗体とカップリングしたことを示すもので
ある。
実施例２．抗−Ｔ６５免疫毒素の相乗作用 前記のようにして得られた、本発明による共軛体（一対
の物質の結合体）を、生物学的諸性質、更に詳細に云う
と適切な細胞模型における抗−Ｔ６５・免疫毒素の作用
を相乗的に強めるような共軛体の能力に関して研究し
た。
の物質の結合体）を、生物学的諸性質、更に詳細に云う
と適切な細胞模型における抗−Ｔ６５・免疫毒素の作用
を相乗的に強めるような共軛体の能力に関して研究し
た。
上記模型は、本来Ｔ６５抗原を担持するリンパ芽球の型
のヒトのＣＥＭ細胞組織中の細胞より構成されている。
使用される免疫毒素が向けられるこの抗原は上記細胞模
型の第一標的抗原を構成する。また、先行の特許出願N
O.７８２７８３８中に説明されている方法に沿って、ト
リニトロフェニル ハプテン（ＴＮＰ）を用いてこれら
細胞を標識づけすることもできる。このハプテンは、被
試免疫酵素共軛体中に含まれる抗ＤＮＰ抗体により全く
充分に認識され、そして、それ自体上記模型の第二標的
抗原を構成する。ＴＮＰハプテンでの細胞の標識づけ
は、細胞の生活能力を変化させることなく、また、抗−
Ｔ６５免疫毒素のこれら細胞への固定を妨害することも
ないことが判った。
のヒトのＣＥＭ細胞組織中の細胞より構成されている。
使用される免疫毒素が向けられるこの抗原は上記細胞模
型の第一標的抗原を構成する。また、先行の特許出願N
O.７８２７８３８中に説明されている方法に沿って、ト
リニトロフェニル ハプテン（ＴＮＰ）を用いてこれら
細胞を標識づけすることもできる。このハプテンは、被
試免疫酵素共軛体中に含まれる抗ＤＮＰ抗体により全く
充分に認識され、そして、それ自体上記模型の第二標的
抗原を構成する。ＴＮＰハプテンでの細胞の標識づけ
は、細胞の生活能力を変化させることなく、また、抗−
Ｔ６５免疫毒素のこれら細胞への固定を妨害することも
ないことが判った。
これら免疫毒素の基本性質は、標的細胞による蛋白合成
を抑制することであるから、適用される試験は、培地中
での癌細胞中への14Ｃ−ロイシンの組込に対する被験物
質の効果を測定することにある。
を抑制することであるから、適用される試験は、培地中
での癌細胞中への14Ｃ−ロイシンの組込に対する被験物
質の効果を測定することにある。
この測定は、蛋白合成速度を求めるための14Ｃ−ロイシ
ンという追跡用物質を用いるJournal of Biological Ch
emistry，１９７４，２４９（ii）pp．３５５７〜６２
に説明された方法を適当に調整した技術に従い、行なわ
れる。組込まれた放射能の測定はその場合、濾別された
細胞群全体について行なわれる。
ンという追跡用物質を用いるJournal of Biological Ch
emistry，１９７４，２４９（ii）pp．３５５７〜６２
に説明された方法を適当に調整した技術に従い、行なわ
れる。組込まれた放射能の測定はその場合、濾別された
細胞群全体について行なわれる。
これらの測定から投薬量／薬効果−曲線をグラフ上に描
く。Ｘ軸は被験物質の鎖構造Ａのモル濃度を示し、Ｙ軸
は、蛋白合成に影響するあらゆる物質の不存在における
対照細胞による組込値に対する百分率とし表わされた14
Ｃ−ロイシンの組込値を示す。
く。Ｘ軸は被験物質の鎖構造Ａのモル濃度を示し、Ｙ軸
は、蛋白合成に影響するあらゆる物質の不存在における
対照細胞による組込値に対する百分率とし表わされた14
Ｃ−ロイシンの組込値を示す。
各被験物質において、14Ｃ−ロイシン組込の５０％を抑
制する濃度、すなわち“抑制濃度・５０”（ＩＣ−５
０）がこのようにして求められる。
制する濃度、すなわち“抑制濃度・５０”（ＩＣ−５
０）がこのようにして求められる。
この実験中の種々の試験は、次のように行なわれた。相
対応する実験結果を第１図に示してある。
対応する実験結果を第１図に示してある。
a)ＣＥＭ細胞を、対照物質としてのリシンまたは単離し
た鎖Ａの既知濃度の存在において３７℃で１８時間培養
してから、放射性追跡物質を細胞へ混入する。求められ
たＩＣ−５０は、リシンと鎖構造Ａにおいて、それぞれ
４×１０-12モルと４．５×１０-8モルであった。これ
らのモル値が、ＴＮＰハプテンで標識づけされたＣＥＭ
細胞について得られた値から差別できないことも、認め
られた（カーブ１はＣＥＭ細胞にリシンを作用された結
果を、そしてカーブ２はＣＥＭ細胞に鎖構造Ａリシンを
作用された結果を示す。） b)ＴＮＰにより標識づけされたＣＥＭ細胞を、初期出願
NO.７８２７８３８および追加出願NO.７９２４６５５の
説明に従って得られかつ抗ＤＮＰ特異性を有する免疫毒
素の存在において３７℃で１８時間培養してから、放射
性追跡用物質を混入した。こうして得られた細胞毒性度
カーブの形状とＩＣ−５０の値（１．５×１０-9モル）
により、これら細胞は通常抗ＤＮＰ免疫毒素の細胞毒効
果に敏感であるからこれら細胞は正確にＴＮＰにより標
識づけされることが示される（カーブ３）。
た鎖Ａの既知濃度の存在において３７℃で１８時間培養
してから、放射性追跡物質を細胞へ混入する。求められ
たＩＣ−５０は、リシンと鎖構造Ａにおいて、それぞれ
４×１０-12モルと４．５×１０-8モルであった。これ
らのモル値が、ＴＮＰハプテンで標識づけされたＣＥＭ
細胞について得られた値から差別できないことも、認め
られた（カーブ１はＣＥＭ細胞にリシンを作用された結
果を、そしてカーブ２はＣＥＭ細胞に鎖構造Ａリシンを
作用された結果を示す。） b)ＴＮＰにより標識づけされたＣＥＭ細胞を、初期出願
NO.７８２７８３８および追加出願NO.７９２４６５５の
説明に従って得られかつ抗ＤＮＰ特異性を有する免疫毒
素の存在において３７℃で１８時間培養してから、放射
性追跡用物質を混入した。こうして得られた細胞毒性度
カーブの形状とＩＣ−５０の値（１．５×１０-9モル）
により、これら細胞は通常抗ＤＮＰ免疫毒素の細胞毒効
果に敏感であるからこれら細胞は正確にＴＮＰにより標
識づけされることが示される（カーブ３）。
c)ＴＮＰにより標識づけされたＣＥＭ細胞を先ず、５単
位／mlの割合で共軛化されていない尿素分解酵素（ウレ
アーゼ）の存在において４℃で１時間培養してから洗浄
し、抗−Ｔ６５免疫毒素および尿素５モルの存在におい
て３７℃で１８時間培養し、最後に放射性追跡用物質を
混入する。ＩＣ−５０値を求めると５×１０-9モルであ
った。この値は、ウレアーゼによる処理もせずウレアー
ゼ洗浄後の培養媒質中に尿素を加えもしないで、同条件
においてＴＮＰで標識づけしてないＣＥＭ細胞を使用し
て得られた値に一致する。この試験によると、共軛化さ
れてないウレアーゼの存在における培養がウレアーゼの
ＣＥＭ細胞への結合を伴なわず従って、抗・Ｔ６５免疫
毒素の効果の相乗作用は生じない（カーブ４）。
位／mlの割合で共軛化されていない尿素分解酵素（ウレ
アーゼ）の存在において４℃で１時間培養してから洗浄
し、抗−Ｔ６５免疫毒素および尿素５モルの存在におい
て３７℃で１８時間培養し、最後に放射性追跡用物質を
混入する。ＩＣ−５０値を求めると５×１０-9モルであ
った。この値は、ウレアーゼによる処理もせずウレアー
ゼ洗浄後の培養媒質中に尿素を加えもしないで、同条件
においてＴＮＰで標識づけしてないＣＥＭ細胞を使用し
て得られた値に一致する。この試験によると、共軛化さ
れてないウレアーゼの存在における培養がウレアーゼの
ＣＥＭ細胞への結合を伴なわず従って、抗・Ｔ６５免疫
毒素の効果の相乗作用は生じない（カーブ４）。
d)ＴＮＰにより標識づけられたＣＥＭ細胞を先ず、前記
に説明された免疫酵素共軛体の存在（６．５単位／mlの
濃度で使用）において４℃で１時間培養する。他方、こ
の共軛体は上記の諸条件で使用されると、被験細胞に固
有の細胞毒を及ぼさないことが認められている。次にこ
れら細胞を、固定されないあらゆる共軛体を除去するた
めに洗浄してから、抗Ｔ−６５免疫毒素と尿素５モルの
存在において３７℃で１８時間培養する。最後に放射性
追跡用物質を混入する。求められたＩＣ−５０値は、
３．５×１０-13モルであった。（カーブ５） この結果によると、免疫酵素共軛体の相乗効果は、標的
細胞に対する免疫毒素の細胞毒・活性を約１４．０００
倍に増加させる。この試験によって、上記相乗効果は、
その免疫学的特異性質に対応する抗原に対する免疫酵素
共軛体の固定を意味することが判った。この固定は、細
胞の洗浄に耐え、細胞の表面に少量の酵素活性ウレアー
ゼを残留し、この残留ウレアーゼは、免疫毒素と共に培
養媒質中に存在する尿素からＮＨ4 +イオンを生じ、これ
によってＮＨ4 +イオンの周知相乗効果を起す。こうして
生じた相乗効果は、塩化アンモニウム１０ミリモルを培
養媒質に加えた場合に、以前に観察された相乗効果に極
めて類似するものである。
に説明された免疫酵素共軛体の存在（６．５単位／mlの
濃度で使用）において４℃で１時間培養する。他方、こ
の共軛体は上記の諸条件で使用されると、被験細胞に固
有の細胞毒を及ぼさないことが認められている。次にこ
れら細胞を、固定されないあらゆる共軛体を除去するた
めに洗浄してから、抗Ｔ−６５免疫毒素と尿素５モルの
存在において３７℃で１８時間培養する。最後に放射性
追跡用物質を混入する。求められたＩＣ−５０値は、
３．５×１０-13モルであった。（カーブ５） この結果によると、免疫酵素共軛体の相乗効果は、標的
細胞に対する免疫毒素の細胞毒・活性を約１４．０００
倍に増加させる。この試験によって、上記相乗効果は、
その免疫学的特異性質に対応する抗原に対する免疫酵素
共軛体の固定を意味することが判った。この固定は、細
胞の洗浄に耐え、細胞の表面に少量の酵素活性ウレアー
ゼを残留し、この残留ウレアーゼは、免疫毒素と共に培
養媒質中に存在する尿素からＮＨ4 +イオンを生じ、これ
によってＮＨ4 +イオンの周知相乗効果を起す。こうして
生じた相乗効果は、塩化アンモニウム１０ミリモルを培
養媒質に加えた場合に、以前に観察された相乗効果に極
めて類似するものである。
故意に塩化アンモニウムを添加する場合と同様に、上記
の相乗効果はリシンを用いてもリシンの鎖構造Ａを用い
ても、また被験細胞に関して非特異な免疫毒素を用いて
も、得られない。
の相乗効果はリシンを用いてもリシンの鎖構造Ａを用い
ても、また被験細胞に関して非特異な免疫毒素を用いて
も、得られない。
本実施例における諸条件のもとでは、使用される免疫酵
素共軛体の存在における抗Ｔ６５免疫毒素の細胞毒活性
は、リシンの構造鎖の細胞毒活性の約１３０，０００倍
であり、更にリシンの細胞毒活性の約１１倍でさえあ
る。
素共軛体の存在における抗Ｔ６５免疫毒素の細胞毒活性
は、リシンの構造鎖の細胞毒活性の約１３０，０００倍
であり、更にリシンの細胞毒活性の約１１倍でさえあ
る。
実施例３ マレイミド基により置換された抗ＤＮＰ抗体
と植物起源ウレアーゼを反応をさせて得られる免疫酵素
共軛体 a)抗ＤＮＰ抗体 この抗体は、ハイブリドーマＦ9が移植されているBalb
／Ｃ系統のマウスの腹水液から従来技術により精製され
たモノクローナル抗体である。
と植物起源ウレアーゼを反応をさせて得られる免疫酵素
共軛体 a)抗ＤＮＰ抗体 この抗体は、ハイブリドーマＦ9が移植されているBalb
／Ｃ系統のマウスの腹水液から従来技術により精製され
たモノクローナル抗体である。
上記のハイブリドーマ自体は、従来の技術によってモル
当り２０個のＤＮＰ基が予め固定されている牛のガンマ
グロブリンを用いて免疫化されたBalb／Ｃ系統のマウス
の脾細胞とでネズミのＮＳ１骨髄腫細胞を融合しそして
クローニングにより分離することによって得られる。こ
うして得られる抗体は、クラスＧ，イソタイプ２ｂの免
疫グロブリンで、その新和力定数（配位子ε−ＤＮＰ−
リシンで測定）は１．８×１０8Ｍ-1である。
当り２０個のＤＮＰ基が予め固定されている牛のガンマ
グロブリンを用いて免疫化されたBalb／Ｃ系統のマウス
の脾細胞とでネズミのＮＳ１骨髄腫細胞を融合しそして
クローニングにより分離することによって得られる。こ
うして得られる抗体は、クラスＧ，イソタイプ２ｂの免
疫グロブリンで、その新和力定数（配位子ε−ＤＮＰ−
リシンで測定）は１．８×１０8Ｍ-1である。
b)活性化された抗ＤＮＰ−抗体。
抗ＤＮＰ−抗体の溶液（pH７．０の燐酸塩１２５ミリモ
ル緩衝液中における濃度９．７mg／ml）２．５mlに、ｍ
−マレインイミド−安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシン
イミド・エステル０．４mgを含むジメチルホルムアミド
１０μを加える。こうして得た混合物を２５℃で３０
分間培養する。次に、この溶液を、燐酸塩１２５ミリモ
ル（pH７．０）緩衝液中に釣合されたSephadexＧ２５の
１０mlカラム上へ沈積させる。溶出は、光学的密度を２
８０nmで測定して制御される。カラムの排除容積から
２．５mlを回収する。置換割合を、14Ｃ−システィン過
剰量との反応により分取試料を用いて測定した。
ル緩衝液中における濃度９．７mg／ml）２．５mlに、ｍ
−マレインイミド−安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシン
イミド・エステル０．４mgを含むジメチルホルムアミド
１０μを加える。こうして得た混合物を２５℃で３０
分間培養する。次に、この溶液を、燐酸塩１２５ミリモ
ル（pH７．０）緩衝液中に釣合されたSephadexＧ２５の
１０mlカラム上へ沈積させる。溶出は、光学的密度を２
８０nmで測定して制御される。カラムの排除容積から
２．５mlを回収する。置換割合を、14Ｃ−システィン過
剰量との反応により分取試料を用いて測定した。
このようにして抗体濃度８mg／mlの溶液が得られ、その
置換割合はマレインイミド基３．５個／抗体１モルであ
った。
置換割合はマレインイミド基３．５個／抗体１モルであ
った。
c)ウレアーゼ 使用された酵素は、１７０単位／mgと検定されたシグマ
（ＳＩＧＭＡ）起原のウレアーゼ（VII型、ref.Ｕ０３
７６）である。１単位は、尿素から２０℃，pH７におい
て毎分ＮＨ4 +１ミクロモルを遊離できる酵素量である。
（ＳＩＧＭＡ）起原のウレアーゼ（VII型、ref.Ｕ０３
７６）である。１単位は、尿素から２０℃，pH７におい
て毎分ＮＨ4 +１ミクロモルを遊離できる酵素量である。
この酵素は、分子量４８０，０００で本来チオール基２
７個／モル含んでいる。エルマン法で検定された上記チ
オール基は、全部が酵素活性に必要なわけではない。従
ってチオール基の一部は、活性化された抗体とカップリ
ングさせるのに使用され得る。
７個／モル含んでいる。エルマン法で検定された上記チ
オール基は、全部が酵素活性に必要なわけではない。従
ってチオール基の一部は、活性化された抗体とカップリ
ングさせるのに使用され得る。
d)抗体と酵素とのカップリング。
Ｇ２５カラム上で塩を除いて直ぐに、活性化された抗体
の溶液２．４mlを燐酸塩１２５ミリモル緩衝液（pH７．
０）に溶かしたウレアーゼの溶液（濃度２４mg／ml）
２．０mlと混合する。この混合液を２５℃で１時間培養
し、遠心分離後、ＰＢＳ（燐酸塩緩衝）溶液中に釣合わ
されたSephadex Ｇ２００ゲルカラム４５０ml上に沈析
させる。その溶出は、２８０nmで光学的密度を測りまた
サマー法に従ってウレアーゼ活性を測ることによって、
制御される。
の溶液２．４mlを燐酸塩１２５ミリモル緩衝液（pH７．
０）に溶かしたウレアーゼの溶液（濃度２４mg／ml）
２．０mlと混合する。この混合液を２５℃で１時間培養
し、遠心分離後、ＰＢＳ（燐酸塩緩衝）溶液中に釣合わ
されたSephadex Ｇ２００ゲルカラム４５０ml上に沈析
させる。その溶出は、２８０nmで光学的密度を測りまた
サマー法に従ってウレアーゼ活性を測ることによって、
制御される。
最も高いウレアーゼ活性度を有するフラクションを再び
まとめて、１４mlの共軛体溶液（濃度は１０２単位／m
l）が得られる。
まとめて、１４mlの共軛体溶液（濃度は１０２単位／m
l）が得られる。
もしこの溶液の分割試料（アリコート）を蛋白Ａ−セフ
ァロース、ゲルカラム上でクロマトグラフィにかける
と、ウレアーゼ活性の３０％はカラム上に沈積しないこ
とが判る。ウレアーゼ活性の残りを、pH３．５の緩衝液
により抗体と同時に溶出させる。対照試験により判るよ
うに、抗体とカップリングしないウレアーゼは全く、カ
ラム上に固定されない。これにより、実に再びまとめら
れたフラクションのウレアーゼ活性の７０％は抗体−ウ
レアーゼ共軛体に属することが判る。以下に説明する試
験については、遊離の汚染ウレアーゼが溶液ら除かれて
いないが、このウレアーゼは以下に説明するように適用
の諸条件のもとでは無効である。
ァロース、ゲルカラム上でクロマトグラフィにかける
と、ウレアーゼ活性の３０％はカラム上に沈積しないこ
とが判る。ウレアーゼ活性の残りを、pH３．５の緩衝液
により抗体と同時に溶出させる。対照試験により判るよ
うに、抗体とカップリングしないウレアーゼは全く、カ
ラム上に固定されない。これにより、実に再びまとめら
れたフラクションのウレアーゼ活性の７０％は抗体−ウ
レアーゼ共軛体に属することが判る。以下に説明する試
験については、遊離の汚染ウレアーゼが溶液ら除かれて
いないが、このウレアーゼは以下に説明するように適用
の諸条件のもとでは無効である。
実施例４．実施例３の免疫酵素・共軛体による抗Ｔ６５
免疫毒素相乗作用。
免疫毒素相乗作用。
上記の説明の通りに（実施例３の）得られた本発明の共
軛体を、生物学的諸性質に関して、特に、適切な細胞模
型における抗Ｔ６５免疫毒素活性を相乗化する能力に関
して試験した。
軛体を、生物学的諸性質に関して、特に、適切な細胞模
型における抗Ｔ６５免疫毒素活性を相乗化する能力に関
して試験した。
この模型は、Ｔ６５抗原を通常担持しているリンパ芽球
−型のヒトのＣＥＭ細胞組織によりなる細胞から構成さ
れる。使用される免疫毒素が向けられるこの抗原は、上
記細胞模型の第一標的抗原を構成する。本出願人の以前
の出願NO.７８２７８３８に説明されている技術に従っ
て上記の細胞をトリニトロフェニルハプテン（ＴＮＰ）
で標識することも可能である。上記ハプテンは、試験さ
れる免疫酵素共軛体に含まれる抗ＤＮＰ・抗体によって
完全に認識され、従って上記細胞模型の第二標的抗原を
構成する。ＴＮＰハプテンにより細胞を標識づけしても
これら細胞の生活能力に影響しないし、これら細胞への
抗Ｔ６５免疫毒素の固定にも影響しないことが見出され
た。
−型のヒトのＣＥＭ細胞組織によりなる細胞から構成さ
れる。使用される免疫毒素が向けられるこの抗原は、上
記細胞模型の第一標的抗原を構成する。本出願人の以前
の出願NO.７８２７８３８に説明されている技術に従っ
て上記の細胞をトリニトロフェニルハプテン（ＴＮＰ）
で標識することも可能である。上記ハプテンは、試験さ
れる免疫酵素共軛体に含まれる抗ＤＮＰ・抗体によって
完全に認識され、従って上記細胞模型の第二標的抗原を
構成する。ＴＮＰハプテンにより細胞を標識づけしても
これら細胞の生活能力に影響しないし、これら細胞への
抗Ｔ６５免疫毒素の固定にも影響しないことが見出され
た。
免疫毒素の基本的性質は、標的細胞が行なう蛋白合成を
抑制することであるから、行なわれるべき試験は、14Ｃ
−ロイシンが培地中の癌細胞中に組込まれることに及ぼ
す被試物質の効果を測定するにある。
抑制することであるから、行なわれるべき試験は、14Ｃ
−ロイシンが培地中の癌細胞中に組込まれることに及ぼ
す被試物質の効果を測定するにある。
この測定は、14Ｃ−ロイシンという追跡用物質を蛋白合
成速度の測定に用いるJ.of Biological Chem.１９７
４，２４９（１１）、pp３５５７〜６２に説明された方
法を改変した技術に従って行なわれる。組込まれた放射
能は、この場合、濾別された細胞全部について測定され
る。
成速度の測定に用いるJ.of Biological Chem.１９７
４，２４９（１１）、pp３５５７〜６２に説明された方
法を改変した技術に従って行なわれる。組込まれた放射
能は、この場合、濾別された細胞全部について測定され
る。
これら測定結果によって投薬量／効果−曲線をグラフに
描くことができ、このグラフのＸ軸は、被験物質におけ
る鎖構造Ａのモル濃度を表わし、Ｙ軸は蛋白合成に影響
するあらゆる物質の不存在における対照細胞による組込
値に対する百分率として表わされた14Ｃ−ロイシンの組
込割合を示す。
描くことができ、このグラフのＸ軸は、被験物質におけ
る鎖構造Ａのモル濃度を表わし、Ｙ軸は蛋白合成に影響
するあらゆる物質の不存在における対照細胞による組込
値に対する百分率として表わされた14Ｃ−ロイシンの組
込割合を示す。
研究された各物質について、14Ｃ−ロイシン組込の５０
％を抑制する濃度すなわち“抑制濃度５０”（ＩＣ５
０）をこのようにして求めることができる。
％を抑制する濃度すなわち“抑制濃度５０”（ＩＣ５
０）をこのようにして求めることができる。
この実験における種々の試験が、次のように行なわれ、
その相対応する実験結果が第２図に示される。
その相対応する実験結果が第２図に示される。
a)実施例２（ａ）で行なわれた対照試験を繰返し行なわ
なかった。それは、その説明ずみ対照試験はそのままで
本実施例においても有効だからである。
なかった。それは、その説明ずみ対照試験はそのままで
本実施例においても有効だからである。
b)ＴＮＰで標識づけされたＣＥＭ細胞を、本出願人の前
出願NO.８１２１８３６に説明されているようにして得
られる抗Ｔ６５特異性免疫毒素の存在で、１８時間３７
℃で培養し、次いで放射性追跡用物質を混入する。細胞
毒性カーブは、同じ細胞を用いるがＴＮＰで標識づけさ
れていないものを用いて同じ培養条件下で得られたカー
ブに一致する。従って、これら細胞をＴＮＰで標識づけ
するのが正確に行なわれることが、立証される。
出願NO.８１２１８３６に説明されているようにして得
られる抗Ｔ６５特異性免疫毒素の存在で、１８時間３７
℃で培養し、次いで放射性追跡用物質を混入する。細胞
毒性カーブは、同じ細胞を用いるがＴＮＰで標識づけさ
れていないものを用いて同じ培養条件下で得られたカー
ブに一致する。従って、これら細胞をＴＮＰで標識づけ
するのが正確に行なわれることが、立証される。
c)ＴＮＰで標識づけされたＣＥＭ細胞を先ず、１mlにつ
き１単位の割合で非共軛ウレアーゼの存在において４℃
で１時間培養し次に洗浄してから、唯一の濃度１０-9モ
ルにおける抗Ｔ６５−免疫毒素および５ミリモルの尿素
の存在において１８時間３７℃で培養し、次いで放射性
追跡用物質を混入する。
き１単位の割合で非共軛ウレアーゼの存在において４℃
で１時間培養し次に洗浄してから、唯一の濃度１０-9モ
ルにおける抗Ｔ６５−免疫毒素および５ミリモルの尿素
の存在において１８時間３７℃で培養し、次いで放射性
追跡用物質を混入する。
この試験で得られた14Ｃ−ロイシン組込値（６５％）
は、（ｂ）試験における抗Ｔ６５免疫毒素の同一濃度を
用い得られる値と差別できない。この結果は、非共軛ウ
レアーゼの存在における培養では、細胞へのウレアーゼ
の結合が起らず従って抗Ｔ６５−免疫毒素効果の相乗作
用も起らないことを裏書きする。
は、（ｂ）試験における抗Ｔ６５免疫毒素の同一濃度を
用い得られる値と差別できない。この結果は、非共軛ウ
レアーゼの存在における培養では、細胞へのウレアーゼ
の結合が起らず従って抗Ｔ６５−免疫毒素効果の相乗作
用も起らないことを裏書きする。
d)ＴＮＰにより標識づけられたＣＥＭ細胞を先ず、１．
０２単位／mlの濃度で使用される、前記に説明の免疫酵
素共軛体の存在において４℃で１時間培養する。この共
軛体が上記諸条件下に使用された場合、用いた細胞へ固
有の細胞毒性を呈しないことも確かめられた。これら細
胞を次いで洗浄して未固定の共軛体を除き、抗Ｔ６５−
免疫毒素と５ミリモルの尿素との存在において３７℃で
１８時間培養する。これら細胞は、最後に放射性追跡用
物質を混入される。こうして得られたＩＣ５０の値は
２．４×１０-13モルである（カーブ７）。
０２単位／mlの濃度で使用される、前記に説明の免疫酵
素共軛体の存在において４℃で１時間培養する。この共
軛体が上記諸条件下に使用された場合、用いた細胞へ固
有の細胞毒性を呈しないことも確かめられた。これら細
胞を次いで洗浄して未固定の共軛体を除き、抗Ｔ６５−
免疫毒素と５ミリモルの尿素との存在において３７℃で
１８時間培養する。これら細胞は、最後に放射性追跡用
物質を混入される。こうして得られたＩＣ５０の値は
２．４×１０-13モルである（カーブ７）。
実施例１の共軛体を使用して得られるＩＣ５０値に全く
匹敵する上記ＩＣ−５０は、免疫毒素に及ぼす免疫酵素
共軛体の相乗効果が著しいことを示す。
匹敵する上記ＩＣ−５０は、免疫毒素に及ぼす免疫酵素
共軛体の相乗効果が著しいことを示す。
この試験によって、上記相乗作用が、免疫学的特異性に
対応する抗原上への免疫酵素共軛体の固定を示すことが
判る。この固定は細胞の洗浄に耐えるし、また細胞表面
上へ若干の酵素的活性のウレアーゼを残し、このウレア
ーゼは、免疫毒素とともに培養媒質中に存在する尿素か
らＮＨ4 +イオンを生ずる。このことから、ＮＨ4 +イオン
の相乗効果が生ずる。
対応する抗原上への免疫酵素共軛体の固定を示すことが
判る。この固定は細胞の洗浄に耐えるし、また細胞表面
上へ若干の酵素的活性のウレアーゼを残し、このウレア
ーゼは、免疫毒素とともに培養媒質中に存在する尿素か
らＮＨ4 +イオンを生ずる。このことから、ＮＨ4 +イオン
の相乗効果が生ずる。
得られた相乗効果は、免疫酵素共軛体／基質系の代りに
培養媒質へ加えられた１０ミリモルの塩化アンモニウム
の存在において培養が行なわれるとき観察される相乗効
果に極めて類似する。
培養媒質へ加えられた１０ミリモルの塩化アンモニウム
の存在において培養が行なわれるとき観察される相乗効
果に極めて類似する。
塩化アンモニウムを加えた場合、得られるＩＣ５０値
は、第２図の相応カーブ８により表わされるように実に
３．８×１０-13モルである。
は、第２図の相応カーブ８により表わされるように実に
３．８×１０-13モルである。
既掲の各実施例は、本発明の生成物がヒトの疾病治療に
使用しうることを示す。
使用しうることを示す。
本発明の新規医薬は好ましい静脈ルートによる投与用に
注射可能な形で提供し得る。それらは免疫毒素の製造に
使用される抗体に感応する癌性または非癌性疾患の治療
に使用しうる。それらは患者のおよび疾患の種類の函数
として各場合に決定される投与量および条件で使用され
るべきである。
注射可能な形で提供し得る。それらは免疫毒素の製造に
使用される抗体に感応する癌性または非癌性疾患の治療
に使用しうる。それらは患者のおよび疾患の種類の函数
として各場合に決定される投与量および条件で使用され
るべきである。
第１図及び第２図は、投薬量／薬効果を示すグラフであ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−90858（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−22698（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−130674（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−124682（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−72284（ＪＰ，Ａ) 石川栄治ほか編「酵素免疫測定法」（昭 和53−12−15）医学書院Ｐ．37〜38
Claims (3)
- 【請求項１】リシンの鎖Ａと、標的細胞が有する抗原に
対する抗体または抗体断片とを、共有結合によりカップ
リングさせて得られる免疫毒素を含有する医薬会合体に
おける免疫毒素の作用増強剤として有用な免疫酵素共軛
体であって、前記標的細胞が有する抗原を認識する能力
を保持している抗体または抗体断片と、高等動物の器官
内で充分に耐忍される天然基質からアンモニウムイオン
を脱離させることができる酵素とを、共有結合により化
学的にカップリングさせて成ることを特徴とする前記免
疫酵素共軛体。 - 【請求項２】共有結合がジスルフィド結合である特許請
求の範囲第１項に記載の共軛体。 - 【請求項３】共有結合がチオエーテル結合である特許請
求の範囲第１項に記載の共軛体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8204547 | 1982-03-17 | ||
| FR8204547A FR2523445A1 (fr) | 1982-03-17 | 1982-03-17 | Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58208238A JPS58208238A (ja) | 1983-12-03 |
| JPH0653677B2 true JPH0653677B2 (ja) | 1994-07-20 |
Family
ID=9272107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58043276A Expired - Lifetime JPH0653677B2 (ja) | 1982-03-17 | 1983-03-17 | 共有結合によって酵素と抗体をカップリングさせた新規共軛体 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4762707A (ja) |
| EP (1) | EP0089880B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0653677B2 (ja) |
| KR (1) | KR910000029B1 (ja) |
| AT (1) | ATE27915T1 (ja) |
| AU (1) | AU563356B2 (ja) |
| CA (1) | CA1216791A (ja) |
| CS (1) | CS268656B2 (ja) |
| DD (1) | DD209578A5 (ja) |
| DE (1) | DE3372175D1 (ja) |
| DK (1) | DK166966B1 (ja) |
| EG (1) | EG15882A (ja) |
| ES (1) | ES8405071A1 (ja) |
| FI (1) | FI830897L (ja) |
| FR (1) | FR2523445A1 (ja) |
| GR (1) | GR77119B (ja) |
| HU (1) | HU189246B (ja) |
| IE (1) | IE54624B1 (ja) |
| IL (1) | IL68106A0 (ja) |
| MA (1) | MA19742A1 (ja) |
| NO (1) | NO166618C (ja) |
| NZ (1) | NZ203586A (ja) |
| OA (1) | OA07388A (ja) |
| PH (1) | PH18890A (ja) |
| PL (1) | PL142316B1 (ja) |
| PT (1) | PT76394B (ja) |
| ZA (1) | ZA831833B (ja) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4542225A (en) * | 1984-08-29 | 1985-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Acid-cleavable compound |
| FR2573656B1 (fr) * | 1984-11-29 | 1987-02-27 | Sanofi Sa | Medicament comportant en tant qu'association au moins une immunotoxine et au moins un polymere contenant du mannose |
| AU595173B2 (en) * | 1985-01-08 | 1990-03-29 | General Hospital Corporation, The | Method and use for site-specific activation of substances |
| DE3612643A1 (de) * | 1985-12-05 | 1987-06-11 | Mueller Lierheim Kg Biolog Lab | Traegerkoerper, der durch kovalent an seine oberflaeche gebundene antikoerper bioaktiviert ist |
| EP0252951A4 (en) * | 1986-01-06 | 1988-09-07 | Univ Melbourne | TECHNETIUM-ANTIBODY CONJUGATES. |
| US5716990A (en) * | 1987-03-09 | 1998-02-10 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Drug delivery systems |
| NZ225599A (en) | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
| US4975278A (en) * | 1988-02-26 | 1990-12-04 | Bristol-Myers Company | Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells |
| US5773435A (en) * | 1987-08-04 | 1998-06-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Prodrugs for β-lactamase and uses thereof |
| FR2624010B1 (fr) * | 1987-12-07 | 1991-07-05 | Fabre Pierre Cosmetique | Compositions topiques heterogenes a base de microgranules de cafeine et/ou de ses derives, utiles comme amincissant et/ou dans le traitement de la cellulite, ainsi que leur preparation |
| DE3807904A1 (de) * | 1988-03-10 | 1989-09-21 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US5851527A (en) * | 1988-04-18 | 1998-12-22 | Immunomedics, Inc. | Method for antibody targeting of therapeutic agents |
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