JPH0654695A - 有機ｃ−ｓ結合の生化学的切断 - Google Patents
有機ｃ−ｓ結合の生化学的切断Info
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- JPH0654695A JPH0654695A JP5052304A JP5230493A JPH0654695A JP H0654695 A JPH0654695 A JP H0654695A JP 5052304 A JP5052304 A JP 5052304A JP 5230493 A JP5230493 A JP 5230493A JP H0654695 A JPH0654695 A JP H0654695A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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- C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
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- C10G32/00—Refining of hydrocarbon oils by electric or magnetic means, by irradiation, or by using microorganisms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 微生物に基づく生化学的試薬により有機Ｃ−
Ｓ結合を選択的に切断する方法提供する。 【構成】 生長条件下の少なくとも１種の微生物、微生
物の細胞膜の断片のエキストラクトまたは微生物の細胞
膜に関連した少なくとも１つの酵素であってよい、少な
くとも１つの硫黄に特異的な反応試薬であり、各々の硫
黄特異的反応試薬が、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能を
もつ試薬に、硫黄を含む有機炭素質物質を接触させるこ
とによる、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断のための微生
物を用いる方法。ロドコッカス ロドクロウスおよびバ
シルス スフェリクスおよびそれらの誘導株の微生物は
有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもつことが見い出さ
れ、特に好ましい微生物はロドコッカス ロドクロウス
菌株ＡＴＣＣ５３９６８およびバシルス スフェリクス
菌株ＡＴＣＣ５３９６９およびそれらの誘導株である。
Ｃ−Ｓ結合の切断を、石炭または炭化水素油の中の有機
物に結合した硫黄の低下のために、およびデフェンシン
の生化学的な不活性化および修飾において使用すること
ができる。
Ｓ結合を選択的に切断する方法提供する。 【構成】 生長条件下の少なくとも１種の微生物、微生
物の細胞膜の断片のエキストラクトまたは微生物の細胞
膜に関連した少なくとも１つの酵素であってよい、少な
くとも１つの硫黄に特異的な反応試薬であり、各々の硫
黄特異的反応試薬が、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能を
もつ試薬に、硫黄を含む有機炭素質物質を接触させるこ
とによる、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断のための微生
物を用いる方法。ロドコッカス ロドクロウスおよびバ
シルス スフェリクスおよびそれらの誘導株の微生物は
有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもつことが見い出さ
れ、特に好ましい微生物はロドコッカス ロドクロウス
菌株ＡＴＣＣ５３９６８およびバシルス スフェリクス
菌株ＡＴＣＣ５３９６９およびそれらの誘導株である。
Ｃ−Ｓ結合の切断を、石炭または炭化水素油の中の有機
物に結合した硫黄の低下のために、およびデフェンシン
の生化学的な不活性化および修飾において使用すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生化学的試薬により有機
Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する方法に関する。有機Ｃ−
Ｓ結合の選択的切断は、カロリー値の損失のない、含硫
黄炭素質有機物質からの硫黄の高い効率での除去を提供
する。本発明の方法はまた有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断
を必要とするディフェンシンの生化学的不活化および修
飾にも適している。本発明の方法の利用に適しているの
は、有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を持つ微生
物、例えばロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）とバシルス ス
フェリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ）およびそのような特徴を示す派生物などの微生物で
ある。また、有機Ｃ−Ｓ結合の切断について選択的能力
を示す上記微生物の、産生された細菌の膜エキストラク
ト、即ち膜抽出物および酵素も適している。特に好適な
のは、ロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー
５３９６８とバシルス スフェリクス株ＡＴＣＣナンバ
ー５３９６９およびその派生微生物、膜エキストラク
ト、および酵素である。本発明の方法は、含硫黄の石炭
および石油などの化石燃料からの有機硫黄の除去に、そ
してディフェンシンとして知られる炭水化物を含まない
ポリペプチドの修飾、その不活化を可能にするＣ−Ｓ結
合の切断、およびその活性と特異的様式を改変するため
の官能基の変更に特に有用である。
Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する方法に関する。有機Ｃ−
Ｓ結合の選択的切断は、カロリー値の損失のない、含硫
黄炭素質有機物質からの硫黄の高い効率での除去を提供
する。本発明の方法はまた有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断
を必要とするディフェンシンの生化学的不活化および修
飾にも適している。本発明の方法の利用に適しているの
は、有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を持つ微生
物、例えばロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）とバシルス ス
フェリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ）およびそのような特徴を示す派生物などの微生物で
ある。また、有機Ｃ−Ｓ結合の切断について選択的能力
を示す上記微生物の、産生された細菌の膜エキストラク
ト、即ち膜抽出物および酵素も適している。特に好適な
のは、ロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー
５３９６８とバシルス スフェリクス株ＡＴＣＣナンバ
ー５３９６９およびその派生微生物、膜エキストラク
ト、および酵素である。本発明の方法は、含硫黄の石炭
および石油などの化石燃料からの有機硫黄の除去に、そ
してディフェンシンとして知られる炭水化物を含まない
ポリペプチドの修飾、その不活化を可能にするＣ−Ｓ結
合の切断、およびその活性と特異的様式を改変するため
の官能基の変更に特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】石炭や石油などの炭素質燃料の硫黄含量
が有機的に結合した硫黄の約３．５重量％に達すると、
環境に有害な影響をもたらすことからこのような物質の
相当量の利用が妨げられていた。ジベンゾチオフェン
（ＤＢＴ）は、有機硫黄が石炭や石油などの天然にある
有機炭素質燃料に存在する形を代表するものと、多くの
者が考えている有機硫黄化合物であり、有機硫黄化合物
の微生物による代謝が集中する化合物である。ＤＢＴの
微生物による分解経路は、コダマ（Ｋｏｄａｍａ）、
Ｋ．ナカタニ（Ｎａｋａｔａｎｉ）、Ｓ．ウメハラ（Ｕ
ｍｅｈａｒａ）、Ｋ．シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）、Ｋ．
ミノダ（Ｍｉｎｏｄａ）、Ｙ．およびヤマダ（Ｙａｍａ
ｄａ）、Ｋ．の“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓ
ｉｏｎ ｏｆＰｅｔｒｏｓｕｌｆｅｒ Ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉ
ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ”、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌｏ
ｇ．Ｃｈｅｍ．，３４，１３２０−１３２４（１９７
０）により最初確立された、ＤＢＴの微生物による分解
経路に従ったＣ−Ｃ結合の切断によるものであった。含
硫黄有機炭素質物質のＣ−Ｃ結合切断による微生物的分
解は、その炭素質燃料のカロリー値の大部分を失ってし
まう。コダマら（上記）の経路によれば、ＤＢＴのＣ−
Ｃ結合切断による微生物的分解の含硫黄最終産物は、３
−ヒドロキシベンゾチオフェン スルフォキシド、２−
ホルミルベンゾチオフェン、またはベンゾチオフェンで
ある。従って、ＤＢＴから炭素を除くことなくこの分子
から硫黄を除くという微生物的分解経路（これにより、
炭素分解経路による場合よりも多くの燃料カロリー値が
残る）が望ましい。有機基質の硫黄特異的代謝は、含硫
黄有機分子の炭素−硫黄結合の切断を必要とする。ジベ
ンゾチオフェンの硫黄特異的代謝の場合、最終有機産物
は２−ヒドロキシビフェニルである。このＣ−Ｓ切断経
路は、ジベンゾチオフェン→ジベンゾチオフェン スル
フォキシド→ジベンゾチオフェン スルフォン→スルフ
ォン酸ジベンゾチオフェン→２−ヒドロキシビフェニル
に従って進行することができる。このＣ−Ｓ切断経路の
モノヒドロキシ産物は、有意な量のビヒドロキシビフェ
ニルを生ずる経路から本経路を区別する。
が有機的に結合した硫黄の約３．５重量％に達すると、
環境に有害な影響をもたらすことからこのような物質の
相当量の利用が妨げられていた。ジベンゾチオフェン
（ＤＢＴ）は、有機硫黄が石炭や石油などの天然にある
有機炭素質燃料に存在する形を代表するものと、多くの
者が考えている有機硫黄化合物であり、有機硫黄化合物
の微生物による代謝が集中する化合物である。ＤＢＴの
微生物による分解経路は、コダマ（Ｋｏｄａｍａ）、
Ｋ．ナカタニ（Ｎａｋａｔａｎｉ）、Ｓ．ウメハラ（Ｕ
ｍｅｈａｒａ）、Ｋ．シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）、Ｋ．
ミノダ（Ｍｉｎｏｄａ）、Ｙ．およびヤマダ（Ｙａｍａ
ｄａ）、Ｋ．の“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓ
ｉｏｎ ｏｆＰｅｔｒｏｓｕｌｆｅｒ Ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉ
ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ”、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌｏ
ｇ．Ｃｈｅｍ．，３４，１３２０−１３２４（１９７
０）により最初確立された、ＤＢＴの微生物による分解
経路に従ったＣ−Ｃ結合の切断によるものであった。含
硫黄有機炭素質物質のＣ−Ｃ結合切断による微生物的分
解は、その炭素質燃料のカロリー値の大部分を失ってし
まう。コダマら（上記）の経路によれば、ＤＢＴのＣ−
Ｃ結合切断による微生物的分解の含硫黄最終産物は、３
−ヒドロキシベンゾチオフェン スルフォキシド、２−
ホルミルベンゾチオフェン、またはベンゾチオフェンで
ある。従って、ＤＢＴから炭素を除くことなくこの分子
から硫黄を除くという微生物的分解経路（これにより、
炭素分解経路による場合よりも多くの燃料カロリー値が
残る）が望ましい。有機基質の硫黄特異的代謝は、含硫
黄有機分子の炭素−硫黄結合の切断を必要とする。ジベ
ンゾチオフェンの硫黄特異的代謝の場合、最終有機産物
は２−ヒドロキシビフェニルである。このＣ−Ｓ切断経
路は、ジベンゾチオフェン→ジベンゾチオフェン スル
フォキシド→ジベンゾチオフェン スルフォン→スルフ
ォン酸ジベンゾチオフェン→２−ヒドロキシビフェニル
に従って進行することができる。このＣ−Ｓ切断経路の
モノヒドロキシ産物は、有意な量のビヒドロキシビフェ
ニルを生ずる経路から本経路を区別する。
【０００３】本発明の発明者の知る、Ｃ−Ｓ切断による
ＤＢＴ分解を行う能力があるとされている古くからの唯
一の微生物は、プシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）種で、イスビスター（Ｉｓｂｉｓｔｅｒ），Ｊ．
Ｄ．とコビリンスキー（Ｋｏｂｙｌｉｎｓｋｉ），Ｅ．
Ａ．の“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏａｌ ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇ
ｈ Ｓｕｌｆｕｒ Ｃｏａｌｓ、“ＣｏａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、
Ｎｏ．９、６２７、アッティア（Ａｔｔｉａ），Ｙ．
Ａ．編集のアムステルダム：エルスフィアー（１９８
５）、および米国特許第４，５６２，１５６号明細書に
述べられているプシュードモナスＡＴＣＣ３９３８１で
ある。保管されているＡＴＣＣ３９３８１培養液はＣ−
Ｓ切断性を有しておらず、培養液の保管者によれば、保
管中の培養液が置き代わっているはずがなく、彼らの知
る限りではＣ−Ｓ切断性を持つような培養液は存在しな
いとのことであった（第４回エネルギー調製、利用およ
び環境制御の契約者会議（４ｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ ＥｎｅｒｇｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｕｔ
ｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒｓ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ）、アメリカ エネルギー省、ピッツ
バーグ エネルギー技術センター、アメリカ、ペンシル
バニア州１５２３６、ピッツバーグ、１９８８）。硫黄
を制限された条件下で培養して得た混合培養液は、ＤＢ
Ｔから硫黄を代謝的に選択除去することができた［キル
ベーン（Ｋｉｌｂａｎｅ）、ジョン（Ｊｏｈｎ），Ｊ．
の“Ｓｕｌｆｕｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，”Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ｏｆ Ｃｏａｌｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，バージニア州、
タイソンズ コーナー（Ｔｙｓｏｎｓ Ｃｏｒｎｅ
ｒ）、１９８８年、８月１６−１８）。
ＤＢＴ分解を行う能力があるとされている古くからの唯
一の微生物は、プシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）種で、イスビスター（Ｉｓｂｉｓｔｅｒ），Ｊ．
Ｄ．とコビリンスキー（Ｋｏｂｙｌｉｎｓｋｉ），Ｅ．
Ａ．の“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏａｌ ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇ
ｈ Ｓｕｌｆｕｒ Ｃｏａｌｓ、“ＣｏａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、
Ｎｏ．９、６２７、アッティア（Ａｔｔｉａ），Ｙ．
Ａ．編集のアムステルダム：エルスフィアー（１９８
５）、および米国特許第４，５６２，１５６号明細書に
述べられているプシュードモナスＡＴＣＣ３９３８１で
ある。保管されているＡＴＣＣ３９３８１培養液はＣ−
Ｓ切断性を有しておらず、培養液の保管者によれば、保
管中の培養液が置き代わっているはずがなく、彼らの知
る限りではＣ−Ｓ切断性を持つような培養液は存在しな
いとのことであった（第４回エネルギー調製、利用およ
び環境制御の契約者会議（４ｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ ＥｎｅｒｇｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｕｔ
ｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒｓ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ）、アメリカ エネルギー省、ピッツ
バーグ エネルギー技術センター、アメリカ、ペンシル
バニア州１５２３６、ピッツバーグ、１９８８）。硫黄
を制限された条件下で培養して得た混合培養液は、ＤＢ
Ｔから硫黄を代謝的に選択除去することができた［キル
ベーン（Ｋｉｌｂａｎｅ）、ジョン（Ｊｏｈｎ），Ｊ．
の“Ｓｕｌｆｕｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，”Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ｏｆ Ｃｏａｌｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，バージニア州、
タイソンズ コーナー（Ｔｙｓｏｎｓ Ｃｏｒｎｅ
ｒ）、１９８８年、８月１６−１８）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかして、石炭や石油
などの炭素質燃料中の含硫黄有機質物質から炭素を除く
ことなくその有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断して硫黄を
除く効率的な微生物的分解法の開発が望まれる。
などの炭素質燃料中の含硫黄有機質物質から炭素を除く
ことなくその有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断して硫黄を
除く効率的な微生物的分解法の開発が望まれる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、もともと結合
状態にあった硫黄の選択的除去、有機合成、およびディ
フェンシンなどのＣ−Ｓ結合を持つ有機物質の生化学的
不活化および修飾において、増殖条件下にある微生物、
その派生物、その膜断片と膜結合酵素または有機炭素質
物質のＣ−Ｓ結合の特異的切断が可能な酵素を、硫黄特
異的な反応試薬として利用している。本発明の方法は、
Ｃ−Ｓ結合による架橋をもつ含硫黄有機物質を、Ｃ−Ｓ
結合を選択的に切断し得る硫黄特異的反応物の少なくと
も１つと接触させることを含む。Ｃ−Ｓ結合の選択的切
断性を持つ、ロドコッカス ロドクロウス（特にロドコ
ッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８）
およびバシルス スフェリクス（特にバシルス スフェ
リクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９）なる微生物とそ
の派生物、膜エキストラクトおよび膜結合酵素が適して
いる。ロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー
５３９６８およびバシルス スフェリクス株ＡＴＣＣナ
ンバー５３９６９の各々の微生物の培養液は、ブタペス
ト協定に基づき、アメリカン タイプ カルチャー コ
レクション、１２３０１ パーク ローン ドライブ
（Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ）、メリーランド
州、ロックヴィレ、アメリカ２０８５２のもとに保管さ
れ、上に示されたＡＴＣＣナンバーを付けられている。
状態にあった硫黄の選択的除去、有機合成、およびディ
フェンシンなどのＣ−Ｓ結合を持つ有機物質の生化学的
不活化および修飾において、増殖条件下にある微生物、
その派生物、その膜断片と膜結合酵素または有機炭素質
物質のＣ−Ｓ結合の特異的切断が可能な酵素を、硫黄特
異的な反応試薬として利用している。本発明の方法は、
Ｃ−Ｓ結合による架橋をもつ含硫黄有機物質を、Ｃ−Ｓ
結合を選択的に切断し得る硫黄特異的反応物の少なくと
も１つと接触させることを含む。Ｃ−Ｓ結合の選択的切
断性を持つ、ロドコッカス ロドクロウス（特にロドコ
ッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８）
およびバシルス スフェリクス（特にバシルス スフェ
リクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９）なる微生物とそ
の派生物、膜エキストラクトおよび膜結合酵素が適して
いる。ロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナンバー
５３９６８およびバシルス スフェリクス株ＡＴＣＣナ
ンバー５３９６９の各々の微生物の培養液は、ブタペス
ト協定に基づき、アメリカン タイプ カルチャー コ
レクション、１２３０１ パーク ローン ドライブ
（Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ）、メリーランド
州、ロックヴィレ、アメリカ２０８５２のもとに保管さ
れ、上に示されたＡＴＣＣナンバーを付けられている。
【０００６】ロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣＣナ
ンバー５３９６８およびバシルススフェリクス株ＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６９は、Ｃ−Ｓ結合を持つ本材料をも
つ場所からの混合細菌を増殖培地（無機栄養素、同化可
能な炭素源を含み、Ｃ−Ｓ結合の形でのみ硫黄を持つ化
合物以外は実質的に含硫黄化合物を含まない増殖培地）
に植えて調製することもできる。約２０℃から約３４℃
の温度で好気的条件下で、そして切断されて欲しい型の
Ｃ−Ｓ結合でのみ硫黄を持つ化合物以外は含硫黄化合物
が実質的に無い状態で、炭素質有機物質のＣ−Ｓ結合を
選択的に切断することにより硫黄代謝を行う性質を持つ
ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバー５３９６
８および／またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナン
バー５３９６９が選択的に産生されるのに十分な時間だ
け、本細菌培養液を増殖させる。バシルス スフェリク
スＡＴＣＣナンバー５３９６９の産生のために、ヘルパ
ー培養液を要して増殖に必要な栄養素を供給することも
できる。ヘルパー培養液はバシルス スフェリクスＡＴ
ＣＣナンバー５３９６９の要求栄養素を供給するが、有
機硫黄を代謝する能力は持たない。
ンバー５３９６８およびバシルススフェリクス株ＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６９は、Ｃ−Ｓ結合を持つ本材料をも
つ場所からの混合細菌を増殖培地（無機栄養素、同化可
能な炭素源を含み、Ｃ−Ｓ結合の形でのみ硫黄を持つ化
合物以外は実質的に含硫黄化合物を含まない増殖培地）
に植えて調製することもできる。約２０℃から約３４℃
の温度で好気的条件下で、そして切断されて欲しい型の
Ｃ−Ｓ結合でのみ硫黄を持つ化合物以外は含硫黄化合物
が実質的に無い状態で、炭素質有機物質のＣ−Ｓ結合を
選択的に切断することにより硫黄代謝を行う性質を持つ
ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバー５３９６
８および／またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナン
バー５３９６９が選択的に産生されるのに十分な時間だ
け、本細菌培養液を増殖させる。バシルス スフェリク
スＡＴＣＣナンバー５３９６９の産生のために、ヘルパ
ー培養液を要して増殖に必要な栄養素を供給することも
できる。ヘルパー培養液はバシルス スフェリクスＡＴ
ＣＣナンバー５３９６９の要求栄養素を供給するが、有
機硫黄を代謝する能力は持たない。
【０００７】含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量は、その
ような含硫黄炭素質有機物質をロドコッカス ロドクロ
ウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシルス ス
フェリクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９と接触させる
ことにより減らしてもよい。本方法は、含硫黄炭素質物
質が石炭または炭化水素石油である場合の利用に特に適
している。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバ
ー５３９６８またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナ
ンバー５３９６９の含硫黄石炭の存在下における連続的
増殖により、有機的に結合した硫黄の８０％以上、好適
には９０％以上が除去される。含硫黄炭素質有機物質の
硫黄含量を減らすこの方法は、微生物ロドコッカス ロ
ドクロウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシル
ス スフェリクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９による
有機Ｃ−Ｓ結合の切断により起こる。有機硫黄選択性の
変異微生物であるロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６８およびバシルス スフェリクス株
ＡＴＣＣナンバー５３９６９は、含硫黄炭素質有機物質
以外の含硫黄化合物を含まず、無機栄養素と同化可能な
炭素源からなる増殖培地において約２０から約３４℃で
好気的条件下で増殖させると、有機Ｃ−Ｓ結合の切断に
より含硫炭素質有機物質の硫黄含量を選択的に減少させ
る能力を持つ。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナ
ンバー５３９６８およびバシルス スフェリクスＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６９の派生微生物も、同様にして有機
Ｃ−Ｓ結合の切断により含硫黄炭素質有機物質の硫黄含
量を選択的に減少させる能力を持つ。
ような含硫黄炭素質有機物質をロドコッカス ロドクロ
ウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシルス ス
フェリクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９と接触させる
ことにより減らしてもよい。本方法は、含硫黄炭素質物
質が石炭または炭化水素石油である場合の利用に特に適
している。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバ
ー５３９６８またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナ
ンバー５３９６９の含硫黄石炭の存在下における連続的
増殖により、有機的に結合した硫黄の８０％以上、好適
には９０％以上が除去される。含硫黄炭素質有機物質の
硫黄含量を減らすこの方法は、微生物ロドコッカス ロ
ドクロウス株ＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシル
ス スフェリクス株ＡＴＣＣナンバー５３９６９による
有機Ｃ−Ｓ結合の切断により起こる。有機硫黄選択性の
変異微生物であるロドコッカス ロドクロウス株ＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６８およびバシルス スフェリクス株
ＡＴＣＣナンバー５３９６９は、含硫黄炭素質有機物質
以外の含硫黄化合物を含まず、無機栄養素と同化可能な
炭素源からなる増殖培地において約２０から約３４℃で
好気的条件下で増殖させると、有機Ｃ−Ｓ結合の切断に
より含硫炭素質有機物質の硫黄含量を選択的に減少させ
る能力を持つ。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナ
ンバー５３９６８およびバシルス スフェリクスＡＴＣ
Ｃナンバー５３９６９の派生微生物も、同様にして有機
Ｃ−Ｓ結合の切断により含硫黄炭素質有機物質の硫黄含
量を選択的に減少させる能力を持つ。
【０００８】細胞の膜断片を含むエキストラクトは上記
微生物から溶菌法によりライセートとして調製すること
ができる。細胞の膜断片を濃縮させるいづれの方法も、
Ｃ−Ｓ結合の選択的切断にあずかっている化学物質がそ
の産物中に保持されている限り、適当である。上記微生
物の膜に結合している酵素または酵素群は酵素抽出法に
より分離することができ、炭素質有機化合物のＣ−Ｓ結
合を切断することができる。この酵素または酵素群は抽
出された形で用いてもよいし、さらに精製して精製され
た形で用いてもよい。本明細書中および特許請求の範囲
を通じて使用されている“酵素”または“酵素群”とい
う用語は、抽出型または精製型における単一の酵素また
は複数の酵素による構成物を含むことを意図するもので
ある。有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能力を持つ、膜断片
を含むエキストラクトおよび／または膜に結合した酵素
または酵素群といった、これらの硫黄特異的な反応物質
の利用は、水性または非水性媒体と微生物の増殖に要さ
れる以上の温度を用いて、有機硫黄の選択的除去法の利
用を可能にする。
微生物から溶菌法によりライセートとして調製すること
ができる。細胞の膜断片を濃縮させるいづれの方法も、
Ｃ−Ｓ結合の選択的切断にあずかっている化学物質がそ
の産物中に保持されている限り、適当である。上記微生
物の膜に結合している酵素または酵素群は酵素抽出法に
より分離することができ、炭素質有機化合物のＣ−Ｓ結
合を切断することができる。この酵素または酵素群は抽
出された形で用いてもよいし、さらに精製して精製され
た形で用いてもよい。本明細書中および特許請求の範囲
を通じて使用されている“酵素”または“酵素群”とい
う用語は、抽出型または精製型における単一の酵素また
は複数の酵素による構成物を含むことを意図するもので
ある。有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能力を持つ、膜断片
を含むエキストラクトおよび／または膜に結合した酵素
または酵素群といった、これらの硫黄特異的な反応物質
の利用は、水性または非水性媒体と微生物の増殖に要さ
れる以上の温度を用いて、有機硫黄の選択的除去法の利
用を可能にする。
【０００９】本発明によれば、膜断片を含むエキストラ
クトおよび／または膜に結合した酵素または酵素群から
選択され、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断特性を持つ、硫
黄特異的な反応試薬は、石油などの有機硫黄を含む炭素
質有機液体と直接混合してもよいし、あるいは有機硫黄
を含む炭素質有機固形物を接触させるための有機液体と
混合してもよい。本明細書中および特許請求の範囲を通
じて使用されている“接触させる”という用語は、エマ
ルジョン、ミクロエマルジョン、不動化されたエキスト
ラクト／酵素の標品、膜リアクター、撹拌、ソニケーシ
ョンなどを利用するなどして、硫黄特異的な反応試薬と
含硫黄有機化合物との接触を促進させるいづれの手段も
含むことを意図している。有機液体における硫黄特異的
反応試薬の利用により、水性培地中の微生物を有機硫黄
の除去に適用する場合に生じる、水／油の境界障壁が避
けられる。硫黄特異的反応試薬は、必要ならば水性媒体
において使用してもよい。高い触媒速度、広範な基質利
用性、および水性媒体の使用と比較して高い安定性を得
ることができることから、非水性の液体の使用が好適で
ある。微生物増殖を硫黄除去に適用するときの許容温度
よりも高い温度で本発明の硫黄除去法を操作すると、よ
り高い有機硫黄の除去速度が達成される。さらに、単一
または連続的な非水性媒体法において有機硫黄及び無機
硫黄を解放し、除去することも可能である。
クトおよび／または膜に結合した酵素または酵素群から
選択され、有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断特性を持つ、硫
黄特異的な反応試薬は、石油などの有機硫黄を含む炭素
質有機液体と直接混合してもよいし、あるいは有機硫黄
を含む炭素質有機固形物を接触させるための有機液体と
混合してもよい。本明細書中および特許請求の範囲を通
じて使用されている“接触させる”という用語は、エマ
ルジョン、ミクロエマルジョン、不動化されたエキスト
ラクト／酵素の標品、膜リアクター、撹拌、ソニケーシ
ョンなどを利用するなどして、硫黄特異的な反応試薬と
含硫黄有機化合物との接触を促進させるいづれの手段も
含むことを意図している。有機液体における硫黄特異的
反応試薬の利用により、水性培地中の微生物を有機硫黄
の除去に適用する場合に生じる、水／油の境界障壁が避
けられる。硫黄特異的反応試薬は、必要ならば水性媒体
において使用してもよい。高い触媒速度、広範な基質利
用性、および水性媒体の使用と比較して高い安定性を得
ることができることから、非水性の液体の使用が好適で
ある。微生物増殖を硫黄除去に適用するときの許容温度
よりも高い温度で本発明の硫黄除去法を操作すると、よ
り高い有機硫黄の除去速度が達成される。さらに、単一
または連続的な非水性媒体法において有機硫黄及び無機
硫黄を解放し、除去することも可能である。
【００１０】含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量は、ロド
コッカス ロドクロウスおよびバシルス スフェリクス
などの、Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断することのできる微
生物（ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバー５
３９６８またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナンバ
ー５３９６９およびその派生物が最も好適である）の膜
由来のまたは膜に結合した硫黄特異的反応試薬と、その
ような含硫黄炭素質有機物質を接触させることにより減
少させることも可能である。本方法は、含硫黄炭素質物
質が石炭または炭化水素石油である場合の利用に特に適
している。そのような方法では、８０％以上の、好適に
は９０％以上の有機的に結合した硫黄を除去することが
可能である。含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量を減少さ
せる方法は、有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を
持つ微生物、即ちロドコッカスロドクロウスおよびバシ
ルス スフェリクス、特に微生物、ロドコッカス ロド
クロウスＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシルス
スフェリクスＡＴＣＣナンバー５３９６９およびその派
生物から得られるような、上記のような性質を持つ膜に
由来するか、または結合した硫黄特異的反応物による有
機Ｃ−Ｓ結合の切断によって起こる。これらの硫黄特異
的反応物は、有機Ｃ−Ｓ結合の切断により含硫炭素質有
機物質の硫黄含量を減少させ、ジベンゾチオフェンから
のモノヒドロキシビフェニルといった主要な最終有機産
物を生じさせる。派生微生物、特にロドコッカス ロド
クロウスＡＴＣＣナンバー５３９６８およびバシルス
スフェリクスＡＴＣＣナンバー５３９６９の膜断片およ
び／または膜に結合した酵素または酵素群を含むエキス
トラクトは、上記と同様にして有機Ｃ−Ｓ結合を切断す
ることにより含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量を選択的
に減少させる能力を示すことが既に示されており、本明
細書中および特許請求の範囲において、“硫黄特異的反
応物”という用語が用いられる場合にはこれも含まれる
とみなされる。
コッカス ロドクロウスおよびバシルス スフェリクス
などの、Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断することのできる微
生物（ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣナンバー５
３９６８またはバシルス スフェリクスＡＴＣＣナンバ
ー５３９６９およびその派生物が最も好適である）の膜
由来のまたは膜に結合した硫黄特異的反応試薬と、その
ような含硫黄炭素質有機物質を接触させることにより減
少させることも可能である。本方法は、含硫黄炭素質物
質が石炭または炭化水素石油である場合の利用に特に適
している。そのような方法では、８０％以上の、好適に
は９０％以上の有機的に結合した硫黄を除去することが
可能である。含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量を減少さ
せる方法は、有機Ｃ−Ｓ結合を選択的に切断する能力を
持つ微生物、即ちロドコッカスロドクロウスおよびバシ
ルス スフェリクス、特に微生物、ロドコッカス ロド
クロウスＡＴＣＣナンバー５３９６８またはバシルス
スフェリクスＡＴＣＣナンバー５３９６９およびその派
生物から得られるような、上記のような性質を持つ膜に
由来するか、または結合した硫黄特異的反応物による有
機Ｃ−Ｓ結合の切断によって起こる。これらの硫黄特異
的反応物は、有機Ｃ−Ｓ結合の切断により含硫炭素質有
機物質の硫黄含量を減少させ、ジベンゾチオフェンから
のモノヒドロキシビフェニルといった主要な最終有機産
物を生じさせる。派生微生物、特にロドコッカス ロド
クロウスＡＴＣＣナンバー５３９６８およびバシルス
スフェリクスＡＴＣＣナンバー５３９６９の膜断片およ
び／または膜に結合した酵素または酵素群を含むエキス
トラクトは、上記と同様にして有機Ｃ−Ｓ結合を切断す
ることにより含硫黄炭素質有機物質の硫黄含量を選択的
に減少させる能力を示すことが既に示されており、本明
細書中および特許請求の範囲において、“硫黄特異的反
応物”という用語が用いられる場合にはこれも含まれる
とみなされる。
【００１１】石炭などの非常に小さな孔サイズを持つ有
機炭素質物質の硫黄含量を選択的に減少させることが求
められている場合、インタクトな細菌の細胞と比較し
て、より小さいサイズの酵素群または膜断片は細菌には
利用不可能な孔に近づくことができ、活性物質とのより
効果的な接触をもたらし、接近可能な表面積を増加させ
る効果をもつことから、硫黄特異的な反応物の酵素群ま
たは膜断片を利用することが望ましい。
機炭素質物質の硫黄含量を選択的に減少させることが求
められている場合、インタクトな細菌の細胞と比較し
て、より小さいサイズの酵素群または膜断片は細菌には
利用不可能な孔に近づくことができ、活性物質とのより
効果的な接触をもたらし、接近可能な表面積を増加させ
る効果をもつことから、硫黄特異的な反応物の酵素群ま
たは膜断片を利用することが望ましい。
【００１２】炭素源として酢酸、ベンゼン、安息香酸、
エタノール、グルコース、グリセロール、栄養ブロー
ス、コハク酸およびトルエンを用い、ベンゾチオフェ
ン、ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、チオフェン、トリ
チエンなどの有機硫黄化合物を含む富栄養培養液（ｅｎ
ｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）と同様に有機硫
黄化合物に晒した経過が知られている環境培養液（ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）は、用いた
各々の有機硫黄化合物を代謝し得る細菌培養液を産生し
た。試験した環境からの分離体および富栄養培養液の全
てが、硫黄の唯一の栄養源としてチオフェンを添加した
混合培養液（その産物の約２０％が炭素−硫黄結合の切
断が可能であり、残りの８０％が炭素−炭素結合切断の
結果であることが示された）を除き、炭素−炭素結合で
生分解を開始することにより有機硫黄化合物を代謝する
ことが見いだされた。有機硫黄化合物からの硫黄の利用
に関して最も成功している微生物は、唯一の硫黄源とし
てＤＢＴを用いた富栄養培地から分離されたプシュード
モナスであった。このプシュードモナス種は、有機的に
結合した硫黄を利用できるが、炭素−硫黄結合の酸化に
ついては選択性および特異性を示さなかった。従って、
そのような選択的硫黄代謝を持つ微生物の開発には、選
択的な変異過程を利用しなければならない。
エタノール、グルコース、グリセロール、栄養ブロー
ス、コハク酸およびトルエンを用い、ベンゾチオフェ
ン、ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、チオフェン、トリ
チエンなどの有機硫黄化合物を含む富栄養培養液（ｅｎ
ｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）と同様に有機硫
黄化合物に晒した経過が知られている環境培養液（ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）は、用いた
各々の有機硫黄化合物を代謝し得る細菌培養液を産生し
た。試験した環境からの分離体および富栄養培養液の全
てが、硫黄の唯一の栄養源としてチオフェンを添加した
混合培養液（その産物の約２０％が炭素−硫黄結合の切
断が可能であり、残りの８０％が炭素−炭素結合切断の
結果であることが示された）を除き、炭素−炭素結合で
生分解を開始することにより有機硫黄化合物を代謝する
ことが見いだされた。有機硫黄化合物からの硫黄の利用
に関して最も成功している微生物は、唯一の硫黄源とし
てＤＢＴを用いた富栄養培地から分離されたプシュード
モナスであった。このプシュードモナス種は、有機的に
結合した硫黄を利用できるが、炭素−硫黄結合の酸化に
ついては選択性および特異性を示さなかった。従って、
そのような選択的硫黄代謝を持つ微生物の開発には、選
択的な変異過程を利用しなければならない。
【００１３】有機基質に関して硫黄特異的な代謝能力を
持つ微生物を、生組織に通常は見られない栄養素や有機
的に結合した硫黄が硫酸塩、ビタミン、アミノ酸などと
いった他の利用可能な硫黄を含まないで供給され得る、
連続的な培養液−石炭バイオリアクター／セレクトスタ
ット（ｓｅｌｅｃｔｏｓｔａｔ）を通じた選択により開
発した。この増殖培地は微生物の良好な増殖のための有
機及び無機栄養素を供給するが、変異微生物に代謝され
て欲しい含硫黄有機物以外の無機および有機含硫黄化合
物を持たないものがよい。有機硫黄条件下での微生物の
増殖に適した培地は、滅菌済み脱イオン水１リットルあ
たり４グラムのＫ2ＨＰＯ4、４グラムのＮａ2ＨＰＯ4、
２グラムのＮＨ4Ｃｌ、０．２グラムのＭｇＣｌ2・６Ｈ
2Ｏ、０．００１グラムのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏおよび
０．００１グラムのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを含むような無
機栄養素の構成物が適当なものであってもよい。硫黄を
含まない同化可能な炭素源はいづれも、求められる微生
物繁殖を支持する量だけ使用することができる。同化可
能な炭素源として適当なものには、２０ｍＭの濃度のグ
ルコース、グリセロール、酢酸ナトリウム、安息香酸ナ
トリウム、コハク酸ナトリウムおよびショ糖が含まれて
おり、ベンゼン、エタノール、イソブタノールおよびト
ルエンは、細菌増殖のバイオリアクターの頭部スペース
において蒸気として利用することができる。有機Ｃ−Ｓ
結合を持つ有機硫黄化合物は、ベンゾチオフェン、ベン
ジルジスルフィド、ジベンゾチオフェン、ジベンゾチフ
ェンスルフォン、フェニルジスルフィド、チアントレ
ン、チオキサンテン［アルドリッチケミカル社（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ウィ
スコンシン州、ミルウォーキー、ＵＳＡ］、ジンベンゾ
チフェン スルフォキシド［ＩＣＮ バイオメディカル
ズ社（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｓ、
ニュージャージー州、プレーンビュー、ＵＳＡ］および
トリチアン［フェアフィールドケミカル社（Ｆａｉｒｆ
ｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ ２０、サウスカロライナ州、クリースウッ
ド、ＵＳＡ］を含めたものが適しており、約２０ｍＭの
オーダーで微生物の増殖を補助する範囲の濃度で用いる
ことができ、チオフェン（アルドリッチケミカル社）は
蒸気として用いることができる。１リットルあたり１５
ｇの寒天［ディフコ ラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州、デトロイ
ト、ＵＳＡ］で固めた栄養ブロース（ディフコ）または
上記増殖培地を、細菌培養液を引いたりまいたりするた
めに用いてもよい。細菌の増殖は、クレット−ソマーソ
ン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｏｍｍｅｒｓｏｎ）カロリーメータ
ーを用いて濁度を見たり、適当な寒天上でコロニー形成
単位を計数したりしてモニターする事もできる。
持つ微生物を、生組織に通常は見られない栄養素や有機
的に結合した硫黄が硫酸塩、ビタミン、アミノ酸などと
いった他の利用可能な硫黄を含まないで供給され得る、
連続的な培養液−石炭バイオリアクター／セレクトスタ
ット（ｓｅｌｅｃｔｏｓｔａｔ）を通じた選択により開
発した。この増殖培地は微生物の良好な増殖のための有
機及び無機栄養素を供給するが、変異微生物に代謝され
て欲しい含硫黄有機物以外の無機および有機含硫黄化合
物を持たないものがよい。有機硫黄条件下での微生物の
増殖に適した培地は、滅菌済み脱イオン水１リットルあ
たり４グラムのＫ2ＨＰＯ4、４グラムのＮａ2ＨＰＯ4、
２グラムのＮＨ4Ｃｌ、０．２グラムのＭｇＣｌ2・６Ｈ
2Ｏ、０．００１グラムのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏおよび
０．００１グラムのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを含むような無
機栄養素の構成物が適当なものであってもよい。硫黄を
含まない同化可能な炭素源はいづれも、求められる微生
物繁殖を支持する量だけ使用することができる。同化可
能な炭素源として適当なものには、２０ｍＭの濃度のグ
ルコース、グリセロール、酢酸ナトリウム、安息香酸ナ
トリウム、コハク酸ナトリウムおよびショ糖が含まれて
おり、ベンゼン、エタノール、イソブタノールおよびト
ルエンは、細菌増殖のバイオリアクターの頭部スペース
において蒸気として利用することができる。有機Ｃ−Ｓ
結合を持つ有機硫黄化合物は、ベンゾチオフェン、ベン
ジルジスルフィド、ジベンゾチオフェン、ジベンゾチフ
ェンスルフォン、フェニルジスルフィド、チアントレ
ン、チオキサンテン［アルドリッチケミカル社（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ウィ
スコンシン州、ミルウォーキー、ＵＳＡ］、ジンベンゾ
チフェン スルフォキシド［ＩＣＮ バイオメディカル
ズ社（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｓ、
ニュージャージー州、プレーンビュー、ＵＳＡ］および
トリチアン［フェアフィールドケミカル社（Ｆａｉｒｆ
ｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ ２０、サウスカロライナ州、クリースウッ
ド、ＵＳＡ］を含めたものが適しており、約２０ｍＭの
オーダーで微生物の増殖を補助する範囲の濃度で用いる
ことができ、チオフェン（アルドリッチケミカル社）は
蒸気として用いることができる。１リットルあたり１５
ｇの寒天［ディフコ ラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州、デトロイ
ト、ＵＳＡ］で固めた栄養ブロース（ディフコ）または
上記増殖培地を、細菌培養液を引いたりまいたりするた
めに用いてもよい。細菌の増殖は、クレット−ソマーソ
ン（Ｋｌｅｔｔ−Ｓｏｍｍｅｒｓｏｎ）カロリーメータ
ーを用いて濁度を見たり、適当な寒天上でコロニー形成
単位を計数したりしてモニターする事もできる。
【００１４】接種液は、石炭保管庫および石油精製所か
ら得られた５グラムの試料を１０ｍｌの上記増殖培地に
加え、６０秒間ボルテックスミキサーにかけ、３０分間
静置することによって調製することができる。上澄をパ
スツールピペットを用いて取り、そのまま使用するか、
もしくは等量の栄養ブロースで希釈して、約２４から４
８時間室温でインキュベートし、バイオリアクターへの
接種に用いることができる。
ら得られた５グラムの試料を１０ｍｌの上記増殖培地に
加え、６０秒間ボルテックスミキサーにかけ、３０分間
静置することによって調製することができる。上澄をパ
スツールピペットを用いて取り、そのまま使用するか、
もしくは等量の栄養ブロースで希釈して、約２４から４
８時間室温でインキュベートし、バイオリアクターへの
接種に用いることができる。
【００１５】バイオリアクター／セレクトスタットは、
石炭または有機硫黄固形物を残したままで、液体栄養素
の連続的な流れを提供するよう特別な設計を施した。同
じバッチの石炭または有機硫黄化合物は操作の間バイオ
リアクター内に保持され、一方水相である培地はバイオ
リアクターに常に供給され得る。長時間にわたる石炭の
バイオリアクター内での保持は、比較的大きな粒の（典
型的には−９＋１２メッシュ）石炭を用い、いくつかの
堰／バッフルを含む傾斜した非混合沈降管（ここからバ
イオリアクターの流出液が比較的遅い流速で出され得
る）を利用することにより達成することができる。流出
液の流出速度は、本微生物が硫黄律速誘発に応答する能
力に従って調整してもよい。典型的には、水圧保持時間
が７２時間のオーダーであることができる。
石炭または有機硫黄固形物を残したままで、液体栄養素
の連続的な流れを提供するよう特別な設計を施した。同
じバッチの石炭または有機硫黄化合物は操作の間バイオ
リアクター内に保持され、一方水相である培地はバイオ
リアクターに常に供給され得る。長時間にわたる石炭の
バイオリアクター内での保持は、比較的大きな粒の（典
型的には−９＋１２メッシュ）石炭を用い、いくつかの
堰／バッフルを含む傾斜した非混合沈降管（ここからバ
イオリアクターの流出液が比較的遅い流速で出され得
る）を利用することにより達成することができる。流出
液の流出速度は、本微生物が硫黄律速誘発に応答する能
力に従って調整してもよい。典型的には、水圧保持時間
が７２時間のオーダーであることができる。
【００１６】セレクトスタットをモニターすることによ
り、適当な炭素源供給速度を決定し、流出液中の生物学
的に利用可能な硫黄の存在を調べることも可能である。
これは、フレッシュなバイオリアクター流出液を遠心処
理して有機硫黄基質の石炭粉末および粒子と細菌を除
き、その上澄を細菌増殖試験に用いることにより、行う
ことができる。４つの培養液を調整する：上澄；１５ｍ
ＭのＳＯ4を含む上澄；２０ｍＭの炭素源を含む上澄；
および１５ｍＭのＳＯ4と２０ｍＭの炭素源を含む上
澄。各々に１０５微生物／ｍｌで微生物培養液を接種
し、試験する微生物についての増殖温度で振とうしなが
ら２〜５日間インキュベートした。細菌増殖は濁度で、
またはコロニー形成単位の決定によりモニターした。炭
素源試料により、流出液上澄中の生物学的に利用可能な
硫黄の存在が示され、一方、添加された硫黄を含む試料
により、流出液上澄中の炭素源の存在が示される。そし
て炭素および添加硫黄の両方を含む試料により流出液上
澄中の阻害基質の存在が示される。
り、適当な炭素源供給速度を決定し、流出液中の生物学
的に利用可能な硫黄の存在を調べることも可能である。
これは、フレッシュなバイオリアクター流出液を遠心処
理して有機硫黄基質の石炭粉末および粒子と細菌を除
き、その上澄を細菌増殖試験に用いることにより、行う
ことができる。４つの培養液を調整する：上澄；１５ｍ
ＭのＳＯ4を含む上澄；２０ｍＭの炭素源を含む上澄；
および１５ｍＭのＳＯ4と２０ｍＭの炭素源を含む上
澄。各々に１０５微生物／ｍｌで微生物培養液を接種
し、試験する微生物についての増殖温度で振とうしなが
ら２〜５日間インキュベートした。細菌増殖は濁度で、
またはコロニー形成単位の決定によりモニターした。炭
素源試料により、流出液上澄中の生物学的に利用可能な
硫黄の存在が示され、一方、添加された硫黄を含む試料
により、流出液上澄中の炭素源の存在が示される。そし
て炭素および添加硫黄の両方を含む試料により流出液上
澄中の阻害基質の存在が示される。
【００１７】細菌が増殖のために有機硫黄化合物を利用
する能力は、硫黄生物活用能力分析（Ｓｕｌｆｕｒ Ｂ
ｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）により測
定することができる。この分析法は全生物が増殖のため
にいくらかの硫黄を必要とし、従って、細菌増殖の定量
により有機、無機を問わず硫黄源となる化合物の利用の
尺度が提供されるという状況を作り出すことが可能であ
る、という事実に基づいている。実施に当たっては、２
０ｍＭで炭素源を含む増殖培地を、無添加、２０ｍＭの
Ｎａ2ＳＯ4を添加、および２０ｍＭの有機硫黄化合物ま
たは無機硫黄化合物を添加して使用する。次に、この３
つの条件の各々に１０５微生物／ｍｌで微生物培養液を
接種し、試験する微生物に適した温度で振とうしながら
２〜５日間インキュベートする。細菌の増殖は濁度で、
またはコロニー形成単位の決定によりモニターする。無
添加試料はネガティブコントロールとして用い、一方硫
黄を添加した試料はポジティブコントロールとして用い
る。そして、両コントロールを用いて、細菌増殖が試験
有機硫黄化合物から得られる硫黄を消費して起こってい
るものかを調べる。
する能力は、硫黄生物活用能力分析（Ｓｕｌｆｕｒ Ｂ
ｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）により測
定することができる。この分析法は全生物が増殖のため
にいくらかの硫黄を必要とし、従って、細菌増殖の定量
により有機、無機を問わず硫黄源となる化合物の利用の
尺度が提供されるという状況を作り出すことが可能であ
る、という事実に基づいている。実施に当たっては、２
０ｍＭで炭素源を含む増殖培地を、無添加、２０ｍＭの
Ｎａ2ＳＯ4を添加、および２０ｍＭの有機硫黄化合物ま
たは無機硫黄化合物を添加して使用する。次に、この３
つの条件の各々に１０５微生物／ｍｌで微生物培養液を
接種し、試験する微生物に適した温度で振とうしながら
２〜５日間インキュベートする。細菌の増殖は濁度で、
またはコロニー形成単位の決定によりモニターする。無
添加試料はネガティブコントロールとして用い、一方硫
黄を添加した試料はポジティブコントロールとして用い
る。そして、両コントロールを用いて、細菌増殖が試験
有機硫黄化合物から得られる硫黄を消費して起こってい
るものかを調べる。
【００１８】選択的有機硫黄特異的な培養液の開発は、
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）または紫外線照射にさらすことによって突然変異
を導入することにより速めることができる。ＮＴＧによ
る変異導入は細菌の溶液を寒天プレート上にまき、その
プレートの中央にＮＴＧの結晶を置くことによって行う
こともできる。インキュベーションの間、このＮＴＧ結
晶は寒天に溶けていき、拡散濃度勾配を形成する。これ
により、中央では細菌の増殖は行われず、プレートの外
側の周縁部では正常な増殖が行われる。この両極端の間
には、中間的な増殖が行われる狭いゾーンが容易に観察
され、このゾーンから変異を持った細菌が得られる。Ｕ
Ｖで変異導入した細菌は、遠心操作により液体培養液か
ら落としてきて、上記増殖培地で洗い、一倍量の上記培
地に再懸濁してもよい。その一部（３ｍｌずつ）を開放
ペトリ皿に置いていき、２ログを殺し得るのに十分な線
量（典型的には１０Ｊ／ｍ２）のＵＶにさらしてよい。
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）または紫外線照射にさらすことによって突然変異
を導入することにより速めることができる。ＮＴＧによ
る変異導入は細菌の溶液を寒天プレート上にまき、その
プレートの中央にＮＴＧの結晶を置くことによって行う
こともできる。インキュベーションの間、このＮＴＧ結
晶は寒天に溶けていき、拡散濃度勾配を形成する。これ
により、中央では細菌の増殖は行われず、プレートの外
側の周縁部では正常な増殖が行われる。この両極端の間
には、中間的な増殖が行われる狭いゾーンが容易に観察
され、このゾーンから変異を持った細菌が得られる。Ｕ
Ｖで変異導入した細菌は、遠心操作により液体培養液か
ら落としてきて、上記増殖培地で洗い、一倍量の上記培
地に再懸濁してもよい。その一部（３ｍｌずつ）を開放
ペトリ皿に置いていき、２ログを殺し得るのに十分な線
量（典型的には１０Ｊ／ｍ２）のＵＶにさらしてよい。
【００１９】数カ月の操作の後に選択器から得られた混
合された細菌の培養物は上述された硫黄生物活用能分析
で決定されたように、硫黄の唯一の供給源としてある範
囲の有機硫黄化合物を利用できることが示されていた。
この混合培養物によるジベンゾチオフェンにおける特異
的なＣ−Ｓ結合の切断は、ガスクロマトグラフィー／質
量分光分析によって示されていた。標準的な微生物学的
技術が、混合培養物中に存在する各細菌型の典型的な培
養物の純粋なものを得るために用いられた。各純粋培養
物は個別に、硫黄生物活用能分析によって、硫黄の唯一
の供給源として有機硫黄を利用できる能力に関してテス
トされた。硫黄の唯一の供給源として有機硫黄化合物を
利用する能力を示した、単離された培養物は、ロドコッ
カス ロドクロウスおよびバシルス スフェリクスとし
て同定された有機硫黄選択微生物変異体である。ロドコ
ッカス ロドクロウス株はアメリカン タイプ カルチ
ャー コレクションに預けられており、指定番号はＡＴ
ＣＣ５３９６８である。この株は、約０．５マイクロ長
のグラム陽性の短い棒状型を特徴としており、栄養培地
上で桃色のコロニーを生じ、Ｃ−Ｓ結合の切断によって
高い有機硫黄特異性を有している。バシルス スフェリ
クス株は、アメリカン タイプ カルチャーコレクショ
ンに預けられており、指定番号はＡＴＣＣ５３９６９で
ある。この株は、約０．５マイクロ長のグラム陽性の短
い棒状型を特徴としており、栄養培地上でベージュ／白
色のコロニーを生じ、Ｃ−Ｓ結合の切断によって高い有
機硫黄特異性を有している。バシルス スフェリクスＡ
ＴＣＣ番号５３９６９は、同化できる炭素源、および硫
黄がＣ−Ｓ結合の位置にのみ存在している有機硫黄化合
物の存在下では、成長に必要な交差栄養を供給する栄養
補助培養物の存在無しに化学的に定義された最小塩培地
上では成長しない。そのような条件下で、生育のための
栄養を供給するいかなる細菌も十分である。バシルス
スフェリクスＡＴＣＣ番号５３９６９の生育のための栄
養要素を完全にする、適切な栄養補助培養物は、その技
術に熟練した者によってすぐに確認され得る。現在知ら
れている適当な補助培養物は、Ｅ．エロジェネス、Ｅ．
アグロメランス、およびＥ．クロアカエといったいくつ
かのエンテロバクター種および、クレブシーラ種を含ん
でいる。補助培養物は有機硫黄化合物の特異的な脱硫作
用能は持たない。
合された細菌の培養物は上述された硫黄生物活用能分析
で決定されたように、硫黄の唯一の供給源としてある範
囲の有機硫黄化合物を利用できることが示されていた。
この混合培養物によるジベンゾチオフェンにおける特異
的なＣ−Ｓ結合の切断は、ガスクロマトグラフィー／質
量分光分析によって示されていた。標準的な微生物学的
技術が、混合培養物中に存在する各細菌型の典型的な培
養物の純粋なものを得るために用いられた。各純粋培養
物は個別に、硫黄生物活用能分析によって、硫黄の唯一
の供給源として有機硫黄を利用できる能力に関してテス
トされた。硫黄の唯一の供給源として有機硫黄化合物を
利用する能力を示した、単離された培養物は、ロドコッ
カス ロドクロウスおよびバシルス スフェリクスとし
て同定された有機硫黄選択微生物変異体である。ロドコ
ッカス ロドクロウス株はアメリカン タイプ カルチ
ャー コレクションに預けられており、指定番号はＡＴ
ＣＣ５３９６８である。この株は、約０．５マイクロ長
のグラム陽性の短い棒状型を特徴としており、栄養培地
上で桃色のコロニーを生じ、Ｃ−Ｓ結合の切断によって
高い有機硫黄特異性を有している。バシルス スフェリ
クス株は、アメリカン タイプ カルチャーコレクショ
ンに預けられており、指定番号はＡＴＣＣ５３９６９で
ある。この株は、約０．５マイクロ長のグラム陽性の短
い棒状型を特徴としており、栄養培地上でベージュ／白
色のコロニーを生じ、Ｃ−Ｓ結合の切断によって高い有
機硫黄特異性を有している。バシルス スフェリクスＡ
ＴＣＣ番号５３９６９は、同化できる炭素源、および硫
黄がＣ−Ｓ結合の位置にのみ存在している有機硫黄化合
物の存在下では、成長に必要な交差栄養を供給する栄養
補助培養物の存在無しに化学的に定義された最小塩培地
上では成長しない。そのような条件下で、生育のための
栄養を供給するいかなる細菌も十分である。バシルス
スフェリクスＡＴＣＣ番号５３９６９の生育のための栄
養要素を完全にする、適切な栄養補助培養物は、その技
術に熟練した者によってすぐに確認され得る。現在知ら
れている適当な補助培養物は、Ｅ．エロジェネス、Ｅ．
アグロメランス、およびＥ．クロアカエといったいくつ
かのエンテロバクター種および、クレブシーラ種を含ん
でいる。補助培養物は有機硫黄化合物の特異的な脱硫作
用能は持たない。
【００２０】種同一性を確認するため、ロドコッカス
ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の膜脂質を溶媒抽出
し、展開し、ガスクロマトグラフィーで分析した。クロ
マトグラムは、マイクロチェック社（Ｍｉｃｒｏｃｈｅ
ｃｋ，Ｉｎｃ．）（ノールフィールド、ＶＴ）によって
供給されているコンピューター ライブラリー中に記録
された既知のロドコッカス培養物の脂質分析と比較され
る。これらのテストは、左の列中に溶出順に挙げられた
ライブラリー記載事項と比較した、抽出物中に見いださ
れた全ての脂肪酸を示している、表１に示されたよう
に、ＡＴＣＣ５３９６８をロドコッカス ロドクロウス
と同定した。脂肪酸の名称と反対側の行に、各酸に対し
て“ｘ”が印刷されているが、これは、その酸の量と
“＋”で同定された酸に関するライブラリー記載事項の
平均値を示している。ライブラリー平均の割合と抽出物
中の実際の割合が同じ場合は、“＊”が印刷される。横
線は、ライブラリー記載事項の平均値を中心として、＋
２および−２の標準偏差幅を表している。表１を検討す
ることによってロドコッカス ロドクロウスの同定を高
い信憑性を持って行うことができる。
ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の膜脂質を溶媒抽出
し、展開し、ガスクロマトグラフィーで分析した。クロ
マトグラムは、マイクロチェック社（Ｍｉｃｒｏｃｈｅ
ｃｋ，Ｉｎｃ．）（ノールフィールド、ＶＴ）によって
供給されているコンピューター ライブラリー中に記録
された既知のロドコッカス培養物の脂質分析と比較され
る。これらのテストは、左の列中に溶出順に挙げられた
ライブラリー記載事項と比較した、抽出物中に見いださ
れた全ての脂肪酸を示している、表１に示されたよう
に、ＡＴＣＣ５３９６８をロドコッカス ロドクロウス
と同定した。脂肪酸の名称と反対側の行に、各酸に対し
て“ｘ”が印刷されているが、これは、その酸の量と
“＋”で同定された酸に関するライブラリー記載事項の
平均値を示している。ライブラリー平均の割合と抽出物
中の実際の割合が同じ場合は、“＊”が印刷される。横
線は、ライブラリー記載事項の平均値を中心として、＋
２および−２の標準偏差幅を表している。表１を検討す
ることによってロドコッカス ロドクロウスの同定を高
い信憑性を持って行うことができる。
【００２１】
【表１】 種同一性を確認するためにバシルス スフェリクスＡＴ
ＣＣ５３９６９の膜脂質は溶媒抽出され、展開されて同
様にガスクロマトグラフィーで分析された。クロマトグ
ラムは、マイクロチェック社（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｃｋ，
Ｉｎｃ．）（ノールフィールド、ＶＴ）によって供給さ
れているコンピューター ライブラリー中に記録された
既知のバシルス培養物の脂質分析と比較される。これら
のテストは、表２に示されたように、ＡＴＣＣ５３９６
９をバシルス スフェリクスと同定した。表２を検討す
ることによってバシルス スフェリクスの同定を高い信
憑性を持って行うことができる。
ＣＣ５３９６９の膜脂質は溶媒抽出され、展開されて同
様にガスクロマトグラフィーで分析された。クロマトグ
ラムは、マイクロチェック社（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｃｋ，
Ｉｎｃ．）（ノールフィールド、ＶＴ）によって供給さ
れているコンピューター ライブラリー中に記録された
既知のバシルス培養物の脂質分析と比較される。これら
のテストは、表２に示されたように、ＡＴＣＣ５３９６
９をバシルス スフェリクスと同定した。表２を検討す
ることによってバシルス スフェリクスの同定を高い信
憑性を持って行うことができる。
【００２２】
【表２】 ロドコッカスＡＴＣＣ５３９６８は、アメリカン タイ
プ カルチャー コレクションから得られたその他のロ
ドコッカス種と、これらの培養物の生育を補助する炭素
源に関して比較された。培養物は、指示された炭素源を
含む指定された寒天プレート上にストリークされ、およ
び／または液体倍地中に植えられ、３０℃で９６時間培
養の後に評価された。様々なロドコッカス株を用いた炭
素源活用に関する研究の結果は、表３に示されている。
微生物の生育を支持する炭素源から、ロドコッカス ロ
ドクロウスＡＴＣＣ５３９６８が実際ロドコッカス ロ
ドクロウスであるのは、完全に整合性があるように見え
る。
プ カルチャー コレクションから得られたその他のロ
ドコッカス種と、これらの培養物の生育を補助する炭素
源に関して比較された。培養物は、指示された炭素源を
含む指定された寒天プレート上にストリークされ、およ
び／または液体倍地中に植えられ、３０℃で９６時間培
養の後に評価された。様々なロドコッカス株を用いた炭
素源活用に関する研究の結果は、表３に示されている。
微生物の生育を支持する炭素源から、ロドコッカス ロ
ドクロウスＡＴＣＣ５３９６８が実際ロドコッカス ロ
ドクロウスであるのは、完全に整合性があるように見え
る。
【００２３】表３に挙げられた各ロドコッカス種は、そ
れらのＤＢＴ中の有機的に結合した硫黄の利用能を決定
するため、上述した硫黄生物活用能分析を用いて評価さ
れた。ほとんどの株は、様々な基質を用いて数回テスト
された。ＡＴＣＣ５３９６８株は、テストされたロドコ
ッカス種の中でＣ−Ｓ結合切断性を有する唯一のもので
あった。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６
８に関するさらなるテストの結果、トリチアン、チアン
トレン、ジベンゾチオフェンスルフォキシドおよびジベ
ンゾティオフェン−スルフォンおよびその他の有機硫黄
化合物もまたロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８の硫黄源として利用可能であることが示された。
れらのＤＢＴ中の有機的に結合した硫黄の利用能を決定
するため、上述した硫黄生物活用能分析を用いて評価さ
れた。ほとんどの株は、様々な基質を用いて数回テスト
された。ＡＴＣＣ５３９６８株は、テストされたロドコ
ッカス種の中でＣ−Ｓ結合切断性を有する唯一のもので
あった。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６
８に関するさらなるテストの結果、トリチアン、チアン
トレン、ジベンゾチオフェンスルフォキシドおよびジベ
ンゾティオフェン−スルフォンおよびその他の有機硫黄
化合物もまたロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８の硫黄源として利用可能であることが示された。
【００２４】ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８株はジベンゾチオフェンおよび非有機硫黄の両方
の存在下で、約１２時間で細胞数が２倍になることが知
られている。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８の成長速度は栄養豊富な培地（ルリアブロース）
上ではずっと速いが、その他の微生物は栄養豊富な培地
上の成長速度はやや速い程度である。
９６８株はジベンゾチオフェンおよび非有機硫黄の両方
の存在下で、約１２時間で細胞数が２倍になることが知
られている。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８の成長速度は栄養豊富な培地（ルリアブロース）
上ではずっと速いが、その他の微生物は栄養豊富な培地
上の成長速度はやや速い程度である。
【００２５】バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６
９は上述したように、アメリカンタイプ カルチャー
コレクションから得られたその他のバシルス種と、これ
らの培養物の生育を補助する炭素源に関して比較され
た。様々なバシルス株を用いた炭素源活用に関する研究
の結果は、表４に示されている。バシルス スフェリク
スＡＴＣＣ５３９６９を用いて得られた炭素源利用のデ
ータは、バシルス スフェリクスＡＴＣＣ１４５７７で
得られたものと同一であった。しかしながら、バシルス
スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９が、純粋培養と同様
に生育する、化学的に定義された成長培地はまだ見いだ
されていない。栄養寒天培地上の生育、顕微鏡観察及
び、生育温度研究を含む更なる微生物学的検査の結果、
Ｂ．スフェリクス１４５７７およびＢ．スフェリクス５
３９６９に関して同一の結果が得られた。これらのデー
タは、膜脂質分析のデータと合わせて、微生物ＡＴＣＣ
５３９６９は微生物バシルス スフェリクスであること
を示唆している。
９は上述したように、アメリカンタイプ カルチャー
コレクションから得られたその他のバシルス種と、これ
らの培養物の生育を補助する炭素源に関して比較され
た。様々なバシルス株を用いた炭素源活用に関する研究
の結果は、表４に示されている。バシルス スフェリク
スＡＴＣＣ５３９６９を用いて得られた炭素源利用のデ
ータは、バシルス スフェリクスＡＴＣＣ１４５７７で
得られたものと同一であった。しかしながら、バシルス
スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９が、純粋培養と同様
に生育する、化学的に定義された成長培地はまだ見いだ
されていない。栄養寒天培地上の生育、顕微鏡観察及
び、生育温度研究を含む更なる微生物学的検査の結果、
Ｂ．スフェリクス１４５７７およびＢ．スフェリクス５
３９６９に関して同一の結果が得られた。これらのデー
タは、膜脂質分析のデータと合わせて、微生物ＡＴＣＣ
５３９６９は微生物バシルス スフェリクスであること
を示唆している。
【００２６】表４に挙げられたバシルス種は、それらの
ＤＢＴ中の有機的に結合した硫黄の利用能を決定するた
め、上述した硫黄生物活用能分析を用いて評価された。
ほとんどの株は、様々な基質を用いて数回テストされ
た。ＡＴＣＣ５３９６９株は、テストされたバシルス種
の中でＣ−Ｓ結合切断性を有する唯一のものであった。
バシルス スフェリクスＡＴＣＣ番号５３９６９は、栄
養補助培養物としてのエンテロバクター アエロジーナ
スまたはエンテロバクター アグロメランスの存在下で
生育した。バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９
中の脱硫作用特性は、選択及び非選択培地の両方におい
て、多くの補培養を通じ、安定であることが観察され
た。
ＤＢＴ中の有機的に結合した硫黄の利用能を決定するた
め、上述した硫黄生物活用能分析を用いて評価された。
ほとんどの株は、様々な基質を用いて数回テストされ
た。ＡＴＣＣ５３９６９株は、テストされたバシルス種
の中でＣ−Ｓ結合切断性を有する唯一のものであった。
バシルス スフェリクスＡＴＣＣ番号５３９６９は、栄
養補助培養物としてのエンテロバクター アエロジーナ
スまたはエンテロバクター アグロメランスの存在下で
生育した。バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９
中の脱硫作用特性は、選択及び非選択培地の両方におい
て、多くの補培養を通じ、安定であることが観察され
た。
【００２７】バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６
９が、化学的に決定された無機塩培地中の補助培養物と
共に、唯一の硫黄源としてＤＢＴを供給されながら培養
された場合、約０．２ミリモルの２−ヒドロキシビフェ
ニルが培地中に検出される。２−ヒドロキシビフェニル
は、これらの条件下で検出される、唯一のＤＢＴの代謝
物である。
９が、化学的に決定された無機塩培地中の補助培養物と
共に、唯一の硫黄源としてＤＢＴを供給されながら培養
された場合、約０．２ミリモルの２−ヒドロキシビフェ
ニルが培地中に検出される。２−ヒドロキシビフェニル
は、これらの条件下で検出される、唯一のＤＢＴの代謝
物である。
【００２８】ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８の脱硫特性の安定性は、何世代にもわたって非選
択条件下で培養することによって評価され、２００以上
のシングルコロニーが得られ、上述した硫黄活用能解析
によってテストされ、全ての培養物がＣ−Ｓ結合切断に
よって脱硫する能力があることが示された。上述した培
養条件下では、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５
３９６８の有するＣ−Ｓ結合切断能は安定した性質のも
のであることが判明した。ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ５３９６８の脱硫特性は熱ショックを通じて保
持される。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９
６８の生育は、３７℃及び４３℃で４８時間培養する
と、非常に遅れるか、生育しなくなる。脱硫作用を持つ
ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の７２
個のシングルコロニーを栄養寒天培地状にストリーク
し、３７℃または４２℃で４２時間培養し、その後に３
０℃で７２時間培養し、上述した硫黄生物活用能分析に
よってテストしたところ、全てのコロニーは脱硫特性を
安定して保持していた。
９６８の脱硫特性の安定性は、何世代にもわたって非選
択条件下で培養することによって評価され、２００以上
のシングルコロニーが得られ、上述した硫黄活用能解析
によってテストされ、全ての培養物がＣ−Ｓ結合切断に
よって脱硫する能力があることが示された。上述した培
養条件下では、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５
３９６８の有するＣ−Ｓ結合切断能は安定した性質のも
のであることが判明した。ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ５３９６８の脱硫特性は熱ショックを通じて保
持される。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９
６８の生育は、３７℃及び４３℃で４８時間培養する
と、非常に遅れるか、生育しなくなる。脱硫作用を持つ
ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の７２
個のシングルコロニーを栄養寒天培地状にストリーク
し、３７℃または４２℃で４２時間培養し、その後に３
０℃で７２時間培養し、上述した硫黄生物活用能分析に
よってテストしたところ、全てのコロニーは脱硫特性を
安定して保持していた。
【００２９】
【表３】
【表４】 変異ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の
培養物は、唯一の硫黄源としてジベンゾチオフェンを含
む無機塩グルコース細菌成長培地中に植えられた。３０
℃で７２時間培養した後、培養物は遠心処理され、上澄
はＣ−１８シリカ化合物を用いた固相抽出によって処理
され、ジクロロメタンで溶出され、ジベゾチオフェンの
代謝物を同定し、定量するためにガスクロマトグラフィ
ー／質量分光分析を用いて分析された。結果は表５に示
されており、既知の濃度のエチルナフタレンをジクロロ
メタン溶出物に加え、純粋な化学的化合物を用いて作成
された保持時間と濃度曲線と、代謝物のピークを比較す
ることによって、代謝物の定量が行なわれている。特に
求められている化合物は表５に挙げられている。２−ヒ
ドロキシビフェニルのみが見いだされ、３−ヒドロキシ
−２−フォルミル−ベンゾチオフェン、およびＤＢＴ分
解の脱炭素過程で形成されることが知られているその他
のどんな化合物も見いだされなかったという事実は、ロ
ドコッカスロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８がジベンゾ
チオフェンをＣ−Ｓ結合切断経路によって代謝してお
り、これまで行なわれてきた技術の多くの微生物が行な
ったようなＣ−Ｃ結合切断経路によって代謝しているの
ではない、ということを示している。
培養物は、唯一の硫黄源としてジベンゾチオフェンを含
む無機塩グルコース細菌成長培地中に植えられた。３０
℃で７２時間培養した後、培養物は遠心処理され、上澄
はＣ−１８シリカ化合物を用いた固相抽出によって処理
され、ジクロロメタンで溶出され、ジベゾチオフェンの
代謝物を同定し、定量するためにガスクロマトグラフィ
ー／質量分光分析を用いて分析された。結果は表５に示
されており、既知の濃度のエチルナフタレンをジクロロ
メタン溶出物に加え、純粋な化学的化合物を用いて作成
された保持時間と濃度曲線と、代謝物のピークを比較す
ることによって、代謝物の定量が行なわれている。特に
求められている化合物は表５に挙げられている。２−ヒ
ドロキシビフェニルのみが見いだされ、３−ヒドロキシ
−２−フォルミル−ベンゾチオフェン、およびＤＢＴ分
解の脱炭素過程で形成されることが知られているその他
のどんな化合物も見いだされなかったという事実は、ロ
ドコッカスロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８がジベンゾ
チオフェンをＣ−Ｓ結合切断経路によって代謝してお
り、これまで行なわれてきた技術の多くの微生物が行な
ったようなＣ−Ｃ結合切断経路によって代謝しているの
ではない、ということを示している。
【００３０】
【表５】 ＊ Ｃ−Ｓ結合中間体 ＊＊ Ｃ−Ｓ結合産物 + Ｃ−Ｃ結合産物 ＢＤＬは〜０．００１の検出限界以下を示している。
【００３１】２０ｍＭ以上の高濃度の硫酸塩の存在はＤ
ＢＴの脱硫を阻害し、栄養の豊富なバクテリアの生長培
地中でのロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６
８による脱硫は起きない。テストチューブ／振とうフラ
スコ中でのバクテリアの生長のための最少の硫酸塩の要
求は約０．２５から１．０ｍＭであり、その量の利用で
きる硫黄の存在は有機物からの脱硫を阻害せず、より活
発な生長を可能にすることによって有機物からの脱硫を
刺激するかもしれないが、高濃度の硫酸塩の存在は生長
では優れているにもかかわらず、ロドコッカス ロドク
ロウスＡＴＣＣ５３９６８によるＤＢＴの脱硫を阻害ま
たは抑制する。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５
３９６８を栄養の豊富なバクテリアの培地中で生長させ
るときのＤＢＴの脱硫の完全な欠損は、ある量の飢餓／
ストレスは脱硫の特性の発現を得るために要求されて、
ＤＢＴはその微生物の脱硫の特性を誘導できないという
ことを示唆する。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ
５３９６８を表４に示すような無機塩のバクテリアの生
長培地または栄養の豊富な培地中に接種して、３０℃で
７２時間生長させた後に、ＤＢＴの代謝物を同定して定
量するためにガスクロマトグラフィー／質量分析によっ
てサンプルを分析した。結果を表６に示す。
ＢＴの脱硫を阻害し、栄養の豊富なバクテリアの生長培
地中でのロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６
８による脱硫は起きない。テストチューブ／振とうフラ
スコ中でのバクテリアの生長のための最少の硫酸塩の要
求は約０．２５から１．０ｍＭであり、その量の利用で
きる硫黄の存在は有機物からの脱硫を阻害せず、より活
発な生長を可能にすることによって有機物からの脱硫を
刺激するかもしれないが、高濃度の硫酸塩の存在は生長
では優れているにもかかわらず、ロドコッカス ロドク
ロウスＡＴＣＣ５３９６８によるＤＢＴの脱硫を阻害ま
たは抑制する。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５
３９６８を栄養の豊富なバクテリアの培地中で生長させ
るときのＤＢＴの脱硫の完全な欠損は、ある量の飢餓／
ストレスは脱硫の特性の発現を得るために要求されて、
ＤＢＴはその微生物の脱硫の特性を誘導できないという
ことを示唆する。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ
５３９６８を表４に示すような無機塩のバクテリアの生
長培地または栄養の豊富な培地中に接種して、３０℃で
７２時間生長させた後に、ＤＢＴの代謝物を同定して定
量するためにガスクロマトグラフィー／質量分析によっ
てサンプルを分析した。結果を表６に示す。
【表６】 ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の誘導
株はＡＴＣＣ５３９６８菌株と同じまたはそれよりも優
れた選択的な脱硫の特性を保持していることを示した。
抗生物質アンピシリン、セファロリジン、ナラジクス
酸、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、リファ
ンピシン、に対する耐性およびこれらの耐性の特性の２
つまたは３つの組合わせを付随的に示した、ロドコッカ
ス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の誘導株の微生物
を得た。これらの抗生物質耐性の誘導株は、組換えＤＮ
Ａ技術の産物ではないのだが遺伝子の変異の結果であ
る。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の
他の誘導株の微生物は栄養要求性突然変異株／１つまた
は１つ以上の必須アミノ酸またはビタミンを合成する能
力に欠陥のある誘導株であることが証明された。栄養要
求性突然変異株の誘導株のいくつかは硫黄を含むアミノ
酸であるシステインおよびメチオニンを合成する能力に
欠陥があることが示された。抗生物質耐性および栄養要
求性の性質を示すロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ
５３９６８誘導株の微生物は有機物のＣ−Ｓ結合を切断
する能力を保持していた。ジベンゾチオフェンのような
別の有機硫黄を含む化合物とともに存在すると、ロドコ
ッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の有機Ｃ−Ｓ
結合を切断する特性をトリルジスルフィドは特異的に阻
害することを見い出した。しかしトリルジスルフィドは
生長のための無機硫黄塩の利用を阻害しないので、一般
的にそれはロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９
６８の阻害剤であるわけではない。有機物のＣ−Ｓ結合
の切断の特性のそのような阻害を克服し、硫黄の唯一の
供給源としてトリルジスルフィドを用いて生長できたロ
ドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の変異株
／誘導株を選択した。そのような誘導株は、有機Ｃ−Ｓ
結合の切断によってジベンゾチオフェンを代謝する能力
が約２５％増強していることが示された。
株はＡＴＣＣ５３９６８菌株と同じまたはそれよりも優
れた選択的な脱硫の特性を保持していることを示した。
抗生物質アンピシリン、セファロリジン、ナラジクス
酸、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、リファ
ンピシン、に対する耐性およびこれらの耐性の特性の２
つまたは３つの組合わせを付随的に示した、ロドコッカ
ス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の誘導株の微生物
を得た。これらの抗生物質耐性の誘導株は、組換えＤＮ
Ａ技術の産物ではないのだが遺伝子の変異の結果であ
る。ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の
他の誘導株の微生物は栄養要求性突然変異株／１つまた
は１つ以上の必須アミノ酸またはビタミンを合成する能
力に欠陥のある誘導株であることが証明された。栄養要
求性突然変異株の誘導株のいくつかは硫黄を含むアミノ
酸であるシステインおよびメチオニンを合成する能力に
欠陥があることが示された。抗生物質耐性および栄養要
求性の性質を示すロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ
５３９６８誘導株の微生物は有機物のＣ−Ｓ結合を切断
する能力を保持していた。ジベンゾチオフェンのような
別の有機硫黄を含む化合物とともに存在すると、ロドコ
ッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の有機Ｃ−Ｓ
結合を切断する特性をトリルジスルフィドは特異的に阻
害することを見い出した。しかしトリルジスルフィドは
生長のための無機硫黄塩の利用を阻害しないので、一般
的にそれはロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９
６８の阻害剤であるわけではない。有機物のＣ−Ｓ結合
の切断の特性のそのような阻害を克服し、硫黄の唯一の
供給源としてトリルジスルフィドを用いて生長できたロ
ドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の変異株
／誘導株を選択した。そのような誘導株は、有機Ｃ−Ｓ
結合の切断によってジベンゾチオフェンを代謝する能力
が約２５％増強していることが示された。
【００３２】約２０ｍＭ程度の高濃度の無機硫酸塩の存
在下で有機Ｃ−Ｓ結合の切断の特性を示すロドコッカス
ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の別の誘導株の培養
を単離した。微生物ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣ
Ｃ５３９６８自身は、そのような濃度の無機硫酸塩中で
の有機Ｃ−Ｓ結合の切断の特性が減少していることが示
されている。
在下で有機Ｃ−Ｓ結合の切断の特性を示すロドコッカス
ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８の別の誘導株の培養
を単離した。微生物ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣ
Ｃ５３９６８自身は、そのような濃度の無機硫酸塩中で
の有機Ｃ−Ｓ結合の切断の特性が減少していることが示
されている。
【００３３】ＡＴＣＣ５３９６８の抗生物質耐性の誘導
株をエンテロバクターエアロジーンズ（Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）との混合培養におい
て使用した。混合接種原はＥ．エアロジーンズ（Ｅ．ａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ）に対して１０倍量過剰のＡＴＣＣ５
３９６８を含み、生長は上で定義した生長培地、グリセ
ロール、および硫黄の唯一の供給源としてのＤＢＴ中で
モニターした。５０、７０、１４０および２４０時間の
培養のサンプルを、栄養を含むアガーおよび２５０ミリ
グラム／ｍＬのストレプトマイシンを含む栄養を含むア
ガー上で培養した希釈系列を調製するために使用した。
Ｅ．エアロジーンズは栄養を含むアガー上でＡＴＣＣ５
３９６８誘導株よりも速く生長したが、一方で抗生物質
を含み栄養を含むアガー上ではＡＴＣＣ５３９６８の誘
導株のみが生長した。ＡＴＣＣ５３９６８誘導株はＤＢ
Ｔからの硫黄を代謝できる唯一の生物なので、最初の７
０−８０時間は速く生長した。しかし、約５０−６０時
間後には、Ｅ．エアロジーンズはたとえＤＢＴを代謝で
きなにもかかわらず急速な生長を開始して、２４０時間
ではＡＴＣＣ５３９６８誘導株よりもおよそ３けた多く
存在している。このことは、ＡＴＣＣ５３９６８がＤＢ
Ｔから遊離した硫黄は他のバクテリアの代謝に利用でき
るような方法で、ＡＴＣＣ５３９６８のバクテリアの外
側の表面に関連してＤＢＴは代謝されることを示唆す
る。
株をエンテロバクターエアロジーンズ（Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）との混合培養におい
て使用した。混合接種原はＥ．エアロジーンズ（Ｅ．ａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ）に対して１０倍量過剰のＡＴＣＣ５
３９６８を含み、生長は上で定義した生長培地、グリセ
ロール、および硫黄の唯一の供給源としてのＤＢＴ中で
モニターした。５０、７０、１４０および２４０時間の
培養のサンプルを、栄養を含むアガーおよび２５０ミリ
グラム／ｍＬのストレプトマイシンを含む栄養を含むア
ガー上で培養した希釈系列を調製するために使用した。
Ｅ．エアロジーンズは栄養を含むアガー上でＡＴＣＣ５
３９６８誘導株よりも速く生長したが、一方で抗生物質
を含み栄養を含むアガー上ではＡＴＣＣ５３９６８の誘
導株のみが生長した。ＡＴＣＣ５３９６８誘導株はＤＢ
Ｔからの硫黄を代謝できる唯一の生物なので、最初の７
０−８０時間は速く生長した。しかし、約５０−６０時
間後には、Ｅ．エアロジーンズはたとえＤＢＴを代謝で
きなにもかかわらず急速な生長を開始して、２４０時間
ではＡＴＣＣ５３９６８誘導株よりもおよそ３けた多く
存在している。このことは、ＡＴＣＣ５３９６８がＤＢ
Ｔから遊離した硫黄は他のバクテリアの代謝に利用でき
るような方法で、ＡＴＣＣ５３９６８のバクテリアの外
側の表面に関連してＤＢＴは代謝されることを示唆す
る。
【００３４】バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６
９の誘導株はＡＴＣＣ５３９６９菌株と同じまたはより
優れた選択的な脱硫特性を保持している。同じ選択的な
脱硫特性をもつバシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９
６９の誘導株は記載した任意の脱硫の過程における使用
に適しており、そのような使用も含まえれるものであ
る。
９の誘導株はＡＴＣＣ５３９６９菌株と同じまたはより
優れた選択的な脱硫特性を保持している。同じ選択的な
脱硫特性をもつバシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９
６９の誘導株は記載した任意の脱硫の過程における使用
に適しており、そのような使用も含まえれるものであ
る。
【００３５】バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６
９の脱硫特性は、見かけは、この微生物の細胞の外膜に
関連している。純培養としての補助培養は、ＤＢＴが唯
一の硫黄の供給源である化学的に定義された無機塩培地
中で生長する能力がないという知見によってこの事実は
支持される。しかし脱硫できる微生物、特にバシルスス
フェリクスＡＴＣＣ５３９６９が同時に存在するときに
は、この補助培養はよく生長する。補助培養のこのよい
生長は、バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９が
ＤＢＴから遊離する硫黄が補助培養による使用に利用で
きるようになったときにのみ起こりうるだろう。
９の脱硫特性は、見かけは、この微生物の細胞の外膜に
関連している。純培養としての補助培養は、ＤＢＴが唯
一の硫黄の供給源である化学的に定義された無機塩培地
中で生長する能力がないという知見によってこの事実は
支持される。しかし脱硫できる微生物、特にバシルスス
フェリクスＡＴＣＣ５３９６９が同時に存在するときに
は、この補助培養はよく生長する。補助培養のこのよい
生長は、バシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９が
ＤＢＴから遊離する硫黄が補助培養による使用に利用で
きるようになったときにのみ起こりうるだろう。
【００３６】５００ミリグラム／ｍＬのストレプトマイ
シンに耐性のロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．５３９６８の誘導株およびバシルス スフェリクス
ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９誘導株を各々エンテロバク
ター アグロメランスと混合した。エンテロバクター
アグロメランス培養はストレプトマイシンに感受性であ
り、硫黄のバイオアベイラビリティのアッセイ条件下で
は生長することができず、ジベンゾチオフェンを検出で
きる量の２−ヒドロキシビフェニルへ変換できなかっ
た。純培養および混合培養をエンテロバクターは殺すが
ロドコッカスまたはバシルスには影響を及ぼさないであ
ろう量のストレプトマイシンの存在下または非存在下で
栄養を含むアガー上で培養した。４０時間後に、純細胞
培養中のロドコッカスの密度は２．６×１０6 細胞／ｍ
ｌであり、混合培養中では２．４×１０4 細胞／ｍｌだ
った。３６０時間後に、ロドコッカスの純培養の細胞密
度は３．５×１０8 から２．２×１０9 細胞／ｍｌだっ
た；ロドコッカス／エンテロバクターの混合培養中のロ
ドコッカスは２．７×１０6 細胞／ｍｌであり、全細胞
数は５．５×１０8 細胞／ｍｌだった；バシルス／エン
テロバクター混合培養中のバシルスは６．８×１０5 細
胞／ｍｌであり、全細胞数は３．２×１０8 細胞／ｍｌ
だった。たとえこれらの混合培養に含まれるジベンゾチ
オフェンの代謝におけるＣ−Ｓ結合の切断が可能な細胞
は何倍も少なくて、ロドコッカスについては、２．７×
１０6 ／５．５×１０8 およびバシルスについては６．
８×１０5 ／３．２×１０8 であるにもかかわらず、約
３００時間後にはこれらは、ロドコッカスの純培養と比
較してほぼ等しい量の２−ヒドロキシビフェニルを最終
的に生産できた。これらの生長の研究から、混合培養中
のエンテロバクター アグロメランスの生長はロドコッ
カスまたはバシルスのジベンゾチオフェンの代謝によっ
て利用できるようになった硫黄のためであったことが明
確であり、Ｃ−Ｓ結合の切断は恐らく微生物の外側の表
面で起きて、細胞壁に関連することを示している。も
し、ＤＢＴが最初にロドコッカスまたはバシルスの細胞
中へ取り込まれて、後に硫黄がＤＢＴから細胞質へ遊離
するならば、ロドコッカスまたはバシルスの細胞から次
に硫黄が放出されてエンテロバクターの細胞に利用され
るということがありえそうにないので、この結論を保証
できるように思われる。
シンに耐性のロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．５３９６８の誘導株およびバシルス スフェリクス
ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９誘導株を各々エンテロバク
ター アグロメランスと混合した。エンテロバクター
アグロメランス培養はストレプトマイシンに感受性であ
り、硫黄のバイオアベイラビリティのアッセイ条件下で
は生長することができず、ジベンゾチオフェンを検出で
きる量の２−ヒドロキシビフェニルへ変換できなかっ
た。純培養および混合培養をエンテロバクターは殺すが
ロドコッカスまたはバシルスには影響を及ぼさないであ
ろう量のストレプトマイシンの存在下または非存在下で
栄養を含むアガー上で培養した。４０時間後に、純細胞
培養中のロドコッカスの密度は２．６×１０6 細胞／ｍ
ｌであり、混合培養中では２．４×１０4 細胞／ｍｌだ
った。３６０時間後に、ロドコッカスの純培養の細胞密
度は３．５×１０8 から２．２×１０9 細胞／ｍｌだっ
た；ロドコッカス／エンテロバクターの混合培養中のロ
ドコッカスは２．７×１０6 細胞／ｍｌであり、全細胞
数は５．５×１０8 細胞／ｍｌだった；バシルス／エン
テロバクター混合培養中のバシルスは６．８×１０5 細
胞／ｍｌであり、全細胞数は３．２×１０8 細胞／ｍｌ
だった。たとえこれらの混合培養に含まれるジベンゾチ
オフェンの代謝におけるＣ−Ｓ結合の切断が可能な細胞
は何倍も少なくて、ロドコッカスについては、２．７×
１０6 ／５．５×１０8 およびバシルスについては６．
８×１０5 ／３．２×１０8 であるにもかかわらず、約
３００時間後にはこれらは、ロドコッカスの純培養と比
較してほぼ等しい量の２−ヒドロキシビフェニルを最終
的に生産できた。これらの生長の研究から、混合培養中
のエンテロバクター アグロメランスの生長はロドコッ
カスまたはバシルスのジベンゾチオフェンの代謝によっ
て利用できるようになった硫黄のためであったことが明
確であり、Ｃ−Ｓ結合の切断は恐らく微生物の外側の表
面で起きて、細胞壁に関連することを示している。も
し、ＤＢＴが最初にロドコッカスまたはバシルスの細胞
中へ取り込まれて、後に硫黄がＤＢＴから細胞質へ遊離
するならば、ロドコッカスまたはバシルスの細胞から次
に硫黄が放出されてエンテロバクターの細胞に利用され
るということがありえそうにないので、この結論を保証
できるように思われる。
【００３７】ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．５３９６８およびエンテロバクター アグロメラン
ス培養を透析膜によって分離した生長培地中で培養し
て、ジベンゾチオフェンを生長のための唯一の硫黄の供
給源として使用したときに、ロドコッカスによって代謝
されたジベンゾチオフェンから遊離した硫黄のエンテロ
バクターによる利用のためにはロドコッカスおよびエン
テロバクターの細胞間の細胞の接触が要求されることが
示された。これは、ジベンゾチオフェンを用いて生長さ
せたロドコッカスの培養の上澄にはジベンゾチオフェン
以外の検出できる濃度の硫黄を含む化合物を全く含まな
いという所見と一致する。これも、Ｃ−Ｓ結合の切断の
反応がロドコッカス微生物の外膜に関連して起きる証拠
である。
ｏ．５３９６８およびエンテロバクター アグロメラン
ス培養を透析膜によって分離した生長培地中で培養し
て、ジベンゾチオフェンを生長のための唯一の硫黄の供
給源として使用したときに、ロドコッカスによって代謝
されたジベンゾチオフェンから遊離した硫黄のエンテロ
バクターによる利用のためにはロドコッカスおよびエン
テロバクターの細胞間の細胞の接触が要求されることが
示された。これは、ジベンゾチオフェンを用いて生長さ
せたロドコッカスの培養の上澄にはジベンゾチオフェン
以外の検出できる濃度の硫黄を含む化合物を全く含まな
いという所見と一致する。これも、Ｃ−Ｓ結合の切断の
反応がロドコッカス微生物の外膜に関連して起きる証拠
である。
【００３８】ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８およびその誘導株およびバシルス スフェリクス
ＡＴＣＣ５３９６９およびその誘導株を、有機硫黄を含
む炭素質の材料、石炭、石油、頁岩、オイル、樹炭のよ
うな特に天然に存在する化石燃料、およびそれに由来す
る合成燃料から有機硫黄を極めて効率的に除去するため
に使用することができる。ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ５３９６８および／またはその誘導株を水性の
培地中で約４２℃までの温度で接触させることによっ
て、有機硫黄をそのような材料から選択的に除去でき
る。そのような材料からの有機硫黄の除去は、適当な無
機栄養分および同化できる炭素源を含む水性の生長培地
中で、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８
および／またはその誘導株を用いた、固体の有機硫黄を
含む化合物に由来する有機硫黄の選択的な代謝によって
行うことができる。代謝は酸素を要求する好気性の条件
下にあり、水性の生長培地のｐＨは約６から７が好まし
いのだが約５から８に、そして温度は約２８℃から３２
℃が好ましいのだが約１５℃から３４℃に維持される。
より高温の範囲では代謝はより速くなるが、しかし微生
物は３７℃程度の温度に耐えられないことが知られてい
る。水性の培地には、好ましい時間の間隔内で好ましい
選択的な硫黄の除去を達成するために、適当な濃度の微
生物を含むべきである。
９６８およびその誘導株およびバシルス スフェリクス
ＡＴＣＣ５３９６９およびその誘導株を、有機硫黄を含
む炭素質の材料、石炭、石油、頁岩、オイル、樹炭のよ
うな特に天然に存在する化石燃料、およびそれに由来す
る合成燃料から有機硫黄を極めて効率的に除去するため
に使用することができる。ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ５３９６８および／またはその誘導株を水性の
培地中で約４２℃までの温度で接触させることによっ
て、有機硫黄をそのような材料から選択的に除去でき
る。そのような材料からの有機硫黄の除去は、適当な無
機栄養分および同化できる炭素源を含む水性の生長培地
中で、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８
および／またはその誘導株を用いた、固体の有機硫黄を
含む化合物に由来する有機硫黄の選択的な代謝によって
行うことができる。代謝は酸素を要求する好気性の条件
下にあり、水性の生長培地のｐＨは約６から７が好まし
いのだが約５から８に、そして温度は約２８℃から３２
℃が好ましいのだが約１５℃から３４℃に維持される。
より高温の範囲では代謝はより速くなるが、しかし微生
物は３７℃程度の温度に耐えられないことが知られてい
る。水性の培地には、好ましい時間の間隔内で好ましい
選択的な硫黄の除去を達成するために、適当な濃度の微
生物を含むべきである。
【００３９】ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３
９６８およびその誘導株バシルススフェリクスＡＴＣＣ
５３９６８およびその誘導株は有機物の炭素質の材料中
のＣ−Ｓ結合の切断によって硫黄を一通りに代謝する。
例えば、ジベンゾチオフェンの代謝では、有機物の最終
産物は２−ヒドロキシビフェニルである。微生物の代謝
のこれらの性質のために、これらの微生物およびその誘
導株は、様々な有機合成系の過程において使用できる、
有機物のＣ−Ｓ結合の切断のための有機化学合成におけ
る使用のための特異的な試薬になる。生ゴムの製品のよ
うな硫黄を含む有機分子の分解における再生使用のため
の操作において有機Ｃ−Ｓ結合の切断による広範囲の有
機物の材料の脱硫による分解に同様に、これらの微生物
およびその誘導株の珍しい性質を利用できる。
９６８およびその誘導株バシルススフェリクスＡＴＣＣ
５３９６８およびその誘導株は有機物の炭素質の材料中
のＣ−Ｓ結合の切断によって硫黄を一通りに代謝する。
例えば、ジベンゾチオフェンの代謝では、有機物の最終
産物は２−ヒドロキシビフェニルである。微生物の代謝
のこれらの性質のために、これらの微生物およびその誘
導株は、様々な有機合成系の過程において使用できる、
有機物のＣ−Ｓ結合の切断のための有機化学合成におけ
る使用のための特異的な試薬になる。生ゴムの製品のよ
うな硫黄を含む有機分子の分解における再生使用のため
の操作において有機Ｃ−Ｓ結合の切断による広範囲の有
機物の材料の脱硫による分解に同様に、これらの微生物
およびその誘導株の珍しい性質を利用できる。
【００４０】硫黄を含む有機物の炭素質の材料の硫黄の
含有量を、硫黄に特異的な反応試薬に接触させることに
よって選択的に減少させることができる。本発明に従っ
た硫黄に特異的な反応試薬は、細胞膜が有機Ｃ−Ｓ結合
の選択的切断能をもつような膜の断片および／または細
胞膜に関連した酵素または酵素群の構成物を含むエキス
トラクトであってもよい。有機物のＣ−Ｓ結合の選択的
切断能をもつロドコッカス ロドクロウスおよびバシル
ス スフェリクス微生物は、細胞膜の断片および／また
は細胞膜に関連した酵素または酵素群を含むエキストラ
クトのための適当な供給源であり、特に好ましい硫黄に
特異的な反応試薬は、微生物ロドコッカス ロドクロウ
ス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８および／またはバシ
ルス スフェリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９か
ら得られる。これらの硫黄に特異的な反応試薬は水性の
または非水性の媒体中で、有機硫黄を含む炭素質の材
料、石炭、石油、頁岩、オイル、樹皮のような特に天然
に存在する化石材料およびそれに由来する合成燃料から
有機硫黄を極めて効率的に除去するために使用できる。
硫黄を含む有機物の炭素質の材料の接触は、乳濁液、固
定ベッドリアクター類、カウンターフローリアクター類
および接触のための大きな表面積をもつ他の手段を用い
るような当業者に知られている任意の手段によって行う
ことができる。
含有量を、硫黄に特異的な反応試薬に接触させることに
よって選択的に減少させることができる。本発明に従っ
た硫黄に特異的な反応試薬は、細胞膜が有機Ｃ−Ｓ結合
の選択的切断能をもつような膜の断片および／または細
胞膜に関連した酵素または酵素群の構成物を含むエキス
トラクトであってもよい。有機物のＣ−Ｓ結合の選択的
切断能をもつロドコッカス ロドクロウスおよびバシル
ス スフェリクス微生物は、細胞膜の断片および／また
は細胞膜に関連した酵素または酵素群を含むエキストラ
クトのための適当な供給源であり、特に好ましい硫黄に
特異的な反応試薬は、微生物ロドコッカス ロドクロウ
ス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８および／またはバシ
ルス スフェリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９か
ら得られる。これらの硫黄に特異的な反応試薬は水性の
または非水性の媒体中で、有機硫黄を含む炭素質の材
料、石炭、石油、頁岩、オイル、樹皮のような特に天然
に存在する化石材料およびそれに由来する合成燃料から
有機硫黄を極めて効率的に除去するために使用できる。
硫黄を含む有機物の炭素質の材料の接触は、乳濁液、固
定ベッドリアクター類、カウンターフローリアクター類
および接触のための大きな表面積をもつ他の手段を用い
るような当業者に知られている任意の手段によって行う
ことができる。
【００４１】適当な非水性の媒体には、灯油、原油、石
油分留物、植物油および他の軽油、グリセロール、ジメ
チルホルムアミド、メタノール、エタノール、ベンゼ
ン、トルエン、オクタノール、オクタン、酢酸エチルお
よびエキサンのような有機物の液体が含まれる。好まし
い有機物の液体には灯油、軽油、およびメタノールが含
まれる。
油分留物、植物油および他の軽油、グリセロール、ジメ
チルホルムアミド、メタノール、エタノール、ベンゼ
ン、トルエン、オクタノール、オクタン、酢酸エチルお
よびエキサンのような有機物の液体が含まれる。好まし
い有機物の液体には灯油、軽油、およびメタノールが含
まれる。
【００４２】膜の断片から成るエキストラクトは、当業
者によく知られているように、超音波、界面活性剤の使
用またはフレンチプレスの使用のような溶菌の過程によ
って上述の微生物からの溶菌物として調製できる。選択
的なＣ−Ｓ結合の切断に関する生化学的な活性が産物中
に存在するかぎりは、細胞膜の断片の濃縮物を提供する
任意の過程を使用できる。溶菌による細胞膜の調製は、
多くの方法によって可能であり、Ｃ−Ｓ結合の切断の性
質を溶菌物によって保持できる。例えば、フレンチプレ
スおよびその後の超音波によって溶菌させたロドコッカ
ス ロドクロウスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８では細胞
の生存力は５０倍低下したが、Ｃ−Ｓ結合の切断の活性
は元の値のわずか３分の１に低下したにすぎず、また一
方でフレンチプレス処理のみでは細胞の約６３％を破壊
し、Ｃ−Ｓ結合の切断の活性の約９２％を保持した。Ｃ
−Ｓ結合の切断の活性は上澄には全く検出されなかっ
た。これらのデータから、細胞膜のエキストラクトはＣ
−Ｓ結合の切断の活性のために効果的であることが明ら
かになる。しかし、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．５３９６８微生物は大腸菌およびＢ．サブチ
リス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりも溶菌させるのがよ
り困難であることが見い出された。
者によく知られているように、超音波、界面活性剤の使
用またはフレンチプレスの使用のような溶菌の過程によ
って上述の微生物からの溶菌物として調製できる。選択
的なＣ−Ｓ結合の切断に関する生化学的な活性が産物中
に存在するかぎりは、細胞膜の断片の濃縮物を提供する
任意の過程を使用できる。溶菌による細胞膜の調製は、
多くの方法によって可能であり、Ｃ−Ｓ結合の切断の性
質を溶菌物によって保持できる。例えば、フレンチプレ
スおよびその後の超音波によって溶菌させたロドコッカ
ス ロドクロウスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８では細胞
の生存力は５０倍低下したが、Ｃ−Ｓ結合の切断の活性
は元の値のわずか３分の１に低下したにすぎず、また一
方でフレンチプレス処理のみでは細胞の約６３％を破壊
し、Ｃ−Ｓ結合の切断の活性の約９２％を保持した。Ｃ
−Ｓ結合の切断の活性は上澄には全く検出されなかっ
た。これらのデータから、細胞膜のエキストラクトはＣ
−Ｓ結合の切断の活性のために効果的であることが明ら
かになる。しかし、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．５３９６８微生物は大腸菌およびＢ．サブチ
リス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）よりも溶菌させるのがよ
り困難であることが見い出された。
【００４３】上記の微生物の膜に関連する酵素を酵素の
抽出過程によって分離でき、それは有機物の炭素質の材
料中のＣ−Ｓ結合の切断が可能である。適当な酵素の抽
出過程は、当業者によく知られているような超音波、界
面活性剤による、またはフレンチプレスおよびその後の
硫安沈殿、分画、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳
動、等電点電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、免疫沈降または他の適当な手順による溶菌をふく
む。酵素または酵素群を抽出した形で使用でき、または
さらに精製することができて、そして精製した形で使用
できる。
抽出過程によって分離でき、それは有機物の炭素質の材
料中のＣ−Ｓ結合の切断が可能である。適当な酵素の抽
出過程は、当業者によく知られているような超音波、界
面活性剤による、またはフレンチプレスおよびその後の
硫安沈殿、分画、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳
動、等電点電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、免疫沈降または他の適当な手順による溶菌をふく
む。酵素または酵素群を抽出した形で使用でき、または
さらに精製することができて、そして精製した形で使用
できる。
【００４４】特定した微生物の膜の断片および／または
膜に関連した酵素の使用によって、微生物の生長に要求
される条件に十分な非水性または水性の培地および温度
を使用する、選択的な有機硫黄の除去の過程の使用が可
能になる。有機硫黄の大部分を除去するのに十分な時間
に効率を高めた接触の両立性のための有機物の媒体中で
硫黄に特異的な反応試薬と接触させることによって、有
機硫黄を含む炭素質の材料から有機硫黄を選択的に除去
するのが好ましい。本発明に従って、硫黄に特異的な反
応試薬は、石油のような有機硫黄を含む有機物の炭素質
の液体と直接混合することができ、乳化を促進するため
に乳化剤を含ませることができ、または有機硫黄を含む
有機物の炭素質の固体を接触させるための有機物の液体
と混合することができる。過程の時間的な制約の中で有
機硫黄の大部分と選択的に反応するのに有効な濃度とな
る十分な量を使用するべきであり、これらの両方を当業
者は特定の反応試薬について確認できる。有機物の液体
の媒体の中で本発明に従った硫黄に特異的な反応試薬の
使用は、微生物の生長および／または微生物の使用また
は水性の媒体中での産物が有機硫黄の除去に依存すると
きに存在する水／油の境界を作らないですませることが
できる。もし希望するならば、硫黄に特異的な反応試薬
を水性の媒体中で使用できる。非水性の液体の使用によ
って、水性の媒体と比較して触媒速度がより高く、基質
の利用の範囲が広がり、安定性が上昇するので、非水性
の液体の使用が好ましい。微生物の生長が硫黄の除去に
依存しているときに許容されるよりも高い温度における
硫黄の除去の過程の操作によって、有機硫黄の除去をよ
り高い速度で行うことができる。硫黄を除去する反応速
度は、約３５℃以上の温度で上昇するかもしれず、約３
５℃から約１００℃が適しており、水性の媒体には約３
５℃から約４５℃が好ましく、非水性の媒体には約３５
℃から約６０℃が好ましい。遺伝子の修飾によって得ら
れるより高温に耐えられる誘導株の微生物を用いると、
これらの温度は制限されなくなることも考えられる。そ
のうえ、有機または無機硫黄を、単一のまたは連続的な
非水性の媒体の過程において除去できる。極めて有効な
化学反応を行えることが当業者に知られている接触の任
意の方法を使用できて、例えば、約８０パーセント以上
の有機硫黄を除去するのに十分な時間に培養の生長を制
限する温度よりも高温で、ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８から得た膜の断片から成る
エキストラクトの油を基にした液体の媒体の中でグラウ
ンドコールを攪拌することができる。
膜に関連した酵素の使用によって、微生物の生長に要求
される条件に十分な非水性または水性の培地および温度
を使用する、選択的な有機硫黄の除去の過程の使用が可
能になる。有機硫黄の大部分を除去するのに十分な時間
に効率を高めた接触の両立性のための有機物の媒体中で
硫黄に特異的な反応試薬と接触させることによって、有
機硫黄を含む炭素質の材料から有機硫黄を選択的に除去
するのが好ましい。本発明に従って、硫黄に特異的な反
応試薬は、石油のような有機硫黄を含む有機物の炭素質
の液体と直接混合することができ、乳化を促進するため
に乳化剤を含ませることができ、または有機硫黄を含む
有機物の炭素質の固体を接触させるための有機物の液体
と混合することができる。過程の時間的な制約の中で有
機硫黄の大部分と選択的に反応するのに有効な濃度とな
る十分な量を使用するべきであり、これらの両方を当業
者は特定の反応試薬について確認できる。有機物の液体
の媒体の中で本発明に従った硫黄に特異的な反応試薬の
使用は、微生物の生長および／または微生物の使用また
は水性の媒体中での産物が有機硫黄の除去に依存すると
きに存在する水／油の境界を作らないですませることが
できる。もし希望するならば、硫黄に特異的な反応試薬
を水性の媒体中で使用できる。非水性の液体の使用によ
って、水性の媒体と比較して触媒速度がより高く、基質
の利用の範囲が広がり、安定性が上昇するので、非水性
の液体の使用が好ましい。微生物の生長が硫黄の除去に
依存しているときに許容されるよりも高い温度における
硫黄の除去の過程の操作によって、有機硫黄の除去をよ
り高い速度で行うことができる。硫黄を除去する反応速
度は、約３５℃以上の温度で上昇するかもしれず、約３
５℃から約１００℃が適しており、水性の媒体には約３
５℃から約４５℃が好ましく、非水性の媒体には約３５
℃から約６０℃が好ましい。遺伝子の修飾によって得ら
れるより高温に耐えられる誘導株の微生物を用いると、
これらの温度は制限されなくなることも考えられる。そ
のうえ、有機または無機硫黄を、単一のまたは連続的な
非水性の媒体の過程において除去できる。極めて有効な
化学反応を行えることが当業者に知られている接触の任
意の方法を使用できて、例えば、約８０パーセント以上
の有機硫黄を除去するのに十分な時間に培養の生長を制
限する温度よりも高温で、ロドコッカス ロドクロウス
ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８から得た膜の断片から成る
エキストラクトの油を基にした液体の媒体の中でグラウ
ンドコールを攪拌することができる。
【００４５】硫黄を含む有機物の炭素質の材料の硫黄の
含有量は、そのような硫黄を含む有機物の炭素質の材料
を本発明に従って硫黄に特異的な反応試薬に接触させる
ことによって減少させることができる。この過程は、硫
黄を含む炭素質の材料が石炭または炭化水素の油のとき
の使用に特に適している。そのような過程は、有機物に
結合した硫黄の８０パーセント以上、好ましくは９０パ
ーセント以上の除去をもたらすことができる。
含有量は、そのような硫黄を含む有機物の炭素質の材料
を本発明に従って硫黄に特異的な反応試薬に接触させる
ことによって減少させることができる。この過程は、硫
黄を含む炭素質の材料が石炭または炭化水素の油のとき
の使用に特に適している。そのような過程は、有機物に
結合した硫黄の８０パーセント以上、好ましくは９０パ
ーセント以上の除去をもたらすことができる。
【００４６】本発明に従った選択的な硫黄の反応試薬
は、有機物の炭素質の材料中のＣ−Ｓ結合の切断によっ
て硫黄と独特に反応する；例えば、ジベンゾチオフェン
との反応においては有機物の最終産物は２−ヒドロキシ
ビフェニルである。これらの性質のために本発明の選択
的な硫黄の反応試薬は、有機合成系の過程、除草剤、殺
虫剤、デフェシンなどにおけるような有機硫黄化合物の
分解または合成のための、および酵素電極および免疫学
の実験におけるような診断学、検出および定量における
使用のための、有機Ｃ−Ｓ結合の切断のための特異的な
試薬である。同様に、本発明の選択的な硫黄の反応試薬
は、ゴム製品中の硫黄を含む有機分子の分解におけるよ
うな、再生利用のための操作における有機Ｃ−Ｓ結合の
切断による、広範な有機物の材料を脱硫させる分解にお
いて利用できる。
は、有機物の炭素質の材料中のＣ−Ｓ結合の切断によっ
て硫黄と独特に反応する；例えば、ジベンゾチオフェン
との反応においては有機物の最終産物は２−ヒドロキシ
ビフェニルである。これらの性質のために本発明の選択
的な硫黄の反応試薬は、有機合成系の過程、除草剤、殺
虫剤、デフェシンなどにおけるような有機硫黄化合物の
分解または合成のための、および酵素電極および免疫学
の実験におけるような診断学、検出および定量における
使用のための、有機Ｃ−Ｓ結合の切断のための特異的な
試薬である。同様に、本発明の選択的な硫黄の反応試薬
は、ゴム製品中の硫黄を含む有機分子の分解におけるよ
うな、再生利用のための操作における有機Ｃ−Ｓ結合の
切断による、広範な有機物の材料を脱硫させる分解にお
いて利用できる。
【００４７】生物学的な膜は一般的に疎水性であり、従
って膜の断片および膜に関連した酵素から成るエキスト
ラクトには非水性の系が好ましいのは当然である。硫黄
に選択的な微生物であるロドコッカス ロドクロウス菌
株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス スフェ
リクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９の膜の断片およ
び膜に関連した酵素から成る、本発明によるエキストラ
クトは、炭素質の材料からの有機および無機硫黄の両方
を同時に除去する可能性のような、性能の改善および方
法の融通性をもたらすことができる。有機物の液体中で
の、膜の断片および酵素の使用によって、触媒の速度を
数百倍に上昇させることができて、作用する基質の範囲
を拡大でき、ｐＨ、温度、および他の環境のストレスに
対する耐性を劇的に改善できる。例えば、パーオキシダ
ーゼが触媒するピロガロールの酸化の活性は、水中での
活性に対してオクタール中で酵素の逆性ミセルを用いる
と百倍に上昇する、マルチネク，Ｋ．（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｋ，Ｋ．）、レバショフ，Ａ．Ｖ．（Ｌｅｖａｓｈｏ
ｖ，Ａ．Ｖ．）、クリャシコ，Ｎ．（Ｋｌｙａｃｈｋ
ｏ，Ｎ．）、ヘメルニツキ、Ｙ．Ｌ．（Ｋｈｍｅｌｎｉ
ｔｓｋｉ，Ｙ．Ｌ．），およびベレジン，Ｉ．Ｖ．（Ｂ
ｅｒｅｚｉｎ，Ｉ．Ｖ．）の「ミセルの酵素学」（“Ｍ
ｉｃｅｌｌａｒ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”），Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１５５、４５３−４６８（１９８６）；
非水性または低水性の系での酵素の使用は、ヘメルニツ
キ，Ｙ．Ｌ．（Ｋｈｍｅｌｎｉｔｓｋｙ，Ｙ．Ｌ．）、
レバショフ，Ａ．Ｖ．、クリャシコ，Ｎ．Ｌ．およびマ
ルチネク，Ｋ．の「水の含量の低い有機物の媒体中での
工学的な生体の触媒のシステム」（“Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｌｏｗ
Ｗａｔｅｒ Ｃｏｎｔｅｎｔ”、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉ
ｃｒｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０（１９８８年１２月）
中で論評されている；および逆性ミセルの溶液を用いた
石炭の処理における生物学的な反応は、細胞全体の調製
物よりも優れた、Ｔ．フェロオキシダンス（Ｔ．ｆｅｒ
ｒｏｘｉｄａｎｓ）の細胞のセルフリーの酵素のエキス
トラクトを示した、リー，Ｋ．Ｉ．（Ｌｅｅ，Ｋ．
Ｉ．）およびイェン，Ｔ．Ｆ．（Ｙｅｎ，Ｔ．Ｆ．）の
「逆性ミセルの生体活性の過程における石炭からの脱
硫」（“Ｃｏａｌ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ
Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｍｉｃｅｌｌｅ Ｂ
ｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ，”）、アメ
リカ化学会の燃料化学部会、国際シンポジウム、ロサン
ゼルス、１９８８年９月２５−３０日。 細胞膜および
／またはそれに由来する酵素を利用する本発明の方法
を、統合した方法を提供するための他の方法と関連させ
て都合よく使用することができる。例えば、無機および
有機硫黄の両方の除去；およびより有効に硫黄を除去す
るためのより広い活性表面の範囲を提供するために、石
炭の孔の構造を拡大する化学的および／または物理的な
方法。
って膜の断片および膜に関連した酵素から成るエキスト
ラクトには非水性の系が好ましいのは当然である。硫黄
に選択的な微生物であるロドコッカス ロドクロウス菌
株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス スフェ
リクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９の膜の断片およ
び膜に関連した酵素から成る、本発明によるエキストラ
クトは、炭素質の材料からの有機および無機硫黄の両方
を同時に除去する可能性のような、性能の改善および方
法の融通性をもたらすことができる。有機物の液体中で
の、膜の断片および酵素の使用によって、触媒の速度を
数百倍に上昇させることができて、作用する基質の範囲
を拡大でき、ｐＨ、温度、および他の環境のストレスに
対する耐性を劇的に改善できる。例えば、パーオキシダ
ーゼが触媒するピロガロールの酸化の活性は、水中での
活性に対してオクタール中で酵素の逆性ミセルを用いる
と百倍に上昇する、マルチネク，Ｋ．（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｋ，Ｋ．）、レバショフ，Ａ．Ｖ．（Ｌｅｖａｓｈｏ
ｖ，Ａ．Ｖ．）、クリャシコ，Ｎ．（Ｋｌｙａｃｈｋ
ｏ，Ｎ．）、ヘメルニツキ、Ｙ．Ｌ．（Ｋｈｍｅｌｎｉ
ｔｓｋｉ，Ｙ．Ｌ．），およびベレジン，Ｉ．Ｖ．（Ｂ
ｅｒｅｚｉｎ，Ｉ．Ｖ．）の「ミセルの酵素学」（“Ｍ
ｉｃｅｌｌａｒ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”），Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１５５、４５３−４６８（１９８６）；
非水性または低水性の系での酵素の使用は、ヘメルニツ
キ，Ｙ．Ｌ．（Ｋｈｍｅｌｎｉｔｓｋｙ，Ｙ．Ｌ．）、
レバショフ，Ａ．Ｖ．、クリャシコ，Ｎ．Ｌ．およびマ
ルチネク，Ｋ．の「水の含量の低い有機物の媒体中での
工学的な生体の触媒のシステム」（“Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｌｏｗ
Ｗａｔｅｒ Ｃｏｎｔｅｎｔ”、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉ
ｃｒｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０（１９８８年１２月）
中で論評されている；および逆性ミセルの溶液を用いた
石炭の処理における生物学的な反応は、細胞全体の調製
物よりも優れた、Ｔ．フェロオキシダンス（Ｔ．ｆｅｒ
ｒｏｘｉｄａｎｓ）の細胞のセルフリーの酵素のエキス
トラクトを示した、リー，Ｋ．Ｉ．（Ｌｅｅ，Ｋ．
Ｉ．）およびイェン，Ｔ．Ｆ．（Ｙｅｎ，Ｔ．Ｆ．）の
「逆性ミセルの生体活性の過程における石炭からの脱
硫」（“Ｃｏａｌ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ
Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｍｉｃｅｌｌｅ Ｂ
ｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ，”）、アメ
リカ化学会の燃料化学部会、国際シンポジウム、ロサン
ゼルス、１９８８年９月２５−３０日。 細胞膜および
／またはそれに由来する酵素を利用する本発明の方法
を、統合した方法を提供するための他の方法と関連させ
て都合よく使用することができる。例えば、無機および
有機硫黄の両方の除去；およびより有効に硫黄を除去す
るためのより広い活性表面の範囲を提供するために、石
炭の孔の構造を拡大する化学的および／または物理的な
方法。
【００４８】細胞膜および／またはそれに由来する酵素
を利用する、本発明による硫黄に特異的な反応試薬を調
製して、未来の使用のために、Ｃ−Ｓ結合の切断の能力
を失うことなく凍結乾燥および冷凍によって保存するこ
とができる。ロドコッカスロドクロウスＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．５３９６８の細胞を凍結乾燥して、凍結乾燥した直
後には凍結乾燥の前と実験誤差内で同じＣ−Ｓ結合の切
断活性をもつことが明らかになった。凍結乾燥した細胞
をスクリューキャップ付きのボトルに入れてアルミニウ
ムホイルで包み１．５週間室温で保持すると、元のＣ−
Ｓ結合の活性の約２３％の損失を示した。同種の細胞を
液体窒素中で急速凍結して凍結乾燥し、その後室温で２
４時間保存すると、急速凍結および凍結乾燥する以前と
本質的に変わらないＣ−Ｓ結合の切断特性を保持してい
ることが明らかになった。１０％グリセロール中の同種
の細胞を予め急速凍結させずに−７０℃のフリーザーに
置いて凍結した。−７０℃で一晩および７日間保存した
後では、細胞は元のＣ−Ｓ結合を切断する能力を示した
が、−７０℃で８週間保存した後では、細胞は元のＣ−
Ｓ結合を切断する活性の約９１．５％を示した。本発明
の生体触媒を一カ所で調製して、凍結乾燥して、そして
周囲の温度で希望の使用する場所へ輸送して、重さと体
積を大幅に減らすことができることをこの研究は証明し
ている。
を利用する、本発明による硫黄に特異的な反応試薬を調
製して、未来の使用のために、Ｃ−Ｓ結合の切断の能力
を失うことなく凍結乾燥および冷凍によって保存するこ
とができる。ロドコッカスロドクロウスＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．５３９６８の細胞を凍結乾燥して、凍結乾燥した直
後には凍結乾燥の前と実験誤差内で同じＣ−Ｓ結合の切
断活性をもつことが明らかになった。凍結乾燥した細胞
をスクリューキャップ付きのボトルに入れてアルミニウ
ムホイルで包み１．５週間室温で保持すると、元のＣ−
Ｓ結合の活性の約２３％の損失を示した。同種の細胞を
液体窒素中で急速凍結して凍結乾燥し、その後室温で２
４時間保存すると、急速凍結および凍結乾燥する以前と
本質的に変わらないＣ−Ｓ結合の切断特性を保持してい
ることが明らかになった。１０％グリセロール中の同種
の細胞を予め急速凍結させずに−７０℃のフリーザーに
置いて凍結した。−７０℃で一晩および７日間保存した
後では、細胞は元のＣ−Ｓ結合を切断する能力を示した
が、−７０℃で８週間保存した後では、細胞は元のＣ−
Ｓ結合を切断する活性の約９１．５％を示した。本発明
の生体触媒を一カ所で調製して、凍結乾燥して、そして
周囲の温度で希望の使用する場所へ輸送して、重さと体
積を大幅に減らすことができることをこの研究は証明し
ている。
【００４９】１つの重要なＣ−Ｓ結合の切断は、デフェ
ンシンを生長条件下の微生物の少なくとも１種、微生物
の膜の断片から成るエキストラクト、微生物の細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素から選択した少なくとも
１つの硫黄に特異的な反応試薬と接触させることによっ
て達成できるのだが、その際に各々の硫黄に特異的な反
応試薬は有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもっていなけ
ればならない。ロドコッカス ロドクロウスおよびバシ
ルス スフェリクスの微生物、特にロドコッカスロドク
ロウス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス
スフェリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８および
その誘導株の微生物は有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断を
示し、デフェンシンの生化学的な不活化および修飾に適
している。本明細書中で使用される生化学的な不活化お
よび修飾という用語は、デフェンシン分子中のジスルフ
ィド結合の有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断のための、微
生物の生体内での作用、および膜の断片および細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素のような、微生物が生産
する試薬の試験管内での作用を含むことを確めておく。
ンシンを生長条件下の微生物の少なくとも１種、微生物
の膜の断片から成るエキストラクト、微生物の細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素から選択した少なくとも
１つの硫黄に特異的な反応試薬と接触させることによっ
て達成できるのだが、その際に各々の硫黄に特異的な反
応試薬は有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもっていなけ
ればならない。ロドコッカス ロドクロウスおよびバシ
ルス スフェリクスの微生物、特にロドコッカスロドク
ロウス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス
スフェリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８および
その誘導株の微生物は有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断を
示し、デフェンシンの生化学的な不活化および修飾に適
している。本明細書中で使用される生化学的な不活化お
よび修飾という用語は、デフェンシン分子中のジスルフ
ィド結合の有機Ｃ−Ｓ結合の選択的な切断のための、微
生物の生体内での作用、および膜の断片および細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素のような、微生物が生産
する試薬の試験管内での作用を含むことを確めておく。
【００５０】本明細書中で使用されるデフェンシンとい
う用語は、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイ
ン残基をもち、デフェンシンとして知られている炭水化
物を含まないポリペプチドのような、複数のジスルフィ
ド結合をもつ有機物のポリペプチドを含むことを意味す
る。デフェンシンは２９から３４個のアミノ酸を含む類
似の、炭水化物を含まないペプチドのグループであり、
各々のデフェンシンは３つの特徴的な分子内ジスルフィ
ド結合を形成する６つのシステイン残基を含む。好中球
に由来する天然のペプチド性抗生物質であるデフェンシ
ンは、昆虫にはもちろんヒトおよび他の哺乳動物にも存
在することが知られており、内在的な宿主の防御組織の
基本的な成分であると思われる。デフェンシンは抗菌抗
真菌、抗ウイルス、および細胞毒性の活性を宿主の防御
組織中で示す天然のペプチド性抗生物質なので、特に重
要な有機物のジスルフィドである。システイン残基は有
機Ｃ−Ｓ結合を形成し、その存在はデフェンシンのこれ
らの活性に不可欠であることが明らかになった。従っ
て、デフェンシンのＣ−Ｓ結合の切断によってデフェン
シンを不活化できると思われ、これはデフェンシンの不
適当な生産によって引き起こされる事故免疫疾患を軽減
するのに有効となりうる。作物の損害の制御のための
「自然の方法」における昆虫またはネモトーズ（ｎｅｍ
ｏｔｏｄｅｓ）の駆除のような、デフェンシンが存在す
る生物の駆除のためにデフェンシンの分解を使用するこ
ともできる。昆虫の幼虫が摂食すると、それを殺す有害
なタンパクを放出するバクテリアを用いた蚊および黒色
の昆虫の制御におけるような、昆虫の害虫のためのおよ
び蚊の幼虫の制御のための天然の制御の試薬として微生
物を使用してきた。
う用語は、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイ
ン残基をもち、デフェンシンとして知られている炭水化
物を含まないポリペプチドのような、複数のジスルフィ
ド結合をもつ有機物のポリペプチドを含むことを意味す
る。デフェンシンは２９から３４個のアミノ酸を含む類
似の、炭水化物を含まないペプチドのグループであり、
各々のデフェンシンは３つの特徴的な分子内ジスルフィ
ド結合を形成する６つのシステイン残基を含む。好中球
に由来する天然のペプチド性抗生物質であるデフェンシ
ンは、昆虫にはもちろんヒトおよび他の哺乳動物にも存
在することが知られており、内在的な宿主の防御組織の
基本的な成分であると思われる。デフェンシンは抗菌抗
真菌、抗ウイルス、および細胞毒性の活性を宿主の防御
組織中で示す天然のペプチド性抗生物質なので、特に重
要な有機物のジスルフィドである。システイン残基は有
機Ｃ−Ｓ結合を形成し、その存在はデフェンシンのこれ
らの活性に不可欠であることが明らかになった。従っ
て、デフェンシンのＣ−Ｓ結合の切断によってデフェン
シンを不活化できると思われ、これはデフェンシンの不
適当な生産によって引き起こされる事故免疫疾患を軽減
するのに有効となりうる。作物の損害の制御のための
「自然の方法」における昆虫またはネモトーズ（ｎｅｍ
ｏｔｏｄｅｓ）の駆除のような、デフェンシンが存在す
る生物の駆除のためにデフェンシンの分解を使用するこ
ともできる。昆虫の幼虫が摂食すると、それを殺す有害
なタンパクを放出するバクテリアを用いた蚊および黒色
の昆虫の制御におけるような、昆虫の害虫のためのおよ
び蚊の幼虫の制御のための天然の制御の試薬として微生
物を使用してきた。
【００５１】昆虫の病原菌として作用する他の微生物は
昆虫に感染して病気／死を引き起こすことができる。ラ
ンベルト，Ｊ．Ｅ．（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｅ．）らの
Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙに記載されているよう
にキセノラブドス ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂ
ｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）およびエンテロバ
クター クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌ
ｏａｃａｅ）が例である：ウサギ肺の抗菌性ペプチドと
相同性のある配列をもつ２つの昆虫の抗菌性ペプチド
の、双翅類のホルミア テラノバエ（Ｐｈｏｒｍｉａ
ｔｅｒｒａｎｏｖａｅ）の免疫血液からの単離（Ｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＩｍｍｕｎｅＢｌｏｏｄ ｏ
ｆ Ｄｉｐｔｅｒａｎ Ｐｈｏｒｍｉａ ｔｅｒｒａｎ
ｏｖａｅｏｆ Ｔｗｏ Ｉｎｓｅｃｔ Ａｎｔｉｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａ Ｓｉ
ｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｒａｂｂｉｔ
Ｌｕｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｄａｌ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６，２６２−２６６ページ（１９８９）。昆虫の
病原菌である微生物は、感染しようとして戦う試みの際
に昆虫が生産するデフェンシンによって攻撃されると期
待できる。有機Ｃ−Ｓ結合の切断の結果としてデフェン
シンの不活化は、昆虫の病原菌の感染の性質、およびそ
れゆえに昆虫を駆除するときの病原菌の有効性を増強す
るであろうし、それによって作物の損害のような昆虫の
望ましくない効果を軽減するだろう。
昆虫に感染して病気／死を引き起こすことができる。ラ
ンベルト，Ｊ．Ｅ．（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｅ．）らの
Ｉｎｓｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙに記載されているよう
にキセノラブドス ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂ
ｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）およびエンテロバ
クター クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌ
ｏａｃａｅ）が例である：ウサギ肺の抗菌性ペプチドと
相同性のある配列をもつ２つの昆虫の抗菌性ペプチド
の、双翅類のホルミア テラノバエ（Ｐｈｏｒｍｉａ
ｔｅｒｒａｎｏｖａｅ）の免疫血液からの単離（Ｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＩｍｍｕｎｅＢｌｏｏｄ ｏ
ｆ Ｄｉｐｔｅｒａｎ Ｐｈｏｒｍｉａ ｔｅｒｒａｎ
ｏｖａｅｏｆ Ｔｗｏ Ｉｎｓｅｃｔ Ａｎｔｉｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａ Ｓｉ
ｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｒａｂｂｉｔ
Ｌｕｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｄａｌ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６，２６２−２６６ページ（１９８９）。昆虫の
病原菌である微生物は、感染しようとして戦う試みの際
に昆虫が生産するデフェンシンによって攻撃されると期
待できる。有機Ｃ−Ｓ結合の切断の結果としてデフェン
シンの不活化は、昆虫の病原菌の感染の性質、およびそ
れゆえに昆虫を駆除するときの病原菌の有効性を増強す
るであろうし、それによって作物の損害のような昆虫の
望ましくない効果を軽減するだろう。
【００５２】有機Ｃ−Ｓ結合の切断は、次に迅速な分光
学的なアッセイの技術によって同定できる、特定のデフ
ェンシンの特定の構造に特徴的な特定のアミノ酸および
短いポリペプチドへの分解をもたらすので、デフェンシ
ンのＣ−Ｓ結合の切断は特定のデフェンシンのための診
断／アッセイの方法として使用することもできる。効能
を増強する、バクテリアの防御機構を克服する、および
元の天然に存在する抗生物質の分子が持っている特徴へ
付加的な特徴を提供することを可能にすることによって
特定の臨床上の活性を増強させることを可能にするため
の、特定の官能基の導入によってデフェンシンを変化さ
せるためにデフェンシンの有機Ｃ−Ｓ結合の切断を使用
することもできる。現在は天然に存在するデフェンシン
のみが利用できるが、しかし、現在は修飾した抗生物質
の使用が優勢であり、この傾向に合わせて、修飾したデ
フェンシンは現在利用できる天然のデフェンシンよりも
価値があることが証明されるかもしれない。別の手法で
は、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８お
よびバシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９のよう
な、選択的なＣ−Ｓ結合の切断の特性を示す、これらの
微生物中のＣ−Ｓ結合の切断をコードする遺伝子をクロ
ーニングして昆虫の病原菌に導入し、標的の微生物にそ
れ自身のＣ−Ｓ結合を切断する酵素を合成させることが
できる。スー，Ｊ．（Ｘｕ，Ｊ）、オイルソン，Ｍ．
Ｅ．（Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．）、カーン，Ｍ．Ｌ．（Ｋ
ａｈｎ，Ｍ．Ｌ．）およびフールベルト，Ｒ．Ｅ．（Ｈ
ｕｒｌｂｅｒｔ，Ｒ．Ｅ．）のキセノラブドス ネマト
フィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈ
ｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ１９０６１のＴｎ５によって誘導さ
れる変異体の特色（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｔｎ５−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏ
ｆ Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＡＴＣＣ１９０６１），Ａｐｐｌ．＆Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１７３−１１８０ページ，
４月（１９９１）により詳しく記述されたものと同様の
方法でこれを達成することができる。
学的なアッセイの技術によって同定できる、特定のデフ
ェンシンの特定の構造に特徴的な特定のアミノ酸および
短いポリペプチドへの分解をもたらすので、デフェンシ
ンのＣ−Ｓ結合の切断は特定のデフェンシンのための診
断／アッセイの方法として使用することもできる。効能
を増強する、バクテリアの防御機構を克服する、および
元の天然に存在する抗生物質の分子が持っている特徴へ
付加的な特徴を提供することを可能にすることによって
特定の臨床上の活性を増強させることを可能にするため
の、特定の官能基の導入によってデフェンシンを変化さ
せるためにデフェンシンの有機Ｃ−Ｓ結合の切断を使用
することもできる。現在は天然に存在するデフェンシン
のみが利用できるが、しかし、現在は修飾した抗生物質
の使用が優勢であり、この傾向に合わせて、修飾したデ
フェンシンは現在利用できる天然のデフェンシンよりも
価値があることが証明されるかもしれない。別の手法で
は、ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ５３９６８お
よびバシルス スフェリクスＡＴＣＣ５３９６９のよう
な、選択的なＣ−Ｓ結合の切断の特性を示す、これらの
微生物中のＣ−Ｓ結合の切断をコードする遺伝子をクロ
ーニングして昆虫の病原菌に導入し、標的の微生物にそ
れ自身のＣ−Ｓ結合を切断する酵素を合成させることが
できる。スー，Ｊ．（Ｘｕ，Ｊ）、オイルソン，Ｍ．
Ｅ．（Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．）、カーン，Ｍ．Ｌ．（Ｋ
ａｈｎ，Ｍ．Ｌ．）およびフールベルト，Ｒ．Ｅ．（Ｈ
ｕｒｌｂｅｒｔ，Ｒ．Ｅ．）のキセノラブドス ネマト
フィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈ
ｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ１９０６１のＴｎ５によって誘導さ
れる変異体の特色（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｔｎ５−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏ
ｆ Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＡＴＣＣ１９０６１），Ａｐｐｌ．＆Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１７３−１１８０ページ，
４月（１９９１）により詳しく記述されたものと同様の
方法でこれを達成することができる。
【００５３】デフェンシンの有機Ｃ−Ｓ結合による結合
の切断は、各々のＣ−Ｓ結合を切断した分子の一部分を
水素原子で、および分子の他の部分を水酸基でジスルフ
ィド結合を置換することになる。得られる水酸基は、他
の望ましい官能基の導入によってデフェンシンを後に修
飾するための、官能基の存在する反応性の高い部位を提
供することができる。デフェンシンは一般に１〜４個の
水酸基をもち、例えばヒト好中球タンパク−４（ＨＮＰ
−４）は１個の水酸基をもつが、Ｃ−Ｓ結合の切断によ
って３個まで増える。Ｃ−Ｓ結合の切断の結果として導
入される水酸基はデフェンシン分子中の唯一の水酸基と
いうわけでは必ずしもないのだが、それらはデフェンシ
ン分子中の水酸基の増加においては実質的な部分を占
め、従って一般的に、有機化学の反応の技術においてよ
く知られた任意の適当な技術によって導入される他の官
能基の中でも有力な地位を占める。
の切断は、各々のＣ−Ｓ結合を切断した分子の一部分を
水素原子で、および分子の他の部分を水酸基でジスルフ
ィド結合を置換することになる。得られる水酸基は、他
の望ましい官能基の導入によってデフェンシンを後に修
飾するための、官能基の存在する反応性の高い部位を提
供することができる。デフェンシンは一般に１〜４個の
水酸基をもち、例えばヒト好中球タンパク−４（ＨＮＰ
−４）は１個の水酸基をもつが、Ｃ−Ｓ結合の切断によ
って３個まで増える。Ｃ−Ｓ結合の切断の結果として導
入される水酸基はデフェンシン分子中の唯一の水酸基と
いうわけでは必ずしもないのだが、それらはデフェンシ
ン分子中の水酸基の増加においては実質的な部分を占
め、従って一般的に、有機化学の反応の技術においてよ
く知られた任意の適当な技術によって導入される他の官
能基の中でも有力な地位を占める。
【００５４】Ｃ−Ｓ結合の切断によるデフェンシンの生
化学的な不活性化および修飾のための本発明の過程は、
有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもつ生長条件下の微生
物、特にＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８を含めて微生物ロ
ドコッカス ロドクロウス、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６
９を含めてバシルス スフェリクスおよびそれらの誘導
株に、その微生物に対して有害ではないデフェンシンを
接触させることによって実行することができるが、微生
物を生長させるときの生長培地には無機栄養分および酸
素の存在下で同化できる炭素の供給源を含み、デフェン
シンを除けば硫黄を含む材料は実質的に存在しないもの
とする。デフェンシン、および有機Ｃ−Ｓ結合の選択的
切断能をもつ微生物の接触は、上に記載したような生長
培地中で実行することができ、あるいは有機Ｃ−Ｓ結合
の選択的切断能をもつ微生物を、宿主生物へ導入して、
そのような微生物のためのデフェンシンを含む生長培地
を提供することによって実行することができる。本明細
書で使用される生長培地という用語は、そのような生体
内の生長の環境を含む。
化学的な不活性化および修飾のための本発明の過程は、
有機Ｃ−Ｓ結合の選択的切断能をもつ生長条件下の微生
物、特にＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８を含めて微生物ロ
ドコッカス ロドクロウス、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６
９を含めてバシルス スフェリクスおよびそれらの誘導
株に、その微生物に対して有害ではないデフェンシンを
接触させることによって実行することができるが、微生
物を生長させるときの生長培地には無機栄養分および酸
素の存在下で同化できる炭素の供給源を含み、デフェン
シンを除けば硫黄を含む材料は実質的に存在しないもの
とする。デフェンシン、および有機Ｃ−Ｓ結合の選択的
切断能をもつ微生物の接触は、上に記載したような生長
培地中で実行することができ、あるいは有機Ｃ−Ｓ結合
の選択的切断能をもつ微生物を、宿主生物へ導入して、
そのような微生物のためのデフェンシンを含む生長培地
を提供することによって実行することができる。本明細
書で使用される生長培地という用語は、そのような生体
内の生長の環境を含む。
【００５５】デフェンシン中の有機Ｃ−Ｓ結合の選択的
な切断は、本発明の方法によって、膜の断片、細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素およびそれらの混合物か
ら成るエキストラクトであってよい、硫黄に特異的な反
応の材料に、デフェンシンを接触させることによって行
うこともできるのだが、その際には膜は、有機Ｃ−Ｓ結
合の選択的切断能をもつ微生物から得るものとする。特
に適当なのは、上に記載したように、ロドコッカス ロ
ドクロウスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス
スフェリクスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９およびそれ
らの誘導株として同定されて、それらが生産した、変異
体の微生物に由来する膜の断片および／または膜に関連
した酵素または酵素群である。非水性または水性の媒体
の中での膜のエキストラクトおよび酵素について上で記
載したのと同じ方法で、接触を行うことができる。
な切断は、本発明の方法によって、膜の断片、細胞膜に
関連した少なくとも１つの酵素およびそれらの混合物か
ら成るエキストラクトであってよい、硫黄に特異的な反
応の材料に、デフェンシンを接触させることによって行
うこともできるのだが、その際には膜は、有機Ｃ−Ｓ結
合の選択的切断能をもつ微生物から得るものとする。特
に適当なのは、上に記載したように、ロドコッカス ロ
ドクロウスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６８およびバシルス
スフェリクスＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９およびそれ
らの誘導株として同定されて、それらが生産した、変異
体の微生物に由来する膜の断片および／または膜に関連
した酵素または酵素群である。非水性または水性の媒体
の中での膜のエキストラクトおよび酵素について上で記
載したのと同じ方法で、接触を行うことができる。
【００５６】上述の明細書中では、本発明をそれのある
種の好ましい態様に関連させて記載してきたが、多くの
詳細は説明の目的で記述したものであり、本発明を他の
態様においても使用できて、本発明の基本的な原理から
大きくはずれることなく、本明細書中で記載したある部
分の細部を変更することができる、ということは当業者
には明らかであろう。
種の好ましい態様に関連させて記載してきたが、多くの
詳細は説明の目的で記述したものであり、本発明を他の
態様においても使用できて、本発明の基本的な原理から
大きくはずれることなく、本明細書中で記載したある部
分の細部を変更することができる、ということは当業者
には明らかであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 11/00 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (18)
- 【請求項１】 生長条件下の少なくとも１種の微生物、
微生物の膜の断片を含むエキストラクト、および微生物
の細胞膜に関連した少なくとも１種の酵素より成る群か
ら選択される、少なくとも１種の、硫黄に特異的な反応
試薬であり、前記の各硫黄特異性反応試薬が有機Ｃ−Ｓ
結合の選択的切断能をもつ試薬に、硫黄を含む有機炭素
質物質を接触させることを含んで成る、炭素質物質中の
有機Ｃ−Ｓ結合の切断法。 - 【請求項２】 前記の微生物が、ロドコッカス ロドク
ロウス、バシルススフェリクス、それらの混合物および
それらの誘導株から選択される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 前記の微生物が、ロドコッカス ロドク
ロウス菌株ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８、バシルス スフ
ェリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９、それらの混
合物およびそれらの誘導株から選択される、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項４】 前記の微生物がロドコッカス ロドクロ
ウス菌株ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８およびその誘導株で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記の微生物がバシルス スフェリクス
菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９およびその誘導株であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記の有機炭素質物質が、石炭、炭化水
素油およびデフェンシンから選択される、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項７】 前記の有機炭素質物質が前記の微生物に
有害ではなく、かつ前記の接触に、微生物の生長条件下
での有機Ｃ−Ｓ結合の切断によって、前記の有機炭素質
物質の硫黄と選択的に反応する能力をもつ、ロドコッカ
ス ロドクロウス、バシルス スファエリクス、それら
の混合物およびそれらの誘導株から選択される、生長条
件下の微生物を用いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記の硫黄特異的反応試薬が水性の媒体
中に存在する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記の硫黄特異的反応試薬が、有機Ｃ−
Ｓ結合の切断によって硫黄を含む有機炭素質物質の硫黄
と選択的に反応する能力をもつ、細胞膜の断片を含むエ
キストラクト、細胞膜に関連した少なくとも１種の酵素
およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１０】 前記の膜が、有機Ｃ−Ｓ結合の切断に
よって硫黄を含む有機炭素質物質の硫黄と選択的に反応
する能力をもつ、ロドコッカス ロドクロウス、バシル
ス スフェリクスおよびそれらの誘導株から選択される
微生物から調製される、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記の膜が、ロドコッカス ロドクロ
ウス菌株ＡＴＣＣＮｏ．５３９６８、バシルス スファ
エリクス菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３９６９、それらの混
合物およびそれらの誘導株から選択される微生物から調
製される、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記の硫黄特異的反応試薬が有機媒体
中に存在する、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記の硫黄特異的反応試薬が前記のエ
キストラクトから成り、かつ有機媒体中に存在する、請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記の硫黄特異的反応試薬が前記の酵
素から成り、かつ有機媒体中に存在する、請求項９に記
載の方法。 - 【請求項１５】 前記の接触が約３５℃から約１００℃
の温度で行われる、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１６】 炭素質物質中の有機Ｃ−Ｓ結合の前記
の切断によって、石炭および炭化水素油から選択される
前記の炭素質物質の硫黄含有量を低下させる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１７】 有機Ｃ−Ｓ結合の前記の切断がデフェ
ンシン中で起きて、デフェンシンを不活化または修飾す
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記の接触が、Ｃ−Ｓ結合を選択的に
切断すること、および前記の切断の部位に望ましい化学
的な官能基を付加することによる、デフェンシンの生化
学的な修飾のためである、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85014092A | 1992-03-12 | 1992-03-12 | |
| US07/850,081 US5358869A (en) | 1990-01-05 | 1992-03-12 | Microbial cleavage of organic C-S bonds |
| US890190 | 1992-05-28 | ||
| US07/890,190 US5344778A (en) | 1990-02-28 | 1992-05-28 | Process for enzymatic cleavage of C-S bonds and process for reducing the sulfur content of sulfur-containing organic carbonaceous material |
| US850081 | 1992-05-28 | ||
| US850140 | 1992-05-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0654695A true JPH0654695A (ja) | 1994-03-01 |
Family
ID=27420345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5052304A Pending JPH0654695A (ja) | 1992-03-12 | 1993-03-12 | 有機ｃ−ｓ結合の生化学的切断 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0562313A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0654695A (ja) |
| MX (1) | MX9301323A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06296483A (ja) * | 1993-04-14 | 1994-10-25 | Hokkaido Togyo Kk | バチルス属に属する新規微生物 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1283233B1 (it) * | 1996-03-12 | 1998-04-16 | Eniricerche Spa | Arthrobacter sp. e suo impiego per la desolforazione di combustibili fossili |
| RU2137839C1 (ru) * | 1998-06-05 | 1999-09-20 | Курашов Виктор Михайлович | Микробиологический способ снижения содержания серы и азота в нефти и сероводорода в пластовых водах и попутных газах |
| GB0304574D0 (en) | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Univ Napier | Method |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5002888A (en) * | 1990-01-05 | 1991-03-26 | Institute Of Gas Technology | Mutant microorganisms useful for cleavage of organic C-S bonds |
| US5104801A (en) * | 1990-01-05 | 1992-04-14 | Institute Of Gas Technology | Mutant microorganisms useful for cleavage of organic c-s bonds |
| US5132219A (en) * | 1990-02-28 | 1992-07-21 | Institute Of Gas Technology | Enzymes from Rhodococcus rhodochrous strain ATCC No. 53968, Bacillus sphaericus strain ATCC No. 53969 and mixtures thereof for cleavage of organic C--S bonds of carbonaceous material |
| US5232854A (en) * | 1991-03-15 | 1993-08-03 | Energy Biosystems Corporation | Multistage system for deep desulfurization of fossil fuels |
-
1993
- 1993-03-03 EP EP93103355A patent/EP0562313A1/en not_active Withdrawn
- 1993-03-10 MX MX9301323A patent/MX9301323A/es unknown
- 1993-03-12 JP JP5052304A patent/JPH0654695A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06296483A (ja) * | 1993-04-14 | 1994-10-25 | Hokkaido Togyo Kk | バチルス属に属する新規微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0562313A1 (en) | 1993-09-29 |
| MX9301323A (es) | 1995-01-31 |
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| Yuda | United States Patent po |