JPH0579308B2 - - Google Patents
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- JPH0579308B2 JPH0579308B2 JP60121627A JP12162785A JPH0579308B2 JP H0579308 B2 JPH0579308 B2 JP H0579308B2 JP 60121627 A JP60121627 A JP 60121627A JP 12162785 A JP12162785 A JP 12162785A JP H0579308 B2 JPH0579308 B2 JP H0579308B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はDNAの組み換え技術を用いてアミラ
ーゼのコードされた遺伝子を有するベクターが導
入される宿主として有用なバチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）の新規なアミラーゼ非産生
突然変異株に関する。 細菌の遺伝物質の大部分は、細胞中の染色体に
巨大なDNA分子として存在している。ある量の
遺伝物質は、プラスミドとして知られる、より小
さな環の閉じたDNA分子の形で存在する場合も
ある。特異な遺伝的性質に関連したDNA分子の
部分を遺伝子と呼称する。 遺伝子工学に関連する技術によつて、特別な蛋
白質をその産生物質としてコードしている遺伝子
を、一つの微生物から他の微生物へと移すことが
可能である。新しい遺伝物質を受容する微生物を
宿主と呼称する。多くの研究者は、これらの技術
を用いて、ある特別な蛋白質例えば酸素などを産
生することにすぐれた微生物を供給してきた。 連続した遺伝子が環状の形に連鎖しているプラ
スミドは、ある微生物の細胞からの移動と他の微
生物の細胞への導入が比較的容易になされうるこ
とが発見されている。また、プラスミドは、新し
い遺伝物質を宿主体に導入するペクターとしても
使用可能である。このことは制限酵素として知ら
れる、環状DNAを開裂させる酵素によるプラス
ミドの最初の切断により遂行される。所望の遺伝
子を含有する異種DNA鎖はDNA環の切断された
部分に挿入される。環状構造はDNAリガーゼに
よる処理で再構成される。新しい環状DNA分子
である再構成されたプラスミドは、元のプラスミ
ドの遺伝子に加えて、挿入されたDNAの小鎖で
ある新しい遺伝子を含有している。このプラスミ
ドは宿主微生物体中に導入されうる。ついで新し
い遺伝子を含むプラスミドは、宿主微生物体中で
複製され、その遺伝物質の一部となる。 遺伝子工学で適切な宿主微生物体として用いら
れるためには、新しいDNAの導入が可能でなけ
ればならない。さらに、新らたに挿入された遺伝
子にコードされた遺伝的性質を発現することが実
行可能な微生物が得られなければならない。有用
な量の蛋白質を産生する微生物であるには、その
微生物はまた工業規模で生育できるものでなけれ
ばならない。 新しいDNA組み換え技術を用いた実験から、
新しい遺伝物質を導入された微生物は、ヒト、動
物および植物に有害な物質を産生する可能性があ
るとみなされている。この判断から、1978年にナ
シヨナル・インステイテユート・オブ・ヘルス
（NIH）は「DNA分子組み換えに伴う実験の手
引き」を発行した。この手引き書には、遺伝子工
学実験が行なわれる実験室における物理的封じ込
めのための種々の基準が規定されている。また、
組み換えDNAを含有する微生物の生物学的封じ
込めの基準もそこに確立されている。 宿主細胞とベクターの使用に関する生物学的封
じ込めは、それらが実験室から自然環境の中へ逃
げ出した時の生存可能性の限定として規定されて
いる。そのような限定された存在可能性を有する
微生物細胞は、芽胞を形成しないものである（例
えば、無芽胞性の部生物）。 本発明は室主−ベクター系の宿主として有用な
新しい無芽胞性突然変異株パチルス・ズプチリス
（B.subtilis）B1−109である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというさらにつけ
加えるべき有効性も有する。この突然変異株は、
熱安定性のα−アミラーゼなどの特異なアミラー
ゼ産生能をコードされた遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドの宿主として用いる場合には特に適して
いる。これらのアミラーゼは、デンプン加水分解
物、グルコース、および高フルクトースシロツプ
を製造する方法に使用するのに対し商業的に重要
である。 本発明の突然変異株には熱安定性α−アミラー
ゼ遺伝子を含むプラスミドがたやすく導入され
る。得られた微生物は、熱安定性α−アミラーゼ
酸素の産生能において、1983年10月26日に発行さ
れた公開ヨーロツパ特許出願No.092235に発表され
たATCC39096のようなパチルス・ズブチリスの
アミラーゼ非産生株より、宿主−ベクター系用と
して優れている。 本発明によれば、アミラーゼをコードした遺伝
子を含まず、好気的条件下の生育で約10-7未満の
芽胞形成株への復帰頻度をもち、以下の遺伝標
識：spoＡ12、amyEおよびsacA321を有する
ことを特徴とする、宿主−ベクター系における宿
主としての使用に適する無芽胞性バチルス・ズブ
チリスB1−109の培養株が提供される。これらの
特性をもつバチルス・ズブチリスの菌株は、
ATCC39701としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されている。 さらに、本発明によれば、バチルス・ズブチリ
ス1830株からのDNAをバチルス・ズブチリスB1
−20株のコンビテント細胞に導入し、添加したメ
チオニンのない状態で生育し、α−アミラーゼ酵
素を産生せず、そして90℃で10分間の熱シヨツク
処理したとき芽胞を形成しない細胞を分離するこ
とよりなる、遺伝標識：spoＡ12、amyE、お
よびsacA321を有するバチルス・ズブチリスの菌
株の作製方法が提供される。 最後に、バチルス・ズブチリスの菌株の１つの
コンビテント細胞に、所望の遺伝物質を含有する
ブラスミドを導入し、ブラスミドが細胞内に維持
されるような条件下で該細胞を培養することより
なる、宿主−ベクター系における宿主としてバチ
ルス・ズブチルスB1−109株を使用する方法が提
供される。 本明細書に明らかにされ、特許請求の範囲に記
載されたバチルス・ズブチリスの菌株は、バチル
ス・ズブチルスの他の菌株から遺伝物質を導入す
ることにより作製された。標識：aro906、
metB５、sacA321、およびamyEを有する。ア
ミラーゼ非産生株バチルス・ズブチリス1A289
（ATCC39711）は、バチルス・ズブチリス1A221
株（ATCC39086）よりDNAの一部を導入される
ことによつてもはや芳香族アミノ酸を要求しない
菌株へ変換された。 1A289株は、MO1.Gen.Genet.、148巻、281−
285頁（1976年）にSteinmetzらにより報告され
ている。これは、ATCC39711としてメリーラン
ド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン、より入手可能である。
1A221株は、Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、65
巻、96−103頁（1970年）にDubnauとSmithによ
り報告されている。これは、ATCC39086として
メリーランド州、ロツクピルのアメリカン・タイ
プ・コレクシヨンより入手可能である。 B1−20と表示される、得られた導入産物は以
下の標識を含む：metB５、amyE、およびsacA
321。これは、ATCC39706としてアメリカン・タ
イプ・カルチヤーコレクシヨンより入手可能であ
る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベクター
系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際して中間
体として有用である。この株は、芽胞形成宿主の
使用が容認される条件下では、それ自身また宿主
として用いられる。 バチルス・ズブチリスの無芽胞性株のDNAの
一部は、新しいB1−109株を作製するためB1−
20株に導入された。そのDNA供与体として用い
た無芽胞株は、オハイオ州、コロンブスのバチル
ス・ジエネテツタ・ストツク・センターの微生物
部門より得た1S30であつた。標識spoＡ12を持
つこの菌株は、IonecoおよびSchaefferにより
Ann.Inst.Pasteur、Paris、114巻、１−９（1968
年）に発表されている。これは、ATCC39712と
して、メレーランド州、ロツクビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンより入手
できる。 本発明の無芽胞性アミラーゼ非産生株B1−109
は、約10-7未満の芽胞産生菌への復帰頻度を示
す。工業的条件での生育は可能で、また高価な生
育に必要な添加物を要求しない。自然または逃亡
した場合の環境下での生き残る率は低く、また自
然発生的遺伝子移動による他の菌体へのプラスミ
ドの導出傾向は大変低い。標準的遺伝子導入法に
用いた場合、この菌株は高いプラスミド取り込み
頻度を示す。このコンピテント細胞を遺伝子導入
操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミスドベクター
の宿主として良好に機能し、バチルス・ズブチリ
ス宿主−ベクター系の宿主として有用性が高い。
アミラーゼ非産生であるので、この菌株はアミラ
ーゼ産生能をコードされた遺伝子を含む組み換え
型プラスミドの宿主として用いる際、特に適す
る。 バチルス・ズブチリスの染色体の詳細な遺伝子
地図は、HennerおよびHochにより、
Miorobiological Reviews、44巻、57−82頁
（1980年）に発表されている。 本発明の記載中に述べられる遺伝標識の簡潔な
記述は以下の通りである。： (1) spoＡ12：これは、芽胞形成の最も初期の
段階における障害を起こす欠損突然変 異である。この突然変異はバチルスの芽胞形成
能を消滅させる。この芽胞は熱、紫外線、化学
物質および乾燥に曝された時の自然状態におけ
る菌の正常な生き残りの形である。 (2) aro906：フエニルアラニン、チロシン、
およびトリブトフアン要求性を起こす突然変異
である。これらのアミノ酸が欠損した時、この
突然変異株の生育は止まる。 (3) amyE：この標識は、α−アミラーゼを産生
する構造遺伝子の欠損に関連している。この突
然変異は、非常に低い復帰頻度により特徴づけ
られる。 (4) lin2：この遺伝標識を持つ菌株は、適当なア
ミノ酸および100μｇ／mlの濃度のリンコミシ
ン（lincomycin）を添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株
は、そのような平板上では生育できない。 (5) motB５：この突然変異は、メチオニン要求
性を引き起こす。このアミノ酸が欠損した場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。 (6) sacA321：これは、微生物によるシヨ糖の代
謝に必要な酵素の産生を失わせる突然変異であ
る。炭素源としてシヨ糖を含む培地での宿主の
生育は妨げられる。 以下に例を示して本発明を具体的に説明する。
特記される以外は、すべての比率およびパーセン
トは重さを基礎に算出されたものである。aTcc
ナンバーを冠せられたすべての菌株は、メリーラ
ンド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンから入手できる。これらの
菌株は、特許目的のための微生物の寄託について
のブタベスト条約の規定のもとに寄託されたもの
である。デイフコ社商品名を冠されたすべての試
薬は、ミシガン州、デトロイトのデイフコ研究所
より入手できる。 例 バチルス・ズブチリス1A289株（ATCC39780）
の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌株への
形質転換は、バチルス・ズブチリス1A221株
（ATCC39036）から得たDNAを導入することで
実現された。その方法は以下の通りである。 バチルス・ズブチリス1A289株（ATCC39711）
の細胞は、トリブトース・血液・寒天・培養基
（デイフコ）を含む平板培地上で一晩生育された。
この平板培地上の細胞は、ベナセイ・プロス（デ
イフコ）に接種され、37℃で200rpmの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離さ
れ、５倍容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培
養液の組成は、0.5％グルコース、0.6％リン酸一
カリウム、1.4％リン酸二カリウム、0.1％クエン
酸ナトリウム、0.2％硫安および0.07％硫酸マグ
ネシウムを含み、50μｇ／mlの濃度になるように
ロイシン、イソロイシン、メチオニンを加え、
25μｇ／mlの濃度となるようにヒスチジン、トリ
ブトフアン、アルギニン、バリン、リジン、スレ
オニン、グリシン、アスパラギン酸を加えたもの
である。分光光度計を用い、培養液の波長620n
ｍにおける吸光度の増加が計測された。培養細胞
が対数増殖期から定常増殖期に転換する時点で
（15分で吸光度変化が５％より小となる）。この培
養細胞はDNA導入に用いられた。 供給されるDNAは、バチルス・ズブチリス
1A221株（ATCC39086）から以下の操作で得ら
れた。 1A221株は、100mlのペナセイ・プロス（デイ
フコ）中で生育された。培養細胞は、37℃で、波
長660ナノメーターの吸光度が0.6になるまで培養
された。この細胞は、遠心操作で集め、0.005M
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および0.05M
塩化ナトリウムを含み、２mgのリゾチームを含む
溶液１mlに再懸濁された。細胞がこわれ始めた
時、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍
結させた。次いで、0.03Mトリス（ビドロキシメ
チル）アミノメタンPH8.0、0.005MEDTAを含む
緩衝溶液が凍結細胞に加えられ、この混合液は２
回凍結融解をくり返えされた。これに同量のフエ
ノールを加え、この混合液は４℃で70分間振盪さ
れた。沈澱した蛋白質は遠心操作で除去された。
DNAを沈澱させるために透明な上清に0.12mlの
3M酢酸ナトリウム（PH8.0）および0.64mlのイソ
プロパノールが、溶液１ml当りに加えられた。沈
澱したDNAはガラス棒でかき回して集められ、
さらにイソプロパノールで洗浄された。DNAは、
0.015M塩化ナトリウムおよび0.0015酢酸ナトリ
ウムを含むPH７の溶液に再溶解され、導入操作に
用いるまで４℃で保存された。 上記の方法で調製されたバチルス・ズブチリシ
1A289株（1.0ml）のコンビテント細胞は最終混
合物の濃度10μｇ／mlでDNAと混合され、培養
液は37℃で30分温和な振盪（100rpm）下に置か
れた。この培養液は、２mlのペナセー・ブロス
（デイフコ）で希釈され、更に37℃で90分間培養
が行なわれた。この細胞は遠心操作により集めら
れ、蒸留水で１度洗浄され、当初の容量の培地に
再懸濁され、スピジジエン（Spizizen）の最小培
地にメチオニン（5μｇ／ml）を加えた平板培地
の上に広げられた。スピジジエン最小培他の組成
は、(a)硫安0.2％；(b)リン酸カリウム（２塩基）−
1.4％；(c)リン酸カリウム（１塩基）−0.6％；(d)
クエン酸ナトリウム−0.1％；および(e)硫酸マグ
ネシウム−0.02％を含みPH7.4に調整した溶液で
ある。0.5mlの細胞懸濁液を加えた時に、２つの
コロニーが生育し、その内の１つはアミラーゼ非
産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条
件下での生育可能性により選択され、B1−20と
表示される。このものは以下の標識：metB５、
amyE、およびsacA321をもつ。この生物学的に
純粋な培養株は、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンにATCC39706として寄託され
ている。 B1−20株（metB５、amyE、saoA321）は、
供給株1S30（ATCC39712）からDNAを導入さ
れ、無芽胞性株B1−109に転換させられた。導入
はB1−20細胞を用いて行なわれた。 供給されるDNAは、バチルス・ズブチリス
1S30株（ATCC39712）より以下の方法で得られ
た。細胞の培養は、37℃で100mlのグルコース添
加トリブテイク・ソイ（TSG）培地（デイフコ）
中で、一晩行なわれた。次いで、40mgのリゾチー
ム加え、この混合液は60℃で30分保温された。ス
フエロブラスト（Spheroplast）は4500rpmで10
分の遠心操作で分離され、0.15M塩化ナトリウム
および0.1MEDTAを含むPH10.2の溶液40mlに懸
濁された。３mlの25％ドデシル硫酸ナトリウム溶
液を加えた後、この混合液は70℃に保温し１時間
置かれた。0.03M塩化ナトリウムおよび0.003M
クエン酸ナトリウムを含み、フエノールで飽和し
たPH７の溶液を加えることにより２回蛋白質を沈
澱させた。この上清に５mlの3M酢酸ナトリウム
溶液が加えられた。この溶液にイソプロパノール
層が加えられた。二層間に存在するDNAはガラ
ス棒で巻き取られた。ガラス棒上のDNAは、冷
イソプロパノールで２度洗浄され、0.03M塩化ナ
トリウムおよび0.003Mクエン酸ナトリウムを含
むPH７の溶液に溶解された。0.015M塩化ナトリ
ウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウムを含むPH
７の大容量溶液に対し、上記の得られた溶液を透
析し、透析外液は３度交換し、24時間透析した。
この結果得られた透析内液を遺伝子導入に用い
た。 バチルス・ズブチリスB1−20株の細胞は、ト
リブトース・血液・寒天・培養基（デイフコ）を
含む平板培地上で、一晩37℃で培養された。平板
培地上からの細胞は、小量の増殖培養液に懸濁さ
れ、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中の60ml
の増殖培養液に接種された。この混合液は33−37
℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を
含有した：0.5％グレコース、0.6％リン酸一カリ
ウム、1.4％リン酸二カリウム、0.1％クエン酸ナ
トリウム、0.2％硫安、0.01％硫酸マグネシウム、
0.02％カサミノ酸（デイフコ）、0.1％イーストエ
クストラクタ（デイフコ）、および0.02％Ｌ−ト
リブトフアン。生育は620nｍの吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期
に転換する時（15分で吸光度変化が５％より小と
なる）。この培養細胞はDNA導入に用いられた。
細胞懸濁液は２倍容量の導入用培地により希釈さ
れた。この導入用培地は、２％の0.1M塩化マグ
ネシウムおよび１％の0.05M塩化カルシウムが追
加的に加えられている以外は、増殖培養液と同じ
組成である。希釈は33−37℃にあらかじめ保温し
てある導入用培地に加えることにより行なわれ
た。この混合液は、同温度で90分間、300rpmで
振盪された。振盪終了５分前に、最終濃度１ｍＭ
となるように20ｍＭエチレングリコール−ビス
（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，N′，
N′−四酢酸が加えられた。 1S30株から上記の方法で分離された20μの
DNAと上記のB1−20株のコンビテント細胞0.5ml
を混合することにより導入を行なつた。この混合
液は、30−37℃で90分間250rpmで振盪された。
得られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地
上にまかれた。メチオン産生、アミラーゼ非産生
の特性をもつ細胞は、この寒天平板培地上で生育
する培養株として選択された。この寒天平板培地
の組成は、スピジジエン最小培地にトリブトフア
ン（5μｇ／ml）および１％リントナー（Lintner）
デン粉を加えたものである。90℃で10分の熱シヨ
クによる無芽胞特性選別のため、600のコロニー
がスクリーニングされた。その結果、１つのコロ
ニー、B1−109が無芽胞性であつた。このものは
遺伝標識：spoＡ12、amyEおよびsacA321を
有する。この生物学的に純粋な培養株は、
ATCC39701としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されている。 B1−109株は、生育のためにアンモニウム、カ
リウム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む
無機塩を要求する。この株は、グルコースを含む
種々の炭素源を利用する。以下の試験で認められ
るように、芽胞形成株への逆行はない。細胞は、
37℃でDSM（デイフコ）培地を含む寒天平板上で
生育された。24時間後、この細胞は0.1％グルコ
ースを含むトリブテイク・ソイ培地中に懸濁さ
れ、90℃で10分間加熱された。次いでこの細胞
は、トリブトース・血液・寒天・培養基（デイフ
コ）を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な
総細胞数が決定された。非加熱検体を滴下して、
平板培地上に展開する１ミリリツトル当りのコロ
ニー形成単位数が比較された。非加熱検体は、１
ml当り1.27×108コロニー形成単位を含有するに
対し、加熱された細胞は単に１ml当り５コロニー
形成単位しか含有しなかつた。このことは、この
株は好気的条件下の生育で約10-7未満の芽胞形成
株への復帰頻度をもつことを示す。 B1−20およびB1−109の両株は、標準的導入
方法において高頻度でのブラスミド導入を示す。
このベクターを含有するこれら宿主が45℃という
高温で生育される場合でも、ブラズミド・ベクタ
ーはこれら宿主中に保持された。 本明細書に記載された研究は、すべてNIHの
手引きに特定された物理的および生物学的危険封
じ込めに関する要求項目に合致して行われたもの
である。
ーゼのコードされた遺伝子を有するベクターが導
入される宿主として有用なバチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）の新規なアミラーゼ非産生
突然変異株に関する。 細菌の遺伝物質の大部分は、細胞中の染色体に
巨大なDNA分子として存在している。ある量の
遺伝物質は、プラスミドとして知られる、より小
さな環の閉じたDNA分子の形で存在する場合も
ある。特異な遺伝的性質に関連したDNA分子の
部分を遺伝子と呼称する。 遺伝子工学に関連する技術によつて、特別な蛋
白質をその産生物質としてコードしている遺伝子
を、一つの微生物から他の微生物へと移すことが
可能である。新しい遺伝物質を受容する微生物を
宿主と呼称する。多くの研究者は、これらの技術
を用いて、ある特別な蛋白質例えば酸素などを産
生することにすぐれた微生物を供給してきた。 連続した遺伝子が環状の形に連鎖しているプラ
スミドは、ある微生物の細胞からの移動と他の微
生物の細胞への導入が比較的容易になされうるこ
とが発見されている。また、プラスミドは、新し
い遺伝物質を宿主体に導入するペクターとしても
使用可能である。このことは制限酵素として知ら
れる、環状DNAを開裂させる酵素によるプラス
ミドの最初の切断により遂行される。所望の遺伝
子を含有する異種DNA鎖はDNA環の切断された
部分に挿入される。環状構造はDNAリガーゼに
よる処理で再構成される。新しい環状DNA分子
である再構成されたプラスミドは、元のプラスミ
ドの遺伝子に加えて、挿入されたDNAの小鎖で
ある新しい遺伝子を含有している。このプラスミ
ドは宿主微生物体中に導入されうる。ついで新し
い遺伝子を含むプラスミドは、宿主微生物体中で
複製され、その遺伝物質の一部となる。 遺伝子工学で適切な宿主微生物体として用いら
れるためには、新しいDNAの導入が可能でなけ
ればならない。さらに、新らたに挿入された遺伝
子にコードされた遺伝的性質を発現することが実
行可能な微生物が得られなければならない。有用
な量の蛋白質を産生する微生物であるには、その
微生物はまた工業規模で生育できるものでなけれ
ばならない。 新しいDNA組み換え技術を用いた実験から、
新しい遺伝物質を導入された微生物は、ヒト、動
物および植物に有害な物質を産生する可能性があ
るとみなされている。この判断から、1978年にナ
シヨナル・インステイテユート・オブ・ヘルス
（NIH）は「DNA分子組み換えに伴う実験の手
引き」を発行した。この手引き書には、遺伝子工
学実験が行なわれる実験室における物理的封じ込
めのための種々の基準が規定されている。また、
組み換えDNAを含有する微生物の生物学的封じ
込めの基準もそこに確立されている。 宿主細胞とベクターの使用に関する生物学的封
じ込めは、それらが実験室から自然環境の中へ逃
げ出した時の生存可能性の限定として規定されて
いる。そのような限定された存在可能性を有する
微生物細胞は、芽胞を形成しないものである（例
えば、無芽胞性の部生物）。 本発明は室主−ベクター系の宿主として有用な
新しい無芽胞性突然変異株パチルス・ズプチリス
（B.subtilis）B1−109である。この宿主は、アミ
ラーゼ非産生突然変異株であるというさらにつけ
加えるべき有効性も有する。この突然変異株は、
熱安定性のα−アミラーゼなどの特異なアミラー
ゼ産生能をコードされた遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドの宿主として用いる場合には特に適して
いる。これらのアミラーゼは、デンプン加水分解
物、グルコース、および高フルクトースシロツプ
を製造する方法に使用するのに対し商業的に重要
である。 本発明の突然変異株には熱安定性α−アミラー
ゼ遺伝子を含むプラスミドがたやすく導入され
る。得られた微生物は、熱安定性α−アミラーゼ
酸素の産生能において、1983年10月26日に発行さ
れた公開ヨーロツパ特許出願No.092235に発表され
たATCC39096のようなパチルス・ズブチリスの
アミラーゼ非産生株より、宿主−ベクター系用と
して優れている。 本発明によれば、アミラーゼをコードした遺伝
子を含まず、好気的条件下の生育で約10-7未満の
芽胞形成株への復帰頻度をもち、以下の遺伝標
識：spoＡ12、amyEおよびsacA321を有する
ことを特徴とする、宿主−ベクター系における宿
主としての使用に適する無芽胞性バチルス・ズブ
チリスB1−109の培養株が提供される。これらの
特性をもつバチルス・ズブチリスの菌株は、
ATCC39701としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されている。 さらに、本発明によれば、バチルス・ズブチリ
ス1830株からのDNAをバチルス・ズブチリスB1
−20株のコンビテント細胞に導入し、添加したメ
チオニンのない状態で生育し、α−アミラーゼ酵
素を産生せず、そして90℃で10分間の熱シヨツク
処理したとき芽胞を形成しない細胞を分離するこ
とよりなる、遺伝標識：spoＡ12、amyE、お
よびsacA321を有するバチルス・ズブチリスの菌
株の作製方法が提供される。 最後に、バチルス・ズブチリスの菌株の１つの
コンビテント細胞に、所望の遺伝物質を含有する
ブラスミドを導入し、ブラスミドが細胞内に維持
されるような条件下で該細胞を培養することより
なる、宿主−ベクター系における宿主としてバチ
ルス・ズブチルスB1−109株を使用する方法が提
供される。 本明細書に明らかにされ、特許請求の範囲に記
載されたバチルス・ズブチリスの菌株は、バチル
ス・ズブチルスの他の菌株から遺伝物質を導入す
ることにより作製された。標識：aro906、
metB５、sacA321、およびamyEを有する。ア
ミラーゼ非産生株バチルス・ズブチリス1A289
（ATCC39711）は、バチルス・ズブチリス1A221
株（ATCC39086）よりDNAの一部を導入される
ことによつてもはや芳香族アミノ酸を要求しない
菌株へ変換された。 1A289株は、MO1.Gen.Genet.、148巻、281−
285頁（1976年）にSteinmetzらにより報告され
ている。これは、ATCC39711としてメリーラン
ド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン、より入手可能である。
1A221株は、Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、65
巻、96−103頁（1970年）にDubnauとSmithによ
り報告されている。これは、ATCC39086として
メリーランド州、ロツクピルのアメリカン・タイ
プ・コレクシヨンより入手可能である。 B1−20と表示される、得られた導入産物は以
下の標識を含む：metB５、amyE、およびsacA
321。これは、ATCC39706としてアメリカン・タ
イプ・カルチヤーコレクシヨンより入手可能であ
る。このアミラーゼ非産生株は、宿主−ベクター
系でのアミラーゼ非産生宿主の作製に際して中間
体として有用である。この株は、芽胞形成宿主の
使用が容認される条件下では、それ自身また宿主
として用いられる。 バチルス・ズブチリスの無芽胞性株のDNAの
一部は、新しいB1−109株を作製するためB1−
20株に導入された。そのDNA供与体として用い
た無芽胞株は、オハイオ州、コロンブスのバチル
ス・ジエネテツタ・ストツク・センターの微生物
部門より得た1S30であつた。標識spoＡ12を持
つこの菌株は、IonecoおよびSchaefferにより
Ann.Inst.Pasteur、Paris、114巻、１−９（1968
年）に発表されている。これは、ATCC39712と
して、メレーランド州、ロツクビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンより入手
できる。 本発明の無芽胞性アミラーゼ非産生株B1−109
は、約10-7未満の芽胞産生菌への復帰頻度を示
す。工業的条件での生育は可能で、また高価な生
育に必要な添加物を要求しない。自然または逃亡
した場合の環境下での生き残る率は低く、また自
然発生的遺伝子移動による他の菌体へのプラスミ
ドの導出傾向は大変低い。標準的遺伝子導入法に
用いた場合、この菌株は高いプラスミド取り込み
頻度を示す。このコンピテント細胞を遺伝子導入
操作に用いた場合、卓越した遺伝子導入効果が得
られる。この菌株は種々のプラスミスドベクター
の宿主として良好に機能し、バチルス・ズブチリ
ス宿主−ベクター系の宿主として有用性が高い。
アミラーゼ非産生であるので、この菌株はアミラ
ーゼ産生能をコードされた遺伝子を含む組み換え
型プラスミドの宿主として用いる際、特に適す
る。 バチルス・ズブチリスの染色体の詳細な遺伝子
地図は、HennerおよびHochにより、
Miorobiological Reviews、44巻、57−82頁
（1980年）に発表されている。 本発明の記載中に述べられる遺伝標識の簡潔な
記述は以下の通りである。： (1) spoＡ12：これは、芽胞形成の最も初期の
段階における障害を起こす欠損突然変 異である。この突然変異はバチルスの芽胞形成
能を消滅させる。この芽胞は熱、紫外線、化学
物質および乾燥に曝された時の自然状態におけ
る菌の正常な生き残りの形である。 (2) aro906：フエニルアラニン、チロシン、
およびトリブトフアン要求性を起こす突然変異
である。これらのアミノ酸が欠損した時、この
突然変異株の生育は止まる。 (3) amyE：この標識は、α−アミラーゼを産生
する構造遺伝子の欠損に関連している。この突
然変異は、非常に低い復帰頻度により特徴づけ
られる。 (4) lin2：この遺伝標識を持つ菌株は、適当なア
ミノ酸および100μｇ／mlの濃度のリンコミシ
ン（lincomycin）を添加した最小培地を含有
する平板で生育する。この標識を持たない菌株
は、そのような平板上では生育できない。 (5) motB５：この突然変異は、メチオニン要求
性を引き起こす。このアミノ酸が欠損した場
合、この突然変異をもつ菌株は生育を止める。 (6) sacA321：これは、微生物によるシヨ糖の代
謝に必要な酵素の産生を失わせる突然変異であ
る。炭素源としてシヨ糖を含む培地での宿主の
生育は妨げられる。 以下に例を示して本発明を具体的に説明する。
特記される以外は、すべての比率およびパーセン
トは重さを基礎に算出されたものである。aTcc
ナンバーを冠せられたすべての菌株は、メリーラ
ンド州、ロツクビルのアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンから入手できる。これらの
菌株は、特許目的のための微生物の寄託について
のブタベスト条約の規定のもとに寄託されたもの
である。デイフコ社商品名を冠されたすべての試
薬は、ミシガン州、デトロイトのデイフコ研究所
より入手できる。 例 バチルス・ズブチリス1A289株（ATCC39780）
の、生育に芳香族アミノ酸を要求しない菌株への
形質転換は、バチルス・ズブチリス1A221株
（ATCC39036）から得たDNAを導入することで
実現された。その方法は以下の通りである。 バチルス・ズブチリス1A289株（ATCC39711）
の細胞は、トリブトース・血液・寒天・培養基
（デイフコ）を含む平板培地上で一晩生育された。
この平板培地上の細胞は、ベナセイ・プロス（デ
イフコ）に接種され、37℃で200rpmの振盪下で
一晩生育された。この細胞は遠心操作で分離さ
れ、５倍容量の増殖培養液に懸濁された。増殖培
養液の組成は、0.5％グルコース、0.6％リン酸一
カリウム、1.4％リン酸二カリウム、0.1％クエン
酸ナトリウム、0.2％硫安および0.07％硫酸マグ
ネシウムを含み、50μｇ／mlの濃度になるように
ロイシン、イソロイシン、メチオニンを加え、
25μｇ／mlの濃度となるようにヒスチジン、トリ
ブトフアン、アルギニン、バリン、リジン、スレ
オニン、グリシン、アスパラギン酸を加えたもの
である。分光光度計を用い、培養液の波長620n
ｍにおける吸光度の増加が計測された。培養細胞
が対数増殖期から定常増殖期に転換する時点で
（15分で吸光度変化が５％より小となる）。この培
養細胞はDNA導入に用いられた。 供給されるDNAは、バチルス・ズブチリス
1A221株（ATCC39086）から以下の操作で得ら
れた。 1A221株は、100mlのペナセイ・プロス（デイ
フコ）中で生育された。培養細胞は、37℃で、波
長660ナノメーターの吸光度が0.6になるまで培養
された。この細胞は、遠心操作で集め、0.005M
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および0.05M
塩化ナトリウムを含み、２mgのリゾチームを含む
溶液１mlに再懸濁された。細胞がこわれ始めた
時、ドライアイス−アセトン槽中に容器を沈め凍
結させた。次いで、0.03Mトリス（ビドロキシメ
チル）アミノメタンPH8.0、0.005MEDTAを含む
緩衝溶液が凍結細胞に加えられ、この混合液は２
回凍結融解をくり返えされた。これに同量のフエ
ノールを加え、この混合液は４℃で70分間振盪さ
れた。沈澱した蛋白質は遠心操作で除去された。
DNAを沈澱させるために透明な上清に0.12mlの
3M酢酸ナトリウム（PH8.0）および0.64mlのイソ
プロパノールが、溶液１ml当りに加えられた。沈
澱したDNAはガラス棒でかき回して集められ、
さらにイソプロパノールで洗浄された。DNAは、
0.015M塩化ナトリウムおよび0.0015酢酸ナトリ
ウムを含むPH７の溶液に再溶解され、導入操作に
用いるまで４℃で保存された。 上記の方法で調製されたバチルス・ズブチリシ
1A289株（1.0ml）のコンビテント細胞は最終混
合物の濃度10μｇ／mlでDNAと混合され、培養
液は37℃で30分温和な振盪（100rpm）下に置か
れた。この培養液は、２mlのペナセー・ブロス
（デイフコ）で希釈され、更に37℃で90分間培養
が行なわれた。この細胞は遠心操作により集めら
れ、蒸留水で１度洗浄され、当初の容量の培地に
再懸濁され、スピジジエン（Spizizen）の最小培
地にメチオニン（5μｇ／ml）を加えた平板培地
の上に広げられた。スピジジエン最小培他の組成
は、(a)硫安0.2％；(b)リン酸カリウム（２塩基）−
1.4％；(c)リン酸カリウム（１塩基）−0.6％；(d)
クエン酸ナトリウム−0.1％；および(e)硫酸マグ
ネシウム−0.02％を含みPH7.4に調整した溶液で
ある。0.5mlの細胞懸濁液を加えた時に、２つの
コロニーが生育し、その内の１つはアミラーゼ非
産生である。このものは、芳香族アミノ酸欠損条
件下での生育可能性により選択され、B1−20と
表示される。このものは以下の標識：metB５、
amyE、およびsacA321をもつ。この生物学的に
純粋な培養株は、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンにATCC39706として寄託され
ている。 B1−20株（metB５、amyE、saoA321）は、
供給株1S30（ATCC39712）からDNAを導入さ
れ、無芽胞性株B1−109に転換させられた。導入
はB1−20細胞を用いて行なわれた。 供給されるDNAは、バチルス・ズブチリス
1S30株（ATCC39712）より以下の方法で得られ
た。細胞の培養は、37℃で100mlのグルコース添
加トリブテイク・ソイ（TSG）培地（デイフコ）
中で、一晩行なわれた。次いで、40mgのリゾチー
ム加え、この混合液は60℃で30分保温された。ス
フエロブラスト（Spheroplast）は4500rpmで10
分の遠心操作で分離され、0.15M塩化ナトリウム
および0.1MEDTAを含むPH10.2の溶液40mlに懸
濁された。３mlの25％ドデシル硫酸ナトリウム溶
液を加えた後、この混合液は70℃に保温し１時間
置かれた。0.03M塩化ナトリウムおよび0.003M
クエン酸ナトリウムを含み、フエノールで飽和し
たPH７の溶液を加えることにより２回蛋白質を沈
澱させた。この上清に５mlの3M酢酸ナトリウム
溶液が加えられた。この溶液にイソプロパノール
層が加えられた。二層間に存在するDNAはガラ
ス棒で巻き取られた。ガラス棒上のDNAは、冷
イソプロパノールで２度洗浄され、0.03M塩化ナ
トリウムおよび0.003Mクエン酸ナトリウムを含
むPH７の溶液に溶解された。0.015M塩化ナトリ
ウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウムを含むPH
７の大容量溶液に対し、上記の得られた溶液を透
析し、透析外液は３度交換し、24時間透析した。
この結果得られた透析内液を遺伝子導入に用い
た。 バチルス・ズブチリスB1−20株の細胞は、ト
リブトース・血液・寒天・培養基（デイフコ）を
含む平板培地上で、一晩37℃で培養された。平板
培地上からの細胞は、小量の増殖培養液に懸濁さ
れ、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中の60ml
の増殖培養液に接種された。この混合液は33−37
℃で振盪培養された。増殖培養液は以下の成分を
含有した：0.5％グレコース、0.6％リン酸一カリ
ウム、1.4％リン酸二カリウム、0.1％クエン酸ナ
トリウム、0.2％硫安、0.01％硫酸マグネシウム、
0.02％カサミノ酸（デイフコ）、0.1％イーストエ
クストラクタ（デイフコ）、および0.02％Ｌ−ト
リブトフアン。生育は620nｍの吸光度により監
視された。培養細胞が対数増殖期から定常増殖期
に転換する時（15分で吸光度変化が５％より小と
なる）。この培養細胞はDNA導入に用いられた。
細胞懸濁液は２倍容量の導入用培地により希釈さ
れた。この導入用培地は、２％の0.1M塩化マグ
ネシウムおよび１％の0.05M塩化カルシウムが追
加的に加えられている以外は、増殖培養液と同じ
組成である。希釈は33−37℃にあらかじめ保温し
てある導入用培地に加えることにより行なわれ
た。この混合液は、同温度で90分間、300rpmで
振盪された。振盪終了５分前に、最終濃度１ｍＭ
となるように20ｍＭエチレングリコール−ビス
（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，N′，
N′−四酢酸が加えられた。 1S30株から上記の方法で分離された20μの
DNAと上記のB1−20株のコンビテント細胞0.5ml
を混合することにより導入を行なつた。この混合
液は、30−37℃で90分間250rpmで振盪された。
得られた細胞は、滅菌水で希釈後、寒天平板培地
上にまかれた。メチオン産生、アミラーゼ非産生
の特性をもつ細胞は、この寒天平板培地上で生育
する培養株として選択された。この寒天平板培地
の組成は、スピジジエン最小培地にトリブトフア
ン（5μｇ／ml）および１％リントナー（Lintner）
デン粉を加えたものである。90℃で10分の熱シヨ
クによる無芽胞特性選別のため、600のコロニー
がスクリーニングされた。その結果、１つのコロ
ニー、B1−109が無芽胞性であつた。このものは
遺伝標識：spoＡ12、amyEおよびsacA321を
有する。この生物学的に純粋な培養株は、
ATCC39701としてアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されている。 B1−109株は、生育のためにアンモニウム、カ
リウム、リン酸、およびナトリウムイオンを含む
無機塩を要求する。この株は、グルコースを含む
種々の炭素源を利用する。以下の試験で認められ
るように、芽胞形成株への逆行はない。細胞は、
37℃でDSM（デイフコ）培地を含む寒天平板上で
生育された。24時間後、この細胞は0.1％グルコ
ースを含むトリブテイク・ソイ培地中に懸濁さ
れ、90℃で10分間加熱された。次いでこの細胞
は、トリブトース・血液・寒天・培養基（デイフ
コ）を含む平板培地上に滴下された。これら平板
培地上でのコロニー形成単位として、生存可能な
総細胞数が決定された。非加熱検体を滴下して、
平板培地上に展開する１ミリリツトル当りのコロ
ニー形成単位数が比較された。非加熱検体は、１
ml当り1.27×108コロニー形成単位を含有するに
対し、加熱された細胞は単に１ml当り５コロニー
形成単位しか含有しなかつた。このことは、この
株は好気的条件下の生育で約10-7未満の芽胞形成
株への復帰頻度をもつことを示す。 B1−20およびB1−109の両株は、標準的導入
方法において高頻度でのブラスミド導入を示す。
このベクターを含有するこれら宿主が45℃という
高温で生育される場合でも、ブラズミド・ベクタ
ーはこれら宿主中に保持された。 本明細書に記載された研究は、すべてNIHの
手引きに特定された物理的および生物学的危険封
じ込めに関する要求項目に合致して行われたもの
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アミラーゼをコードした遺伝子を含まず、好
気的条件下の生育で約10-7未満の芽胞形成株への
復帰頻度をもち、以下の遺伝標識：spoＡ12、
amyEおよびsacA321を有することを特徴とする、
宿主−ベクター系における宿主としての使用に適
する無芽胞性バチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）B1−109株。 ２ ATCCNo.39701を有する特許請求の範囲第１
項記載の株。 ３ バチルス・ズブチリス1S30株からのDNAを
バチルス・ズブチリスB1−20株のコンピテント
細胞に導入し、添加したメチオニンのない状態で
生育し、α−アミラーゼ酵素を産生せず、そして
90℃で10分間の熱シヨツク処理したとき芽胞を形
成しない細胞を分離することを特徴とする、アミ
ラーゼをコードした遺伝子を含まず、好気的条件
下の生育で約10-7未満の芽胞形成株への復帰頻度
をもち、以下の遺伝標識：spoＡ12、amyEお
よびsacA321を有する、宿主−ベクター系におけ
る宿主としての使用に適する無芽胞性バチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）B1−109株の作
製方法。 ４ アミラーゼをコードした遺伝子を含まず、好
気的条件下の生育で約10-7未満の芽胞形成株への
復帰頻度をもち、以下の遺伝標識：spoＡ12、
amyEおよびsacA321を有する、宿主−ベクター
系における宿主としての使用に適する無芽胞性バ
チルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）B1−
109株を宿主−ベクター系における宿主として使
用する方法であつて、バチルス・ズブチリスB1
−109のコンピテント細胞に所望の遺伝物質を含
有するプラスミドを導入し、プラスミドを含有す
る細胞を、プラスミドが細胞内に維持されるよう
な条件下で培養することを特徴とする、上記方
法。
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