JPH0655153B2 - ヒトインターロイキン―２結晶の製造法 - Google Patents
ヒトインターロイキン―２結晶の製造法Info
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- JPH0655153B2 JPH0655153B2 JP61042565A JP4256586A JPH0655153B2 JP H0655153 B2 JPH0655153 B2 JP H0655153B2 JP 61042565 A JP61042565 A JP 61042565A JP 4256586 A JP4256586 A JP 4256586A JP H0655153 B2 JPH0655153 B2 JP H0655153B2
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- ril
- crystals
- crystal
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、腫瘍の予防，治療や免疫機能低下疾患の治療
等の医薬として有用な組換え型ヒトインターロイキン−
２の結晶の製造法に関する。
等の医薬として有用な組換え型ヒトインターロイキン−
２の結晶の製造法に関する。
本明細書においては、組換え型ヒトインターロイキン−
２を「ｒＩＬ−２」と略称することもある。
２を「ｒＩＬ−２」と略称することもある。
従来の技術 ヒトインターロイキン−２はレクチンやアロ抗原の刺激
を受けたＴリンパ球が生産するリンホカインの一種であ
る。ヒトインターロイキン−２にはin vitroにおけるＴ
細胞の長期増殖促進以外に、細胞障害性Ｔ細胞の誘導，
脾細胞中のＢ細胞の抗体産生の誘導，ＮＫ細胞の活性化
などの生物活性が報告されており、生体の免疫応答の制
御に大きな役割を演じていることが明らかにされてきて
いる。
を受けたＴリンパ球が生産するリンホカインの一種であ
る。ヒトインターロイキン−２にはin vitroにおけるＴ
細胞の長期増殖促進以外に、細胞障害性Ｔ細胞の誘導，
脾細胞中のＢ細胞の抗体産生の誘導，ＮＫ細胞の活性化
などの生物活性が報告されており、生体の免疫応答の制
御に大きな役割を演じていることが明らかにされてきて
いる。
最近の組換えＤＮＡ技術の急速な進歩は、従来、生体よ
り極く微量にしか得られなかったヒトインターロイキン
−２の大量供給を可能にした。
り極く微量にしか得られなかったヒトインターロイキン
−２の大量供給を可能にした。
発明が解決しようとする問題点 ｒＩＬ−２を結晶化することにより、純度ならびに安定
性を著しく向上させ得ることが予想される。
性を著しく向上させ得ることが予想される。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、ｒＩＬ−２の結晶化を種々の方法で試み
たところ、水を主体とする高濃度のｒＩＬ−２溶液に食
塩またはポリエチレングリコールを添加しｒＩＬ−２の
溶解度を下げることにより、ｒＩＬ−２結晶を析出させ
得ることを見い出し、これに基づいてさらに研究した結
果、本発明を完成した。本発明は、水を主体とする高濃
度の組換え型ヒトインターロイキン−２の酢酸アンモニ
ウムウム溶液に終濃度約５〜２５％（Ｗ／Ｖ）の食塩ま
たは終濃度約０．５〜３０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレン
グリコールを添加して組換え型ヒトインターロイキン−
２の溶解度を下げることにより組換え型ヒトインターロ
イキン−２結晶を析出させることを特徴とする組換え型
ヒトインターロイキン−２結晶の製造法である。本発明
のｒＩＬ−２としては具体的には、例えば第１図で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド（第１図中、Ｘ
は水素原子またはメチオニン残基を表わす。）や、その
生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ
酸配列からなるフラグメントでもよく、例えば、第１図
中Ｘが水素原子で表されるポリペプチドのアミノ末端か
ら１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開９１５３９号公報）また
は４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開昭６０−１
２６０８８号公報）や、カルボキシル末端部分の数個の
アミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに第
１図中Ｘが水素原子で表されるポリペプチドの構成アミ
ノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換された
もの、例えば１２５位のシスティン残基がセリン残基に
置換されたもの（特開昭５９−９３０９３号公報）でも
よい。
たところ、水を主体とする高濃度のｒＩＬ−２溶液に食
塩またはポリエチレングリコールを添加しｒＩＬ−２の
溶解度を下げることにより、ｒＩＬ−２結晶を析出させ
得ることを見い出し、これに基づいてさらに研究した結
果、本発明を完成した。本発明は、水を主体とする高濃
度の組換え型ヒトインターロイキン−２の酢酸アンモニ
ウムウム溶液に終濃度約５〜２５％（Ｗ／Ｖ）の食塩ま
たは終濃度約０．５〜３０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレン
グリコールを添加して組換え型ヒトインターロイキン−
２の溶解度を下げることにより組換え型ヒトインターロ
イキン−２結晶を析出させることを特徴とする組換え型
ヒトインターロイキン−２結晶の製造法である。本発明
のｒＩＬ−２としては具体的には、例えば第１図で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド（第１図中、Ｘ
は水素原子またはメチオニン残基を表わす。）や、その
生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ
酸配列からなるフラグメントでもよく、例えば、第１図
中Ｘが水素原子で表されるポリペプチドのアミノ末端か
ら１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開９１５３９号公報）また
は４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開昭６０−１
２６０８８号公報）や、カルボキシル末端部分の数個の
アミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに第
１図中Ｘが水素原子で表されるポリペプチドの構成アミ
ノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換された
もの、例えば１２５位のシスティン残基がセリン残基に
置換されたもの（特開昭５９−９３０９３号公報）でも
よい。
これらはアミノ酸残基を１００個以上有し、ヒトインタ
ーロイキン−２活性、すなわちＴ細胞をその機能を維持
したまま継代維持しうる作用を有する物質であればよ
い。
ーロイキン−２活性、すなわちＴ細胞をその機能を維持
したまま継代維持しうる作用を有する物質であればよ
い。
本明細書においては、第１図で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドにおいて、Ｘが水素原子であるもの
をＩＬ−２と、Ｘがメチオニン残基であるものをMet−
ＩＬ−２とぞれぞれ略称することがある。
有するポリペプチドにおいて、Ｘが水素原子であるもの
をＩＬ−２と、Ｘがメチオニン残基であるものをMet−
ＩＬ−２とぞれぞれ略称することがある。
また、第１図において、アミノ酸を略号で表示する場
合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biocheical N
omenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用
略号に基づくものであり、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 本発明方法に用いられる水を主体とす
る酢酸アンモニウムウム溶液としてはは酢酸アンモニウ
ムウム緩衝液が挙げられる。本発明におけるｒＩＬ−２
の酢酸アンモニウムウム溶液中の濃度としては、たとえ
ば０．０５％(w/v)以上がよく、さらに好ましは、０．
１％(w/v)以上が良好である。ポリエチレングリコール
は平均分子量約１０００ないし１５，０００のものが好
ましく、なかでも約２０００ないし８０００のものが好
ましい。
合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biocheical N
omenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用
略号に基づくものであり、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 本発明方法に用いられる水を主体とす
る酢酸アンモニウムウム溶液としてはは酢酸アンモニウ
ムウム緩衝液が挙げられる。本発明におけるｒＩＬ−２
の酢酸アンモニウムウム溶液中の濃度としては、たとえ
ば０．０５％(w/v)以上がよく、さらに好ましは、０．
１％(w/v)以上が良好である。ポリエチレングリコール
は平均分子量約１０００ないし１５，０００のものが好
ましく、なかでも約２０００ないし８０００のものが好
ましい。
上記食塩の添加濃度としてはは、終濃度約５〜２５％(w
/v)、より好ましくは約８〜１５％(w/v)である。
/v)、より好ましくは約８〜１５％(w/v)である。
ポリエチレングリコールのの添加濃度は、終濃度約０．
５〜３０％(w/v)，好ましくは、約５〜１０％(w/v)であ
る。
５〜３０％(w/v)，好ましくは、約５〜１０％(w/v)であ
る。
本発明方法を行う際の溶液は、pHを約２乃至１０に保つ
のが良い。さらに好ましくは、pHを約４乃至９に保つの
が良い。溶液の温度は約０℃から５０℃の間に保つのが
よく、結晶化に要する時間は１分から２ケ月である。
のが良い。さらに好ましくは、pHを約４乃至９に保つの
が良い。溶液の温度は約０℃から５０℃の間に保つのが
よく、結晶化に要する時間は１分から２ケ月である。
このようにして析出したｒＩＬ−２結晶は、たとえばガ
ラスフィルターを用いて濾過し、飽和食溶液（例、食塩
水溶液、硫酸アンモニウム水溶液，クエン酸ナトリウム
水溶液，リン酸ナトリウム水溶液）などで洗浄し、次い
で水で洗浄し、乾燥されることにより、採取される。
ラスフィルターを用いて濾過し、飽和食溶液（例、食塩
水溶液、硫酸アンモニウム水溶液，クエン酸ナトリウム
水溶液，リン酸ナトリウム水溶液）などで洗浄し、次い
で水で洗浄し、乾燥されることにより、採取される。
本発明により製造されるｒＩＬ−２結晶は、いずれも天
然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学的
活性を有し、著しく高純度に精製されており、夾雑蛋白
質、発熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として
安全に使用される。
然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学的
活性を有し、著しく高純度に精製されており、夾雑蛋白
質、発熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として
安全に使用される。
本発明により得られるｒＩＬ−２結晶は正常なＴ細胞や
ナチュラルキラー細胞をその機能を保持させたまま増殖
させる活性を有する。したがって、本発明により得られ
るｒＩＬ−２結晶は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞をインビトロで長期にわたり増殖，継代したりク
ローン化するのに使用できる。なお、この性質を利用し
てヒトインターロイキン−２の活性を測定することがで
きる。
ナチュラルキラー細胞をその機能を保持させたまま増殖
させる活性を有する。したがって、本発明により得られ
るｒＩＬ−２結晶は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞をインビトロで長期にわたり増殖，継代したりク
ローン化するのに使用できる。なお、この性質を利用し
てヒトインターロイキン−２の活性を測定することがで
きる。
さらに、本発明により得られるｒＩＬ−２結晶は、たと
えば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラーＴ
細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能力
をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロで選
択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細胞を
生体へ移入する際に、本発明により得られるｒＩＬ−２
結晶を同時に接種することにより、その抗腫瘍効果を増
大させることから、温血動物（例、マウス，ラット，ウ
サギ，犬，ネコ，ブタ，ウマ，ヒツジ，ウシ，ヒトな
ど）の腫瘍の予防，治療や免疫機能低下疾患の治療のた
めに用いることができる。
えば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラーＴ
細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能力
をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロで選
択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細胞を
生体へ移入する際に、本発明により得られるｒＩＬ−２
結晶を同時に接種することにより、その抗腫瘍効果を増
大させることから、温血動物（例、マウス，ラット，ウ
サギ，犬，ネコ，ブタ，ウマ，ヒツジ，ウシ，ヒトな
ど）の腫瘍の予防，治療や免疫機能低下疾患の治療のた
めに用いることができる。
本発明により得られるｒＩＬ−２結晶は夾雑蛋白質によ
る抗原性がなく低毒性である。
る抗原性がなく低毒性である。
本発明により得られるｒＩＬ−２結晶を腫瘍の予防，治
療剤として用いるには、当該物質を自体公知の担体，賦
形剤，希釈剤などと混合希釈して、たとえば注射剤，カ
プセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与する
ことができる。さらに、前述したようにインビトロで増
殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にま
たは単独で使用することができる。
療剤として用いるには、当該物質を自体公知の担体，賦
形剤，希釈剤などと混合希釈して、たとえば注射剤，カ
プセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与する
ことができる。さらに、前述したようにインビトロで増
殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にま
たは単独で使用することができる。
本発明のｒＩＬ−２結晶は、公知の天然から分離された
ヒトインターロイキン−２と実質的に同じ生物活性を有
するのでこれと同様に使用することができ、細胞のヒト
インターロイキン−２受容体との解離定数がきわめて小
さいことから、極く小量の投与で良い。
ヒトインターロイキン−２と実質的に同じ生物活性を有
するのでこれと同様に使用することができ、細胞のヒト
インターロイキン−２受容体との解離定数がきわめて小
さいことから、極く小量の投与で良い。
Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するために
は、本発明のｒＩＬ−２結晶を約０．０１〜１ユニット
／ｍ、好ましくは約０．１〜０．５ユニット／ｍの
濃度で培地に添加して用いることができる。
は、本発明のｒＩＬ−２結晶を約０．０１〜１ユニット
／ｍ、好ましくは約０．１〜０．５ユニット／ｍの
濃度で培地に添加して用いることができる。
ヒトインターロイキン−２の生物活性の測定は、ヒトイ
ンターロイキン−２依存性細胞を用いる方法［バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ(Biochemical Biophysical Resertch Co
mmunications),109,363(1982)]により行なうことができ
る。
ンターロイキン−２依存性細胞を用いる方法［バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ(Biochemical Biophysical Resertch Co
mmunications),109,363(1982)]により行なうことができ
る。
Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用する具体例
としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ １６４０培地にヒト末梢血より分離したＴ細胞（１
×１０6個／ｍ）およびＸ線（１５００ラッド）照射
したＢ細胞トランスフォーマント（１×１０6個／ｍ
）を加えて３７℃，５％ＣＯ2存在下で３日間リンパ
球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞を含
む細胞浮遊液に本発明のｒＩＬ−２結晶を０．１〜０．
５ユニット／ｍの濃度で加え約一週間ごとに培地交換
しながら約１か月間培養を続ける方法などが挙げられ
る。
としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ １６４０培地にヒト末梢血より分離したＴ細胞（１
×１０6個／ｍ）およびＸ線（１５００ラッド）照射
したＢ細胞トランスフォーマント（１×１０6個／ｍ
）を加えて３７℃，５％ＣＯ2存在下で３日間リンパ
球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞を含
む細胞浮遊液に本発明のｒＩＬ−２結晶を０．１〜０．
５ユニット／ｍの濃度で加え約一週間ごとに培地交換
しながら約１か月間培養を続ける方法などが挙げられ
る。
本発明の結晶化によって、ｒＩＬ−２の純度および安定
性を著しく向上させることができる。たとえば、超微粒
存在すると予想される発熱物質や、夾雑蛋白質を結晶に
より除去することが可能であり、また安定性の向上によ
ってｒＩＬ−２の室温での保存も可能となるであろう。
性を著しく向上させることができる。たとえば、超微粒
存在すると予想される発熱物質や、夾雑蛋白質を結晶に
より除去することが可能であり、また安定性の向上によ
ってｒＩＬ−２の室温での保存も可能となるであろう。
さらに、結晶化すことにより、Ｘ線解析法によるｒＩＬ
−２の立体構造を解明することができ、その作用機械解
明の手掛りとなり得る等学問的な面への寄与も大きいこ
とが期待される。
−２の立体構造を解明することができ、その作用機械解
明の手掛りとなり得る等学問的な面への寄与も大きいこ
とが期待される。
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するもの
ではない。
的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するもの
ではない。
実施例１ ＩＬ−２結晶の製造 後述の参考例１で得られたＩＬ−２の５ｍＭ酢酸アンモ
ニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜１．５mg／
ｍ）１０ｍを遠心濃縮装置（サーバント社，米
国，）により約１ｍにまで濃縮した。この溶液を氷冷
し、ついで飽和食塩水を溶液に少しにごるまで加え、そ
のまま４℃で３週間放置すると結晶が析出した。結晶を
遠心法により集め、飽和食塩水，ついで少量の冷蒸留水
で洗浄し、ＩＬ−２結晶０．５〜４．５mgを得た。
ニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜１．５mg／
ｍ）１０ｍを遠心濃縮装置（サーバント社，米
国，）により約１ｍにまで濃縮した。この溶液を氷冷
し、ついで飽和食塩水を溶液に少しにごるまで加え、そ
のまま４℃で３週間放置すると結晶が析出した。結晶を
遠心法により集め、飽和食塩水，ついで少量の冷蒸留水
で洗浄し、ＩＬ−２結晶０．５〜４．５mgを得た。
▲［α］24 D▼−２３℃（ｃ＝１．０，５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液，pH５．０） 本結晶の写真を第２図に示す。
モニウム緩衝液，pH５．０） 本結晶の写真を第２図に示す。
本結晶は結晶化されていないＩＬ−２と同程度の比活性
を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
移動度も結晶化されていないＩＬ−２のそれと同じであ
った。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時間）の
アミノ酸分析値も理論値によく一致した。
を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
移動度も結晶化されていないＩＬ−２のそれと同じであ
った。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時間）の
アミノ酸分析値も理論値によく一致した。
実施例２ Met−ＩＬ−２の製造 後述の参考例１で得られたMet−ＩＬ−２の５ｍＭ酢酸
アンモニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜３．
５mg／ｍ）１０ｍを用いて、実施例１と同様に処理
し、Met−ＩＬ−２結晶０．５〜１１mgを得た。
アンモニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜３．
５mg／ｍ）１０ｍを用いて、実施例１と同様に処理
し、Met−ＩＬ−２結晶０．５〜１１mgを得た。
▲［α］24 D▼−２４℃（ｃ＝１．０，５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液，pH５．０） 本結晶の写真を第３図に示す。
モニウム緩衝液，pH５．０） 本結晶の写真を第３図に示す。
本結晶は結晶化されていないMet−ＩＬ−２と同程度の
比活性を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動での移動度も結晶化されていないMet−ＩＬ−２と同
じであった。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時
間）のアミノ酸分析値も理論値によく一致した。
比活性を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動での移動度も結晶化されていないMet−ＩＬ−２と同
じであった。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時
間）のアミノ酸分析値も理論値によく一致した。
実施例３ ＩＬ−２結晶の製造 後述の参考例１で得られたＩＬ−２の５ｍＭ酢酸アンモ
ニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜１．５mg／
ｍ）１０ｍを遠心濃縮装置（サーバント社）により
約１ｍにまで濃縮した。この溶液の中へポリエチレン
グリコール６０００（平均分子量６０００）（和光純薬
工業株式会社製）の２０mgを加えて溶解し、室温に３週
間放置しておくと結晶が析出した。結晶を遠心分離によ
り集め、０．５％(w/v)ポリエチレングリコール６００
０溶液により洗浄した。本結晶は結晶化されていないＩ
Ｌ−２と同程度の比活性を有し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動での移動度も結晶化されていないＩ
Ｌ−２のそれと同じであった。酸分解物（６Ｎ塩酸，１
１０℃，２４時間）の酸分析値も理論値によく一致し
た。
ニウム溶液（pH５．０，蛋白質量，０．５〜１．５mg／
ｍ）１０ｍを遠心濃縮装置（サーバント社）により
約１ｍにまで濃縮した。この溶液の中へポリエチレン
グリコール６０００（平均分子量６０００）（和光純薬
工業株式会社製）の２０mgを加えて溶解し、室温に３週
間放置しておくと結晶が析出した。結晶を遠心分離によ
り集め、０．５％(w/v)ポリエチレングリコール６００
０溶液により洗浄した。本結晶は結晶化されていないＩ
Ｌ−２と同程度の比活性を有し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動での移動度も結晶化されていないＩ
Ｌ−２のそれと同じであった。酸分解物（６Ｎ塩酸，１
１０℃，２４時間）の酸分析値も理論値によく一致し
た。
実施例２Met−ＩＬ−２の製造 後述の参考例１で得られたMet−ＩＬ−２の５ｍＭ酢酸
アンモニウム溶液（pH５ｍＭ５．０，蛋白質量，０．５
〜３．５mg／ｍ）１０ｍを用いて、実施例３と同様
に処理し、Met−ＩＬ−２結晶を得た。取得した結晶は
結晶化していないMet−ＩＬ−２と同程度の比活性を有
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での移動
度も結晶化されていないMet−ＩＬ−２と同じであっ
た。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時間）のア
ミノ酸分析値も理論値によく一致した。
アンモニウム溶液（pH５ｍＭ５．０，蛋白質量，０．５
〜３．５mg／ｍ）１０ｍを用いて、実施例３と同様
に処理し、Met−ＩＬ−２結晶を得た。取得した結晶は
結晶化していないMet−ＩＬ−２と同程度の比活性を有
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での移動
度も結晶化されていないMet−ＩＬ−２と同じであっ
た。酸分解物（６ＮＨＣｌ，１１０℃，２４時間）のア
ミノ酸分析値も理論値によく一致した。
参考例１ ＦＰＬＣによるＩＬ−２とMet−ＩＬ−２と
の分離 特開昭６０−１１５５２８号公報の実施例４〜６で得ら
れたＩＬ−２およびMet−ＩＬ−２の混合物である非グ
リコシル化ヒトインターロイキン−２を含む５ｍＭ酢酸
アンモニウム緩衝液（pH５ｍＭ５．０（蛋白質濃度，1.
18mg／ｍ）５ｍを０．０２５Ｍジエタノールアミン
−塩酸緩衝液（pH９．４）で平衡化したＦＰＬＣ（Fast
Protein Liquid Choromatography）用モノＰカラム
（０．５×２０cm，ファルマシア社製）にのせ、ついで
１％(v/v)ファルマライト（８−１０．５）−５．２％
(v/v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液（pH８．０）を
用いてモノＰカラムに吸着したタンパク質を溶出した。
なおＦＰＬＣは室温下、流速３０ｍ／ｈで行った。そ
の結果、pH８．０で溶液されるピーク１とpH７．９で溶
出されるピーク２とに分離された。そこで、これらを分
取後、ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するた
め、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒と
する高速液体クロマトグラフイーを行った。
の分離 特開昭６０−１１５５２８号公報の実施例４〜６で得ら
れたＩＬ−２およびMet−ＩＬ−２の混合物である非グ
リコシル化ヒトインターロイキン−２を含む５ｍＭ酢酸
アンモニウム緩衝液（pH５ｍＭ５．０（蛋白質濃度，1.
18mg／ｍ）５ｍを０．０２５Ｍジエタノールアミン
−塩酸緩衝液（pH９．４）で平衡化したＦＰＬＣ（Fast
Protein Liquid Choromatography）用モノＰカラム
（０．５×２０cm，ファルマシア社製）にのせ、ついで
１％(v/v)ファルマライト（８−１０．５）−５．２％
(v/v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液（pH８．０）を
用いてモノＰカラムに吸着したタンパク質を溶出した。
なおＦＰＬＣは室温下、流速３０ｍ／ｈで行った。そ
の結果、pH８．０で溶液されるピーク１とpH７．９で溶
出されるピーク２とに分離された。そこで、これらを分
取後、ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するた
め、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒と
する高速液体クロマトグラフイーを行った。
カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ（１．０×２５cm，アル
テックス社，アメリカカラム温度，30℃；溶出溶媒Ａ，
０．１％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ，
０．１％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル，溶
出プログラム，０分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−４分（５
５％Ａ＋４５％Ｂ）−２８分（４２％Ａ＋５８％Ｂ）−
３８分（３４％Ａ＋６６％Ｂ）−４３分（２０％Ａ＋８
０％Ｂ）−４４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ），溶出速度
３．０ｍ／min。このクロマトグラフイーによって得
られた溶液をそれぞれ乾結乾燥に付し、白色粉末を得
た。ＦＰＬＣにおけるピーク１およびピーク２から得ら
れたものを、それぞれＰ１およびＰ２となずけた。Ｐ１
の収量は１．１２mg（１９．０％），Ｐ２の収量は３．
０１mg（５１．０％）であった。
テックス社，アメリカカラム温度，30℃；溶出溶媒Ａ，
０．１％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ，
０．１％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル，溶
出プログラム，０分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−４分（５
５％Ａ＋４５％Ｂ）−２８分（４２％Ａ＋５８％Ｂ）−
３８分（３４％Ａ＋６６％Ｂ）−４３分（２０％Ａ＋８
０％Ｂ）−４４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ），溶出速度
３．０ｍ／min。このクロマトグラフイーによって得
られた溶液をそれぞれ乾結乾燥に付し、白色粉末を得
た。ＦＰＬＣにおけるピーク１およびピーク２から得ら
れたものを、それぞれＰ１およびＰ２となずけた。Ｐ１
の収量は１．１２mg（１９．０％），Ｐ２の収量は３．
０１mg（５１．０％）であった。
アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析の
結果から、Ｐ１は第１図中Ｘ＝水素原子で示される分子
種（ＩＬ−２）をＰ２は第１図中Ｘ＝メチオニン残基で
示される分子種（Met−ＩＬ−２）をそれぞれ９８％お
よび９９％以上の純度で含んでいることが確認された。
結果から、Ｐ１は第１図中Ｘ＝水素原子で示される分子
種（ＩＬ−２）をＰ２は第１図中Ｘ＝メチオニン残基で
示される分子種（Met−ＩＬ−２）をそれぞれ９８％お
よび９９％以上の純度で含んでいることが確認された。
発明の効果 本発明方法により、ｒＩＬ−２を結晶化することがで
き、これによりｒＩＬ−２の純度およびその安定性を著
しく向上させることができるので、医薬として有利に用
いることができる。
き、これによりｒＩＬ−２の純度およびその安定性を著
しく向上させることができるので、医薬として有利に用
いることができる。
第１図は、ＩＬ−２のアミノ酸配列（図中、Ｘ＝水素原
子）およびMet−ＩＬ−２のアミノ酸配列（図中、Ｘ＝
メチオニン残基）をそれぞれ示す。 第２図は実施例１で得られたＩＬ−２結晶の写真を示
す。 第３図は実施例２で得られたMet−ＩＬ−２結晶の写真
を示す。
子）およびMet−ＩＬ−２のアミノ酸配列（図中、Ｘ＝
メチオニン残基）をそれぞれ示す。 第２図は実施例１で得られたＩＬ−２結晶の写真を示
す。 第３図は実施例２で得られたMet−ＩＬ−２結晶の写真
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−115528（ＪＰ，Ａ) 阿南功一（外４名）編「基礎生化学実験 法２ 抽出・分離・精製」（丸善）（昭49 −９−30）ｐ．57〜67 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ，1979〔55〕Ｐ．800
Claims (1)
- 【請求項１】水を主体とする高濃度の組換え型ヒトイン
ターロイキン−２の酢酸アンモニウム溶液に終濃度約５
〜２５％（Ｗ／Ｖ）の食塩または終濃度約０．５〜３０
％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコールを添加して組換
え型ヒトインターロイキン−２の溶解度を下げることに
より組換え型ヒトインターロイキン−２結晶を析出させ
ることを特徴とする組換え型ヒトインターロイキン−２
結晶の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61042565A JPH0655153B2 (ja) | 1986-02-26 | 1986-02-26 | ヒトインターロイキン―２結晶の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61042565A JPH0655153B2 (ja) | 1986-02-26 | 1986-02-26 | ヒトインターロイキン―２結晶の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62198622A JPS62198622A (ja) | 1987-09-02 |
| JPH0655153B2 true JPH0655153B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=12639576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61042565A Expired - Fee Related JPH0655153B2 (ja) | 1986-02-26 | 1986-02-26 | ヒトインターロイキン―２結晶の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0655153B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
-
1986
- 1986-02-26 JP JP61042565A patent/JPH0655153B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７９〔５５〕Ｐ．８００ |
| 阿南功一（外４名）編「基礎生化学実験法２抽出・分離・精製」（丸善）（昭４９−９−３０）ｐ．５７〜６７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62198622A (ja) | 1987-09-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |