JPH0811759B2 - 新リンホカイン▲ｉｉ▼とその製法および用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有する新
リンホカインIIとその製法および用途に関する。

腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するリンホカイン
としては、ヒトを含む動物由来のリンホトキシンや、ヒ
ト以外の動物由来のツモア ネクロシス ファクター
（以下、「TNF」と呼ぶ）などが知られている。

リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホカイ
ン」新免疫学叢書６、第87〜105頁（1979年）医学書
院、ブルーム ビー アール（Bloom B.R.）とグレイド
ピー アール（Glade P.R.）との共著「イン ビトロ
メソッズ イン セルメディエイテッド イムニティ
（In Vitro Methods in Cell−Mediated Immunit
y）」、アカデミック プレス（Academic Press）（197
1年）および「セルラー イムノロジー（Cellular Immu
nology）」、第38巻、第388〜402頁（1978年）などに記
載され、TNFは、カーズウェル イー エイ（Carswell
E.A.）など、「プロシーディグズ オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユー
エス エー（Proceedings of the National Academy of
Sience of the U.S.A.）」、第72巻、第９号、第3666
〜3670頁（1975年）およびイー ピック（E.Pick）編
「ツモア ネクロシス ファクター イン リンホカイ
ンズ（Tumor Necrosis Factor in Lymphokines）」、第
II巻、第235〜272頁、アカデミック プレス（Academic
Press）（1981年）などに記載されている。

また、最近、大西治夫らが特開昭58−146293号公報で
リンホカインの一種である抗腫瘍性糖蛋白質を明らかに
している。

本発明者らは、リンホカインについて多年研究してき
た。その結果、従来知られているこれらリンホカインと
は全く違った文献未記載の理化学的性質を有する新リン
ホカインIIの存在を認め、その製法を確立し、さらに各
種悪性腫瘍細胞に対する細胞障害活性を認め、その用途
を確立して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、理化学的性質が、 分子量 20,000±2,000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチル
エーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不
溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性
反応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法
で糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対す
る細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質
的に示さず 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４
℃で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で
安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リン
ホカインII（本明細書を通じて、本物質を新リンホカイ
ンIIと云う。）と、その製法および用途に関する。

新リンホカインIIの製法は、例えば、新リンホカイン
II産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血球、リン
パ球、培養株化された細胞などに誘導剤を作用させて生
成せしめればよい。

ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取した血
液を分離して調製すればよい。

培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従って、生
体外（in vitro）で増殖させた細胞が使用できる。

しかしながら、本発明の場合には、培養株化された細
胞の増殖に際し、ヒト以外の温血動物体内に直接移植す
るか、または拡散チャンバー内へ接種して、その温血動
物の体液の供給を受けながら増殖させる方が望ましい。

即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合とは違っ
て、高価な血清などを含む栄養培地が不要、または大幅
に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持管理も
極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘導生成
される新リンホカインII活性が高い特徴を有している。

ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株化され
たヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に移植
し、あるいは、その動物の体液の供給を受けることので
きる拡散チャンバーを動物体内に埋設して通常の飼育を
すれば、温血動物体から供給される栄養物を含有する体
液を利用してその細胞が容易に増殖しうるのである。

更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と比較し
て、この細胞の増殖が安定であること、その増殖速度が
大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更には、細胞
当りの新リンホカインIIの収量が著しく増加することも
大きな特徴である。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、
ヒト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得て、
しかも新リンホカインII産生能を有する細胞であればよ
く、例えば「蛋白質核酸酵素Vol.20、No.6」616〜643頁
（1975年）に記載されているヒト由来の各種株化細胞を
用いることができる。ジャーナル オブ クリニカル
ミクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiolo
gy）」、第１巻、第116〜117頁（1975年）に記載されて
いるNamalwa細胞、アイ ミヨシ（I.Miyoshi）著、「ネ
イチャ（Nature）」、第267巻、第843〜844頁（1977
年）に記載されているBALL−１細胞、TALL−１細胞、NA
LL−１細胞、「ザ ジャーナル オブ イムノロジー
（The Journal of Immunology）」、第113巻、第1334〜
1345頁（1974年）に記載のＭ−7002細胞、Ｂ−7101細
胞、「組織培養」第６巻、第13号、527〜546頁（1980
年）に記載されているJBL細胞、EBV−Sa細胞、EBV−wa
細胞、EBV−HO細胞、MOLT−３細胞や、その他BALM−２
細胞、CCRF−SB細胞、（ATCC CCL120）CCRF−CEM細胞、
DND−41細胞などの株化されたリンパ芽球様細胞や、ま
た、正常な単核細胞、顆粒性白血球細胞などを各種ウィ
ルス、薬剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞な
どが好適である。

また、これらヒト由来の細胞の新リンホカインIIの産
生能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコー
ルやセンダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、
DNAリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、DNAポリメラ
ーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などに
よって処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当りの新
リンホカインII産生能を高めたりして使用してもよく、
本明細書に記載する株化細胞のみに限定されるものでは
ない。これらの細胞は、後に述べる新リンホカインIIを
誘導生成させるまでの過程で、単独、または２種以上を
混合して自由に利用される。必要ならば、これに、例え
ばヒトから採取し調製される白血球、リンパ球などを併
用することもできる。

本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖
し得るものであればよく、例えばニワトリ、ハトなどの
鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、
ウシ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハムスタ
ー、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用でき
る。

これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましく
ない免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をでき
るだけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状
態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好ましい。

また、これら動物に例えば200〜600レム程度のエック
ス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清若し
くは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほどこし
て、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスあるいはヌードラットの
場合には、成長したものであっても免疫反応が弱いの
で、これらの前処理を必要とすることもなく、培養株化
されたヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるの
で特に好都合である。

また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハ
ムスターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌード
マウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間
で移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、
更にそれらから誘導生成される新リンホカインII量を増
加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同綱間、同
門間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動
物体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれ
ばよく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選
ばれる。

また、動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約10^-7〜10^-5mを有するメンブランフィルター、
限外濾過膜またはフォローファイバーなどを設けた公知
の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、例え
ば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体液の
供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養株化さ
れたヒト由来の細胞を何れも増殖させることができる。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む
溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにした
チャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内
のヒト由来の細胞の増殖状態をその表面に設けた窓を通
じて透視できるようにすることも、また、このチャンバ
ー部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せず
に寿命一杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産
量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来
の細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細
胞のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免
疫反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前
処置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特
徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管
理を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何
ら必要としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常１〜10
週の期間で目的を達成することができる。このようにし
て得られるヒト由来の細胞数は動物個体当り約10⁷〜10
¹²個、またはそれ以上に達することも見出した。

換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来の細胞
数は、動物個体当り移植した細胞数の約10²〜10⁷倍、ま
たはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増
殖させる場合の約10¹〜10⁶倍、またはそれ以上にも達し
て、新リンホカインIIの製造のために極めて好都合であ
る。

このようにして増殖させたヒト由来の細胞から新リン
ホカインIIを誘導生成させる方法は自由である。それ
が、増殖した動物体内のままで新リンホカインII誘導剤
を作用させることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮
遊状で増殖したヒト由来の細胞に、また皮下に生じた腫
瘍細胞に、新リンホカインII誘導剤を直接作用させて新
リンホカインIIを誘導生成させ、次いで、その血清、腹
水または腫瘍から新リンホカインIIを精製採取すればよ
い。

また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体内から
取り出し、生体外で新リンホカインII誘導剤を作用させ
て新リンホカインIIを誘導生成させることもできる。例
えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、また
は皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散
し、得られる細胞を約20〜40℃に保った栄養培地に細胞
濃度が約10⁵〜10⁸/mlになるよう浮遊させ、これに新リ
ンホカインII誘導剤を作用させることによって新リンホ
カインIIを誘導生成させ、これを精製採取すればよい。

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させ
た場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、ま
たはチャンバーから取り出して、新リンホカインII誘導
剤を作用させ、新リンホカインIIを誘導生成させること
もできる。

また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用して得
られるヒト由来の細胞を、必要ならば、更にインビトロ
で１〜４日間程度培養し細胞の増殖世代を同調させるな
どした後、新リンホカインII誘導剤を作用させ新リンホ
カインIIを誘導生成させることも自由である。

また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物
体内のままで新リンホカインIIを誘導生成させた後、次
いで、同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカインIIを誘導
生成させる方法、また、一度新リンホカインIIの誘導生
成に使用した細胞を、更に２度以上新リンホカインIIの
誘導生成に使用する方法、または動物体内に埋設、若し
くは接続するチャンバーを交換して得られる細胞数を増
加させる方法などによって、使用する動物個体当りの新
リンホカインII生成量を更に高めることも自由である。

本発明の新リンホカインII誘導剤としては、α−イン
ターフェロン誘導剤として知られているウィルス、核
酸、ヌクレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤と
して知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ、ポークウィードミトーゲン、リポポリサッカリ
ド、エンドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられ
る。また、感作化された細胞にとっては、抗原も新リン
ホカインIIの誘導剤である。

更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインIIを誘導生
成させるに際し、新リンホカインII誘導剤として、α−
インターフェロン誘導剤とγ−インターフェロン誘導剤
とを併用することにより新リンホカインIIの生産量を高
めることも自由である。

また、これら誘導生成によって新リンホカインIIが産
生されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェ
ロンも同時に産生されることが判明した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同
時生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を
可能にし、新リンホカインII及びヒトインターフェロン
を大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。

このようにして誘導生成された新リンホカインIIは、
公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分
離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製
分離し、採取することができる。更に高度の精製を必要
とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶
出、ゲル濾過および等電点分画、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィーなど公知の方法を組合せれば、比活性約10⁹単位/
mg蛋白質の最高純度の新リンホカインIIを採取すること
も可能である。

また、このようにして得られた新リンホカインIIを、
抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗
体産生細胞を採取して、この細胞と骨髄腫細胞とを融合
せしめ、得られる融合細胞から抗新リンホカインII抗体
産生能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増殖
させ、生成したモノクローナル抗体を、例えば、ブロム
シアン活性化セファロースと反応させて得られる固定化
モノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リンホ
カインIIを高収率で採取することも有利に用いることが
できる。

このようにして精製し製造された新リンホカインII
は、理化学的性質が、 分子量 20,000±2,000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、R_f＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチル
エーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不
溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性
反応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法
で糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対す
る細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質
的に示さず 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４
℃で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で
安定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定であることが
判明した。

また、新リンホカインIIは、マウスL₉₂₉細胞のみなら
ず、多くのヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅させる能力を
有しているが、ヒト正常細胞には実質的に障害を与えな
いことも判明した。

従って、新リンホカインIIは、これを含有する組成物
などとして、新リンホカインII感受性疾患、例えば、悪
性腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がきわめ
て困難とされていたヒトの各種悪性腫瘍治療剤として有
利に用いることができる。

新リンホカインIIの活性は、標的細胞としてKB細胞、
またはL₉₂₉細胞を用いて測定した。即ち、KB細胞を用い
る場合には、キヤンサー ケモテラピー リポーツ（Ca
ncer Chemotherapy Reports）パーツ（Parts）３、Vol.
3、No.2、September 1972の記載に準じて、KB細胞の増
殖抑制活性を測定し、L₉₂₉細胞を用いる場合には、イー
ピック（E.Pick）編、ツモア ネクロシス ファクタ
ー イン リンホカインズ（Tumor Necrosis Factor in
Lymphokines）Vol.II、245〜249頁、アカデミック プ
レス（Academic Press）（1981年）の記載に準じて、ア
クチノマイシンＤ存在下でのL₉₂₉細胞に与える細胞障害
活性を測定した。この際、L₉₂₉細胞の増殖を50％抑制す
るときの活性を50単位とした。本明細書では、特にこと
わらない限り、L₉₂₉細胞を用いる活性測定方法を採用し
た。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は「蛋
白質核酸酵素」Vol.20、No.6、616〜643頁（1975年）に
報告されているヒト羊膜由来のFL細胞を使用して公知の
プラーク半減法で測定した。

赤血球凝集価はゼイ イー サーク（J.E.Salk）著、
ザ ジャーナル オブ イムノロジー（The Journal of
Immunology）Vol.49、87頁（1944年）の方法に準じて
測定した。

次に、本発明を実験で説明する。

実験Ａ−１ 部分精製した新リンホカインIIの調製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製
した抗血清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下にBALL−１細胞を移植し、その後通常の方
法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出して細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清添加のRPMI 1640培地（pH7.2）で洗浄し、同培地
に約２×10⁶/mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁液に対
して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイウィルスを
添加し、37℃で24時間保って新リンホカインIIを誘導生
成させた。

これを約４℃、約1,000gで遠心分離し、沈澱物を除去
し、得られた上清をpH7.2、0.01Mリン酸塩緩衝液を含有
する生理的食塩水で20時間透析し、更に、精密濾過して
得た濾液を、抗インターフェロン抗体を固定化している
抗体カラムに流し、その非吸着画分を採取し、更に、こ
れをクロマトフォーカッシング法により活性画分を採取
し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインII活性を含有
する粉末を得た。

本粉末の比活性は、約10⁶単位/mg蛋白質であった。ま
た、新リンホカインIIの収量は、ハムスター１匹当り約
2,000万単位であった。

実験Ａ−２ 抗新リンホカインII抗体の調製 実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインIIを生理食塩
水に蛋白質濃度として約0.05w/v％になるように溶解
し、これとフロイント完全アジュバント乳化液とを等量
混合して、この混合液0.2mlをマウスの皮下に注射し、
７日後再び同様に注射してマウスを免疫した。その抗体
産生能を有する細胞に抗新リンホカインII抗体を誘導生
成せしめ、このマウスからひ臓を摘出し、細切分散して
得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞P₃−X63−Ag8「フ
ローラボラトリーズ（Flow Laboratories）社製」と
を、血清無含有Eagleの最少基本培地で調製した50W/V％
ポリエチレングリコール−1000溶液（pH7.2、温度37
℃）に、それぞれ10⁴/mlになるように浮遊させて５分間
保った後、前記基本培地で20倍に希釈し、次いで、ダビ
ソン（Davison）などがソマティック セル ゼネティ
ックス（Somatic Cell Genetics）、Vol.2、175〜176頁
（1976年）に報告している方法に準じてヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合細
胞を採取し、この融合細胞から抗新リンホカインII抗体
産生能を有する融合細胞を選択した。得られた融合細胞
をマウス腹腔内に１匹当り約10⁶個移植して２週間飼育
した後、これを屠殺して腹水、血液などの体液を集め、
遠心分離し、この上清を硫安塩析して飽和度30〜50％の
沈澱画分を集め、次いで透析し、更に、この液を、実験
Ａ−１の方法で得た新リンホカインIIをブロムシアン活
性化セファロースと室温下で反応させて得られる固定化
新リンホカインIIゲルを用いてアフィニティクロマトグ
ラフィーを行ない、抗新リンホカインII抗体画分を得、
透析した後濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインIIのモ
ノクローナル抗体粉末を採取した。

本品は、新リンホカインIIの細胞障害活性に対して免
疫学的に特異的な中和活性を示した。

実験Ａ−３ 高純度に精製した新リンホカインIIの調製
とその理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカインIIの部分
精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモノクローナル
抗体を固定化したゲルを用いてアフィニティクロマトグ
ラフィーを行ない新リンホカインIIの活性画分を採取
し、透析し、濃縮して凍結乾燥した。

本品は、高純度に精製された新リンホカインIIであっ
て、その比活性は、約10⁹単位/mg蛋白質であった。

本品を用いて、理化学的性質を調査した。

分子量 ケイ ウェーバー アンド エム オズボーン（K.We
ber and M.Osborn）、ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリイ（Journal of Biological Chemistr
y）、Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた。即
ち、0.1％SDS存在下、10％アクリルアミドゲルカラムに
試料約10μｇを負荷し、カラム当り8mAで４時間泳動
後、クーマシー・ブルー（Coomassie blue）を用いて染
色すると分子量20,000±2,000の単一の鋭い帯が得られ
た。この単一の帯は新リンホカインII活性を有してい
た。

等電点 スウェーデン、LKB社製、等電点電気泳動用ゲル、商
品名AMPHOLINE PAGPLATE（pH3.5〜9.5）を用いて、25
W、２時間泳動した結果、等電点pIは6.2±0.3であっ
た。

電気易動度 ビー ゼイ デービス（B.J.Davis）、アニュアルズ
オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイエ
ンシズ（Annuals of the New York Academy of Science
s）Vol.121、404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％ア
クリルアミドゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、pH8.
3、カラム当り3mAで２時間泳動後、抽出してその活性測
定から電気易動度を求めたところ、R_f0.29±0.02であっ
た。

紫外線吸収スペクトル 株式会社島津製作所製の分光光度計、商品名UV−250
を用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果、280n
m付近に最大吸収を示した。

溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチル
エーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不
溶であった。

呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性
反応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法
で糖質陽性反応を示した。

作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示した。KB細胞に対
する細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性は実
質的に示さなかった。

水溶液での活性安定性 １）熱安定性 約１×10⁵単位/mlの試料を各温度によりpH7.2で30分
間保持した後、残存する活性を測定した結果、60℃まで
安定であった。

２）pH安定性 約１×10⁶単位/mlの試料0.1mlを各pH緩衝液（pH2〜７
…マックルベイン緩衝液（Mcllvaine buffer）、pH7〜
８…リン酸塩緩衝液（Phosphate buffer）、pH8〜11…
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（Glycine−NaOH bu
ffer））1mlに加え、４℃で16時間保持した後、この0.1
mlをpH7.2、0.05Mリン酸塩緩衝液でpH7.2に調整して残
存する活性を測定した結果、pH4.0乃至11.0の範囲で安
定であった。

３）ディスパーゼ（DISPASE）に対する安定性約１×10⁵
単位/mlの試料にディスパーゼ（合同酒精株式会社製造
のバシラス属細菌由来のプロテアーゼ）100単位/mlにな
るように加え、pH7.2、温度37℃で０乃至２時間反応さ
せ、経済的にサンプリングし、牛血清アルブミンを1w/v
％になるように加えて反応を止めた。この液の新リンホ
カインIIの残存活性を測定した結果、新リンホカインII
はディスパーゼ処理により不安定で、その反応につれて
新リンホカインIIの活性が失なわれた。

凍結貯蔵による安定性 pH7.2の水溶液を一10℃で凍結し１ケ月間貯蔵した
後、融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見られ
なかった。

以上の結果から、新リンホカインIIは、従来知られて
いるリンホトキシン、TNF、インターフェロンなどのリ
ンホカインとは、明らかに違った文献未記載の理化学的
性質を有する。

実験Ｂ−１ 悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用 実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得た新リンホ
カインIIを用いて、ヒト由来の各種細胞に対する増殖抑
制作用を調べた。

牛胎児血清を補足した公知の栄養培地1mlにヒト由来
の各種細胞を10⁶個ずつとり、１日培養した後、これに
実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で調製した新リン
ホカインIIを50単位または500単位含有する生理食塩水
0.1mlを加え、37℃で２日間培養した。培養終了後、ア
プライド ミクロバイオロジー（Applied Microbiolog
y）、Vol.22、No.4、671〜677頁（1971年）に記載され
ている方法に準じて、染色剤ニュートラルレッドで生細
胞を染色し、続いて、この染色剤をアシドエタノールで
溶出し、溶出液の540nmにおける吸光度から生細胞量を
測定した。

なお、対照実験には、新リンホカインIIを含まない生
理食塩水0.1mlを用いた。

細胞の増殖抑制率（％）は、次の式から算出した。

その結果を、第１表に示した。

第１表の結果から明らかなように、新リンホカインII
は、正常細胞に対してほとんど影響を与えず、各種の悪
性腫瘍細胞に対してはその増殖を著るしく抑制すること
が判明した。また、その効果は、高度に精製したものの
みならず、部分精製したものであってもよいことが判明
した。

実験Ｂ−２ BALB/Cマウスに、マウス肉腫Meth−Ａ細胞を移植し、
その移植後10日目から、実験Ａ−３の方法で得られた新
リンホカインIIを生理食塩水に溶解した状態で、毎日１
回、100または1,000単位/Kgずつ15日間静脈注射を行っ
た。その後、マウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。

その結果、第２表に示した。

実験Ｂ−３ BALB/C由来ヌードマウスにヒト乳癌組織片を背部皮下
に移植し、その腫瘍体積が約200mm³になった時期から、
実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得られた新リン
ホカインIIを生理食塩水に溶解した状態で、毎日１回、
100または1,000単位/Kgずつ20日間静脈注射を行った。
その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定し
た。

その結果を、第３表に示した。

実験Ｂ−４ BALB/C由来ヌードマウスにヒト乳癌組織片を実験Ｂ−
３と同様に移植し、その腫瘍体積が約200mm³になった時
期から実験Ａ−３の方法で得られた新リンホカインII及
び／又はヒトα−インターフェロンを生理食塩水に溶解
した状態で毎日１回、20日間静脈注射を行った。

その後、ヌードマウスを屠殺して腫瘍の重量を測定し
た。なお、対照実験には、新リンホカインII及びヒトα
−インターフェロンを含まない生理食塩水を用いた。

結果を第４表に示す。

第４表の結果から、新リンホカインIIは、インターフ
ェロンと併用することにより、その抗腫瘍効果が著しく
増強される。

実験Ｂ−５ 生後20日のマウスを使用して、実験Ａ−３の方法で得
られた新リンホカインIIの急性毒性試験をしたところ、
新リンホカインIIの毒性は極めて低く、腹腔内に注射し
た時のLD₅₀は、10⁹単位以上であることが判明した。

以上の実験からも明らかなように、本発明の新リンホ
カインIIは、生体外（in vitro）のみならず、生体内に
おいても悪性腫瘍の増殖抑制に有効であり、その有効用
量から見て安定性は極めて高い。

本発明の新リンホカインIIの成人１日当りの用量は５
〜500,000,000単位であり、好ましくは局所注射および
点眼などの局所適用用量は５〜10,000,000単位、軟膏ま
たは坐剤などの経皮または経粘皮適用の場合10〜50,00
0,000単位、静注および筋注など全身注射の場合50〜10
0,000,000単位、経口投与の場合500〜500,000,000単位
であるが、用法あるいは症状に応じて適宜増減すること
ができる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤
あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製
することができる。その使用量は、新リンホカインIIの
毒性、有効量および安全性を考慮すると医薬用製剤グラ
ム当り５単位以上の新リンホカインIIを含有せしめるの
が望ましい。

新リンホカインIIを含有する新リンホカインII感受性
疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的に応じてその
形状を自由に選択できる。

経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤などの
腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射剤とし
ては、例えば、用時に注射用蒸溜水に溶解して使用する
凍結乾燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤とし
て用いることもできる。

また、新リンホカインIIを用いて悪性腫瘍を治療する
に際し、例えば、患者の腫瘍の一部を取り、これを新リ
ンホカインIIで処理することによって、その腫瘍の免疫
原性を高めた後、腫瘍患者の体内に戻すことにより、こ
の悪性腫瘍の治療をより効果的に行うこともできる。ま
た、新リンホカインIIと共に各種抗腫瘍剤、例えばイン
ターフェロン、TNF、リンホトキシン、TCGFなどの他の
リンホカイン、β−1,3グルカン、アラビノマンナン、
リポポリサッカリド、OK−432（ピシバニール）、PSK
（クレスチン）、レンチナンなどの抗腫瘍性多糖類、メ
ソトレキサート（MTX）、フルオロウラシル（５−FU）
などの代謝拮抗剤、ドキソルビシン（ADM）、マイトマ
イシンＣ（MMC）などの抗生物質などを併用して新リン
ホカインIIの抗腫瘍効果を更に高めることも有利に実施
できる。

以下、実施例Ａで本発明における新リンホカインIIの
製造例を、実施例Ｂで本発明における新リンホカインII
の組成物である各種薬剤の製造例を述べる。

実施例Ａ−１ ヒト由来のリンパ芽球様細胞BALL−１細胞を牛胎児血
清を20％補足したEagleの最少基本培地（pH7.4）に接種
し、37℃で常法に従い生体外（in vitro）に浮遊培養し
た。得られた細胞を血清無添加のEagleの最少基本培地
（pH7.4）で洗浄し、同培地に約１×10⁷/mlになるよう
に懸濁した。この懸濁液にセンダイウィルスをml当り約
1,000赤血球凝集価添加し、38℃で１日保って新リンホ
カインIIを誘導生成させた。これを４℃、約1,000gで遠
心分離し、得られた上清をpH7.2、0.01Mリン酸塩緩衝液
を含有する生理食塩水で15時間透析し、更に精密濾過し
て得た濾液を実験Ａ−１と同様に抗インターフェロン抗
体のカラムに流し、その非吸着画分を、実験Ａ−３で述
べた方法でモノクローナル抗体のゲルカラムを用いてア
フィニティクロマグラフィーにより精製し、濃縮して比
活性約10⁹単位/mg蛋白質を有する新リンホカインIIの濃
縮液を得た。

活性収率は、誘導生成時の懸濁液１当り約150万単
位であった。

実施例Ａ−２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製
した抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様
細胞BALL−１細胞を移植し、その後通常の方法で３週間
飼育した。皮下に生じた約15gの腫瘤を摘出し細切し、
生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を血清
無添加のRPMI 1640培地（pH7.2）で洗浄し、同培地に
約５×10⁶/mlに懸濁した。この懸濁液に、センダイウィ
ルスをml当り約1,000赤血球凝集価及びE.coli由来のエ
ンドトキシンをml当り約10μｇを添加し、37℃で１日間
保って新リンホカインIIを誘導生成させた。これを約４
℃、約1,000gで遠心分離し、沈澱物を除去し、得られた
上清をpH7.2、0.01Mリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩
水で21時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を、実施
例Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得られる
溶液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約10⁹単位/mg蛋白質
を有する新リンホカインIIの粉末を得た。

活性収率は、約3,200万単位であった。

実施例Ａ−３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化されたヒ
ト由来のリンパ芽球様細胞TALL−１細胞の移植後、通常
の方法で５週間飼育した。この腹腔内へ、約3,000赤血
球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって
予めほとんど失活させて注入し、24時間後に屠殺して腹
水を採取した。以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮
乾燥して新リンホカインIIの粉末を得た。

活性収率は、ヌードマウス１匹当り約350万単位であ
った。

実施例Ａ−４ 成長した普通マウスに約400レムのエックス線を予め
照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下
に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Mono−１
細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮
下に生じた約10gの腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と
同様にして細胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２
と同様に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウィルス
をml当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリンＡをml
当り0.8μｇを添加し、37℃で１日間保って新リンホカ
インIIを誘導生成させた。以後、実施例Ａ−２と同様に
精製、濃縮、乾燥して新リンホカインIIの粉末を得た。

活性収率は、マウス１匹当り2,000万単位であった。

実施例Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−２と同様にして培養
株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Namalva細胞を
移植し、その後通常の方法で４週間飼育した。皮下に生
じた約20gの腫瘤を実施例Ａ−２と同様にほぐして約３
×10⁶/mlの細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウィ
ルスをml当り約1,000赤血球凝集価を添加し36℃で２日
間保って新リンホカインIIを誘導生成させ次いで実施例
Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカインIIの濃縮液
を得た。

活性収率は、ハムスター１匹当り約2,200万単位であ
った。

実施例Ａ−６ 孔径0.5ミクロンのメンブランフィルターを設けた内
容量約10mlのプラスチック製円筒型拡散チャンバー内
に、培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞NALL−
１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラット
の腹腔内に埋設した。このラットを通常の方法で４週間
飼育した後、この拡散チャンバーを取り出した。これに
より得られたヒト由来の細胞の濃度は約５×10⁸/mlであ
って、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキュベーター中
で増殖させる場合の約10²倍以上にも達することがわか
った。この細胞を実施例Ａ−２と同様に懸濁し、この懸
濁液に、ml当り約500赤血球凝集価のニューカッスル病
ウィルスを紫外線で予めほとんど失活させて加え、さら
にフィトヘマグルチニンをml当り約50μｇ加え37℃で１
日間保って新リンホカインIIを誘導生成させた。以後、
実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥して新リンホ
カインIIの粉末を得た。

活性収率は、ラット１匹当り約800万単位であった。

実施例Ａ−７ 37℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、ヒト由来の
株化細胞CCRF−CEM細胞を移植した後、37℃で１週間保
った。この卵を割卵した後、増殖細胞を採取した。この
細胞を実施例Ａ−１と同様に５×10⁶/mlに懸濁した。こ
の懸濁液にml当り約500赤血球凝集価のセンダイウィル
スを添加し、37℃で１日間保って新リンホカインIIを誘
導生成させ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮
乾燥して新リンホカインIIの粉末を得た。

活性収率は、受精卵10個当り約70万単位であった。

実施例Ｂ−１ 注射液 実施例Ａ−２の方法で調製した新リンホカインII500,
000単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メンブランフィ
ルターを用いて無菌的に濾過する。濾液を滅菌したガラ
ス容器に2mlずつ充填して凍結乾燥し、これを密栓し
て、凍結乾燥粉末製剤とする。

本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適
である。

実施例Ｂ−２ 注射剤 実施例Ｂ−１の注射剤の製造において、新リンホカイ
ンII500,000単位と共に、リンパ芽球様細胞由来のα−
インターフェロン300,000,000単位を生理食塩水200mlに
溶解したほかは、実施例Ｂ−１と同様に製造して凍結乾
燥粉末製剤を得た。

本品は、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病などの各種
悪性腫瘍に対して、実施例Ｂ−１の注射剤と比較して顕
著に優れた治療効果を発揮する。

実施例Ｂ−３ 軟膏剤 実施例Ａ−３の方法で調製した新リンホカインIIを常
法に従い少量の流動パラフィンに研和した後、ワセリン
を加え20,000単位/gの軟膏薬とした。

本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適で
ある。

実施例Ｂ−４ 点眼剤 蒸溜水800mlとβ−フェニルエチルアルコール5mlと実
施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカインII 20,00
0,000単位とに等張化するよう食塩を加え蒸溜水で1,000
mlとし点眼剤とした。

本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。

実施例Ｂ−５ 腸溶性錠剤 実施例Ａ−７の方法で調製した新リンホカインIIを常
法に従って澱粉とマルトースとを混合使用して打錠する
に際し、新リンホカインIIを製品１錠（100mg）当り20
0,000単位になるように含有せしめて錠剤を製造し、こ
れにメチルセルロースフタレートをコーティグして腸溶
性錠剤とした。

本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】理化学的性質が、 分子量 20,000±2,000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
   ーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
   糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対する
   細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質的
   に示さず 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
   で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で安
   定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リン
   ホカインII。
2. 【請求項２】下記の理化学的性質を有する新リンホカイ
   ンII産生能を有するヒト由来の細胞に誘導剤を作用させ
   て新リンホカインIIを生成し採取することを特徴とした
   新リンホカインIIの製造方法。 分子量 20,000±2,000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
   ーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
   糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対する
   細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質的
   に示さず 水溶液での活性安定性 pH7.23で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
   で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で安
   定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定
3. 【請求項３】理化学的性質が、 分子量 20,000±2,000 等電点 pH＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
   ーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
   糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対する
   細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質的
   に示さず 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
   で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で安
   定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リン
   ホカインIIを、これに特異性を示すモノクロナル抗体を
   用いて精製し、採取することを特徴とした特許請求の範
   囲第２項記載の新リンホカインIIの製造方法。
4. 【請求項４】理化学的性質が、 分子量 20,000±2,000 等電点 pI＝6.2±0.3 易動度 Disc−PAGEで、Rf＝0.29±0.02 紫外線吸収スペクトル 280nm付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶、エチルエ
   ーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
   応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
   糖質陽性反応を示す 作用 L₉₂₉細胞に対して細胞障害活性を示し、KB細胞に対する
   細胞増殖抑制活性およびインターフェロン活性を実質的
   に示さず、 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
   で16時間保持する条件によりpH4.0乃至11.0の範囲で安
   定 −10℃での凍結貯蔵で１ケ月以上安定である新リン
   ホカインIIを含有することを特徴とした抗腫瘍剤。