JPH0655157B2 - 臨床試料中の微生物の迅速検出方法 - Google Patents
臨床試料中の微生物の迅速検出方法Info
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- JPH0655157B2 JPH0655157B2 JP60005622A JP562285A JPH0655157B2 JP H0655157 B2 JPH0655157 B2 JP H0655157B2 JP 60005622 A JP60005622 A JP 60005622A JP 562285 A JP562285 A JP 562285A JP H0655157 B2 JPH0655157 B2 JP H0655157B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は微生物の検出に関する。より詳細には本発明は
試料中の他の成分の溶解(lysis)を起こす試薬で試料を
処理してその微生物のみが染色される状態にしたのち微
生物を染色することによる、体液中の微生物の検出およ
び計数法に関する。
試料中の他の成分の溶解(lysis)を起こす試薬で試料を
処理してその微生物のみが染色される状態にしたのち微
生物を染色することによる、体液中の微生物の検出およ
び計数法に関する。
健康な個体においては大部分の体液、たとえば血液、髄
液または滑液は無菌であり、これらの体液中に微生物が
存在することは健康上の問題を示し、ある場合には生命
をおびやかす可能性がある。血液感染の効果的治療には
早期診断が必要であり、病原体が正確に同定されるまで
は適切な治療を開始することができない。これは感染の
初期の段階では血液中の病原体の濃度がきわめて低いた
め、著しく困難である。
液または滑液は無菌であり、これらの体液中に微生物が
存在することは健康上の問題を示し、ある場合には生命
をおびやかす可能性がある。血液感染の効果的治療には
早期診断が必要であり、病原体が正確に同定されるまで
は適切な治療を開始することができない。これは感染の
初期の段階では血液中の病原体の濃度がきわめて低いた
め、著しく困難である。
これに対し尿は無菌的な液体ではなく、健康な人々にお
いてすら常に微生物が存在する。それにもかかわらず尿
路感染症（一般に細菌尿症と呼ばれる）は重大な健康上
の問題であり、尿のどのような微生物水準が感染を示
し、どのような水準が正常であるかについてはかなりの
論争がある。一般の尿分析法を考慮したこの問題に関す
る論評はポロツク（Am.J.Medicine,1983年６月28日）に
より提示されている。
いてすら常に微生物が存在する。それにもかかわらず尿
路感染症（一般に細菌尿症と呼ばれる）は重大な健康上
の問題であり、尿のどのような微生物水準が感染を示
し、どのような水準が正常であるかについてはかなりの
論争がある。一般の尿分析法を考慮したこの問題に関す
る論評はポロツク（Am.J.Medicine,1983年６月28日）に
より提示されている。
血液中の微生物を検出するためには、種々の系が提供さ
れている。２方法が現在病院内の微生物学研究室で採用
されている。一つは、増殖培地に患者の血液を接種し、
増殖を示す懸濁な増加を一定期間にわたつて監視する、
一般的な血液培養法である。懸濁を生じる増殖に必要な
期間が長いことが著しい欠点である。ある種の微生物は
混濁により検出するために７日に及び日数を必要とす
る。
れている。２方法が現在病院内の微生物学研究室で採用
されている。一つは、増殖培地に患者の血液を接種し、
増殖を示す懸濁な増加を一定期間にわたつて監視する、
一般的な血液培養法である。懸濁を生じる増殖に必要な
期間が長いことが著しい欠点である。ある種の微生物は
混濁により検出するために７日に及び日数を必要とす
る。
病院で採用される第２の方法は、放射性同位元素(14C)
標識された栄養源が微生物の増殖により14C標識-CO2に
変換されるのを上部空間のガス中で監視する、自動放射
性同位元素検出法である。この方法は陽性の血液培養物
の３０％を１２時間以内に、７０％を２４時間以内に検
出することが示されたが、これも検出のために増殖に依
存している。検出は一般的な培養法を用いた場合よりも
速かに達成されるが、１２〜２４時間という期間は病原
体の迅速な検出が重要である場合にはなお著しい欠点で
ある。
標識された栄養源が微生物の増殖により14C標識-CO2に
変換されるのを上部空間のガス中で監視する、自動放射
性同位元素検出法である。この方法は陽性の血液培養物
の３０％を１２時間以内に、７０％を２４時間以内に検
出することが示されたが、これも検出のために増殖に依
存している。検出は一般的な培養法を用いた場合よりも
速かに達成されるが、１２〜２４時間という期間は病原
体の迅速な検出が重要である場合にはなお著しい欠点で
ある。
敗血症または菌血症の迅速検知のために他の方法も提案
されている。ある方法では可能な限り十分な血球成分を
微生物から分離除去するために各種の濃度勾配が用いら
れた。これらの方法の一例は米国特許第4,131,512号明
細書（ドルン：Dorn）に記載されたものであり、その場
合溶解した血液試料を高濃度の液状クツシヨン剤(cushi
oningagent)上に乗せて遠心分離し、クツシヨン剤と試
料の界面に病原性微生物を集める。集められた微生物を
次いでクツシヨン剤から分離してコロニー形成のため各
種の栄養寒天平板上で培養する。
されている。ある方法では可能な限り十分な血球成分を
微生物から分離除去するために各種の濃度勾配が用いら
れた。これらの方法の一例は米国特許第4,131,512号明
細書（ドルン：Dorn）に記載されたものであり、その場
合溶解した血液試料を高濃度の液状クツシヨン剤(cushi
oningagent)上に乗せて遠心分離し、クツシヨン剤と試
料の界面に病原性微生物を集める。集められた微生物を
次いでクツシヨン剤から分離してコロニー形成のため各
種の栄養寒天平板上で培養する。
細菌尿の検出のために臨床研究所で現在用いられている
方法（一般に１×105コロニー形成単位／ｍ（cfu／ｍ
）以上の尿中微生物濃度として規定）も増殖に基づく
方法である。これらの方法では尿のサンプルの一定量
（通常は１〜１０μ）を種々の型の寒天培地の表面で
１８〜２４時間培養し、コロニーを計数する。これらの
方法は培養に要する時間および最終的に陰性であると証
明された試料に費した材料費で欠点をもつ。
方法（一般に１×105コロニー形成単位／ｍ（cfu／ｍ
）以上の尿中微生物濃度として規定）も増殖に基づく
方法である。これらの方法では尿のサンプルの一定量
（通常は１〜１０μ）を種々の型の寒天培地の表面で
１８〜２４時間培養し、コロニーを計数する。これらの
方法は培養に要する時間および最終的に陰性であると証
明された試料に費した材料費で欠点をもつ。
血中および尿中の微生物の検出には双方とも染色法も用
いられ、種々の標準試薬、たとえばグラム、ライト、ジ
エンナー−ギームザ、ライシユマン、またはメイ−グル
ンワルド−ギームザなどの染色法が用いられている。尿
試料に関しては、これらの方法は遠心分離されていない
グラム染色されたスミアと有意な細菌尿との間に高い相
関を示した。陽性のグラム染色を伴う尿検体の約９０％
が１０5cfu／ｍ以上をもつ。さらに、採取と検査の間
の間隔が過度に長くならない限り、尿分析に用いた遠心
分離された湿潤標本上の細菌の存在との間にも高い相関
がある。これらの方法はグラム陰性菌感染症に関しては
良好であるが、104cfu／ｍの水準または症候性患者に
おいては102〜104cfu／ｍの水準で有意と思われるグ
ラム陽性菌感染に対しては十分ではない。
いられ、種々の標準試薬、たとえばグラム、ライト、ジ
エンナー−ギームザ、ライシユマン、またはメイ−グル
ンワルド−ギームザなどの染色法が用いられている。尿
試料に関しては、これらの方法は遠心分離されていない
グラム染色されたスミアと有意な細菌尿との間に高い相
関を示した。陽性のグラム染色を伴う尿検体の約９０％
が１０5cfu／ｍ以上をもつ。さらに、採取と検査の間
の間隔が過度に長くならない限り、尿分析に用いた遠心
分離された湿潤標本上の細菌の存在との間にも高い相関
がある。これらの方法はグラム陰性菌感染症に関しては
良好であるが、104cfu／ｍの水準または症候性患者に
おいては102〜104cfu／ｍの水準で有意と思われるグ
ラム陽性菌感染に対しては十分ではない。
米国特許第4,025,306号明細書（スチユーダー：Stude
r）には血中のミクロフイラリアをホルムアルデヒドに
よる血球の溶解、非螢光色素による染色、および鏡検に
よつて検出する方法が記載されている。これらの生物は
体腔および体液を冒す糸状虫の前幼虫段階であり、本質
的に単細胞性である微生物とは異なり多細胞性である。
r）には血中のミクロフイラリアをホルムアルデヒドに
よる血球の溶解、非螢光色素による染色、および鏡検に
よつて検出する方法が記載されている。これらの生物は
体腔および体液を冒す糸状虫の前幼虫段階であり、本質
的に単細胞性である微生物とは異なり多細胞性である。
螢光鏡検法が安価な染色法に関する各種の報告書に採用
されている。たとえばアクリジンオレンジが血縁および
尿道分泌液を含む各種の臨床試料において細菌を選択的
に染色するために用いられている（L.R.マツカーシー(M
cCarthy)およびJ.E.センネ(Senne),J.Clin.Microb.１１
281(1980)；G.クロンワル(Kronvall)およびE.マイレ
(Myhre),ActaPath.Microb.Scand85、249(1977)）。臭化
エチジウムは真核細胞および原核細胞の双方を染色する
ために広範に用いられている。しかしこれらの方法は微
生物のみでなく、白血球ならびにある程度他の血液成分
（たとえば血小板および赤血球）をも染色する。これら
の染色された他の物体があるため、微生物（これらは普
通は少量で存在する）の存在を確認するのが困難になる
だけでなく、微生物と他の染色された白血球成分および
残屑とを区別することも困難になる。
されている。たとえばアクリジンオレンジが血縁および
尿道分泌液を含む各種の臨床試料において細菌を選択的
に染色するために用いられている（L.R.マツカーシー(M
cCarthy)およびJ.E.センネ(Senne),J.Clin.Microb.１１
281(1980)；G.クロンワル(Kronvall)およびE.マイレ
(Myhre),ActaPath.Microb.Scand85、249(1977)）。臭化
エチジウムは真核細胞および原核細胞の双方を染色する
ために広範に用いられている。しかしこれらの方法は微
生物のみでなく、白血球ならびにある程度他の血液成分
（たとえば血小板および赤血球）をも染色する。これら
の染色された他の物体があるため、微生物（これらは普
通は少量で存在する）の存在を確認するのが困難になる
だけでなく、微生物と他の染色された白血球成分および
残屑とを区別することも困難になる。
従つて、血液試料および尿試料中の微生物の迅速検出の
ためのより良い方法が求められている。本発明は１０個
／ｍ（試料）程度の低い濃度で約２時間以下の期間、
しばしば４５分以内で微生物を検出する方法を提供する
ことによりこの要求を満たす。これは検出限界が細胞約
10,000個／ｍである既知の染色法に比して実質的な改
良である。
ためのより良い方法が求められている。本発明は１０個
／ｍ（試料）程度の低い濃度で約２時間以下の期間、
しばしば４５分以内で微生物を検出する方法を提供する
ことによりこの要求を満たす。これは検出限界が細胞約
10,000個／ｍである既知の染色法に比して実質的な改
良である。
本発明によれば、試料中に存在する他の成分（たとえば
血球成分）の溶解を起こさせる試薬で試料を処理したの
ち螢光色素で染色することにより体液試料中の微生物を
検出することができる。（ここで用いられる溶解という
語は細胞を化学的環境の変更により、または特定の試薬
により分解させることを意味する。）本方法は大部分の
微生物に適用できる。微生物は染色される唯一のもので
あり、検出を一般の培養法または染色法によるよりもい
つそう速かに行うことができる。
血球成分）の溶解を起こさせる試薬で試料を処理したの
ち螢光色素で染色することにより体液試料中の微生物を
検出することができる。（ここで用いられる溶解という
語は細胞を化学的環境の変更により、または特定の試薬
により分解させることを意味する。）本方法は大部分の
微生物に適用できる。微生物は染色される唯一のもので
あり、検出を一般の培養法または染色法によるよりもい
つそう速かに行うことができる。
ある種の試料に関しては、溶解した試料につき直接に染
色を行うことができる。試料中の計数がきわめて低い他
の試料に関しては、短時間もしくは限定的増殖を行つて
もよい。この実施態様に関しては溶解剤を増殖後に添加
してもよく、溶解剤を増殖培地と組合せた組成物を用い
てもよい。試料がこの組成物に添加された場合、微生物
の増殖および試料成分の溶解が同時に行われる。
色を行うことができる。試料中の計数がきわめて低い他
の試料に関しては、短時間もしくは限定的増殖を行つて
もよい。この実施態様に関しては溶解剤を増殖後に添加
してもよく、溶解剤を増殖培地と組合せた組成物を用い
てもよい。試料がこの組成物に添加された場合、微生物
の増殖および試料成分の溶解が同時に行われる。
従つて本発明の目的は、体液試料中の微生物を迅速に検
出することができる方法を提供することである。本発明
の他の目的は、結果が約４５分以内に得られる方法を提
供することである。さらに他の目的は、体液中にきわめ
て低濃度で存在する微生物を限定的増殖ののち、試料中
の他の成分を同時にまたは続いて溶解させて検出するこ
とができる方法を提供することである。さらに他の目的
は増殖培地および溶解剤からなる、同時増殖および溶解
のための組成物を提供することである。さらに他の目的
は、医師が正常であるかまたは感染症であるかを判断で
きる。尿試料中の微生物の定量的計数法を提供すること
である。本発明の他の目的は、好気的条件下での増殖の
ために１個の容器、および嫌気的条件下での増殖のため
に第２の容器を必要とする一般法に比して、試料の分析
に１個の容器のみを必要とする体液試料中の微生物の検
出法を提供することである。さらに他の目的は、体液試
料において放射性同位体成分を使用せずに微生物を検出
できる方法を提供することである。
出することができる方法を提供することである。本発明
の他の目的は、結果が約４５分以内に得られる方法を提
供することである。さらに他の目的は、体液中にきわめ
て低濃度で存在する微生物を限定的増殖ののち、試料中
の他の成分を同時にまたは続いて溶解させて検出するこ
とができる方法を提供することである。さらに他の目的
は増殖培地および溶解剤からなる、同時増殖および溶解
のための組成物を提供することである。さらに他の目的
は、医師が正常であるかまたは感染症であるかを判断で
きる。尿試料中の微生物の定量的計数法を提供すること
である。本発明の他の目的は、好気的条件下での増殖の
ために１個の容器、および嫌気的条件下での増殖のため
に第２の容器を必要とする一般法に比して、試料の分析
に１個の容器のみを必要とする体液試料中の微生物の検
出法を提供することである。さらに他の目的は、体液試
料において放射性同位体成分を使用せずに微生物を検出
できる方法を提供することである。
本発明方法によれば、試料を溶解剤で処理して、染色さ
れこれにより微生物の計数を妨げる可能性のある他の試
料成分を分解させたのち螢光色素で染色することによ
り、体液試料中の微生物が検出される。本発明により検
出できる微生物には下記のものが含まれるがこれらに限
定されるものではない、黄色ブドウ球菌(Staphylococcu
s aureus)、大腸菌(Escherichia coli)、大便連鎖球菌
(Streptococcus fecalis)、表皮ブドウ球菌(Staphyloco
ccus epidermidis)、奇怪変形菌(Proteus mirabilis)、
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、バクテロイデス・フ
ラギリス(Bacteroides fragilis)、肺炎桿菌(Klebsiell
a pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influe
nzae)および髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)。検出
および計数すべき微生物は体液、たとえば血液、尿、髄
液、滑液、胸水などいずれの中に存在してもよい。
れこれにより微生物の計数を妨げる可能性のある他の試
料成分を分解させたのち螢光色素で染色することによ
り、体液試料中の微生物が検出される。本発明により検
出できる微生物には下記のものが含まれるがこれらに限
定されるものではない、黄色ブドウ球菌(Staphylococcu
s aureus)、大腸菌(Escherichia coli)、大便連鎖球菌
(Streptococcus fecalis)、表皮ブドウ球菌(Staphyloco
ccus epidermidis)、奇怪変形菌(Proteus mirabilis)、
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、バクテロイデス・フ
ラギリス(Bacteroides fragilis)、肺炎桿菌(Klebsiell
a pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influe
nzae)および髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)。検出
および計数すべき微生物は体液、たとえば血液、尿、髄
液、滑液、胸水などいずれの中に存在してもよい。
本発明の種々の特色を示すのに適した体液試料は、染色
されこれにより検出される微生物を体液に溶解および染
色の前に供給することによつて供給できる。微生物はい
ずれかの適切な培地（たとえばトリプチケース大豆肉汁
培地）において増殖させ、対数増殖期に取出すことがで
きる。約103〜108個、好ましくは約106個の量の細胞を
塩溶液で洗浄し、標準塩溶液に懸濁し、懸濁液を微生物
細胞懸濁液１容量部および試料約５〜約１００容量部の
比率で十分に混和する。好ましくは１容量％の懸濁液を
使用する。血液試料を用いる場合、全血、または抗凝血
薬、たとえばヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（以下
EDTAと呼ぶ）で、もしくはポリ アネトール硫酸ナトリ
ウム（以下SPSと呼ぶ）で前処理した全血を用いること
ができる。
されこれにより検出される微生物を体液に溶解および染
色の前に供給することによつて供給できる。微生物はい
ずれかの適切な培地（たとえばトリプチケース大豆肉汁
培地）において増殖させ、対数増殖期に取出すことがで
きる。約103〜108個、好ましくは約106個の量の細胞を
塩溶液で洗浄し、標準塩溶液に懸濁し、懸濁液を微生物
細胞懸濁液１容量部および試料約５〜約１００容量部の
比率で十分に混和する。好ましくは１容量％の懸濁液を
使用する。血液試料を用いる場合、全血、または抗凝血
薬、たとえばヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（以下
EDTAと呼ぶ）で、もしくはポリ アネトール硫酸ナトリ
ウム（以下SPSと呼ぶ）で前処理した全血を用いること
ができる。
次いで微生物と試料液の混合物を溶解剤で処理する。溶
解剤は試料中の他の成分の溶解が、溶解により生じる残
屑が約0.2ミクロン以下、好ましくは約0.1ミクロン以下
の最大粒径をもつように制御された様式で行われるよう
に選ばれる。同時に溶解は検出されるべき微生物までも
溶解するほど苛酷なものであつてはならない。主として
プロテアーゼ活性をもつが若干のヌクレアーゼおよびリ
パーゼ活性をもつ酵素製剤を用いることが本発明による
溶解を行うのに適切であると判定された。適切な溶解剤
にはチールト(Ziefdt)の溶解試薬および5XLAが含まれる
が、チールトの溶解試薬とは、ペンシルバニア州フィラ
デルフィアのローム・アンド・ハース社から市販されて
いる酵素製剤ローザイム(Rhozyme)41（登録商標）を0.5
％、およびツウイーン(Tween)20を含む0.ナトリウム％含む0.
01Ｍリン酸緩衝液(pH8.0)であり（ジャーナル・オブ・
クリニカル・マイクロバイオロジー15：172〜174、1982
年）、そして 5XLAとは、ローザイム41を2.5％、およびツウイーン20
を４％含む0.01Ｍトリシン緩衝液(ph8.5)である。
解剤は試料中の他の成分の溶解が、溶解により生じる残
屑が約0.2ミクロン以下、好ましくは約0.1ミクロン以下
の最大粒径をもつように制御された様式で行われるよう
に選ばれる。同時に溶解は検出されるべき微生物までも
溶解するほど苛酷なものであつてはならない。主として
プロテアーゼ活性をもつが若干のヌクレアーゼおよびリ
パーゼ活性をもつ酵素製剤を用いることが本発明による
溶解を行うのに適切であると判定された。適切な溶解剤
にはチールト(Ziefdt)の溶解試薬および5XLAが含まれる
が、チールトの溶解試薬とは、ペンシルバニア州フィラ
デルフィアのローム・アンド・ハース社から市販されて
いる酵素製剤ローザイム(Rhozyme)41（登録商標）を0.5
％、およびツウイーン(Tween)20を含む0.ナトリウム％含む0.
01Ｍリン酸緩衝液(pH8.0)であり（ジャーナル・オブ・
クリニカル・マイクロバイオロジー15：172〜174、1982
年）、そして 5XLAとは、ローザイム41を2.5％、およびツウイーン20
を４％含む0.01Ｍトリシン緩衝液(ph8.5)である。
溶解剤は試料に直接に添加される。用いられる溶解剤の
量は試料の量に対し約１〜２０容量部であつてよい。チ
ールトの試薬を用いる場合、約８〜１０容量部の溶解液
が用いられる。好ましい5XLA溶解剤を用いる場合、約１
〜約５容量部の溶解液が用いられる。
量は試料の量に対し約１〜２０容量部であつてよい。チ
ールトの試薬を用いる場合、約８〜１０容量部の溶解液
が用いられる。好ましい5XLA溶解剤を用いる場合、約１
〜約５容量部の溶解液が用いられる。
染色前に試料中の微生物を増殖させることが望ましい場
合は、２種の増殖法を採用することができる。第１の場
合、標準培地に試料を接種する。標準培地、たとえばト
リプチケース大豆肉汁培地、コロンビア肉汁培地、脳心
臓浸出物培地、ペプトン肉汁培地およびBACTEC培地（ベ
クトン・デイツキンソン・アンド・カンパニーのジヨン
ストン・ラボラトリーズ部門、マリーランド州コツカイ
スビル）を用いることができる。約1/2〜約２時間イン
キユベートすることにより限定的増殖を誘発する。大部
分の場合、約１1/2時間のインキユベーシヨンによつ
て、検出するのに十分な細菌数が得られる。次いで、溶
解剤を添加し、前記のように溶解を起こさせるためにイ
ンキユベーシヨンを行う。
合は、２種の増殖法を採用することができる。第１の場
合、標準培地に試料を接種する。標準培地、たとえばト
リプチケース大豆肉汁培地、コロンビア肉汁培地、脳心
臓浸出物培地、ペプトン肉汁培地およびBACTEC培地（ベ
クトン・デイツキンソン・アンド・カンパニーのジヨン
ストン・ラボラトリーズ部門、マリーランド州コツカイ
スビル）を用いることができる。約1/2〜約２時間イン
キユベートすることにより限定的増殖を誘発する。大部
分の場合、約１1/2時間のインキユベーシヨンによつ
て、検出するのに十分な細菌数が得られる。次いで、溶
解剤を添加し、前記のように溶解を起こさせるためにイ
ンキユベーシヨンを行う。
第２の増殖態様においては、溶解剤を血液含有増殖培地
を組合わせた組成物に試料を接種する。この組成物は培
地７０〜９０容量％、および溶解剤１０〜３０容量％を
含有する。好ましい組成物においてはトリプチケース大
豆肉汁培地８０容量％を溶解剤２０容量％と混合する。
この組成物に試料を約５〜約２０％、好ましくは約１０
％の容量濃度を添加する。
を組合わせた組成物に試料を接種する。この組成物は培
地７０〜９０容量％、および溶解剤１０〜３０容量％を
含有する。好ましい組成物においてはトリプチケース大
豆肉汁培地８０容量％を溶解剤２０容量％と混合する。
この組成物に試料を約５〜約２０％、好ましくは約１０
％の容量濃度を添加する。
溶解剤または溶解剤−増殖培地組成物を添加したのち、
試料を約１０分ないし約６時間インキユーベートして溶
解、または溶解と増殖を起こさせる。インキユベーシヨ
ンはほぼ周囲温度から約５０℃までの温度で行うことが
できる。溶解は温度が高いほど速かに進行し、好ましく
は約４０〜４５℃、好ましくは４２℃で行う。
試料を約１０分ないし約６時間インキユーベートして溶
解、または溶解と増殖を起こさせる。インキユベーシヨ
ンはほぼ周囲温度から約５０℃までの温度で行うことが
できる。溶解は温度が高いほど速かに進行し、好ましく
は約４０〜４５℃、好ましくは４２℃で行う。
インキユーベーシヨンののち、溶解した試料を臭化エチ
ジウムで染色する。この染料は0.001％水溶液として試
料に添加される。本明細書で用いられる％は特に指示し
ない限り重量％である。添加する染料の量は微生物およ
び用いられる試料により定められ、一般に染料の最終濃
度は約１〜約1000μｇ／（最終容量）、好ましくは約
2.5〜約１００μｇ／ｍの範囲にあるであろう。
ジウムで染色する。この染料は0.001％水溶液として試
料に添加される。本明細書で用いられる％は特に指示し
ない限り重量％である。添加する染料の量は微生物およ
び用いられる試料により定められ、一般に染料の最終濃
度は約１〜約1000μｇ／（最終容量）、好ましくは約
2.5〜約１００μｇ／ｍの範囲にあるであろう。
染色は染色促進剤として作用する緩衝液の存在下に行う
のが最も良い。細胞による色素の吸収を促進する各種の
緩衝液が知られている。この種の緩衝剤の一例はホウ酸
ナトリウム、EDTA、ホルムアルデヒド、および界面活性
剤（たとえばトライトン(Triton)-X-100）からなる水性
組成物である。好ましい実施態様においては、これらの
成分は緩衝化された試料中にそれぞれ40mM、24mM、0.02
容量％および0.02容量％の最終濃度で存在する。
のが最も良い。細胞による色素の吸収を促進する各種の
緩衝液が知られている。この種の緩衝剤の一例はホウ酸
ナトリウム、EDTA、ホルムアルデヒド、および界面活性
剤（たとえばトライトン(Triton)-X-100）からなる水性
組成物である。好ましい実施態様においては、これらの
成分は緩衝化された試料中にそれぞれ40mM、24mM、0.02
容量％および0.02容量％の最終濃度で存在する。
染料を含有する緩衝化された試料混合物を短期間放置す
る。後記のように、染色された細胞の観察は緩衝化さ
れ、染色された試料中で直接に行うことができ、あるい
は所望により染色された細胞を観察する前に試料からい
ずれかの一般的分離法により（好ましくは遠心分離によ
り）分離することができる。この実施態様においては、
細胞を液状クツシヨン剤、たとえばフツ素化された炭化
水素に対して遠心分離する。この種のフツ素化された炭
化水素はフルオルイナート(FLUORINERT)の商品名でスリ
ーエムカンパニー（ミネソタ州ミネアポリス）により市
販されているものである。遠心分離したのち上澄液を捨
て、細胞を塩溶液に懸濁させる。
る。後記のように、染色された細胞の観察は緩衝化さ
れ、染色された試料中で直接に行うことができ、あるい
は所望により染色された細胞を観察する前に試料からい
ずれかの一般的分離法により（好ましくは遠心分離によ
り）分離することができる。この実施態様においては、
細胞を液状クツシヨン剤、たとえばフツ素化された炭化
水素に対して遠心分離する。この種のフツ素化された炭
化水素はフルオルイナート(FLUORINERT)の商品名でスリ
ーエムカンパニー（ミネソタ州ミネアポリス）により市
販されているものである。遠心分離したのち上澄液を捨
て、細胞を塩溶液に懸濁させる。
細胞は螢光を用いて観察することができる。約0.01ｍ
を取出し、顕微鏡スライド上に広げ、適切な波長（好ま
しくは５１５nm）の励起光線を用いて５８０nm以上の波
長で放出される光線を観察することにより約１分間ない
し約１時間観察する。
を取出し、顕微鏡スライド上に広げ、適切な波長（好ま
しくは５１５nm）の励起光線を用いて５８０nm以上の波
長で放出される光線を観察することにより約１分間ない
し約１時間観察する。
螢光活性化されたフローサイトメトリー（流動計数法）
により分析を行うこともできる。この方法は微生物が低
濃度で存在する場合に検出および定量するのに特に有利
である。この方法においては、細胞を一度に一個づつ光
源の集束したビーム（たとえばレーザー）を通過させ、
これにより計数された螢光信号を発生させる。本発明に
おいては、溶解され、染色された液体試料を、約0.05〜
約0.3ｍ／分、好ましくは約0.1ｍ／分の速度でビー
ムを通過させる。
により分析を行うこともできる。この方法は微生物が低
濃度で存在する場合に検出および定量するのに特に有利
である。この方法においては、細胞を一度に一個づつ光
源の集束したビーム（たとえばレーザー）を通過させ、
これにより計数された螢光信号を発生させる。本発明に
おいては、溶解され、染色された液体試料を、約0.05〜
約0.3ｍ／分、好ましくは約0.1ｍ／分の速度でビー
ムを通過させる。
以下の実施例は本発明をさらに説明するために提示され
るが、いかなる様式でも本発明の範囲を制限するものと
解すべきではない。
るが、いかなる様式でも本発明の範囲を制限するものと
解すべきではない。
例１ SPSの前処理された全血の試料を各0.1ｍづつ４本の試
験管に入れた。試験管のうち２本を大腸菌2.74×104cfu
を含有する標準塩溶液１０μで処理し、他の２本の試
験管は対照として用いた。
験管に入れた。試験管のうち２本を大腸菌2.74×104cfu
を含有する標準塩溶液１０μで処理し、他の２本の試
験管は対照として用いた。
各試験管にチールトの溶解試薬0.9ｍを添加し、試験
管を３７℃で３０分間インキユベートした。内容物0.7
ｍを各試験管から取出し、臭化エチジウム１００μ
および染色緩衝液２００μで処理した。
管を３７℃で３０分間インキユベートした。内容物0.7
ｍを各試験管から取出し、臭化エチジウム１００μ
および染色緩衝液２００μで処理した。
一組の試験管（被験および対照）に１００μのフルオ
ルイナート(FLUORINERT)を添加し、試験管を遠心分離
し、上澄液を捨て、ペレツトを標準塩溶液0.7ｍに再
懸濁した。次いですべての試験管を螢光活性化されたフ
ローサイトメーターで分析した（FACS IVインスツルメ
ント、ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニー
のFACS部門、カリフオルニア州サニーベール）。洗浄し
た対照試料および被験試料はそれぞれ９８５おび2.2×1
04計測数／ｍを含んでいることが認められた。後者は
対照方法による計数（2.7×104cfu／ｍ）の約８０％
の回収率を示した。
ルイナート(FLUORINERT)を添加し、試験管を遠心分離
し、上澄液を捨て、ペレツトを標準塩溶液0.7ｍに再
懸濁した。次いですべての試験管を螢光活性化されたフ
ローサイトメーターで分析した（FACS IVインスツルメ
ント、ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニー
のFACS部門、カリフオルニア州サニーベール）。洗浄し
た対照試料および被験試料はそれぞれ９８５おび2.2×1
04計測数／ｍを含んでいることが認められた。後者は
対照方法による計数（2.7×104cfu／ｍ）の約８０％
の回収率を示した。
例２ 例１に記載したと同じ方法で、血液試料１ｍに、標準
塩溶液0.1ｍ中の懸濁状混合細菌培養物約108cfuを接
種し、チールト試薬1.8ｍで処理し、３７℃で１５分
間インキユーベートした。
塩溶液0.1ｍ中の懸濁状混合細菌培養物約108cfuを接
種し、チールト試薬1.8ｍで処理し、３７℃で１５分
間インキユーベートした。
0.35ｍのインキユベート物を直接に染色用緩衝液中の
臭化エチジウムで染色した。これと別にインキユベート
物0.70ｍをフルオルイナート0.1ｍの添加により洗
浄し、遠心分離し、染色前に標準塩溶液に再懸濁した。
臭化エチジウムで染色した。これと別にインキユベート
物0.70ｍをフルオルイナート0.1ｍの添加により洗
浄し、遠心分離し、染色前に標準塩溶液に再懸濁した。
顕微鏡下で見た場合、洗浄した試料および洗浄しない試
料の双方において細菌のみが染色されているのが認めら
れた。染色はきわめて鮮明であつたが、未洗浄試料の方
がより鮮明であつた。
料の双方において細菌のみが染色されているのが認めら
れた。染色はきわめて鮮明であつたが、未洗浄試料の方
がより鮮明であつた。
例３ 例１に記載したものと同様な方法で、EDTAによりあらか
じめ抗凝血処理した血液各１ｍを５つの容器にとつ
て、下記cfuの大腸菌により系列希釈処理した。
じめ抗凝血処理した血液各１ｍを５つの容器にとつ
て、下記cfuの大腸菌により系列希釈処理した。
１……４×１０5 ２……４×１０4 ３……４×１０3 ４……４×１０2 ５……対照 各0.2ｍを取出し、チールトの試薬1.8ｍをそれぞれ
添加した。すべての試験管を、３７℃で３０分間インキ
ユベートした。各試験管から0.7ｍ分を二つ取出し、
臭化エチジウム１００μおよび染色用緩衝液２００μ
で染色した。一組の試験管を遠心分離し、標準塩溶液
に再懸濁するこよにより、標準塩溶液で洗浄した。他は
未洗浄のままであつた洗浄した試料を螢光活性化された
フローサイトメーターで分析したところ、下記のcfu／
ｍ回収率が得られた。
添加した。すべての試験管を、３７℃で３０分間インキ
ユベートした。各試験管から0.7ｍ分を二つ取出し、
臭化エチジウム１００μおよび染色用緩衝液２００μ
で染色した。一組の試験管を遠心分離し、標準塩溶液
に再懸濁するこよにより、標準塩溶液で洗浄した。他は
未洗浄のままであつた洗浄した試料を螢光活性化された
フローサイトメーターで分析したところ、下記のcfu／
ｍ回収率が得られた。
例４ SPSで抗凝血処理した全血を用いて例３と同様な実験を
行つた。血液0.3ｍ（被験および対照）を溶解剤（5XL
A）0.3ｍと共に４２℃で６０分間インキユベートし
た。次いでこの試料0.5ｍを臭化エチジウムおよび染
色用緩衝液により室温で１５分間染色した。洗浄した試
料を螢光活性化されたフローサイトメーターで分析した
ところ、下記の結果が得られた。
行つた。血液0.3ｍ（被験および対照）を溶解剤（5XL
A）0.3ｍと共に４２℃で６０分間インキユベートし
た。次いでこの試料0.5ｍを臭化エチジウムおよび染
色用緩衝液により室温で１５分間染色した。洗浄した試
料を螢光活性化されたフローサイトメーターで分析した
ところ、下記の結果が得られた。
例５ この例においては、対照ウサギおよび大腸菌感染させた
（細菌血症）ウサギから得た血液を用いた。被験動物お
よび対照動物から得たSPS抗凝血処理した血液１ｍを5
XLA溶解剤１ｍと共に４２℃で６０分間インキユベー
トした。臭化エチジウム0.4ｍおよび染色用緩衝液1.6
ｍを室温で１５分間添加した。フルオルイナート0.5
ｍを添加し、混合物を9,000×ｇで１０分間遠心分離
した。上澄液を捨て、ペレツトを標準塩溶液２ｍに再
懸濁し、懸濁液を螢光活性化されたフローサイトメータ
ーで分析した。結果を次表にまとめる。
（細菌血症）ウサギから得た血液を用いた。被験動物お
よび対照動物から得たSPS抗凝血処理した血液１ｍを5
XLA溶解剤１ｍと共に４２℃で６０分間インキユベー
トした。臭化エチジウム0.4ｍおよび染色用緩衝液1.6
ｍを室温で１５分間添加した。フルオルイナート0.5
ｍを添加し、混合物を9,000×ｇで１０分間遠心分離
した。上澄液を捨て、ペレツトを標準塩溶液２ｍに再
懸濁し、懸濁液を螢光活性化されたフローサイトメータ
ーで分析した。結果を次表にまとめる。
例６ 肺炎桿菌(Klebs.pneumoniae)、スタフイロコツカス・サ
プロフイチカス(Staph.saprophyticus)および奇怪変形
菌(Proteus milabilis)をトルプチケース大豆肉汁培地
で対数増殖中期になるまで増殖させ、細胞を分離し、洗
浄し、標準食塩液に懸濁して最終濃度約１×１０8cfu／
ｍにした。次いで１０μの容量の各細胞懸濁液を無
菌過した尿１ｍを含有する試験管に添加した。次い
で各試験管に溶解試薬5XLA１ｍを入れ、すべての試験
管を４２℃で２０分間インキユベートした。染色用緩衝
液1.6ｍおよび臭化エチジウム0.4ｍを各試験管に添
加し、すべての試験管を室温に１０分間放置した。接種
菌数は注入平板により測定され、微生物数はFACSIV螢光
活性化されたフローサイトメーターで測定された。この
実験に関する微生物の回収率を次表に示す。
プロフイチカス(Staph.saprophyticus)および奇怪変形
菌(Proteus milabilis)をトルプチケース大豆肉汁培地
で対数増殖中期になるまで増殖させ、細胞を分離し、洗
浄し、標準食塩液に懸濁して最終濃度約１×１０8cfu／
ｍにした。次いで１０μの容量の各細胞懸濁液を無
菌過した尿１ｍを含有する試験管に添加した。次い
で各試験管に溶解試薬5XLA１ｍを入れ、すべての試験
管を４２℃で２０分間インキユベートした。染色用緩衝
液1.6ｍおよび臭化エチジウム0.4ｍを各試験管に添
加し、すべての試験管を室温に１０分間放置した。接種
菌数は注入平板により測定され、微生物数はFACSIV螢光
活性化されたフローサイトメーターで測定された。この
実験に関する微生物の回収率を次表に示す。
例７ 無菌過した尿１ｍに約１×104cfuの黄色ブドウ球
菌、スタフイロコツカス・サプロフイチカス、奇怪変形
菌、大腸菌、肺炎桿菌、および大便連鎖球菌を接種し
た。各試験管を溶解剤5XLA１ｍで処理し、４２℃で３
０分間インキユベートした。染色用緩衝液1.6ｍおよ
び臭化エチジウム0.4ｍを次いで添加し、試験管を室
温で１５分間インキユベートした。次いでFACS IV分析
を行い、注入平板により得た生存細胞数と比較すること
により回収率（％）を測定した。生物 FACS IV回収率（％） 黄色ブドウ球菌 86スタフイロコツカス・サプロフイチカス 142 奇怪変形菌 63 大腸菌 100 肺炎桿菌 94 大便連鎖球菌 126 例８ 無症候性の８対照供与者から尿検体を得た。生菌数は注
入平板により求められた。各対照尿１ｍを溶解剤5XLA
１ｍと共に４２℃で３０分間インキユベートした。染
色用緩衝液1.6ｍおよび臭化エチジウム0.4ｍを次い
で添加し、試験管を室温で１５分間インキユベートし
た。次いでFACS IV分析を行い、検出された計測数／ｍ
を生菌数（cfu／ｍ）と比較した。結果は下記のと
おりであつた。
菌、スタフイロコツカス・サプロフイチカス、奇怪変形
菌、大腸菌、肺炎桿菌、および大便連鎖球菌を接種し
た。各試験管を溶解剤5XLA１ｍで処理し、４２℃で３
０分間インキユベートした。染色用緩衝液1.6ｍおよ
び臭化エチジウム0.4ｍを次いで添加し、試験管を室
温で１５分間インキユベートした。次いでFACS IV分析
を行い、注入平板により得た生存細胞数と比較すること
により回収率（％）を測定した。生物 FACS IV回収率（％） 黄色ブドウ球菌 86スタフイロコツカス・サプロフイチカス 142 奇怪変形菌 63 大腸菌 100 肺炎桿菌 94 大便連鎖球菌 126 例８ 無症候性の８対照供与者から尿検体を得た。生菌数は注
入平板により求められた。各対照尿１ｍを溶解剤5XLA
１ｍと共に４２℃で３０分間インキユベートした。染
色用緩衝液1.6ｍおよび臭化エチジウム0.4ｍを次い
で添加し、試験管を室温で１５分間インキユベートし
た。次いでFACS IV分析を行い、検出された計測数／ｍ
を生菌数（cfu／ｍ）と比較した。結果は下記のと
おりであつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バーノン・アール・ニース アメリカ合衆国ノース・カロライナ州ダー ハム，ノース・ダツク・ストリート 2601
Claims (12)
- 【請求項１】体液試料中の微生物の検出法であって、 該体液試料を、プロテアーゼ、リパーゼおよびヌクレア
ーゼからなる酵素製剤を緩衝液中に含む溶解剤と混合し
て上記微生物を実質的に溶解せずに上記体液試料成分を
溶解し、 該微生物を臭化エチジウムで染色し、そして 臭化エチジウムから発せられる蛍光を検出することによ
り上記微生物の存在を検出する 工程からなる検出法。 - 【請求項２】試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液
試料または胸水試料である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】血液試料を抗凝血薬で前処理する請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】抗凝血薬がヘパリン、SPSおよびエチレン
ジアミン四酢酸よりなる群から選ばれる請求項３記載の
方法。 - 【請求項５】上記溶解剤が5XLAである請求項１ないし４
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】上記溶解剤がチールト(Zierdt)の溶解試薬
である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】上記溶解剤中の酵素が緩衝液中でエマルジ
ョン化されている請求項１ないし４のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項８】上記緩衝液が、４％ポリオキシアルキレン
ソルビタンまたは0.01モルＮ−［トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル］グリシンよりなる請求項１ないし４のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】体液試料成分の溶解により生じる分解破片
が約0.2ミクロンより小さい粒径を有する請求項１記載
の方法。 - 【請求項１０】体液試料成分の溶解により生じる分解破
片が約0.1ミクロンより小さい粒径を有する請求項１記
載の方法。 - 【請求項１１】培養工程を有し、試料を培養培地に添加
し、培養期間の後に、プロテアーゼ、リパーゼおよびヌ
クレアーゼからなる酵素製剤を緩衝液中に含む溶解剤
を、上記培地中の試料に添加することにより上記溶解を
行う請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】培養工程を有し、プロテアーゼ、リパー
ゼおよびヌクレアーゼからなる酵素製剤を緩衝液中に含
む溶解剤および培養培地よりなる組成物中に試料を添加
し、そして染色を培養期間の後に行う請求項１記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US571001 | 1984-01-16 | ||
| US06/571,001 US4693972A (en) | 1984-01-16 | 1984-01-16 | Composition and method for rapid detection of microorganisms in clinical samples |
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|---|---|
| JPS60164497A JPS60164497A (ja) | 1985-08-27 |
| JPH0655157B2 true JPH0655157B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=24281932
Family Applications (1)
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Country Status (9)
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| US (1) | US4693972A (ja) |
| EP (1) | EP0149165B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0655157B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3481775D1 (ja) |
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| FI (1) | FI83539C (ja) |
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