JPH0795068B2 - 細菌および菌類感染の迅速検出方法 - Google Patents
細菌および菌類感染の迅速検出方法Info
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- JPH0795068B2 JPH0795068B2 JP10411585A JP10411585A JPH0795068B2 JP H0795068 B2 JPH0795068 B2 JP H0795068B2 JP 10411585 A JP10411585 A JP 10411585A JP 10411585 A JP10411585 A JP 10411585A JP H0795068 B2 JPH0795068 B2 JP H0795068B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は宿主における細菌または菌類感染症の病因体を
診断するための迅速な方法に関する。この方法は食細胞
を破壊して摂取された病原体の可溶性成分を放出させた
後特異的結合アツセイで検出することによりなる。
診断するための迅速な方法に関する。この方法は食細胞
を破壊して摂取された病原体の可溶性成分を放出させた
後特異的結合アツセイで検出することによりなる。
背景技術 感染の診断には原因となる病原体の決定を伴うことが多
い。細菌感染の場合には、病原体を知ることによりその
情報を踏まえた抗生物質の選択が可能となる。
い。細菌感染の場合には、病原体を知ることによりその
情報を踏まえた抗生物質の選択が可能となる。
臨床診断には多くの方法が案出されている。これらの中
には培養法、イムノアツセイ、顕微鏡法、分析化学、お
よび核酸ハイブリツド形成法がある。
には培養法、イムノアツセイ、顕微鏡法、分析化学、お
よび核酸ハイブリツド形成法がある。
格段的に最も汎用されている培養法は、栄養培地に検体
を接種し次いで生物増殖度を測定することを伴う。培養
法は時間がかかり、また生存生物の存在しか究明できな
いという制約がある。首尾よく診断を行うには病因体の
増殖を強める適当な培地および培養条件を選択すること
が必要である。難培養性の生物例えばマイコプラズマ
（Micoplasma）spp.、ナイセリア（Neisseria）spp.、
ヘモフイルス（Haemophilus）spp.などおよび例えばす
べての無条件的嫌気性生物は特殊な培養条件および長時
間を増殖に必要とする。適切な増殖条件が満たされない
と標準的な培養スクリーニング手順にかけた際にこれら
難培養性病因体をみのがしてしまう可能性がある。
を接種し次いで生物増殖度を測定することを伴う。培養
法は時間がかかり、また生存生物の存在しか究明できな
いという制約がある。首尾よく診断を行うには病因体の
増殖を強める適当な培地および培養条件を選択すること
が必要である。難培養性の生物例えばマイコプラズマ
（Micoplasma）spp.、ナイセリア（Neisseria）spp.、
ヘモフイルス（Haemophilus）spp.などおよび例えばす
べての無条件的嫌気性生物は特殊な培養条件および長時
間を増殖に必要とする。適切な増殖条件が満たされない
と標準的な培養スクリーニング手順にかけた際にこれら
難培養性病因体をみのがしてしまう可能性がある。
イムノアツセイは診断の迅速化の可能性を約束するもの
のすべての敗血症の30〜50％の間に血液1mlあたり１コ
ロニー形成単位（CFU）以下で存在する微生物の検出に
必要な感度を欠いていることが多い〔Kiehn、T.E.ほ
か、J.Clin.Micro.18、300−304（1983）〕。
のすべての敗血症の30〜50％の間に血液1mlあたり１コ
ロニー形成単位（CFU）以下で存在する微生物の検出に
必要な感度を欠いていることが多い〔Kiehn、T.E.ほ
か、J.Clin.Micro.18、300−304（1983）〕。
顕微鏡法、分析法、化学的方法およびハイブリツド形成
方法は、精緻な装置化および検体調製を必要とすること
が多く、そのため大変な労力を必要とする。
方法は、精緻な装置化および検体調製を必要とすること
が多く、そのため大変な労力を必要とする。
いわゆる食細胞が多くの微生物病原体を摂取することは
知られている。生物の中には細胞内寄生物として食細胞
内に住みつくものもあれば、最低でも食細胞の内部的分
解プロセスにより非生存状態にされ極端にはこれらの分
解プロセスによつて消化されてしまうものもある。
知られている。生物の中には細胞内寄生物として食細胞
内に住みつくものもあれば、最低でも食細胞の内部的分
解プロセスにより非生存状態にされ極端にはこれらの分
解プロセスによつて消化されてしまうものもある。
ジールト氏（Zierdt）らは、家兎における敗血症中の病
原細菌の検出には非溶解血液培養法よりも溶解−過血
液培養の方が高感度の培養法であることを示した。彼ら
は溶解溶液（ツイーン（Tween）−20とローザイム（Rho
zyme）の混合物）が食細胞を溶解し、それによつて食細
胞の内部的分解プロセスにより生存在が破壊されていな
い摂取病原体を放出するものと仮定している。彼らは通
常の培養法を用いて病原体の存在を検出した〔Zierdtほ
か、J.Clin.Micro.、15、74−77（1982）〕。
原細菌の検出には非溶解血液培養法よりも溶解−過血
液培養の方が高感度の培養法であることを示した。彼ら
は溶解溶液（ツイーン（Tween）−20とローザイム（Rho
zyme）の混合物）が食細胞を溶解し、それによつて食細
胞の内部的分解プロセスにより生存在が破壊されていな
い摂取病原体を放出するものと仮定している。彼らは通
常の培養法を用いて病原体の存在を検出した〔Zierdtほ
か、J.Clin.Micro.、15、74−77（1982）〕。
ジールト氏らの用いた溶解溶液は緩和な非イオン洗剤
（ツイーン−20）と一部リパーゼおよびヌクレアーゼを
含むプロテアーゼ（Rhozyme）の混合物である（Zierd
t、J.Clin.Micro.、15、172−174（1982）〕。
（ツイーン−20）と一部リパーゼおよびヌクレアーゼを
含むプロテアーゼ（Rhozyme）の混合物である（Zierd
t、J.Clin.Micro.、15、172−174（1982）〕。
ジールト氏らの用いた溶解溶液は確かに食細胞を溶解し
て以後の培養のための存在病原体を放出するが、その溶
解溶液中にプロテアーゼおよびヌクレアーゼが存在して
いるため、他の検出システム、例えばタンパクである抗
体の使用を必要とするイムノアツセイや核酸プローブの
使用を必要とするハイブリツド形成法には問題を生じる
可能性がある。
て以後の培養のための存在病原体を放出するが、その溶
解溶液中にプロテアーゼおよびヌクレアーゼが存在して
いるため、他の検出システム、例えばタンパクである抗
体の使用を必要とするイムノアツセイや核酸プローブの
使用を必要とするハイブリツド形成法には問題を生じる
可能性がある。
ジールト氏らによれば、食細胞からの生存病原体の放出
が望ましいのは、培養に基づく検出システムでの増殖に
利用可能な生存生物の総数が多くなるからである。
が望ましいのは、培養に基づく検出システムでの増殖に
利用可能な生存生物の総数が多くなるからである。
スラマ．テイー・ジー（Slama.T.G.）氏らは、エヌ・ゴ
ノロエアエ（N.gonorrhoeae）細胞壁抗原のリポポリサ
ツカライドに由来するGc2ポリサツカライドは細菌菌体
が食作用を受けた後２〜６時間でPMN−含有液中で免疫
化学的に検出可能である旨報告した。24時間後は、それ
と同じPMN含有液は特異抗血清と反応しなかつた。食作
用から６時間後のPMN含有液からの細菌を培養しようと
する試みは該液が滅菌状態であることを示した。結果
は、完全なPMN菌体を含むPMN含有液を用いたエヌ・ゴノ
ロエアエのアツセイのための培養法および免疫化学的方
法は適用可能ではあるが、比較的短時間の間、過渡的に
可能であるにすぎないことを示した〔Slama.T.G.ほか、
Sex Transm Dis.、９、70−73（1982）〕。
ノロエアエ（N.gonorrhoeae）細胞壁抗原のリポポリサ
ツカライドに由来するGc2ポリサツカライドは細菌菌体
が食作用を受けた後２〜６時間でPMN−含有液中で免疫
化学的に検出可能である旨報告した。24時間後は、それ
と同じPMN含有液は特異抗血清と反応しなかつた。食作
用から６時間後のPMN含有液からの細菌を培養しようと
する試みは該液が滅菌状態であることを示した。結果
は、完全なPMN菌体を含むPMN含有液を用いたエヌ・ゴノ
ロエアエのアツセイのための培養法および免疫化学的方
法は適用可能ではあるが、比較的短時間の間、過渡的に
可能であるにすぎないことを示した〔Slama.T.G.ほか、
Sex Transm Dis.、９、70−73（1982）〕。
培養に基づく検出システムではなくイムノアツセイまた
はハイブリツド形成に基づく病原体検出システムを用い
れば、食細胞の内部分解プロセスに付された病原体の非
生存生成物を与える食細胞溶解物を臨床診断に有利に使
用できることを見出した。食細胞の分解プロセスは少く
とも２例において抗原がそれらの相補的抗体によりもは
や認識され得なくなるまで抗原を分解することはないこ
とを見出した。
はハイブリツド形成に基づく病原体検出システムを用い
れば、食細胞の内部分解プロセスに付された病原体の非
生存生成物を与える食細胞溶解物を臨床診断に有利に使
用できることを見出した。食細胞の分解プロセスは少く
とも２例において抗原がそれらの相補的抗体によりもは
や認識され得なくなるまで抗原を分解することはないこ
とを見出した。
本発明の開示 本発明は （１）食細胞を含む細胞集団を含む検体を宿主から分離
し； （２）その集団を、サポニンまたは食細胞を破壊して食
作用を受けた細菌または菌類病原体の少なくとも１種の
可溶性抗原を放出することはできるが食作用を受けてい
ない病原体を破壊することはできない15以下のHLB指数
を有する緩和な非イオン表面活性剤と接触させ； （３）その放出された可溶性抗原を該可溶性抗原と特異
的に結合するパートナーと接触させ；そして （４）結合度を測定する ことよりなる、該宿主の食細胞により食作用を受けかつ
少なくとも部分的な分解を受ける細菌または菌類病原体
の存在の検出方法である。
し； （２）その集団を、サポニンまたは食細胞を破壊して食
作用を受けた細菌または菌類病原体の少なくとも１種の
可溶性抗原を放出することはできるが食作用を受けてい
ない病原体を破壊することはできない15以下のHLB指数
を有する緩和な非イオン表面活性剤と接触させ； （３）その放出された可溶性抗原を該可溶性抗原と特異
的に結合するパートナーと接触させ；そして （４）結合度を測定する ことよりなる、該宿主の食細胞により食作用を受けかつ
少なくとも部分的な分解を受ける細菌または菌類病原体
の存在の検出方法である。
本発明の詳細な説明 本発明は人間および他の哺乳動物における多くの細菌お
よび菌類の感染症の診断に適用できる。この方法は人間
および動物の医療に有用である。本発明方法により検出
できる細菌および菌類は食作用を受けかつ少くとも部分
的に食細胞中で分解されるものである。多くの臨床上重
要な病原体がこの群に属する。一般にグラム陽性および
グラム陰性細菌を検出できる。個別的には、スタフイロ
コツカス（Staphylococcus）、ストレプトコツカス（St
reptococcus）、リステリア（Listeria）、クロストリ
ジウム（Clostridium）およびコリネバクテリア（Coryn
ebacteria）属に属するグラム陽性細菌を検出できる。
エンテロバクテリアセアエ（Enterobacteriaceae）科に
属するグラム陰性細菌を検出できる。ヘモフイルス、バ
クテロイデス（Bacteroides）、シュードモナス（Pseud
omonas）、ナイセリアおよびレギオネラ（Legionella）
属に属するグラム陰性細菌を検出できる。カンジダ（Ca
ndida）、クリプトコツカス（Cryptococcus）、コクシ
ジオイデス（Coccidioides）およびヒストプラズマ（Hi
stoplasma）属に属する菌類を検出できる。これら様々
な科および属に属する細菌および菌類は多形核白血球
（PMN）、単球および組織マクロフアージよりなるいわ
ゆる食細胞により捕食されることが知られている。時間
の経過に伴つて病原体はフアゴライソゾーム系によつて
徐々に分解される。フアゴライソゾーム分解の度合およ
び速度は生物の年令およびその化学的組成に依存して変
化しうる。この分解プロセスにより病原体の特徴的な表
面構造成分例えばナイセリアからは毛、ストレプトコツ
カス・ニユモニアエ（Streptococcus pneumoniae）から
は莢膜ポリサツカライドおよび実質的にすべてのグラム
陽性細菌にみられるリポタイコ酸などが除去される。分
解プロセスが続くにつれて、微生物細胞壁および膜の統
合性がPMN特異的分解プロセスおよび微生物特異的自己
溶解素（autolysin）の作用によつて変化を受ける。最
も内側の細胞膜が破壊されるとDNAやRNAなどの病原体の
細胞内成分が放出されることになる。食細胞のライソゾ
ーム内に含まれる細菌からの放射性トレーサー標識細菌
菌体構成成分の放出の追跡によりライソゾーム分解プロ
セスが時間の関数として研究されている〔Cohn.Z.A.、
J.Exp.Med.、117、27−42（1963）;Friedlander.A.M.、
Inf.Imm.、22、148−154（1978）〕。
よび菌類の感染症の診断に適用できる。この方法は人間
および動物の医療に有用である。本発明方法により検出
できる細菌および菌類は食作用を受けかつ少くとも部分
的に食細胞中で分解されるものである。多くの臨床上重
要な病原体がこの群に属する。一般にグラム陽性および
グラム陰性細菌を検出できる。個別的には、スタフイロ
コツカス（Staphylococcus）、ストレプトコツカス（St
reptococcus）、リステリア（Listeria）、クロストリ
ジウム（Clostridium）およびコリネバクテリア（Coryn
ebacteria）属に属するグラム陽性細菌を検出できる。
エンテロバクテリアセアエ（Enterobacteriaceae）科に
属するグラム陰性細菌を検出できる。ヘモフイルス、バ
クテロイデス（Bacteroides）、シュードモナス（Pseud
omonas）、ナイセリアおよびレギオネラ（Legionella）
属に属するグラム陰性細菌を検出できる。カンジダ（Ca
ndida）、クリプトコツカス（Cryptococcus）、コクシ
ジオイデス（Coccidioides）およびヒストプラズマ（Hi
stoplasma）属に属する菌類を検出できる。これら様々
な科および属に属する細菌および菌類は多形核白血球
（PMN）、単球および組織マクロフアージよりなるいわ
ゆる食細胞により捕食されることが知られている。時間
の経過に伴つて病原体はフアゴライソゾーム系によつて
徐々に分解される。フアゴライソゾーム分解の度合およ
び速度は生物の年令およびその化学的組成に依存して変
化しうる。この分解プロセスにより病原体の特徴的な表
面構造成分例えばナイセリアからは毛、ストレプトコツ
カス・ニユモニアエ（Streptococcus pneumoniae）から
は莢膜ポリサツカライドおよび実質的にすべてのグラム
陽性細菌にみられるリポタイコ酸などが除去される。分
解プロセスが続くにつれて、微生物細胞壁および膜の統
合性がPMN特異的分解プロセスおよび微生物特異的自己
溶解素（autolysin）の作用によつて変化を受ける。最
も内側の細胞膜が破壊されるとDNAやRNAなどの病原体の
細胞内成分が放出されることになる。食細胞のライソゾ
ーム内に含まれる細菌からの放射性トレーサー標識細菌
菌体構成成分の放出の追跡によりライソゾーム分解プロ
セスが時間の関数として研究されている〔Cohn.Z.A.、
J.Exp.Med.、117、27−42（1963）;Friedlander.A.M.、
Inf.Imm.、22、148−154（1978）〕。
本発明の実施に適した細胞集団は血液、尿、脊髄液、滑
液、粘膜分泌物および診断用掻爬小片（scrapings）な
どを包含する（PMNを含有する）血液が好ましい。集団
を選択する主な基準はそれが食細胞を含んでいることで
ある。
液、粘膜分泌物および診断用掻爬小片（scrapings）な
どを包含する（PMNを含有する）血液が好ましい。集団
を選択する主な基準はそれが食細胞を含んでいることで
ある。
細胞集団を、食細胞を破壊する能力は有するが食作用を
受けていない病原体を破壊する能力は有しない溶解剤と
接触させる。このようにして、生存病原体全体がPMNか
ら放出されたものであろうとあるいは媒質中に遊離して
いるものであろうと、本発明の比較的迅速な可溶性成分
結合アツセイ検出スキームの推定結果を確認するための
培養に基づく検出に利用できることになる。適当な分解
剤にはツイーン−20、（15以下のHLB指数を有する緩和
な非イオン表面活性剤）および特に精製された形のサポ
ゲニンググリコシド、例えばサポニンなど（1975年５月
13日にドルン（Dorn）に交付された米国特許第3,883,42
5号明細書参照。この文献を参照文献としてここに含め
る。）が包含される。加熱、タンパク分解酵素、強い還
元剤、強酸および強塩基などの激しい処理を避けること
が必要である。何故ならばそれらは生存病原体を殺して
しまうだけでなく食作用による分解プロセスから生じる
可溶性病原体成分を変性してこれら成分を抗体および核
酸を含むそれらの生物特異的結合パートナーにより認識
し得なくしてしまう可能性があるからである。
受けていない病原体を破壊する能力は有しない溶解剤と
接触させる。このようにして、生存病原体全体がPMNか
ら放出されたものであろうとあるいは媒質中に遊離して
いるものであろうと、本発明の比較的迅速な可溶性成分
結合アツセイ検出スキームの推定結果を確認するための
培養に基づく検出に利用できることになる。適当な分解
剤にはツイーン−20、（15以下のHLB指数を有する緩和
な非イオン表面活性剤）および特に精製された形のサポ
ゲニンググリコシド、例えばサポニンなど（1975年５月
13日にドルン（Dorn）に交付された米国特許第3,883,42
5号明細書参照。この文献を参照文献としてここに含め
る。）が包含される。加熱、タンパク分解酵素、強い還
元剤、強酸および強塩基などの激しい処理を避けること
が必要である。何故ならばそれらは生存病原体を殺して
しまうだけでなく食作用による分解プロセスから生じる
可溶性病原体成分を変性してこれら成分を抗体および核
酸を含むそれらの生物特異的結合パートナーにより認識
し得なくしてしまう可能性があるからである。
完全な病原体の食細胞分解によつて生じる可溶性病原体
成分には、当該病原体またはその病原体が一員である分
類学的な群に独特な様々な化学的な物質種が包含され
る。可溶性成分の特定の具体例およびそれらの微生物有
無の診断への関係を第１表に示す。
成分には、当該病原体またはその病原体が一員である分
類学的な群に独特な様々な化学的な物質種が包含され
る。可溶性成分の特定の具体例およびそれらの微生物有
無の診断への関係を第１表に示す。
可溶性成分は操作上、病原体全体をペレツト化するのに
十分な遠心分離の場に付した際にペレツト画分に沈降し
ない病原体特異的成分として定義することができる。
十分な遠心分離の場に付した際にペレツト画分に沈降し
ない病原体特異的成分として定義することができる。
可溶性成分は該成分に対する生物特異的結合パートナー
と接触させる。極めてしばしば、結合パートナーは抗体
である。可溶性成分が核酸（DNAかまたはRNA）である場
合には結合パートナーは相補的塩基対を有する核酸であ
る。
と接触させる。極めてしばしば、結合パートナーは抗体
である。可溶性成分が核酸（DNAかまたはRNA）である場
合には結合パートナーは相補的塩基対を有する核酸であ
る。
可溶性成分がその生物特異的結合パートナーに結合する
程度は種々な周知の方法により測定できる。抗体に基づ
くシステムには様々なイムノアツセイ、例えばラジオイ
ムノアツセイ、酵素結合免疫収着剤アツセイ、放射免疫
拡散、補体結合、などを用いることができる〔「感染症
診断における免疫血清学（Immunoserology in the Diag
nosis of Infectious Diseases）」Friedman.H.ほか
（編者）University Park Press（Baltimore）、1979
年、１−76頁。この文献を言及により本発明書の一部に
含める〕。核酸検出にはハイブリツド形成システム例え
ば1982年11月９日にFalkowに交付された米国特許第4,35
8,535号明細書に記載のシステムを用いることができ
る。
程度は種々な周知の方法により測定できる。抗体に基づ
くシステムには様々なイムノアツセイ、例えばラジオイ
ムノアツセイ、酵素結合免疫収着剤アツセイ、放射免疫
拡散、補体結合、などを用いることができる〔「感染症
診断における免疫血清学（Immunoserology in the Diag
nosis of Infectious Diseases）」Friedman.H.ほか
（編者）University Park Press（Baltimore）、1979
年、１−76頁。この文献を言及により本発明書の一部に
含める〕。核酸検出にはハイブリツド形成システム例え
ば1982年11月９日にFalkowに交付された米国特許第4,35
8,535号明細書に記載のシステムを用いることができ
る。
驚くべきことに、食細胞の溶解の際に放出される細胞内
ライソゾーム酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼおよ
びヌクレアーゼは生物特異的結合パートナーを不働化す
ることにより本発明方法を妨害することはない。
ライソゾーム酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼおよ
びヌクレアーゼは生物特異的結合パートナーを不働化す
ることにより本発明方法を妨害することはない。
本発明方法は食細胞を破壊して食作用を受けていない病
原体の生存性に影響を与えることなく可溶性病原体成分
を放出するので、検体は、細胞集団を溶解剤と接触させ
た後に好ましくは遠心分離により２相、すなわち不溶性
生存病原体を含有する相と可溶性成分を含有する相とに
分離することができる。次いで各相の分画アリクオート
を試験することができる。可溶性成分は本発明に従つて
検出でき、一方不溶性成分（生存病原体全体）は増殖試
験の行われる栄養培地に添加することができる。このよ
うにして、伝統的な培養に基づく方法を本発明を構成す
る比較的迅速な方法の確認に用いることができる。好都
合にも２相への分離はデユポン社からアイソレーター
（Isolator）の商標名で売られている1978年12月26日に
ドルン（Dorn）に交付された米国特許第4,131,512号明
細書に記載の管を用いて行うことができる。
原体の生存性に影響を与えることなく可溶性病原体成分
を放出するので、検体は、細胞集団を溶解剤と接触させ
た後に好ましくは遠心分離により２相、すなわち不溶性
生存病原体を含有する相と可溶性成分を含有する相とに
分離することができる。次いで各相の分画アリクオート
を試験することができる。可溶性成分は本発明に従つて
検出でき、一方不溶性成分（生存病原体全体）は増殖試
験の行われる栄養培地に添加することができる。このよ
うにして、伝統的な培養に基づく方法を本発明を構成す
る比較的迅速な方法の確認に用いることができる。好都
合にも２相への分離はデユポン社からアイソレーター
（Isolator）の商標名で売られている1978年12月26日に
ドルン（Dorn）に交付された米国特許第4,131,512号明
細書に記載の管を用いて行うことができる。
（特に一般的に小量の検体である小児科の検体の検査に
おいて）本発明の方法と共に使用できる別の手順は、検
体を特定時間の間溶解剤と接触させ、次いでそのほかの
検体処理を行わずに、直接培養アツセイおよび特異的結
合アツセイにかけるやり方である。
おいて）本発明の方法と共に使用できる別の手順は、検
体を特定時間の間溶解剤と接触させ、次いでそのほかの
検体処理を行わずに、直接培養アツセイおよび特異的結
合アツセイにかけるやり方である。
スタフイロコツカス・エピデルミデイス（Staphylococc
us epidrmidis）の成分であるペプチドグリカン、およ
びストレプトコツカス・フエカリス（Streptococcus fa
ecalis）のリポテイコ酸の検出について伝統的な培養に
基づく方法を本発明の方法と比較する次の実施例によつ
て本発明を例示する。
us epidrmidis）の成分であるペプチドグリカン、およ
びストレプトコツカス・フエカリス（Streptococcus fa
ecalis）のリポテイコ酸の検出について伝統的な培養に
基づく方法を本発明の方法と比較する次の実施例によつ
て本発明を例示する。
実施例 １ 精製ペプチドグリカンを抗原として用いてモノクローナ
ル抗体を調製した。ペプチドグリカンは大部分の細菌の
主要細胞壁構成成分であることが知られている。ペプチ
ドグリカンはβ−（１→４）結合によつて連結したＮ−
アセチルグリコサミン（NAG）およびＮ−アセチルムラ
ミン酸（NAM）が交互に繰り返す単位よりなる長鎖ムコ
ポリサツカライドである。それらは一部のNAM残基のラ
クチル側鎖基に結合したＤおよびＬ−アミノ酸を含有す
る短ペプチド鎖を含んでいることが知られている。前記
ムコポリサツカライド鎖はこれらペプチドセグメント間
の共有結合により共に連結されている。高度架橋鎖の網
状構造はサツカラス（sacculus）と呼ばれる。
ル抗体を調製した。ペプチドグリカンは大部分の細菌の
主要細胞壁構成成分であることが知られている。ペプチ
ドグリカンはβ−（１→４）結合によつて連結したＮ−
アセチルグリコサミン（NAG）およびＮ−アセチルムラ
ミン酸（NAM）が交互に繰り返す単位よりなる長鎖ムコ
ポリサツカライドである。それらは一部のNAM残基のラ
クチル側鎖基に結合したＤおよびＬ−アミノ酸を含有す
る短ペプチド鎖を含んでいることが知られている。前記
ムコポリサツカライド鎖はこれらペプチドセグメント間
の共有結合により共に連結されている。高度架橋鎖の網
状構造はサツカラス（sacculus）と呼ばれる。
各種ハイブリドーマにより産生された抗体をペプチドグ
リカンへの結合能についてスクリーニングした。ペプチ
ドグリカンと特異的に結合したいくつかのハイブリドー
マセルラインからの免疫グロブリンを精製しそして次の
ようにしてサンドイツチ式イムノアツセイに用いた。す
なわち、抗−ペプチドグリカン抗体（α−pg）をラテツ
クス粒子に結合した。細胞壁にペプチドグリカン（pg）
を含有することが知られている細菌全体、例えばスタフ
イロコツカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）
またはエシエリヒア・コリ（Escherichia coli）などを
α−pg−ラテツクス粒子の存在下にインキユベートし
た。２時間のインキユベーシヨン後に、未結合細菌を洗
浄除去した。次にβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）に
接合されたα−pgを前記ラテツクス粒子に添加した。２
時間のインキユベーシヨンの後に未結合α−pg−β−ga
lを洗浄除去した。最後に、β−galに対する基質である
Ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ON
PG）を添加しそして410nmでの光学密度を測定した。結
果は、105〜106全細菌がこのアツセイの最低検出限界で
あることを示した。この感度は直接顕微鏡検査のそれに
匹敵する。
リカンへの結合能についてスクリーニングした。ペプチ
ドグリカンと特異的に結合したいくつかのハイブリドー
マセルラインからの免疫グロブリンを精製しそして次の
ようにしてサンドイツチ式イムノアツセイに用いた。す
なわち、抗−ペプチドグリカン抗体（α−pg）をラテツ
クス粒子に結合した。細胞壁にペプチドグリカン（pg）
を含有することが知られている細菌全体、例えばスタフ
イロコツカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）
またはエシエリヒア・コリ（Escherichia coli）などを
α−pg−ラテツクス粒子の存在下にインキユベートし
た。２時間のインキユベーシヨン後に、未結合細菌を洗
浄除去した。次にβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）に
接合されたα−pgを前記ラテツクス粒子に添加した。２
時間のインキユベーシヨンの後に未結合α−pg−β−ga
lを洗浄除去した。最後に、β−galに対する基質である
Ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ON
PG）を添加しそして410nmでの光学密度を測定した。結
果は、105〜106全細菌がこのアツセイの最低検出限界で
あることを示した。この感度は直接顕微鏡検査のそれに
匹敵する。
他のイムノアツセイ形式、すなわち、全細菌のケイ光抗
体検出；全細菌を微量滴定板の壁に結合した後にマウス
α−pg、次いで標準ヤギ抗マウスIgGを結合させるエラ
イザ（ELISA）；α−pgを微量滴定板の壁に結合した後
に細菌次いで標識α−pgを結合させるELISAを検討し
た。これらの別法としてのイムノアツセイ形式のいずれ
においても感度は向上しなかつた。
体検出；全細菌を微量滴定板の壁に結合した後にマウス
α−pg、次いで標準ヤギ抗マウスIgGを結合させるエラ
イザ（ELISA）；α−pgを微量滴定板の壁に結合した後
に細菌次いで標識α−pgを結合させるELISAを検討し
た。これらの別法としてのイムノアツセイ形式のいずれ
においても感度は向上しなかつた。
血液1mlあたり約58コロニー形式単位（CFU）のスタフイ
ロコツカス・エピデルミデイスという濃度の菌血を有す
ることが知られている患者から10mlアリコートの全血を
多数採血した。それら血液検体を常法および本発明を構
成する方法により分析した。
ロコツカス・エピデルミデイスという濃度の菌血を有す
ることが知られている患者から10mlアリコートの全血を
多数採血した。それら血液検体を常法および本発明を構
成する方法により分析した。
１つの10mlアリコートの血液を50mlのトリプチケースソ
イブロス（trypticase soy broth）（TSB）を含む通気
された血液培養びんに入れた。TSBは本質的に等張であ
りまた赤血球ないしプロフエツシヨナル食細胞を溶解し
ない。この手順は細菌の増殖を促進することが知られて
いる。前記肉汁に血液を添加した後様々な時点でアリコ
ートを取り出しそして前述のイムノアツセイ形式を用い
て細菌の有無を試験した。350℃で約12時間インキユベ
ーシヨン後、細菌をイムノアツセイで検出した。しかし
ながらこの時点では肉汁の肉眼検査および直接顕微鏡検
査によつても細菌を検出できた。
イブロス（trypticase soy broth）（TSB）を含む通気
された血液培養びんに入れた。TSBは本質的に等張であ
りまた赤血球ないしプロフエツシヨナル食細胞を溶解し
ない。この手順は細菌の増殖を促進することが知られて
いる。前記肉汁に血液を添加した後様々な時点でアリコ
ートを取り出しそして前述のイムノアツセイ形式を用い
て細菌の有無を試験した。350℃で約12時間インキユベ
ーシヨン後、細菌をイムノアツセイで検出した。しかし
ながらこの時点では肉汁の肉眼検査および直接顕微鏡検
査によつても細菌を検出できた。
第２の10mlアリコートの血液を1978年12月26日にドルン
（Dorn）に交付された米国特許第4,131,512号明細書に
記載された溶解−遠心分離装置に入れた。血液検体を遠
心分離しそして上澄液の最頂部8.5mlを取り出して４℃
に維持した。ペレツト化した微生物を含有する残留液を
激しく撹拌して以後微生物濃縮液と呼ばれる懸濁液を生
成した。略1mlの微生物濃縮液を寒天富化増殖培地に直
接塗布した。残りの0.5mlの微生物濃縮液を10mlの緩衝
された食塩水に入れ、そしてＨ−1000ロータを用いたDu
Pont Sorvall RT−6000冷却遠心分離器で細菌を3000rp
mで15分間遠心分離した。上澄液は傾瀉して捨てた。前
記ペレツトは前述のイムノアツセイ形式および400倍お
よび1000倍の光学顕微鏡法により細菌の有無を試験し
た。それら試験のいずれにおいても細菌は全く検出され
なかつた。しかしながら12時間の増殖時間の後、細菌の
小コロニーが培地上に肉視できた。これらの結果は肉汁
培養により得られるものに匹敵した。前述の8.5mlの上
澄液について細菌の有無を試験した。栄養培地での増殖
または直接顕微鏡検査のいずれによつても細菌は全く検
出されなかつた。しかしながら、イムノアツセイではペ
プチド陽性であつた。
（Dorn）に交付された米国特許第4,131,512号明細書に
記載された溶解−遠心分離装置に入れた。血液検体を遠
心分離しそして上澄液の最頂部8.5mlを取り出して４℃
に維持した。ペレツト化した微生物を含有する残留液を
激しく撹拌して以後微生物濃縮液と呼ばれる懸濁液を生
成した。略1mlの微生物濃縮液を寒天富化増殖培地に直
接塗布した。残りの0.5mlの微生物濃縮液を10mlの緩衝
された食塩水に入れ、そしてＨ−1000ロータを用いたDu
Pont Sorvall RT−6000冷却遠心分離器で細菌を3000rp
mで15分間遠心分離した。上澄液は傾瀉して捨てた。前
記ペレツトは前述のイムノアツセイ形式および400倍お
よび1000倍の光学顕微鏡法により細菌の有無を試験し
た。それら試験のいずれにおいても細菌は全く検出され
なかつた。しかしながら12時間の増殖時間の後、細菌の
小コロニーが培地上に肉視できた。これらの結果は肉汁
培養により得られるものに匹敵した。前述の8.5mlの上
澄液について細菌の有無を試験した。栄養培地での増殖
または直接顕微鏡検査のいずれによつても細菌は全く検
出されなかつた。しかしながら、イムノアツセイではペ
プチド陽性であつた。
菌血症患者（bacteremic patient）の血液に由来する血
漿についても検査した。
漿についても検査した。
細菌培養、直接顕微鏡法およびpgに対するイムノアツセ
イはすべて陰性であつた。
イはすべて陰性であつた。
溶解−遠心分離装置の上澄液中のpgの存在が全細菌に対
する食細胞（例えばPMN）の作用に生じたとする仮設を
試験するために試験管内モデルシステムを作つた。スタ
フイロコツカス・エピデリミデイスをPMN細胞に、前述
の培養に基づかない方法、すなわちイムノアツセイおよ
び直接顕微鏡法のいずれによつてもルーチンには検出で
きない濃度である104CFU/mlの濃度で添加した。スタフ
イロコツカス・エピデルミデイスの添加後様々な時点で
PMN/細菌混合物の部分的アリコートを取出しそして平板
培養、直接顕微鏡法およびイムノアツセイにより細菌を
検査した。更に、部分的アリコートを溶解−遠心分離装
置に入れた。培養結果（プレーテイングの24時間後）
は、細菌をPMNにさらしてから１時間以内に90％を超え
る細菌がPMNにより殺され、２時間後には99％を超える
殺菌が認められることを示した。400倍または1000倍で
多くの顕微鏡視野を探索した後、直接ケイ光顕微鏡法
（アクリジンオレンジ染色）はほんのたまにしか単一の
ケイ光細菌を示さなかつた。PMN/細菌混合物から直接分
析された検体からのイムノアツセイ結果は陽性結果の得
られた約８時間までは陰性であつた。溶解−遠心分離装
置から得られた上澄液検体についてのイムノアツセイ結
果は、細菌をPMNと混合してわずか１時間後にpgの存在
を示した。pgの濃度は12時間直線的に増大した。イムノ
アツセイに先立つて溶解−遠心分離上澄液を遠心分離し
てもイムノアツセイ結果を有意に変えることはなかつ
た。
する食細胞（例えばPMN）の作用に生じたとする仮設を
試験するために試験管内モデルシステムを作つた。スタ
フイロコツカス・エピデリミデイスをPMN細胞に、前述
の培養に基づかない方法、すなわちイムノアツセイおよ
び直接顕微鏡法のいずれによつてもルーチンには検出で
きない濃度である104CFU/mlの濃度で添加した。スタフ
イロコツカス・エピデルミデイスの添加後様々な時点で
PMN/細菌混合物の部分的アリコートを取出しそして平板
培養、直接顕微鏡法およびイムノアツセイにより細菌を
検査した。更に、部分的アリコートを溶解−遠心分離装
置に入れた。培養結果（プレーテイングの24時間後）
は、細菌をPMNにさらしてから１時間以内に90％を超え
る細菌がPMNにより殺され、２時間後には99％を超える
殺菌が認められることを示した。400倍または1000倍で
多くの顕微鏡視野を探索した後、直接ケイ光顕微鏡法
（アクリジンオレンジ染色）はほんのたまにしか単一の
ケイ光細菌を示さなかつた。PMN/細菌混合物から直接分
析された検体からのイムノアツセイ結果は陽性結果の得
られた約８時間までは陰性であつた。溶解−遠心分離装
置から得られた上澄液検体についてのイムノアツセイ結
果は、細菌をPMNと混合してわずか１時間後にpgの存在
を示した。pgの濃度は12時間直線的に増大した。イムノ
アツセイに先立つて溶解−遠心分離上澄液を遠心分離し
てもイムノアツセイ結果を有意に変えることはなかつ
た。
実施例 ２ ストレプトコツカス・フエカリスから得られた精製リポ
テイコ酸（LTA）を抗原として用いて調製されたモノク
ローナル抗体を用いて実施例１の手順を繰り返した。
テイコ酸（LTA）を抗原として用いて調製されたモノク
ローナル抗体を用いて実施例１の手順を繰り返した。
リポテイコ酸のポリグリセロールホスフエート背骨構造
を用いて細胞表面上またはその近傍にLTAを有すること
の知られるグラム陽性細菌を凝集させる能力に対してモ
ノクローナル抗体をスクリーニングした。LTAのポリグ
リセロールホスフエート部分に対し特異的な抗体をその
モノクローナル抗体によるLTA含有細菌の凝集を阻害す
る脱アシル化カルデイオリピンの能力に基づいて更に選
択した。この阻害はそのように選択されたモノクローナ
ル抗体が背骨構造に関連したエピトープまたは結合部位
に対する特異性を有し、LTA末端またはその近傍のエピ
トープに対する特異性は有しないことを示した。この選
択によりPMN分解後に細菌LTAとの反応性を維持する確率
が一段と高い抗体が得られる。何故ならば、ラインゾー
ム酵素はより典型的には末端結合を分解するエキソハイ
ドロラーゼだからである。実施例１で得られた結果と本
質的に同じ結果が実証された。すなわち、リポテイコ酸
を含有することが知られている細菌菌体に対する最低検
出限界は細菌菌体個数として105〜106個程度であつた。
培養に基づく検出と溶解−PMN上澄液から得られたリポ
テイコ酸の免疫検出との比較は、リポテイコ酸の免疫検
出の方が高感度の方法であることを示した。培養におい
て何らかの肉視しうる増殖を認めうる少くとも８時間前
にはイムノアツセイにより細菌の存在を検出できた。更
に、溶解PMN上澄は免疫陽性であつたのに対し等容量の
未処理PMN含有血液検体は免疫陰性であつた。従つてペ
プチドグリカンおよリポテイコ酸モノクローナル抗体試
薬を用いて同様な実験を行つても本質的に同じ結果が得
られた。
を用いて細胞表面上またはその近傍にLTAを有すること
の知られるグラム陽性細菌を凝集させる能力に対してモ
ノクローナル抗体をスクリーニングした。LTAのポリグ
リセロールホスフエート部分に対し特異的な抗体をその
モノクローナル抗体によるLTA含有細菌の凝集を阻害す
る脱アシル化カルデイオリピンの能力に基づいて更に選
択した。この阻害はそのように選択されたモノクローナ
ル抗体が背骨構造に関連したエピトープまたは結合部位
に対する特異性を有し、LTA末端またはその近傍のエピ
トープに対する特異性は有しないことを示した。この選
択によりPMN分解後に細菌LTAとの反応性を維持する確率
が一段と高い抗体が得られる。何故ならば、ラインゾー
ム酵素はより典型的には末端結合を分解するエキソハイ
ドロラーゼだからである。実施例１で得られた結果と本
質的に同じ結果が実証された。すなわち、リポテイコ酸
を含有することが知られている細菌菌体に対する最低検
出限界は細菌菌体個数として105〜106個程度であつた。
培養に基づく検出と溶解−PMN上澄液から得られたリポ
テイコ酸の免疫検出との比較は、リポテイコ酸の免疫検
出の方が高感度の方法であることを示した。培養におい
て何らかの肉視しうる増殖を認めうる少くとも８時間前
にはイムノアツセイにより細菌の存在を検出できた。更
に、溶解PMN上澄は免疫陽性であつたのに対し等容量の
未処理PMN含有血液検体は免疫陰性であつた。従つてペ
プチドグリカンおよリポテイコ酸モノクローナル抗体試
薬を用いて同様な実験を行つても本質的に同じ結果が得
られた。
実施例１および２はいずれも本発明による方法が、伝統
的な培養に基づく検出システムよりも実質的に短時間で
信頼しうる臨床的に有意な結果を与え得ることを示して
いる。
的な培養に基づく検出システムよりも実質的に短時間で
信頼しうる臨床的に有意な結果を与え得ることを示して
いる。
Claims (7)
- 【請求項１】（１）食細胞を含む細胞集団を含む検体を
宿主から分離し； （２）その集団を、サポニンまたは食細胞を破壊して食
作用を受けた細菌または菌類病原体の少なくとも１種の
可溶性抗原を放出することはできるが食作用を受けてい
ない病原体を破壊することはできない15以下のHLB指数
を有する緩和な非イオン表面活性剤と接触させ； （３）その放出された可溶性抗原を該可溶性抗原と特異
的に結合するパートナーと接触させ；そして （４）結合度を測定する ことよりなる、該宿主の食細胞により食作用を受けかつ
少なくとも部分的な分解を受ける細菌または菌類病原体
の存在の検出方法。 - 【請求項２】パートナーが抗体である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項３】食細胞が多形核白血球である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】溶解剤がサポニンである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項５】病原体がスタフィロコッカス・エピデルミ
ディス（Staphylococcus epidermidis）であり、食細胞
が多形核白血球であり、検体が血液であり、溶解剤がサ
ポニンであり、可溶性抗原がペプチドグリカンでありそ
してパートナーがモノクローナル抗−ペプチドグリカン
抗体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】病原体がストレプトコッカス・フェカリス
（Sterptococcus feacalis）であり、食細胞が多形核白
血球であり、検体が血液であり、溶解剤がサポニンであ
り、可溶性抗原がリポティコ酸でありそしてパートナー
がモノクローナル抗−リポティコ酸抗体である特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】（１）食細胞を含む細胞集団を含む検体を
宿主から分離し； （２）その集団を、サポニンまたは食細胞を破壊して食
作用を受けた細菌または菌類病原体の少なくとも１種の
可溶性抗原を放出することはできるが食作用を受けてい
ない病原体を破壊することはできない15以下のHLB指数
を有する緩和な非イオン表面活性剤と接触させ； （３）その放出された可溶性抗原を該可溶性抗原と特異
的に結合するパートナーと接触させ；そして （４）結合度を測定する ことによりなる、該宿主の食細胞により食作用を受けか
つ少なくとも部分的な分解を受ける細菌または菌類病原
体の存在の検出を行い、さらに検体の一部を病原体が増
殖できる栄養培地と接触させそして培地での増殖を検査
し、それによって上記の検出で得られた結果の確認を行
う検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61158884A | 1984-05-18 | 1984-05-18 | |
| US611588 | 1990-11-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60259966A JPS60259966A (ja) | 1985-12-23 |
| JPH0795068B2 true JPH0795068B2 (ja) | 1995-10-11 |
Family
ID=24449619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10411585A Expired - Lifetime JPH0795068B2 (ja) | 1984-05-18 | 1985-05-17 | 細菌および菌類感染の迅速検出方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0166164B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0795068B2 (ja) |
| CA (1) | CA1255218A (ja) |
| DE (1) | DE3566165D1 (ja) |
| DK (1) | DK219785A (ja) |
| GR (1) | GR851196B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3700049A1 (de) * | 1987-01-02 | 1988-07-14 | Biotest Serum Institut Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von mykobakterien im sputum sowie monoklonale antikoerper zur durchfuehrung des verfahrens |
| CA1317860C (en) * | 1987-04-01 | 1993-05-18 | Daniel Louis Kacian | Techniques for preparing specimens for bacterial assays |
| JPH01143956A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-06 | Nitsusui Seiyaku Kk | 細菌全菌に対する抗体を利用した細菌の簡易迅速かつ高感度検査法 |
| PL398765A1 (pl) * | 1999-07-16 | 2012-11-05 | Verax Biomedical, Inc., | Zestaw do immunologicznego wykrywania bakterii w krwi i tkankach |
| RU2011105767A (ru) * | 2008-08-04 | 2012-09-10 | Синмед Рисёч Гмбх (At) | Способ исследования, в частности количественного анализа, молекулярных маркеров, поглощенных из ткани макрофагами крови, которые повторно поступают из тканей в кровеносную систему |
| EP2414840A4 (en) * | 2009-04-01 | 2013-03-06 | Saureus Inc | ASSAYS FOR BACTERIAL RECOGNITION AND IDENTIFICATION |
| JP6177009B2 (ja) * | 2013-06-03 | 2017-08-09 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 血球破壊試薬及びそれを用いる血球破壊方法 |
| DE102014206441A1 (de) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren für die Molekulardiagnostik zum Anreichern einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3883425A (en) * | 1973-12-10 | 1975-05-13 | Wadley Res Inst & Blood Bank | Detoxification of saponins |
-
1985
- 1985-05-15 EP EP19850106001 patent/EP0166164B1/en not_active Expired
- 1985-05-15 DE DE8585106001T patent/DE3566165D1/de not_active Expired
- 1985-05-16 CA CA000481714A patent/CA1255218A/en not_active Expired
- 1985-05-16 GR GR851196A patent/GR851196B/el unknown
- 1985-05-17 JP JP10411585A patent/JPH0795068B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-17 DK DK219785A patent/DK219785A/da unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR851196B (ja) | 1985-11-25 |
| JPS60259966A (ja) | 1985-12-23 |
| EP0166164B1 (en) | 1988-11-09 |
| EP0166164A1 (en) | 1986-01-02 |
| DK219785D0 (da) | 1985-05-17 |
| CA1255218A (en) | 1989-06-06 |
| DK219785A (da) | 1985-11-19 |
| DE3566165D1 (en) | 1988-12-15 |
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