JPH0656692A - Ｔｃｆ−ｉｉを有効成分とする創傷治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＴＣＦ−IIを有効成分とする創傷治療剤。 【効果】 切り傷、褥瘡、手術創、熱傷、外傷性皮膚欠
損症など多様の皮膚損傷に局所注射、軟膏あるいは創傷
面保護に用いる皮膜に塗布して非経口的に用いることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト細胞の生産する蛋白
質ＴＣＦ−IIを有効成分とする創傷治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト細胞由来の線維芽細胞が生産する腫
瘍細胞障害性因子としてβインターフェロンが広く知ら
れている。また線維芽細胞が生産する物質としては特開
昭５８−１４６２９３号公報、特開昭６１−３３１２０
号、特開昭６１−１８７２号公報、６２−１０３０２１
号公報、特開昭６４−１０９９８号公報にそれぞれ開示
されている。本発明者らはヒト線維芽細胞由来の抗腫瘍
性蛋白質を研究する過程において、これまで報告された
これらの蛋白質と全く異なる新規な抗腫瘍性物質を発見
し、さらにこの蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニ
ングに成功し、その全アミノ酸配列を確定するととも
に、有用性を確認した。この新規な抗腫瘍性蛋白質とそ
の遺伝子はＷＯ９０／１０６５１として開示されてい
る。この新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＦ−IIと命名されて
いる。このＴＣＦ−IIは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増
殖活性を合わせもち、さらに肝臓実質細胞の増殖因子で
あるＨＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認
された。ＴＣＦ−IIはＳＤＳ電気泳動による分子量測定
では７８０００±２０００または７４０００±２０００
の分子量を示し、還元した場合５２０００±２０００の
共通のバンドであるＡ鎖と３００００±２０００または
２６０００±２０００の２本のバンド（Ｂ鎖、Ｃ鎖）を
示す。ＴＣＦ−IIは肝臓実質細胞の増殖因子であること
から肝切除後の肝臓再生を目的とした利用が可能である
が、本発明で開示される創傷治療に対する効果はこれま
で知られていなかった。創傷や火傷など皮膚面の傷に対
しては、その症状に応じて、縫合や皮膚移植などの外科
的治療の他は、細菌感染による炎症を防止するための抗
菌剤の塗布や内服、あるいは創傷面の保護のためアクリ
ノール・チンク油の塗布、キチン繊維や凍結乾燥豚真皮
による被覆などの消極的な治療方法しか行われていなか
った。また上皮細胞増殖因子(EGF) の投与による上皮細
胞の増殖による皮膚の再生による治療も試みられている
が治療方法としては確立していない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはＴＣＦ−
IIの有用性に注目し、抗腫瘍剤としての利用や疾病の診
断のマーカーとしての利用を検討してきた。しかし、Ｔ
ＣＦ−IIが創傷治療効果を有することは確認されていな
い。本発明者らは、ＴＣＦ−IIの肝臓に対する作用を研
究する過程から、ＴＣＦ−IIが単に肝実質細胞の増殖を
もたらすだけでなく、上皮細胞や線維芽細胞の増殖を促
進し、創傷や火傷の回復を促進することを見いだした。
本発明は、ＴＣＦ−IIを有効成分とする創傷治療剤を提
供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明に係る有効成分で
あるＴＣＦ−IIを得る方法は以下の手段による。ＴＣＦ
−IIは先に示したＷＯ９０／１０６５１に開示された方
法によって得られた、細胞由来のものを用いることが可
能である。また同公報に記載された遺伝子配列に基づい
て、微生物や他の細胞により遺伝子組み換え操作により
生産されたものであっても差し支えない。遺伝子操作に
よりＴＣＦ−IIを製造する方法については、本発明者ら
により出願され、ＷＯ ９２／０１０５３号として公開
されている方法で生産したものを用いることができる。
また宿主細胞、微生物の違いにより糖鎖の異なったもの
や、糖鎖の結合していないものであっても使用可能であ
る。しかし糖鎖は生体内の代謝速度に関係しているため
糖鎖の結合しているものが望ましい。

【０００５】ＴＣＦ−IIは通常の単離精製法によってさ
らに濃縮・精製することができる。例えば、有機溶媒に
よる沈殿法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクローナル
抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法など
が上げられる。これらの精製法の内モノクローナル抗体
を用いたアフィニティークロマトについては、本発明者
により特願平３−１７７２３６号として出願されている
モノクローナル抗体を用いて精製することができる。

【０００６】得られた精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥若し
くは凍結保存することができる。本発明の創傷治療剤は
創傷面の近傍へ注射剤として投与することができる。ま
た創傷部分へ直接塗布したり、脂肪、脂肪油、ラノリ
ン、パラフィン、ろう、樹脂、グリコール類、高級アル
コール、グリセリン、水、乳化剤、懸濁化剤等にＴＣＦ
−IIを加え混和し、全体を均等にして軟膏剤等として塗
布することもできる。さらに、硬膏剤、エアゾール剤、
リニメント剤等として用いることもできるし、殺菌ガー
ゼや創傷面保護に用いる豚凍結乾燥真皮、キチン繊維に
浸漬させて投与することもできる。また必要に応じて、
抗生物質や抗菌剤、殺菌剤などと併用することができ
る。さらに縫合や皮膚移植などの外科手術の際に施術部
位に投与することもできる。本発明の創傷治療剤は、通
常の切り傷の他に褥瘡、手術創、熱傷、外傷性皮膚欠損
症など多様な皮膚損傷の治療に用いることができる。

【０００７】本発明の創傷治療剤に含まれる、ＴＣＦ−
IIの投与量は、投与患者の創傷の状態よって定められる
が、成人一人あたり精製ＴＣＦ−IIとして創傷面に対し
て１００−３００００μｇ好ましくは、５００−３００
０μｇを含有する製剤を１週間に１〜７回創傷面に投与
することができる。また患者の症状によっては長期間の
投与も可能である。

【０００８】以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に
説明する。

【実施例１】ＴＣＦ−IIの精製 ＷＯ９０／１０６５１公報に開示された方法及び東尾ら
の方法(Higasio,K.et.al. B.B.R.C.,vol.170,397-404,1
990)に準じて細胞を培養し精製ＴＣＦ−IIを得た。ヒト
線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８６）
細胞を５％子牛血清を含むＤＭＥＭ１００ｍｌをいれた
ローラーボトルに３×１０⁶ 個移植し、0.５〜２回転／
分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。総
細胞数が１×１０⁷ 個になったところでトリプシンによ
り細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシ
ュのセラミック１００ｇ（東芝セラミック社製）を殺菌
して投入し、２４時間精置して培養した。その後上記培
養液を５００ｍｌ加え、培養を継続した。７〜１０日ご
とに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このよう
にして２ケ月間の生産を継続し、ローラーボトル一本あ
たり４ｌの培養液を回収した。このようにして得た培養
液当たりの比活性は３２ｕ／ｍｌであった。培養液７５
０ｌをアミコン社製メンブランフィルター（ＭＷ ６０
００カット）処理によりＵＦ濃縮し、ＣＭセファテ゛ックス Ｃ
−５０（ファルマシア社製）、ＣｏｎＡセファロース
（ファルマシア社製）、ＭｏｎｏＳカラム（ファルマシ
ア社製）、ヘパリンセファロース（ファルマシア社製）
による４段階のクロマト精製を行い、比活性５２４８０
００ｕ／ｍｇの精製ＴＣＦ−IIを得た。

【０００９】

【実施例２】遺伝子組換ＴＣＦ−IIの生産 ＷＯ９２／０１０５３公報に開示された方法に従い、Ｔ
ＣＦ−II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ
−IIを得た。形質転換ナマルワ（Namalwa)細胞を培養
し、培養液20l を得た。この培養液をCM−セファデック
スC-50クロマト、Con-A セファロースCL-6B クロマト、
MonoS カラムを装着したHPLCの順に処理を行い、約11mg
の活性ＴＣＦ−IIを得た。

【００１０】

【実施例３】ＴＣＦ−II製剤の生産例 本実施例においては、上記実施例２の方法により得るこ
とのできた遺伝子組み換えＴＣＦ−IIの注射製剤の生産
例を示した。この注射製剤を患部近傍への注射や、静
脈、皮下、筋肉注射に用いたりすることができるし、創
傷面を保護する目的で使用する殺菌ガーゼや豚凍結乾燥
真皮、キチン繊維に浸漬させて直接患部へ投与するため
にも使用できる。 (1) ＴＣＦ−II 20μg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１１】(2) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (3) ＴＣＦ−II 20μg ツイーン80 2mg ソルビトール 4ｇ 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１２】(4) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 2mg グリシン 2ｇ 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (5) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 1mg ソルビトール 2ｇ グリシン 1ｇ 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００１３】(6) ＴＣＦ−II 20μg ソルビトール 4ｇ ヒト血清アルブミン 50mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。 (7) ＴＣＦ−II 40μg グリシン 2ｇ ヒト血清アルブミン 50mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (8) ＴＣＦ−II 10mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１４】

【実施例４】ＴＣＦ−II軟膏剤の製剤例 (1) ＴＣＦ−II 1000mg 精製ラノリン 20ｇ 白色ワセリン 80ｇ ＴＣＦ−IIを少量の精製水と混合し、これをラノリン中
に少量ずつ添加し混合した。次いでこの混合物に白色ワ
セリンを少量ずつ添加しながら練り合わせ、ＴＣＦ−II
軟膏を製造した。 (2) ＴＣＦ−II 1000mg マクロゴール400 5ml マクロゴール軟膏 100ｇ ＴＣＦ−IIを少量の精製水と混合し、これをマクロゴー
ル400 中に少量ずつ添加し混合した。次いでこの混合物
にマクロゴール軟膏を少量ずつ添加しながら練り合わ
せ、ＴＣＦ−II軟膏を製造した。

【００１５】

【発明の効果】本発明によりＴＣＦ−IIを有効成分とす
る創傷治療剤が提供される。以下にＴＣＦ−IIの治療効
果を確認した実験例を示し、本発明の効果を説明する。

【００１６】

【実験例】 試験方法 ８週齢のウイスター系雄ラット（日本チャールス・リバ
ー）1 群８−９匹の背部の毛を刈り取った後、正中線で
対称となるように左右に約 1.5cmの皮膚を切開した。対
で化膿防止のため切開部にペニシリンを塗布し切開部の
中央で１カ所縫合した。1mg/ml の濃度になるように0.1
％ヒト血清アルブミン含有パイロジェンフリーPBS に
溶解したＴＣＦ−IIを皮膚切開直後より１日２回、切開
部に直接塗布し、４日目に抜糸し、6 日目にラットを屠
殺した皮膚を剥離し、創傷部を短冊型に切った試料を調
製した。この試料の両端を牽引して創傷部が開口するま
での張力を測定した。測定値はFDピックアップ（日本光
電製 TB-611T) をヒズミ圧力用アンプ（日本光電製 AP-
601G) を介してポリグラフ（日本光電製 RM-6200) に記
録した。対照群には溶媒(0.1％ HSA含有PBS)のみを同様
に塗布し同様に試料を調製して測定した。 試験成績 創傷部分が開口する際の最大張力の測定値を下記表1 に
示した。

【００１７】

【表１】 ^** P<0.01(Wilcoxon検定) 数値は平均値±標準誤差値 表１に示したようにＴＣＦ−II投与群の創傷面の接着力
は対照の約1.65倍であった。ＴＣＦ−IIの創傷治癒効果
が確認できた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＴＣＦ−IIを有効成分とする創傷治療剤