JPH0656896A - 血液伝播型非ａ非ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原タンパク質を有する融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染症の診断薬とし
て有用な融合タンパク質を開発する。 【構成】 血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由来のコ
アタンパク質の少なくともエピトープを含むペプチド
（Ａ）と他のタンパク質の少なくともエピトープを含む
ペプチド（Ｂ）が、酸性領域に等電点を有するキャリヤ
ータンパク質（Ｃ）を介してつながり、等電点が６〜１
０、分子量が２５〜１００キロダルトンである融合タン
パク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業の利用分野】本発明は、診断薬として有用な新規
なタンパク質に関し、さらに詳しくは血液伝播型非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス由来のコアタンパク質の少なくとも一
部と他の抗原タンパク質とが酸性領域に等電点を有する
キャリアータンパク質を介して結合して成る融合タンパ
ク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス性肝炎は肝炎ウイルスの感染に
よりおこる肝疾患である。肝炎ウイルスとして現在まで
にＡ型、Ｂ型、およびＤ型（デルタ）の各肝炎ウイルス
が分離同定されていた。しかしこれらの肝炎ウイルスの
感染によらないウイルス性肝炎が多数存在することが報
告された。このような肝炎を総称して非Ａ非Ｂ型肝炎と
呼ぶようになった。従って非Ａ非Ｂ型肝炎の病因ウイル
スが一種であるとは限らず、実際経口感染型ウイルス
（食物や水を介して伝染する）および血液伝播型ウイル
ス（主として血液を介して伝播し輸血後などに多発す
る）の存在が報告されている。非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
は、従来他のウイルスの発見の経緯とは異なり、ウイル
ス遺伝子の非構造タンパク質領域のクローニングから発
見された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４（４９０９）３５９
−３６２（１９８９））。

【０００３】この非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは現在のとこ
ろエンベロープウイルスであると考えられている。その
ウイルスゲノムの非構造タンパク質領域の一部を、ヒト
・スーパーオキサイド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）との融
合タンパクとして酵母で発現させたＣ１００−３ポリペ
プチドが診断薬として提供され、それを用いる抗体アッ
セイ系（Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ
Ｓｙｓｔｅｍ）が確立されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
４４（４９０９）３６２−３６４（１９８９））。しか
しながら、この非構造タンパク質に対する抗体は、ウイ
ルス感染後、すぐに産生されるものではないため、感染
初期には発見しにくいという問題がある。

【０００４】一方、血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
の構造タンパク質領域についてもいくつかの研究グルー
プによって遺伝子がクローニングされた（たとえば、Ｗ
Ｏ９０／１１０８９、ＷＯ９０／１４４３６、岡本ら：
Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、６０（３）１６７
−１７７（１９９０）、加藤ら：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．、８１、１０９２−１０９４（１９９
０）、加藤ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８７、９５２４−９５２８（１９９０）、
および高見沢ら：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５（３）１１９
５−１２１３（１９９１）など）。構造タンパク質に対
する抗体は、非構造タンパク質とは異なり、感染初期に
産生されるため、診断薬として構造タンパク質を用いる
ことは好ましい。

【０００５】また、血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
とフラビウイルス等の核酸配列の比較に基づいて、その
構造タンパク質の一つと考えられるコアタンパク質を大
腸菌内やバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞
中、動物細胞中で発現させることに成功している（村磯
ら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．、１７２（２）５１１−５１６（１９９０）、
松浦ら：第４９回 日本癌学会 抄録集ｐ１１３、１９
９０年、松浦ら：第３８回日本ウイルス学会総会抄録集
ｐ．４７、１９９０年、原田ら：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、
６５（６）３０１５−３０２１、（１９９１））。

【０００６】コアタンパク質を用いたコア抗体検出率は
Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ ＥＬＩＳＡＴｅｓｔ Ｓｙｓｔｅ
ｍ による検出率より優れているという評価が得られて
いる（千葉ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８８、４６４１−４６４５、（１９９
１））。このコアタンパク質の一部をグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼに結合させてエピトープを見つけ
た報告がなされている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ、８８、５４６２−（１９９１））
ほか、コアタンパク質の親水性領域のペプチドを化学合
成して（岡本ら：Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、
６０（４）２２３−２３３、（１９９０））、非Ａ非Ｂ
型肝炎患者血清中の抗コア抗体を検出するアッセイ系の
作製が試みられている。

【０００７】一般に診断システムとしてはＥＬＩＳＡ
（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏ
ｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法と赤血球やラテックス粒子
を支持体とする凝集法とがあり、前者は高感度ではある
が、操作が繁雑なため、多量の検体を処理するには不向
きである。一方、後者は多量の検体を処理するのに適し
ている。

【０００８】しかし、前述のコアタンパク質は、等電点
が高い塩基性であるため、そのまま支持体に担持させた
のでは、支持体によっては非特異な凝集が生じてしまい
診断薬として使用できない場合がある。また、抗原部位
の合成ペプチドをそのまま担体に担持させたのでは分子
量が小さすぎて感度が上がらないという欠点がある。さ
らに、診断薬としては一般に、輸血用の血液の血液伝播
型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体検査では偽陰性
を防ぐことが重要であり、そのためにはできるだけ多く
の抗原部位を有する抗原を使用することが望まれてい
た。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このような状況をもと
に、本発明者らは血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由
来のコアタンパク質と他の抗原タンパク質とが等電点が
酸性のキャリヤータンパク質を介して結合している融合
タンパク質の製造に成功し、この融合タンパク質が凝集
法システムによる診断薬として適した等電点、分子量、
抗原性を有することを見いだし、本発明を完成するに至
った。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（以下、単に非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスという）由来のコアタンパク質の
少なくともエピトープを含むペプチド（Ａ）と他の抗原
タンパク質の少なくともエピトープを含むペプチド
（Ｂ）が酸性領域に等電点を有するキャリヤータンパク
質（以下、酸性のキャリヤータンパク質という）（Ｃ）
を介してつながり、等電点（ｐＩ）が６〜１０、好まし
くは６．５〜９、分子量が２５〜１００キロダルトン
（以下、Ｋｄという）、好ましくは２８〜４０Ｋｄであ
る融合タンパク質が提供される。

【００１１】本発明のコアタンパク質の少なくともエピ
トープを含むペプチド（Ａ）は、コアタンパク質の疎水
性領域を実質的に含まないものである。本発明で言う疎
水性領域を実質的に含まないコアタンパク質とは、コア
タンパク質の疎水性領域のアミノ酸が１０個程度以下、
好ましくは５個以下、さらに好ましくは全く含まないも
のであって、その分子量が１〜２１Ｋｄ、好ましくは８
〜１０Ｋｄのものであり、このようなペプチドの具体例
としては、配列番号１記載の第１〜１６９番目のアミノ
酸配列を有するものや、ＣＰ９タンパク質やＣＰ１０タ
ンパク質（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１５、２、１８０−
１８６（１９９２））などが挙げられる。なお、コアタ
ンパク質の疎水性領域とは、コアタンパク質のカルボキ
シ末端側に存在する膜領域と言われる領域であり、具体
例としては配列番号４記載の第１７０〜１９０番目のア
ミノ酸配列を有するものが挙げられる。

【００１２】また、コアタンパク質以外の抗原タンパク
質の少なくともエピトープを含むペプチド（Ｂ）は、血
液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのエピトープを含むペ
プチドであれば特に限定されず、例えば構造タンパク質
の一つであるエンベロープタンパク質（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、６５、３、１１５０−１１１３（１９９１））や
非構造タンパク質であるＮＳ４タンパク質（Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、６５、３、１１５０−１１１３（１９９
１））、ＮＳ３タンパク質（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、
３、１１５０−１１１３（１９９１））などのエピトー
プを含む領域が挙げられる。このようなタンパク質の具
体例としては、配列番号２記載のＮＳ４タンパク質のエ
ピトープを含むペプチドが挙げられる。

【００１３】酸性のキャリヤータンパク質（Ｃ）として
は、ヒトに対する病原菌及び病原ウイルス由来の抗原タ
ンパク質でないものであって、等電点（ｐＩ）が酸性、
好ましくはｐＩ４〜６．５、より好ましくはｐＩ５〜６
であるものであればよい。このような酸性のキャリヤー
タンパク質の具体例としては、マウス寄生虫由来のグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．
１８；以下、ＧＳＴという）やチトクロームＣオキシダ
ーゼ（ＥＣ１．９．３．１）などが挙げられるが、好ま
しくはＧＳＴである。この酸性のキャリヤータンパク質
をコアタンパク質と組み合わせることにより、融合タン
パク質の等電点を下げることができるばかりでなく、コ
アタンパク質のエピトープと他のタンパク質のエピトー
プの間に酸性のキャリヤータンパク質を存在せしめるこ
とによってコアタンパク質と他の抗原タンパク質のエピ
トープが立体構造上近接し過ぎるのを防ぎ、お互いの抗
原性を充分発揮させることができる。

【００１４】本発明の融合タンパク質の具体例として
は、コアタンパク質の一部とグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼとＮＳ４タンパク質の一部から構成される
配列番号３に示すアミノ酸配列を有するものや、コアタ
ンパク質の一部とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼとエンベロープタンパク質の一部から構成されるも
の、コアタンパク質の一部とチトクローム−Ｃ−オキシ
ダーゼとＮＳ３タンパク質の一部から構成されるものな
どが挙げられる。

【００１５】本発明の融合タンパク質は、通常、適当な
ベクターに融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込
んだ組み換えベクターを宿主細胞内で発現させることに
より製造される。

【００１６】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原タンパ
ク質をコードする遺伝子は、例えば、ＧＰＴが１００以
上であり、非Ａ非Ｂ型肝炎と診断された日本人の血液か
ら公知技術によってウイルスＲＮＡを単離し、逆転写酵
素によりｃＤＮＡを調製した後、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スの公知配列（高見沢ら、前掲参照）に基づいて設計さ
れたプライマーを使用したＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉら：
雑誌Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、４８７−、（１９８
８））を行いクローニングベクターに挿入し、クローニ
ングすることができる。

【００１７】融合タンパク質をコードする遺伝子は、予
め設計した融合タンパク質を元にして、各タンパク質を
コードする遺伝子の読み枠がずれないように、適当な合
成アダプターなどを用いて常法に従って連結することに
より作製され、このような遺伝子の具体例としては、配
列番号３に示す塩基配列を有するものが挙げられる。

【００１８】組み換えベクターの作製に供されるベクタ
ーは、一般の遺伝子組み換えの技術に使用されるベクタ
ーを使用すればよく、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５、ｐＵＣ１８などのプラスミドや、λ−ファージ、
Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９（Ｇｅｎ
ｅ、１１、２９１（１９８０））などのコスミドが例示
される。

【００１９】ベクターに融合タンパク質をコードする遺
伝子を組み込んで組み換えベクターを作製する方法は常
法に従えばよく、例えばベクターを制限酵素で切断した
後、適当な発現制御配列の支配下に、上記遺伝子を直接
結合すればよい。用いられる発現制御配列は、大腸菌内
で機能するものであれば良く、例えばｌａｃプロモータ
ー・オペレーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモ
ーター、ｌｐｐプロモーター、ＰＬプロモーターなどが
例示される。

【００２０】融合タンパク質をコードする遺伝子を組み
込んだ組み換えベクターを、大腸菌に形質転換して融合
タンパク質の産生能を有する微生物を得ることができ
る。

【００２１】目的とする融合タンパク質が発現している
かどうかは、形質転換体を常法にしたがって分析すれば
よく、例えば、形質転換体を誘導条件下で培養し、それ
を宿主細胞を破砕し、粗タンパク質を回収した後、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した
後、ゲルをクマジーブリリアントブルーの染色液によっ
て染色するか、あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清を用
いたイムノアッセイによって確認できる。

【００２２】融合タンパク質は公知の常法、例えば塩
析、ゲル濾過、イオン交換およびアフィニティーカラム
クロマトグラフィーによる分離法、高速液体クロマトグ
ラフィー、電気泳動による分画法等を適宜組み合わせて
採用することにより精製出来る。精製された融合タンパ
ク質の分子量や等電点は、常法により測定できる。例え
ば、分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって測定すればよく、また等電点はアンホライン（フ
ァルマシアＬＫＤバイオテクノロジー；ｐＨレンジが
３．５−９．８）を使ったゲル電気泳動で測定すればよ
い。

【００２３】このようにして得られた本発明の融合タン
パク質は、等電点が６〜１０、好ましくは６．５〜９、
分子量が２５〜１００Ｋｄ、好ましくは２８〜４０Ｋｄ
のものである。

【００２４】このような融合タンパク質は、常法にした
がって支持体に担持させることにより非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスの診断薬として使用することができる。診断薬の
製造に供される支持体は、診断薬用に供されているもの
であれば特に限定されず、例えばマイクロプレート、ポ
リスチレンビーズ、ラテックス粒子、膜等が挙げられ
る。

【００２５】また、支持体に融合タンパク質を担持させ
る方法は、支持体に適した方法であれば良く、例えば、
マイクロプレートに吸着させる方法として、融合タンパ
ク質を適当な緩衝液に溶解し、プレートに添加後、室温
で放置する方法がある。このようにして製造された診断
薬は、常用されている抗原抗体反応測定法、例えばＲＩ
Ａ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ
法、蛍光抗体法、受身凝集反応、逆受身凝集反応等の常
法に従って使用可能である。

【００２６】

【発明の効果】かくして本発明によれば、凝集法による
診断システムに適した等電点と分子量を有し、かつ複数
の抗原部位を含む血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由
来のコアタンパク質と他の抗原タンパク質と酸性のキャ
リヤータンパク質から本質的に構成される融合タンパク
質が得られる。この融合タンパク質は血液伝播型非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス感染の診断に用いることができる。

【００２７】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例１ 組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＣＶ３６５４
の作製 （Ａ）血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造タンパク
質領域の遺伝子クローニング Ｂ型肝炎陰性でＧＰＴ値１００以上のヒト血清０．５ｍ
ｌに５倍量のグアニジウムチオシアネート溶液（４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ
７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ２−メルカプ
トメタノール、２％ザルコシル）を加えフェノール／ク
ロロホルム抽出しグリコーゲンをキャリアーとしてエタ
ノール沈澱により血清中の全ＲＮＡを精製した。一方、
岡本ら（前掲参照）の結果をもとに以下の配列を持つ４
本の合成ＤＮＡプライマーを作製した。

【００２８】（１）5' CATATGAGCACGAATCCTAA、（２）
5' CCCAACGAGCAAGTCGACGT、（３）5' TGATCATGCATACTCC
CGGGT、（４）5' GCTGCCGTTGGTATTCACAA

【００２９】前記ＲＮＡから（４）の合成ＤＮＡをプラ
イマーを用いて、ｃＤＮＡ合成システム（ベーリンガー
マンハイム社製）でｃＤＮＡを作製した。合成したｃＤ
ＮＡ（約１．２６ｋｂｐ）をテンプレートとして、プラ
イマー（１）と（２）を使ったＰＣＲ法を行いこのｃＤ
ＮＡ断片を増幅した。増幅されたｃＤＮＡ断片の５’末
端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した
後、ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１８と連結し得られた約
３．４１ｋｂｐのプラスミドをｐＩＫＣと命名した。ま
た、プライマー（３）と（４）を用いて前記と同様の操
作を行い、得られた約３．４５ｋｂｐのプラスミドをｐ
ＩＫＥと命名した。ついで、得られたｐＩＫＣとｐＩＫ
Ｅを制限酵素ＡｖａＩで消化した後、連結し、得られた
約４．０１ｋｂｐのプラスミドをｐＩＫ４ＣＥと命名し
た。

【００３０】（Ｂ）ｐＩＫ４ＣＥの核酸塩基配列とアミ
ノ酸配列の決定 上記（Ａ）で作成したｐＩＫ４ＣＥにクローニングされ
た非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ塩基配列を調べる
ためＭ１３ファージに、組み込んだ１．２６ｋｂｐのｃ
ＤＮＡ断片をリクローニングし、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅシ
ーケンスキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）により塩基配列を決定した。そ
の結果得られた塩基配列と、それから予測されるアミノ
酸配列の解読結果を配列番号４に示した。

【００３１】（Ｃ）非構造タンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの合成 特表平２−５００８８０号公報のタンパク質Ｃ１００−
３（ＮＳ３タンパク質とＮＳ４タンパク質の一部）のア
ミノ酸配列を基にして、配列番号２に示す４０アミノ酸
（この４０アミノ酸が抗原性を有することは、この４０
アミノ酸からなる合成ペプチドが血液伝播型非Ａ非Ｂ型
肝炎患者と認定された患者血清と反応する事によって確
認した）をコードするＤＮＡを化学合成で作製した。即
ち、４０アミノ酸をコードするＤＮＡ配列として大腸菌
の好適なコドンユセッジを配慮して配列番号２に示す塩
基配列を設計し、以下に示す１２本のＤＮＡフラグメン
トを合成した。

【００３２】Ｕ１：5'-GATCCGTGGTGCTGTCCGGC-3'、Ｌ
１：3'-GCACCACGACAGGCCGTTCGGCC-5' Ｕ２：5'-AAGCCGGCGATCATTCCGGA-3'、Ｌ２：3'-GCTAGTA
AGGCCTGGCGCTT-5' Ｕ３：5'-CCGCGAAGTCCTGTACCGCG-3'、Ｌ３：3'-CAGGACA
TGGCGCTTAA-5'、 Ｕ４：5'-AATTCGATGAGATGGAAGAGTG-3'、Ｌ４：3'-GCTAC
TCTACCTTCTCACGAGAGTCGT-5'、 Ｕ５5'-CTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAA-3'、Ｌ５：3'-G
AATGGCATGTAGCTCGTTCCGTACTA-5'、 Ｕ６：5'-GGCATGATGCTGGCCAATTAAGAATT-3'、Ｌ６：3'-C
GACCGGTTAATTCTTAAGATC-5'

【００３３】Ｕ１とＬＩ、Ｕ２とＬ２、Ｕ３とＬ３、Ｕ
４とＬ４、Ｕ５とＬ５、Ｕ６とＬ６をそれぞれアニーリ
ングして、アニールしたＵ１／Ｌ１、Ｕ２／Ｌ２、Ｕ３
／Ｌ３を混合して制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）に
ＤＮＡライゲースを使用して挿入した。得られたプラス
ミドをｐＧＥＸ−ＣＶ１２３６と命名した。また、同じ
くＵ４／Ｌ４、Ｕ５／Ｌ５、Ｕ６／Ｌ６を混合して、制
限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＧＥ
Ｘ−２ＴにＤＮＡライゲースを使用して挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＵＣ−ＣＶ１２５４と命名した。

【００３４】プラスミドｐＵＣ−ＣＶ１２５４を制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断して回収した７１ｂｐの断片を先に
得られたｐＧＥＸ−ＣＶ１２３６のＥｃｏＲＩサイトに
ＤＮＡライゲースを使用して挿入した。こうして出来た
プラスミドをｐＧＥＸ−ＣＶ３６５４と命名した。この
プラスミドｐＧＥＸ−ＣＶ３６５４は、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス由来の非構造タンパク質遺伝子の一部を有して
いる。

【００３５】 実施例２ 融合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４の製造 （Ａ）融合タンパク質発現ベクターの作製 実施例１（Ａ）で作製したプラスミドｐＩＫ４ＣＥを制
限酵素ＮｄｅＩと制限酵素ＦｓｐＩで切断後、クレノウ
処理で平滑末端にし、約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をア
ガロースゲルから回収した。ｔａｃプロモーターを有す
るプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、クレノウ処理で平滑末端
にし、先に回収した０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ
ライゲースを使って挿入した。

【００３６】このプラスミドを大腸菌ＴＧ１に導入し、
出現したアンピシリン耐性の形質転換菌から挿入ＤＮＡ
が正方向（配列番号３の方向とｐＫＫ２２３−３のｔａ
ｃプロモーターの転写方向とが同一方向の場合を正方向
とする）に挿入されているプラスミドを持ったコロニー
を選択した。正方向のプラスミド（これをｐＫＫＦｓｐ
と命名）の選択は制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断した時、約０．３４ｋｂｐ断片が出現する
事で容易に選択出来る。

【００３７】このプラスミドｐＫＫＦｓｐの制限酵素Ｋ
ｐｎＩサイトに合成ＤＮＡアダプター（5'-CCTATGGCCAT
AGGGTAC-3'）を挿入して得られたプラスミドをｐＫＫＦ
ｓｐＡＤと命名した。ｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社
製）を制限酵素ＢａｌＩと制限酵素ＰｖｕＩで切断後、
約１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断
片はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子の後
半部分を含んでいる。次にｐＫＫＦｓｐＡＤを制限酵素
ＢａｌＩと制限酵素ＰｖｕＩで切断した後、約２ｋｂｐ
のＤＮＡ複製開始領域を含むＤＮＡ断片を回収した。

【００３８】先に回収した約１．４ＫｂｐのＤＮＡ断片
とこの約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、得られたプラ
スミドをｐＨＣ８３Ｚと命名した。このプラスミドｐＨ
Ｃ８３Ｚは、コアタンパク質の一部をコードする遺伝子
とＧＳＴの一部をコードする遺伝子を有している。

【００３９】さらに、ｐＨＣ８３Ｚを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉと制限酵素ＰｖｕＩで切断後、実施例１で作製したプ
ラスミドｐＧＥＸ−ＣＶ３６５４を同様に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＰｖｕＩで切断後に回収した約１．１ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を挿入して、得られたプラスミドをｐＨＣ８
３Ｚ３６５４と命名した。このプラスミドは、コアタン
パク質のエピトープをコードする遺伝子、ＧＳＴをコー
ドする遺伝子、ＮＳ４タンパク質のエピトープをコード
する遺伝子を有している。また、これらの遺伝子によっ
てコードされているタンパク質はエピトープを有してい
る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
８、５４６２−５４６６（１９９１）、特開平４−１４
９２９８号公報）。このプラスミドｐＨＣ８３Ｚ３６５
４を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた形質転換大腸
菌をＪＭ１０９／［ｐＨＣ８３Ｚ３６５４］と命名し
た。

【００４０】（Ｂ）融合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４の
発現 上記（Ａ）で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９／［ｐ
ＨＣ８３Ｚ３６５４］を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を添加したＬＢ培地１ｍｌで増やし、１ｍＭイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧ
という）で誘導し、さらに３７℃で４時間振とう培養し
た。その菌体を遠心分離で集め、レムリのバッファーに
懸濁して、１００℃で１０分間煮沸して可溶化した。そ
のライセートを１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分析した。コントロールとして実施例３
（Ａ）で作製したｐＨＣ８３Ｚで大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換した形質転換大腸菌ＪＭ１０９／［ｐＨＣ８３
Ｚ］を同様に処理した。

【００４１】電気泳動後のゲルをクマジーブリリアント
ブルーの染色液で染色後、脱色したところ、形質転換大
腸菌ＪＭ１０９／［ｐＨＣ８３Ｚ３６５４］のライセー
トでは分子量３３Ｋｄのタンパク質がメジャーバンドと
して観察された。このタンパク質はｐＨＣ８３Ｚで形質
転換した大腸菌ＪＭ１０９／［ｐＨＣ８３Ｚ］には認め
られなかった。またこのタンパク質が非Ａ非Ｂ慢性肝炎
患者の血清と特異的に反応することをイムノブロット法
で確認した。この３３Ｋｄのタンパク質をＣ８３Ｚ３６
５４と命名した。

【００４２】 （Ｃ）発現した融合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４の精製 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地８ｌ
に上記（Ｂ）で得られた形質転換大腸菌ＪＭ１０９［ｐ
ＨＣ８３Ｚ３６５４］を６６０ｎｍでの濁度が０．１５
になるように植菌した。これを３７℃で２時間振とう培
養後、１ｍＭＩＰＴＧで誘導し、さらに３７℃で４時間
振とう培養し、培養液を５，０００×Ｇで３０分間遠心
分離し、３１ｇの湿菌体を得た。これを６０ｍｌのＰＢ
Ｓ（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．８５％塩化ナ
トリウム（ｐＨ７．５））に懸濁後、フレンチプレス
（大岳製作所５６１５型、１５００ｋｇｆ／ｃｍ2）で
破砕し、１５，０００×ｇで２０分の遠心分離で沈澱を
集めた。

【００４３】次に６０ｍｌの可溶化バッファー（７Ｍ尿
素、２０ｍＭジチオスレイトール、１％トリトンＸ−１
００、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０））に懸濁し、
超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ，ｓｏｎｉｆｉｅｒＩ
Ｉ）にて分散後、室温で一晩振とうさせ、可溶画分とし
て粗タンパク質液を得た。これをＣＭ−トヨパール（東
ソー社製、６５０Ｍ）のカラム（直径２ｃｍ×高さ１６
ｃｍ）に吸着させ、６Ｍ尿素存在下で０．２−０．８Ｍ
食塩の濃度勾配（４００ｍｌ）で溶出を行い、約０．３
Ｍ食塩の濃度で目的融合タンパク質は溶出された。この
ようにして純度が９９％以上の融合タンパク質Ｃ８３Ｚ
３６５４を約１０ｍｇ得た。得られた融合タンパク質の
アミノ酸配列は、配列番号３に示す。

【００４４】実施例３ （Ａ）融合タンパク質の等電点の測定 ＡＣＩジャパン（株）製造のプリキャストゲル（リゾフ
ァインＦＳ−ＩＥＦ、ｐＨ３．５−９．５およびｐＨ９
−１１）を同社製造の泳動装置（Ｆ−ＣＥＬＬＳおよび
ハンディクール８）にセットし、実施例３（Ｃ）で精製
された融合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４（４μｇ）をゲ
ルのサンプルウエルにのせ、充分に冷却した後、定電力
３Ｗで３５分間泳動を行った。泳動後、固定、染色、脱
色を行った。コントロールとしてファルマシア社製の等
電点用キャリブレーションキット（商品コード番号１７
−０４７１−０１）を同時に泳動した。その結果、融合
タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４の等電点の測定値は６．７
であった。

【００４５】（Ｂ）融合タンパク質の非Ａ非Ｂ型肝炎に
対する特異性の検討 実施例３（Ｃ）で得られた融合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６
５４を、濃度が０．１μｇ／ｍｌとなるようにＥ緩衝液
（Ｎａ2ＣＯ3 １．６ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3２．９ｇ／
ｌ、ＮａＮ3 ０．１６ｇ／ｌ）に溶解し、その１００
μｌをＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に添加し、室温
で１時間放置した。抗原タンパク質液を捨て、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−Ｔ
ｗ２０という）で２回洗浄後、３％牛血清アルブミンを
含むＰＢＳ−Ｔｗ２０を２００μｌ加え４℃で１６時間
放置した。ＰＢＳ−Ｔｗ２０で５回洗浄後、段階希釈し
た非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清または正常人血清を１００μ
ｌ加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗ２０で
５回洗浄後、７，５００倍希釈したアルカリフォスファ
ターゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を１００
μｌ加え、室温で１時間反応させ、同様に各ウェルを洗
浄後２００μｌの基質溶液（１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロ
フェニルフォスフェート）を加え、暗所で３０分間放置
後４０５ｎｍの吸光度（Ａ405）を測定した。正常人血
清でのＡ405の平均値の２倍のＡ405をカットオフ値とし
て、それ以上の値を示した検体を陽性と判定した。陽性
血清のエンドポイント（カットオフ値となる血清の希釈
度）を希釈倍率として表１に示す。

【表１】

【００４６】以上のように正常人群では陽性者が見られ
ないのに対し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者群においては陽性率
が１００％の高率で、しかも高感度に検出できることが
わかった。これにより、本発明の融合タンパク質が非Ａ
非Ｂ型肝炎に特異的である事が示された。

【００４７】 （Ｃ）融合蛋白質を抗原とするラテックス凝集試薬 特開平１−１６３６６３号公報記載のアクリルアミド系
ラテックス粒子を２．５％のレッドバイオレットで染色
し、タンニン酸を用いて、実施例３（Ｃ）で得られた融
合タンパク質Ｃ８３Ｚ３６５４をラテックス粒子に担持
させた。このようにして得られた融合タンパク質を担持
させたラテックス粒子（以下、感作粒子という）をＰＢ
Ｓ−０．０１％サルコシネートで２回洗浄し、希釈バッ
ファー（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％サルコシネート、０．１％Ｂ
ＳＡ）で１％（ｗ／ｖ）に調整した。

【００４８】ヒツジ血球用ＰＫプレート（オリンパス光
学工業株式会社）の各ウエルに１％感作粒子を２５μｌ
加え、正常人血清または血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清を希釈バッファーで８倍に希釈したものを２５μｌ
加え、１時間室温に放置した。１時間後各ウエルの感作
粒子が凝集像の有無を観察した。その結果、血液伝播型
非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清では凝集像が見られたが、正常
人血清では凝集像が見られなかった。これにより、本発
明の融合タンパク質がラテックス凝集試薬用の抗原とし
て有用である事が示された。

【００４９】

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:570 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス 配列 ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC 48 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCA 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAG CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT 192 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC CGG 240 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Arg 65 70 75 80 TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGT CTG GGG TGG GCA GGA TGG 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTC CTG TCA CCC CGA GGC TCT CGG CCT AGT TTG TCA CCC ACG GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Leu Ser Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACA TGC 384 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 GGC TTC GGA GCC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA 432 Gly Phe Gly Ala Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 GGC ATG GGC CCC AGG GCC CTG CGG CAT GGC GTC CGG CGT CTG GAG GAC 480 Gly Met Gly Pro Arg Ala Leu Arg His Gly Val Arg Arg Leu Glu Asp 145 150 155 160 GGC GTG AAC TAC GCA ACA GGG AAT CTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC 528 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 TTC CTT CTA GCT TTG CTG TCT TGT CTG ACC ATC CCA GCT TCC 570 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 180 185 190

【００５０】

【配列表】

配列番号:2 配列の長さ:120 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GTG GTG CTG TCC GGC AAG CCG GCG ATC ATT CCG GAC CGC GAA GTC CTG 48 Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu 1 5 10 15 TAC CGC GAA TTC GAT GAG ATG GAA GAG TCC TCT CAG CAC TTA CCG TAC 96 Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Ser Ser Gln His Leu Pro Tyr 20 25 30 ATC GAG CAA GGC ATG ATG CTG GCC 120 Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala 35 40

【００５１】

【配列表】

配列番号:3 配列の長さ:846 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 Hybrid DNA 配列 ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC 48 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCA 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAG CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT 192 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC CGG 240 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Arg 65 70 75 80 TAC CCT ATG GCC ATC ATA CGT TAT ATA GCT GAC AAG CAC AAC ATG TTG 288 Tyr Pro Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu 85 90 95 GGT GGT TGT CCA AAA GAG CGT GCA GAG ATT TCA ATG CTT GAA GGA GCG 336 Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala 100 105 110 GTT TTG GAT ATT AGA TAC GGT GTT TCG AGA ATT GCA TAT AGT AAA GAC 384 Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp 115 120 125 TTT GAA ACT CTC AAA GTT GAT TTT CTT AGC AAG CTA CCT GAA ATG CTG 432 Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu 130 135 140 AAA ATG TTC GAA GAT CGT TTA TGT CAT AAA ACA TAT TTA AAT GGT GAT 480 Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp 145 150 155 160 CAT GTA ACC CAT CCT GAC TTC ATG TTG TAT GAC GCT CTT GAT GTT GTT 528 His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val 165 170 175 TTA TAC ATG GAC CCA ATG TGC CTG GAT GCG TTC CCA AAA TTA GTT TGT 576 Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys 180 185 190 TTT AAA AAA CGT ATT GAA GCT ATC CCA CAA ATT GAT AAG TAC TTG AAA 624 Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys 195 200 205 TCC AGC AAG TAT ATA GCA TGG CCT TTG CAG GGC TGG CAA GCC ACG TTT 672 Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe 210 215 220 GGT GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGT GGA TCC 720 Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser 225 230 235 240 GTG GTG CTG TCC GGC AAG CCG GCG ATC ATT CCG GAC CGC GAA GTC CTG 768 Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu 245 250 255 TAC CGC GAA TTC GAT GAG ATG GAA GAG TCC TCT CAG CAC TTA CCG TAC 816 Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Ser Ser Gln His Leu Pro Tyr 260 265 270 ATC GAG CAA GGC ATG ATG CTG GCC AAT TAA 846 Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Asn *** 275 280

【００５２】

【配列表】

配列番号:4 配列の長さ:1260 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス 配列 CAT -1 ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC 48 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCA 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAG CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT 192 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC CGG 240 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Arg 65 70 75 80 TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGT CTG GGG TGG GCA GGA TGG 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTC CTG TCA CCC CGA GGC TCT CGG CCT AGT TTG TCA CCC ACG GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Leu Ser Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACA TGC 384 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 GGC TTC GGA GCC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA 432 Gly Phe Gly Ala Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 GGC ATG GGC CCC AGG GCC CTG CGG CAT GGC GTC CGG CGT CTG GAG GAC 480 Gly Met Gly Pro Arg Ala Leu Arg His Gly Val Arg Arg Leu Glu Asp 145 150 155 160 GGC GTG AAC TAC GCA ACA GGG AAT CTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC 528 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 TTC CTT CTA GCT TTG CTG TCT TGT CTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAC 576 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr 180 185 190 GAA GTG CGC AAC GAG TCC GGG GTG TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC 624 Glu Val Arg Asn Glu Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser 195 200 205 AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAA CCC CCC 672 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met Gln Pro Pro 210 215 220 GGG TGC GTG CCC TGC ATC CGA GAG AAC AAT TCC TCC CGT TGC TGG GTG 720 Gly Cys Val Pro Cys Ile Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val 225 230 235 240 GCG CTC ACC CCC ACG CTC GCG GCC AGG AAC AAC AGC ATC CCC ACC ACG 768 Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Asn Ser Ile Pro Thr Thr 245 250 255 ACA ATA CGA CGC CAC GGA TCT TTG CTT GTT GGG GCA GCT GCT CTC TGT 816 Thr Ile Arg Arg His Gly Ser Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys 260 265 270 TCC GCT ATG TAC GTA GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTC TTC CTC GTC TCC 864 Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser 275 280 285 CAG CTG TTC ACC TTC TCA CCT CGC CGG TAT GAG ACG GTA CAA GAA TGC 912 Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln Glu Cys 290 295 300 AAC TGC TCA CTC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG GCT TGG 960 Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG 1008 Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln 325 330 335 TTA CCC GGA TCC CAC AAG CCG TCG TGG ATA TGG TGG CGG GGC CAC TGG 1056 Leu Pro Gly Ser His Lys Pro Ser Trp Ile Trp Trp Arg Gly His Trp 340 345 350 GGA GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT 1104 Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 355 360 365 AAA GTG TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGT GTT AGC GGC TCG TCT 1152 Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Ser Gly Ser Ser 370 375 380 ACC TAC ACG ACA GGG GGA CAA GTG GGT CGC CAG ACT AGT CGT CAC GGG 1200 Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Gln Val Gly Arg Gln Thr Ser Arg His Gly 385 390 395 400 GCC CTC TTC AGC CAG GGG GCG TCT CAG GAA GTC CAA CTT GTG AAT ACC 1248 Ala Leu Phe Ser Gln Gly Ala Ser Gln Glu Val Gln Leu Val Asn Thr 405 410 415 AAC GGC AGC GGG 1260 Asn Gly Ser 419

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/51 ＺＮＡ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 長内 正俊 東京都渋谷区幡ヶ谷２−43−２ オリンパ ス光学工業株式会社内 (72)発明者 森 エリコ 東京都渋谷区幡ヶ谷２−43−２ オリンパ ス光学工業株式会社内 (72)発明者 金子 恭庸 東京都渋谷区幡ヶ谷２−43−２ オリンパ ス光学工業株式会社内 (72)発明者 中村 誠 東京都渋谷区幡ヶ谷２−43−２ オリンパ ス光学工業株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液伝播型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス由来
   のコアタンパク質の少なくともエピトープを含むペプチ
   ド（Ａ）と他のタンパク質の少なくともエピトープを含
   むペプチド（Ｂ）が、酸性領域に等電点を有するキャリ
   ヤータンパク質（Ｃ）を介してつながり、等電点が６〜
   １０、分子量が２５〜１００キロダルトンである融合タ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 ペプチド（Ｂ）が非構造タンパク質ＮＳ
   ４の一部である請求項１記載の融合タンパク質。
3. 【請求項３】 コアタンパク質のエピトープと非構造タ
   ンパク質ＮＳ４のエピトープがそれぞれ配列番号１また
   は２のアミノ酸配列である請求項２記載の融合タンパク
   質。