JPH066068B2 - ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 - Google Patents
ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系Info
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- JPH066068B2 JPH066068B2 JP61043068A JP4306886A JPH066068B2 JP H066068 B2 JPH066068 B2 JP H066068B2 JP 61043068 A JP61043068 A JP 61043068A JP 4306886 A JP4306886 A JP 4306886A JP H066068 B2 JPH066068 B2 JP H066068B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトＩｇＧ２に対するモノクローナル抗体ＨＧ
２−５６Ｆ、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
および該モノクローナル抗体の製造法に関する。本発明
のモノクローナル抗体は、臨床検査薬やアフィニティク
ロマトグラフィーのリガンドとして有用である。
２−５６Ｆ、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
および該モノクローナル抗体の製造法に関する。本発明
のモノクローナル抗体は、臨床検査薬やアフィニティク
ロマトグラフィーのリガンドとして有用である。
従来の技術 ヒト血清免疫グロブリンのＩｇＧは、アミノ酸配列が多
様な可変域(variable region)とほとんど一定な定常域
(constant regin)から成っており、可変域は各種抗原に
対する結合に関与し、定常域は各種生体作用に関与して
いる。定常域でのアミノ酸配列はほとんど一定である
が、一部（５％以下）のアミノ酸残基の置換により、４
種のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩ
ｇＧ４に分類される。正常成人血清での濃度(mg/ml)
は、ＩｇＧ１が５〜１２、ＩｇＧ２が２〜６、ＩｇＧ３
が０．５〜１およびＩｇＧ４が０．２〜１である。
様な可変域(variable region)とほとんど一定な定常域
(constant regin)から成っており、可変域は各種抗原に
対する結合に関与し、定常域は各種生体作用に関与して
いる。定常域でのアミノ酸配列はほとんど一定である
が、一部（５％以下）のアミノ酸残基の置換により、４
種のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩ
ｇＧ４に分類される。正常成人血清での濃度(mg/ml)
は、ＩｇＧ１が５〜１２、ＩｇＧ２が２〜６、ＩｇＧ３
が０．５〜１およびＩｇＧ４が０．２〜１である。
ヒトＩｇＧサブクラスの物理化学的性質についての報告
例は次の通りである。（表１）。
例は次の通りである。（表１）。
ＩｇＧは電気易動度が遅く、ペプシンで分解され難い。
ＩｇＧ２はＨ鎖間のＳ−Ｓ結合が４本であり、蛋白質分
解酵素による分解に耐性である。ＩｇＧ３はヒンジ領域
にくり返し構造があるのでＨ鎖間のＳ−Ｓ結合が１１本
と多く、血清中の半減期が短く、蛋白分解酵素による作
用を受け易い。
ＩｇＧ２はＨ鎖間のＳ−Ｓ結合が４本であり、蛋白質分
解酵素による分解に耐性である。ＩｇＧ３はヒンジ領域
にくり返し構造があるのでＨ鎖間のＳ−Ｓ結合が１１本
と多く、血清中の半減期が短く、蛋白分解酵素による作
用を受け易い。
ＩｇＧ４は電気易動度が最も速い。
ヒトＩｇＧサブクラスの生物学的性質についても、報告
例を表２に示したように、サブクラスによって相異があ
る。
例を表２に示したように、サブクラスによって相異があ
る。
すなわち、ＩｇＧ４は補体C1qを結合しないし、ＩｇＧ
３にはリューマチ因子およびプロテインＡが結合しな
い。その他、ヒトまたは異種動物の細胞への結合性にも
相異がみられる。
３にはリューマチ因子およびプロテインＡが結合しな
い。その他、ヒトまたは異種動物の細胞への結合性にも
相異がみられる。
また、各種抗原に対する抗体としてのＩｇＧにも、サブ
クラス分布の偏りが報告されている（表３）。
クラス分布の偏りが報告されている（表３）。
H.L.スピーゲルバーグ(Spregelberg),アドバンシズ・イ
ン・イムノロジー(Adv.Immunol.)１９，259(1974)すな
わち、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイ
ログロブリンなどの複雑な蛋白質抗原に対するＩｇＧサ
ブクラスの分布は血清中存在比に近似しているが、デキ
ストランやテイコ酸のように炭化化物の抗原に対しては
ＩｇＧ２のみが得られており、自己抗原に対してもＩｇ
Ｇサブクラスの分布に偏りが見られる。
ン・イムノロジー(Adv.Immunol.)１９，259(1974)すな
わち、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイ
ログロブリンなどの複雑な蛋白質抗原に対するＩｇＧサ
ブクラスの分布は血清中存在比に近似しているが、デキ
ストランやテイコ酸のように炭化化物の抗原に対しては
ＩｇＧ２のみが得られており、自己抗原に対してもＩｇ
Ｇサブクラスの分布に偏りが見られる。
以上のように、ＩｇＧの各種生体作用に関与する定常域
が相異するサブクラスは、それぞれ各種生体機能や疾患
に関与していることが予想される。
が相異するサブクラスは、それぞれ各種生体機能や疾患
に関与していることが予想される。
発明が解決しようとする問題点 これまでは、いずれかのＩｇＧサブクラスに属する骨髄
腫患者血清を用いてヒトＩｇＧサブクラスの研究が行わ
れてきたが、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇＧサブ
クラスには、サブクラスとしての性質の他にそのＩｇＧ
分子に特有の性質（可変域やアロタイプ）も有している
ので、サブクラスに共通の性質だけが得られるわけでは
ない。同じことは、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇ
Ｇサブクラスを免疫して得た抗体の特異性についても言
える。そのサブクラスの特異的な抗体活性の他にものそ
可変域に特異的な抗体活性も共存している。
腫患者血清を用いてヒトＩｇＧサブクラスの研究が行わ
れてきたが、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇＧサブ
クラスには、サブクラスとしての性質の他にそのＩｇＧ
分子に特有の性質（可変域やアロタイプ）も有している
ので、サブクラスに共通の性質だけが得られるわけでは
ない。同じことは、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇ
Ｇサブクラスを免疫して得た抗体の特異性についても言
える。そのサブクラスの特異的な抗体活性の他にものそ
可変域に特異的な抗体活性も共存している。
この問題点を解決するためには、同一のＩｇＧサブクラ
スに属する骨髄腫患者血清を数多く用いることである
が、これは限られた施設にしか可能でない。ロベらによ
りモノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラス抗体［Ｊ．ロ
ベ(Lowe)ら、イムノロジー(Immunology)47,329(1982)]
が作製されているが本発明のモノクローナル抗体とは、
少なくともその反応性が異なっている。「問題点を解決
するための手段 本発明では、正常ヒトプール血清からポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス４種を得て、それを用いて各サブク
ラスに特異的なモノクローナル抗体を得ることを目的と
した。先ず、これまでに報告されてきたＩｇＧサブクラ
スの物理化学的性質の相異を最大限利用して、ヒトプー
ル血清からポリクローナルＩｇＧサブクラスを可能なか
ぎり分別し、各サブクラスがそれぞれ濃縮されたＩｇＧ
サブクラス粗製品を得る。次に、その粗製品を免疫し
て、細胞融合法によりモノクローナル抗体を多数作製し
て、各サブクラスに特に強く結合したり、或るサブクラ
スにだけ結合しないクローンを選び、それらモノクロー
ナル抗体を固相化してアフィニティーカラムを作製し、
今度は、このアフィニティーカラムを組み合せて、Ｉｇ
Ｇサブクラスを更に精製し、得られたポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス精製品を用いて、すでに得ていたモ
ノクローナル抗体のサブクラス特異性を更に厳密に検定
するという手法で、各サブクラス特有の抗原決定基を認
識するモノクローナル抗体を選別したものである。本発
明においては同一のＩｇＧサブクラスに対して数種のモ
ノクローナル抗体が得られるが、以下の実施例および参
考例で示すとおり、少なくともその反応性が異なってい
る。
スに属する骨髄腫患者血清を数多く用いることである
が、これは限られた施設にしか可能でない。ロベらによ
りモノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラス抗体［Ｊ．ロ
ベ(Lowe)ら、イムノロジー(Immunology)47,329(1982)]
が作製されているが本発明のモノクローナル抗体とは、
少なくともその反応性が異なっている。「問題点を解決
するための手段 本発明では、正常ヒトプール血清からポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス４種を得て、それを用いて各サブク
ラスに特異的なモノクローナル抗体を得ることを目的と
した。先ず、これまでに報告されてきたＩｇＧサブクラ
スの物理化学的性質の相異を最大限利用して、ヒトプー
ル血清からポリクローナルＩｇＧサブクラスを可能なか
ぎり分別し、各サブクラスがそれぞれ濃縮されたＩｇＧ
サブクラス粗製品を得る。次に、その粗製品を免疫し
て、細胞融合法によりモノクローナル抗体を多数作製し
て、各サブクラスに特に強く結合したり、或るサブクラ
スにだけ結合しないクローンを選び、それらモノクロー
ナル抗体を固相化してアフィニティーカラムを作製し、
今度は、このアフィニティーカラムを組み合せて、Ｉｇ
Ｇサブクラスを更に精製し、得られたポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス精製品を用いて、すでに得ていたモ
ノクローナル抗体のサブクラス特異性を更に厳密に検定
するという手法で、各サブクラス特有の抗原決定基を認
識するモノクローナル抗体を選別したものである。本発
明においては同一のＩｇＧサブクラスに対して数種のモ
ノクローナル抗体が得られるが、以下の実施例および参
考例で示すとおり、少なくともその反応性が異なってい
る。
今回得られたモノクローナル抗体を用いることにより、
ヒト血清中のＩｇＧサブクラスが検出できるので、臨床
検査薬として有用であり、また各種疾患とＩｇＧサブク
ラスとの関連が研究できる。更には、このモノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
りポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスを分離精製すれ
ば、それらの物理化学的および生理学的性質が更に詳し
く研究できる。
ヒト血清中のＩｇＧサブクラスが検出できるので、臨床
検査薬として有用であり、また各種疾患とＩｇＧサブク
ラスとの関連が研究できる。更には、このモノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
りポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスを分離精製すれ
ば、それらの物理化学的および生理学的性質が更に詳し
く研究できる。
1)ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス４種の分離 第１法（粗製品の調製） ヒトプール血清を塩析してγ−グロブリン画分を採る。
γ−グロブリン画分を０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH８．
０）でＤＥＡＥイオン交換カラムに通すと、ＩｇＧ４は
吸着される。ＤＥＡＥカラムの素通り画分をプロティン
Ａ−セファロースカラムに添加し、デュアメルらの方法
［R.C.デュアメル(Duhamel)ら、ザ・ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods)31,21
1(1979)]により、ポリクローナルヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ
２およびＩｇＧ３の粗製品を得る。すなわち、ポリクロ
ーナルヒトＩｇＧ３粗製品は０．１Ｍリン酸緩衝液（pH
７．０）での素通り画分として溶出され、次に、０．１
Ｍクエン酸緩衝液でpH５．０から３．０にグラジェント
溶出するとＩｇＧ１がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出さ
れる。ＩｇＧ１とＩｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で
再度クロマト溶出することにより、ポリクローナルヒト
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の粗製品を得る。ＤＥＡＥカラ
ムの吸着成分は０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）で
溶出する。ＩｇＧ４には結合しないが、他のＩｇＧサブ
クラスには全て結合するモノクローナル抗体ＨＧ２−１
９をすでに得ていた［S.ホソイ(Hosoi)ら、ザ・ジャー
ナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノ
ロジー(J.Allergy Clin.Immunol.)75,320(1985)]ので、
臭化シアン活性化セファロースに結合させて抗ヒトＩｇ
Ｇ１、２、３アフィニティーカラムを作製し、ＤＥＡＥ
カラムの吸着成分に混在するＩｇＧ４以外のサブクラス
を吸収除去して、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品を
得る。
γ−グロブリン画分を０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH８．
０）でＤＥＡＥイオン交換カラムに通すと、ＩｇＧ４は
吸着される。ＤＥＡＥカラムの素通り画分をプロティン
Ａ−セファロースカラムに添加し、デュアメルらの方法
［R.C.デュアメル(Duhamel)ら、ザ・ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods)31,21
1(1979)]により、ポリクローナルヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ
２およびＩｇＧ３の粗製品を得る。すなわち、ポリクロ
ーナルヒトＩｇＧ３粗製品は０．１Ｍリン酸緩衝液（pH
７．０）での素通り画分として溶出され、次に、０．１
Ｍクエン酸緩衝液でpH５．０から３．０にグラジェント
溶出するとＩｇＧ１がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出さ
れる。ＩｇＧ１とＩｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で
再度クロマト溶出することにより、ポリクローナルヒト
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の粗製品を得る。ＤＥＡＥカラ
ムの吸着成分は０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）で
溶出する。ＩｇＧ４には結合しないが、他のＩｇＧサブ
クラスには全て結合するモノクローナル抗体ＨＧ２−１
９をすでに得ていた［S.ホソイ(Hosoi)ら、ザ・ジャー
ナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノ
ロジー(J.Allergy Clin.Immunol.)75,320(1985)]ので、
臭化シアン活性化セファロースに結合させて抗ヒトＩｇ
Ｇ１、２、３アフィニティーカラムを作製し、ＤＥＡＥ
カラムの吸着成分に混在するＩｇＧ４以外のサブクラス
を吸収除去して、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品を
得る。
第２法（精製品の調製） ヒトＩｇＧ４にのみ反応するモノクローナル抗体、ヒト
ＩｇＧ３にのみ反応するモノクローナル抗体およびヒト
ＩｇＧ４以外のサブクラスに反応するモノクローナル抗
体をそれぞれ臭化シアン活性化セファロースに固相化し
て、それぞれ抗ヒトＩｇＧ３および抗ヒトＩｇＧ１、
２、３のアフィニティーカラムを調製する。ヒトγ−グ
ロブリン画分を０．０１Ｍリン酸緩衝液生理食塩液（pH
７．４）で抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラムに通す
と、ヒトＩｇＧ４が吸着されるので、低pH又は変性剤を
含む緩衝液で溶出させたのち、更に、抗ヒトＩｇＧ１、
２、３アフィニティーカラムを通して、ヒトＩｇＧ４以
外のサブクラスを吸着除去し、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇ４精製品を得る。抗ヒトＩｇＧ４カラムの素通り画分
を抗ヒトＩｇＧ３アフィニティーカラムに通すと、ヒト
ＩｇＧ３が吸着されるので、低pH又は変性剤を含む緩衝
液で溶出させたのち、更にプロティンＡ−セファロース
カラムに通して、ヒトＩｇＧ３以外のサブクラスを吸着
除去し、ポリクローナルヒトＩｇＧ３精製品を得る。抗
ヒトＩｇＧ３カラムの素通り画分にはヒトＩｇＧ１とＩ
ｇＧ２が含まれているので、第１法と同様にして、プロ
ティンＡ−セファロースカラムによるグラジェント溶出
を２回繰り返して。ポリクローナルヒトＩｇＧ１および
ＩｇＧ２の精製品を得る。
ＩｇＧ３にのみ反応するモノクローナル抗体およびヒト
ＩｇＧ４以外のサブクラスに反応するモノクローナル抗
体をそれぞれ臭化シアン活性化セファロースに固相化し
て、それぞれ抗ヒトＩｇＧ３および抗ヒトＩｇＧ１、
２、３のアフィニティーカラムを調製する。ヒトγ−グ
ロブリン画分を０．０１Ｍリン酸緩衝液生理食塩液（pH
７．４）で抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラムに通す
と、ヒトＩｇＧ４が吸着されるので、低pH又は変性剤を
含む緩衝液で溶出させたのち、更に、抗ヒトＩｇＧ１、
２、３アフィニティーカラムを通して、ヒトＩｇＧ４以
外のサブクラスを吸着除去し、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇ４精製品を得る。抗ヒトＩｇＧ４カラムの素通り画分
を抗ヒトＩｇＧ３アフィニティーカラムに通すと、ヒト
ＩｇＧ３が吸着されるので、低pH又は変性剤を含む緩衝
液で溶出させたのち、更にプロティンＡ−セファロース
カラムに通して、ヒトＩｇＧ３以外のサブクラスを吸着
除去し、ポリクローナルヒトＩｇＧ３精製品を得る。抗
ヒトＩｇＧ３カラムの素通り画分にはヒトＩｇＧ１とＩ
ｇＧ２が含まれているので、第１法と同様にして、プロ
ティンＡ−セファロースカラムによるグラジェント溶出
を２回繰り返して。ポリクローナルヒトＩｇＧ１および
ＩｇＧ２の精製品を得る。
2)ハイブリドーマの調製 マウス又はラット等の動物を、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇサブクラスで免疫する。免疫された動物から抗体産生
細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られたハイブ
リドーマのうち、免疫したヒトＩｇＧサブクラスに強く
反応し、他のサブクラスにはあまり反応しないハイブリ
ドーマのウエルを選択する。選択されたハイブリドーマ
をクローニングし、出現したハイブリドーマクローンに
つき、ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス４種に対す
る抗体産生能を詳しく検定し、免疫したＩｇＧサブクラ
スに対しては強く反応するが、他のサブクラスには反応
しないクローンを選択し、これを培養し、モノクローナ
ル抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞の選択等
は公知の通常の方法によって行うことが出来る。
Ｇサブクラスで免疫する。免疫された動物から抗体産生
細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られたハイブ
リドーマのうち、免疫したヒトＩｇＧサブクラスに強く
反応し、他のサブクラスにはあまり反応しないハイブリ
ドーマのウエルを選択する。選択されたハイブリドーマ
をクローニングし、出現したハイブリドーマクローンに
つき、ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス４種に対す
る抗体産生能を詳しく検定し、免疫したＩｇＧサブクラ
スに対しては強く反応するが、他のサブクラスには反応
しないクローンを選択し、これを培養し、モノクローナ
ル抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞の選択等
は公知の通常の方法によって行うことが出来る。
更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。
ーナル抗体を製造することが出来る。
先ず、マウスをポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスで
免疫する。免疫する動物はマウスに限らず、ラット等の
ネズミ科、動物又はその他の動物を使用してもよいが、
通常はマウスを用いるのが好ましい。ポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラスは熱凝集（６３°、３０分間）させ
たものを用いてもよい。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスに
ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス又はその熱凝集物
を１匹当り１００〜２００μgずつ、フロインド(Freun
d)完全アジュバントと共に腹腔内又は皮下に投与する。
約３週間後、更にポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス
又はその熱凝集物を１匹当り１０〜５０μgをミョウバ
ンアジュバンドと共に、１回又は毎日連続して２〜４
回、腹腔内又は静脈内に投与する。１〜３日後に脾臓を
摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細胞とする。
免疫する。免疫する動物はマウスに限らず、ラット等の
ネズミ科、動物又はその他の動物を使用してもよいが、
通常はマウスを用いるのが好ましい。ポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラスは熱凝集（６３°、３０分間）させ
たものを用いてもよい。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスに
ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス又はその熱凝集物
を１匹当り１００〜２００μgずつ、フロインド(Freun
d)完全アジュバントと共に腹腔内又は皮下に投与する。
約３週間後、更にポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス
又はその熱凝集物を１匹当り１０〜５０μgをミョウバ
ンアジュバンドと共に、１回又は毎日連続して２〜４
回、腹腔内又は静脈内に投与する。１〜３日後に脾臓を
摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細胞とする。
この細胞は増殖していく能力を持たないので、自己増殖
能力を有する細胞と融合させる。自己増殖能力を有する
細胞してとしては骨髄腫細胞が特に好ましい。骨髄腫細
胞としては、同種の動物のもので、抗体を産生せず、ヒ
ポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株であるのが好ましい。融合用抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを、オイ(oi)およびヘルツエンベルグ(H
erzenberg)の方法［セレクテッド・メソッズ・イン・セ
ルラー・イムノロジー(Selected Methods in Cellular
Immunology),351〜372(1980)、サンフランシスコ(San F
ransisco),W.H.フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.F
reeman and Co.)］に従って、ポリエチレングリコール
の存在下に融合させる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使
用割合は細胞数比で２：１〜１０：１とするのが好まし
い。１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
（完全ＲＰＭＩ培地）を基礎培地とし、これにヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培
地と、ヒポキサンチンおよびチミジンのみを含むＨＴ培
地を調整する。融合された細胞をＨＡＴ培地で約２週間
培養することにより、ハイブリドーマのみが選択され
る。次の約２週間はＨＴ培地で培養し、以後は、完全Ｒ
ＰＭＩ培地で培養する。
能力を有する細胞と融合させる。自己増殖能力を有する
細胞してとしては骨髄腫細胞が特に好ましい。骨髄腫細
胞としては、同種の動物のもので、抗体を産生せず、ヒ
ポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株であるのが好ましい。融合用抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを、オイ(oi)およびヘルツエンベルグ(H
erzenberg)の方法［セレクテッド・メソッズ・イン・セ
ルラー・イムノロジー(Selected Methods in Cellular
Immunology),351〜372(1980)、サンフランシスコ(San F
ransisco),W.H.フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.F
reeman and Co.)］に従って、ポリエチレングリコール
の存在下に融合させる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使
用割合は細胞数比で２：１〜１０：１とするのが好まし
い。１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
（完全ＲＰＭＩ培地）を基礎培地とし、これにヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培
地と、ヒポキサンチンおよびチミジンのみを含むＨＴ培
地を調整する。融合された細胞をＨＡＴ培地で約２週間
培養することにより、ハイブリドーマのみが選択され
る。次の約２週間はＨＴ培地で培養し、以後は、完全Ｒ
ＰＭＩ培地で培養する。
3)ハイブリドーマの選択 ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスをポリスチレン製
マイクロタイタープレートのウェルに物理吸着されて固
相化し、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。洗浄
後、酸素標識抗マウス免疫グロブリンを反応させ、洗浄
後、基質を加えて酵素活性を測定し、培養上清中の抗体
活性を求める。免疫したヒトＩｇＧサブクラスに強く反
応し、他のＩｇＧサブクラスにはあまり反応しないハイ
ブリドーマのウェルを選択する。選択されたハイブリド
ーマを限界希釈法等によってクローニングし、出現した
ハイブリドーマクローンにつき、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧサブクラス４種に対する抗体産生を更に詳しく検定
する。免疫したヒトＩｇＧサブクラスには強く反応する
が、他のサブクラスには反応しないクローンを選択す
る。
マイクロタイタープレートのウェルに物理吸着されて固
相化し、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。洗浄
後、酸素標識抗マウス免疫グロブリンを反応させ、洗浄
後、基質を加えて酵素活性を測定し、培養上清中の抗体
活性を求める。免疫したヒトＩｇＧサブクラスに強く反
応し、他のＩｇＧサブクラスにはあまり反応しないハイ
ブリドーマのウェルを選択する。選択されたハイブリド
ーマを限界希釈法等によってクローニングし、出現した
ハイブリドーマクローンにつき、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧサブクラス４種に対する抗体産生を更に詳しく検定
する。免疫したヒトＩｇＧサブクラスには強く反応する
が、他のサブクラスには反応しないクローンを選択す
る。
4)モノクローナル抗体の作製 選択したハイブリドーマをin virto培養法又はin vivo
培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。in
vitro培養法としては、例えば次のように行うことが出
来る。すなわち、ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で
増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収する。
in vivo培養法としては、例えば次のように行うことが
出来る。すなわち、あらかじめプリステンを腹腔内投与
処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６〜１０７個
のハイブリドーマを腹腔内に移植し、約３週間後に、マ
ウス腹部肥大を確めて、その腹水を採取する。
培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。in
vitro培養法としては、例えば次のように行うことが出
来る。すなわち、ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で
増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収する。
in vivo培養法としては、例えば次のように行うことが
出来る。すなわち、あらかじめプリステンを腹腔内投与
処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６〜１０７個
のハイブリドーマを腹腔内に移植し、約３週間後に、マ
ウス腹部肥大を確めて、その腹水を採取する。
実施例１ （１）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス粗製品４種
の分離 ヒトプール血清８００mlを１２％硫酸ナトリウムで３回
塩析してγ−グロブリン画分を採り、その画分をＤＥＡ
Ｅ−セファロースカラム（２．６×４０cm）に添加し、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH８．０）で素通りする成分
Ｉと、０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）で溶出され
る成分IIに分離した。成分Ｉはタンパク濃度２０mg/ml
の０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）の溶液とし、この
液５〜１０mlずつをプロティンＡ−セファロースカラム
（１．６×１０cm）に添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液
（pH７．０）での素通り画分からポリクローナルヒトＩ
ｇＧ３粗製品を得た。次に、０．１Ｍクエン酸緩衝液で
pH５．０から３．０にグラジェント溶出するとＩｇＧ１
がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出される。ＩｇＧ１とＩ
ｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で再度クロマト溶出す
ることにより、ポリクローナルヒトＩｇＧ１およびＩｇ
Ｇ２の粗製品を得た。成分IIには、ＩｇＧ４のほかにＩ
ｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３も混在しているので、
抗ヒトＩｇＧ１、２、３アフィニティーカラム（１．５
×１２cm）と通して、混在するＩｇＧ４以外のサブクラ
スを吸収除去して、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品
を得た。
の分離 ヒトプール血清８００mlを１２％硫酸ナトリウムで３回
塩析してγ−グロブリン画分を採り、その画分をＤＥＡ
Ｅ−セファロースカラム（２．６×４０cm）に添加し、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH８．０）で素通りする成分
Ｉと、０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）で溶出され
る成分IIに分離した。成分Ｉはタンパク濃度２０mg/ml
の０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）の溶液とし、この
液５〜１０mlずつをプロティンＡ−セファロースカラム
（１．６×１０cm）に添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液
（pH７．０）での素通り画分からポリクローナルヒトＩ
ｇＧ３粗製品を得た。次に、０．１Ｍクエン酸緩衝液で
pH５．０から３．０にグラジェント溶出するとＩｇＧ１
がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出される。ＩｇＧ１とＩ
ｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で再度クロマト溶出す
ることにより、ポリクローナルヒトＩｇＧ１およびＩｇ
Ｇ２の粗製品を得た。成分IIには、ＩｇＧ４のほかにＩ
ｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３も混在しているので、
抗ヒトＩｇＧ１、２、３アフィニティーカラム（１．５
×１２cm）と通して、混在するＩｇＧ４以外のサブクラ
スを吸収除去して、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品
を得た。
得られた４種のポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス粗
製品について、ノルディック(Nordic)社のブタ抗ヒトＩ
ｇＧサブクラスを用いた免疫二重拡散法を行い、サブク
ラスを同定し、サブクラスの純度を確認した。
製品について、ノルディック(Nordic)社のブタ抗ヒトＩ
ｇＧサブクラスを用いた免疫二重拡散法を行い、サブク
ラスを同定し、サブクラスの純度を確認した。
（２）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に、それぞれ１６０
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ１粗製品をフロインド
完全アジュバントとともに腹腔内投与し、３週間後に、
更に２０μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ１粗製品をミ
ョウバン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ１粗製品をフロインド
完全アジュバントとともに腹腔内投与し、３週間後に、
更に２０μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ１粗製品をミ
ョウバン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
（３）細胞融合 最終免疫の翌日に、３匹の脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地
を用いて細胞浮遊液を調製した。この３×１０８個の脾
細胞と９×１０７個の骨髄腫細胞ＮＳ−１とを混合し、
遠沈後、沈渣に５０％ポリエチレングリコール（平均分
子量４０００）１mlをゆるやかに攪拌しながら加え、更
に１分間攪拌した。ＲＰＭＩ培地１mlを１分間を要して
加え、同じく１mlを追加した後、更に７mlを３分間を要
して加えた。遠沈後、沈渣を１５％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）６０mlに浮遊させ、
９６穴マイクロ培養プレート６枚の各ウエルに０．１ml
ずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養し
た。２４時間後、ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプ
テリン０．４μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭ
Ｉ培地（ＨＡＴ培地）を０．１ml加える。培養開始後、
２、３、５および８日目に、培養上清０．１mlを捨て、
ＨＡＴ培地０．１mlを加えた。１１および１４日目に、
培養上清０．０１mlを捨て、ヒポキサンチン１００μ
Ｍ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培
地）０．１mlを加えた。計５７６ウェルの全てのウェル
からハイブリドーマのコロニーが出現した。
を用いて細胞浮遊液を調製した。この３×１０８個の脾
細胞と９×１０７個の骨髄腫細胞ＮＳ−１とを混合し、
遠沈後、沈渣に５０％ポリエチレングリコール（平均分
子量４０００）１mlをゆるやかに攪拌しながら加え、更
に１分間攪拌した。ＲＰＭＩ培地１mlを１分間を要して
加え、同じく１mlを追加した後、更に７mlを３分間を要
して加えた。遠沈後、沈渣を１５％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）６０mlに浮遊させ、
９６穴マイクロ培養プレート６枚の各ウエルに０．１ml
ずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養し
た。２４時間後、ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプ
テリン０．４μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭ
Ｉ培地（ＨＡＴ培地）を０．１ml加える。培養開始後、
２、３、５および８日目に、培養上清０．１mlを捨て、
ＨＡＴ培地０．１mlを加えた。１１および１４日目に、
培養上清０．０１mlを捨て、ヒポキサンチン１００μ
Ｍ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培
地）０．１mlを加えた。計５７６ウェルの全てのウェル
からハイブリドーマのコロニーが出現した。
（４）ハイブリドーマの選択 ウェル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養
し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のように
して検出した。
し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のように
して検出した。
ポリスチレン製マイクロタイタープレート ［Immulon2,ダイナテック(Dynatech)社］の各ウェル
に、ポリクローナルＩｇＧ１粗製品を０．０５Ｍ炭酸緩
衝液（pH９．１）にとかした溶液（１０μｇ／ml）５０
μｌを入れ、３７℃で１時間放置した後、１０％ウシ胎
児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．４）１０
０μｌを加え、３７℃で２０分間ブロックした。０．０
５％ツイーン２０を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（pH７．
４）で洗浄し、粗ＩｇＧ１固相ウェルを作製した。粗Ｉ
ｇＧ１固相ウェルに、培養上清５０μｌを加え、３７℃
で１時間インキュベートした。上記と同様に洗浄後、第
２抗体として、ヒトＩｇＧとは反応しない西洋ワサビベ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体
５０μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートした。
同様に洗浄後、１．１％過酸化水素水と１５０μｇ／ml
のアジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルフォン酸）（ＡＢＴＳ）を含む５０mMクエン酸緩衝液
（pH４．５）５０μｌを加え、２５℃で３０分間発色さ
せた。停止液として２mMナトリウムアジドを５０μｌ加
え、４５０nmの吸光度をマイクロプレート用の分光光度
計により測定し、０．５以上の吸光度のあるハイブリド
ーマ計１３７ウェルを選択した。
に、ポリクローナルＩｇＧ１粗製品を０．０５Ｍ炭酸緩
衝液（pH９．１）にとかした溶液（１０μｇ／ml）５０
μｌを入れ、３７℃で１時間放置した後、１０％ウシ胎
児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．４）１０
０μｌを加え、３７℃で２０分間ブロックした。０．０
５％ツイーン２０を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（pH７．
４）で洗浄し、粗ＩｇＧ１固相ウェルを作製した。粗Ｉ
ｇＧ１固相ウェルに、培養上清５０μｌを加え、３７℃
で１時間インキュベートした。上記と同様に洗浄後、第
２抗体として、ヒトＩｇＧとは反応しない西洋ワサビベ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体
５０μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートした。
同様に洗浄後、１．１％過酸化水素水と１５０μｇ／ml
のアジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルフォン酸）（ＡＢＴＳ）を含む５０mMクエン酸緩衝液
（pH４．５）５０μｌを加え、２５℃で３０分間発色さ
せた。停止液として２mMナトリウムアジドを５０μｌ加
え、４５０nmの吸光度をマイクロプレート用の分光光度
計により測定し、０．５以上の吸光度のあるハイブリド
ーマ計１３７ウェルを選択した。
粗ＩｇＧ１に対して抗体産生を行っているハイブリドー
マについて、他のＩｇＧサプクラスに対する反応の有無
を、上記と同様にＥＬＥＳＡ法で調べた。すなわち、ポ
リクローナルヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の
粗製品を同様にマイクロタイタープレートのウェルに固
相化して、それぞれのサブクラス固相ウェルを作製し、
ハイブリドーマ培養上清の反応を調べた。その結果、粗
ＩｇＧ１に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応
しないハイブリドーマ５ウェルを選択した。選択された
ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、出
現したハイブリドーマクローンの培養上清につき、実施
例７で得るポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品
４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ法で検定した。
マについて、他のＩｇＧサプクラスに対する反応の有無
を、上記と同様にＥＬＥＳＡ法で調べた。すなわち、ポ
リクローナルヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の
粗製品を同様にマイクロタイタープレートのウェルに固
相化して、それぞれのサブクラス固相ウェルを作製し、
ハイブリドーマ培養上清の反応を調べた。その結果、粗
ＩｇＧ１に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応
しないハイブリドーマ５ウェルを選択した。選択された
ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、出
現したハイブリドーマクローンの培養上清につき、実施
例７で得るポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品
４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ法で検定した。
このようにして、ヒトＩｇＧ１とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが２クローン得られ、それぞれの
モノクローナル抗体をＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６
Ｄと命名した。
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが２クローン得られ、それぞれの
モノクローナル抗体をＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６
Ｄと命名した。
（５）モノクローナル抗体の作製 （ａ）in vitro培養法 ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（１×１
０６個／ml）になるまで培養し、その培養上清を回収し
た。
０６個／ml）になるまで培養し、その培養上清を回収し
た。
（ｂ）in vivo培養法 あらかじめプリステン０．５mlで腹腔内投与処理したＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６個のハイブリドーマを
腹腔内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確
めて、その腹水を採取した。
ＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６個のハイブリドーマを
腹腔内に移植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確
めて、その腹水を採取した。
（６）モノクローナル抗体ＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−
１６Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 in vitro培養法により得たモノクローナル抗体ＨＧ１−
１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄについて、実施例７で得るポ
リクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種に対する
反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示すよう
に、ＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄのモノクローナ
ル抗体はヒトＩｇＧ１には反応するが、他のＩｇＧサブ
クラスには反応しなかった。
１６Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 in vitro培養法により得たモノクローナル抗体ＨＧ１−
１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄについて、実施例７で得るポ
リクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種に対する
反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示すよう
に、ＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄのモノクローナ
ル抗体はヒトＩｇＧ１には反応するが、他のＩｇＧサブ
クラスには反応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 マイルス(Miles)社の家兎抗マウスＩｇＧ１、家兎抗マ
ウスＩｇＧ２ａ、家兎抗マウスＩｇＧ２ｂ、家兎抗マウ
スＩｇＧ３、家兎抗マウスＩｇＧＭ、家兎抗マウスＩｇ
Ａ、家兎抗マウスＬ（ｋ）鎖、家兎抗マウスＬ（λ）鎖
を用いた免疫二重拡散法を行った。モノクローナル抗体
ＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６ＤはいずれもマウスＩ
ｇＧ１（ｋ）に属した。
ウスＩｇＧ２ａ、家兎抗マウスＩｇＧ２ｂ、家兎抗マウ
スＩｇＧ３、家兎抗マウスＩｇＧＭ、家兎抗マウスＩｇ
Ａ、家兎抗マウスＬ（ｋ）鎖、家兎抗マウスＬ（λ）鎖
を用いた免疫二重拡散法を行った。モノクローナル抗体
ＨＧ１−１ＥおよびＨＧ１−１６ＤはいずれもマウスＩ
ｇＧ１（ｋ）に属した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 in vitro培養法により得たモノクローナル抗体ＨＧ１−
１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄについて各種動物ＩｇＧに対
する反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。モノ
クローナル抗体ＨＧ１−１Ｅは、ブタ、イヌおよびサル
のＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ヤギ、
ヒツジ、ネコ、ウサギおよびラットのＩｇＧには反応し
なかった。モノクローナル抗体ＨＧ１−１６Ｄは、サル
のＩｇＧに対しては反応するが、ニワトリ、ウシ、ブ
タ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギおよびラットの
ＩｇＧに反応しなかった。
１ＥおよびＨＧ１−１６Ｄについて各種動物ＩｇＧに対
する反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。モノ
クローナル抗体ＨＧ１−１Ｅは、ブタ、イヌおよびサル
のＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ヤギ、
ヒツジ、ネコ、ウサギおよびラットのＩｇＧには反応し
なかった。モノクローナル抗体ＨＧ１−１６Ｄは、サル
のＩｇＧに対しては反応するが、ニワトリ、ウシ、ブ
タ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギおよびラットの
ＩｇＧに反応しなかった。
実施例２ （１）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ２００
μｇの熱凝集（６３℃、３０分間）させたポリクローナ
ルヒトＩｇＧ２粗製品をフロインド完全アジュバントと
ともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２０μｇの熱凝
集させたポリクローナルヒトＩｇＧ２粗製品をミョウバ
ン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
μｇの熱凝集（６３℃、３０分間）させたポリクローナ
ルヒトＩｇＧ２粗製品をフロインド完全アジュバントと
ともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２０μｇの熱凝
集させたポリクローナルヒトＩｇＧ２粗製品をミョウバ
ン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
（２）細胞融合 実施例１において、３匹の脾細胞３×１０８個と９×１
０７個のＮＳ−１を融合した代りに、２匹の脾細胞２×
１０８個と６×１０７個のＮＳ−１を融合させたこと、
完全ＲＰＭＩ培地６０mlの浮遊液をプレート６枚に接種
した代りに、４０mlの浮遊液をプレート４枚に接種した
以外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行った。計
３８４ウェルの中の２１１ウェルからハイブリドーマの
コロニーが出現した。
０７個のＮＳ−１を融合した代りに、２匹の脾細胞２×
１０８個と６×１０７個のＮＳ−１を融合させたこと、
完全ＲＰＭＩ培地６０mlの浮遊液をプレート６枚に接種
した代りに、４０mlの浮遊液をプレート４枚に接種した
以外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行った。計
３８４ウェルの中の２１１ウェルからハイブリドーマの
コロニーが出現した。
（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクローナルヒトＩｇＧ２粗
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ２に対して抗体を産生してい
るハイブリードーマ計２０ウエルを選択し、更に、粗Ｉ
ｇＧ２に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ５ウェルを選択した。次に実施例１
と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界希
釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧ
サブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ
法で検定した。
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ２に対して抗体を産生してい
るハイブリードーマ計２０ウエルを選択し、更に、粗Ｉ
ｇＧ２に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ５ウェルを選択した。次に実施例１
と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界希
釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧ
サブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ
法で検定した。
このようにして、ヒトＩｇＧ２とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが３クローン得られ、それぞれの
モノクローナル抗体をＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０Ｆお
よびＨＧ２−５６Ｆと命名した。
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが３クローン得られ、それぞれの
モノクローナル抗体をＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０Ｆお
よびＨＧ２−５６Ｆと命名した。
（４）モノクローナル抗体の作製 in vitroおよびin vivo培養法によるモノクローナル抗
体の作製を実施例１と同様にして行った。
体の作製を実施例１と同様にして行った。
（５）モノクローナル抗体ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０
ＦおよびＨＧ２−５６Ｆの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦおよびＨＧ２
−５６Ｆのモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ２には反
応するが、他のＩｇＧサブクラスには反応しなかった。
ＦおよびＨＧ２−５６Ｆの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦおよびＨＧ２
−５６Ｆのモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ２には反
応するが、他のＩｇＧサブクラスには反応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦおよびＨＧ
２−５６ＦはいずれもマウスＩｇＧ１（ｋ）に属した。
ローナル抗体ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦおよびＨＧ
２−５６ＦはいずれもマウスＩｇＧ１（ｋ）に属した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。
モノクローナル抗体ＨＧ２−６ＡおよびＨＧ２−５６Ｆ
は、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イ
ヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには反応しなか
った。モノクローナル抗体ＨＧ２−３０Ｆは、ヤギおよ
びヒツジのＩｇＧに対して反応するが、ヤギおよびヒツ
ジのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ブ
タ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧに
は反応しなかった。
モノクローナル抗体ＨＧ２−６ＡおよびＨＧ２−５６Ｆ
は、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イ
ヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには反応しなか
った。モノクローナル抗体ＨＧ２−３０Ｆは、ヤギおよ
びヒツジのＩｇＧに対して反応するが、ヤギおよびヒツ
ジのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ブ
タ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧに
は反応しなかった。
実施例３ （１）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹に、１６０μｇのポ
リクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をフロイド完全アジュ
バンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２０μ
ｇポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をミョウバン沈降
懸濁液として腹腔内に投与した。
リクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をフロイド完全アジュ
バンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２０μ
ｇポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をミョウバン沈降
懸濁液として腹腔内に投与した。
（２）細胞融合 実施例１において、最終免疫の翌日に、３匹の脾細胞３
×１０８個と９×１０７個のＮＳ−１を融合した代り
に、最終免疫の３日後に、１匹の脾細胞１×１０８個と
３×１０７個のＮＳ−１を融合させたことと、完全ＲＰ
ＭＩ培地６０μｌの浮遊液をプレート６枚に接種した代
りに、２０mlの浮遊液をプレート２枚に接種した以外は
実施例１と全く同様にして細胞融合を行った。計１９８
ウェル中の９８ウェルからハイブリドーマのコロニーが
出現した。
×１０８個と９×１０７個のＮＳ−１を融合した代り
に、最終免疫の３日後に、１匹の脾細胞１×１０８個と
３×１０７個のＮＳ−１を融合させたことと、完全ＲＰ
ＭＩ培地６０μｌの浮遊液をプレート６枚に接種した代
りに、２０mlの浮遊液をプレート２枚に接種した以外は
実施例１と全く同様にして細胞融合を行った。計１９８
ウェル中の９８ウェルからハイブリドーマのコロニーが
出現した。
（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクローナルヒトＩｇＧ３粗
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ３に対して抗体を産生してい
るハイブリドーマ計１５ウェルを選択し、更に、粗Ｉｇ
Ｇ３に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応しな
いハイブリドーマ３ウェルを選択した。次に実施例１と
全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧサ
ブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ法
で検定した。
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ３に対して抗体を産生してい
るハイブリドーマ計１５ウェルを選択し、更に、粗Ｉｇ
Ｇ３に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応しな
いハイブリドーマ３ウェルを選択した。次に実施例１と
全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧサ
ブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ法
で検定した。
このようにして、ヒトＩｇＧ３とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスは反応しないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノクロ
ーナル抗体をＨＧ３−７Ｃと命名した。
ｇＧサブクラスは反応しないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノクロ
ーナル抗体をＨＧ３−７Ｃと命名した。
（４）モノクローナル抗体の作製 in vitroおよびin vivo培養法によるモノクローナル抗
体の作製を実施例１と同様にして行った。
体の作製を実施例１と同様にして行った。
（５）モノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ３−７Ｃのモノクローナル抗体は、ヒト
ＩｇＧ３には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
すように、ＨＧ３−７Ｃのモノクローナル抗体は、ヒト
ＩｇＧ３には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ３−７ＣはマウスＩｇＧ１（ｋ）に属
した。
ローナル抗体ＨＧ３−７ＣはマウスＩｇＧ１（ｋ）に属
した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。
モノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃは、ネコおよびイヌの
ＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤ
ギ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには反
応しなかった。
モノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃは、ネコおよびイヌの
ＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤ
ギ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには反
応しなかった。
実施例４ （１）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹に、それぞれ１６０
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をフロイド完
全アジュバンドトともに腹腔内投与し、３週間後に、更
に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をミョウ
バン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をフロイド完
全アジュバンドトともに腹腔内投与し、３週間後に、更
に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ３粗製品をミョウ
バン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
（２）細胞融合 実施例１と全く同様に細胞融合を行い、計５７６ウェル
中の５０４ウェルからハイブリドーマのコロニーが出現
した。
中の５０４ウェルからハイブリドーマのコロニーが出現
した。
（３）ハイブリドーマの選択 実施例３と全く同様にハイブリドーマの選択を行い、ヒ
トＩｇＧ３とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マが４クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗体
をＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−４５Ｂおよ
びＨＧ３−４９Ｄと命名した。
トＩｇＧ３とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マが４クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗体
をＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−４５Ｂおよ
びＨＧ３−４９Ｄと命名した。
（４）モノクローナル抗体の作製 in vitroおよびin vivo培養法によるモノクローナル抗
体の作製を実施例１と同様にして行った。
体の作製を実施例１と同様にして行った。
（５）モノクローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２
Ｃ、ＨＧ３−４５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラトとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−４
５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄのモノクローナル抗体はヒト
ＩｇＧ３には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
Ｃ、ＨＧ３−４５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラトとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−４
５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄのモノクローナル抗体はヒト
ＩｇＧ３には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−
４５ＢおよびＨＧ３−４９ＤはいずれもマウスＩｇＧ１
（ｋ）に属した。
ローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−
４５ＢおよびＨＧ３−４９ＤはいずれもマウスＩｇＧ１
（ｋ）に属した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。
モノクローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、Ｈ
Ｇ３−４５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄは、ニワトリ、ウ
シ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット
およびサルのＩｇＧには反応しなかった。
モノクローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、Ｈ
Ｇ３−４５ＢおよびＨＧ３−４９Ｄは、ニワトリ、ウ
シ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット
およびサルのＩｇＧには反応しなかった。
実施例５ （１）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹に、それぞれ１７５
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をフロイド完
全アジュバンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、更
に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をミョウ
バン沈降懸濁液として腹腔内に４日連続投与した。
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をフロイド完
全アジュバンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、更
に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をミョウ
バン沈降懸濁液として腹腔内に４日連続投与した。
（２）細胞融合 実施例２と全く同様に細胞融合を行い、計３８４ウェル
の全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが出現し
た。
の全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが出現し
た。
（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ４に対して抗体を産生してい
るハイブリドーマ計２３３ウェルを選択し、更に、粗Ｉ
ｇＧ４に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ３ウェルを選択した。次に、実施例
１と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界
希釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇサブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳ
Ａ法で検定した。
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗ＩｇＧ４に対して抗体を産生してい
るハイブリドーマ計２３３ウェルを選択し、更に、粗Ｉ
ｇＧ４に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ３ウェルを選択した。次に、実施例
１と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界
希釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇサブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳ
Ａ法で検定した。
このようにして、ヒトＩｇＧとは反応するが、他のＩｇ
Ｇサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノクロ
ーナル抗体をＨＧ４−３Ｆと命名した。
Ｇサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノクロ
ーナル抗体をＨＧ４−３Ｆと命名した。
（４）モノクローナル抗体の作製 in vitroおよびin vivo培養法によるモノクローナル抗
体の作製を実施例１と同様にして行った。
体の作製を実施例１と同様にして行った。
（５）モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ４−３Ｆのモノクローナル抗体は、ヒト
ＩｇＧ４には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
すように、ＨＧ４−３Ｆのモノクローナル抗体は、ヒト
ＩｇＧ４には反応するが、他のＩｇＧサブクラスには反
応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ４−３ＦはマウスＩｇＧ１（ｋ）に属
した。
ローナル抗体ＨＧ４−３ＦはマウスＩｇＧ１（ｋ）に属
した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。
モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆは、ブタおよびサルの
ＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧ
には反応しなかった。
モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆは、ブタおよびサルの
ＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧ
には反応しなかった。
実施例６ （１）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に、それぞれ１７５
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をフロインド
完全アジュバンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、
更に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をミョ
ウバン沈降懸濁液として腹腔内に投与した。
μｇのポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をフロインド
完全アジュバンドとともに腹腔内投与し、３週間後に、
更に２０μｇポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品をミョ
ウバン沈降懸濁液として腹腔内に投与した。
（２）細胞融合 実施例１において、最終免疫の翌日の代りに３日後に脾
臓を摘出した以外は実施例１と全く同様に細胞融合を行
った。計５７６ウェル中の３２０ウェルからハイブリド
ーマのコロニーが出現した。
臓を摘出した以外は実施例１と全く同様に細胞融合を行
った。計５７６ウェル中の３２０ウェルからハイブリド
ーマのコロニーが出現した。
（３）ハイブリドーマの選択 実施例５と全く同様にハイブリドーマの選択を行い、ヒ
トＩｇＧ４とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マが２クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗体
をＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂと命名した。
トＩｇＧ４とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マが２クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗体
をＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂと命名した。
（４）モノクローナル抗体の作製 in vitroおよびin vivo培養法によるモノクローナル抗
体の作製を実施例１と同様にして行った。
体の作製を実施例１と同様にして行った。
（５）モノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４
−３８Ｂの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂのモノ
クローナル抗体は、ヒトＩｇＧ４には反応するが、他の
ＩｇＧサブクラスには反応しなかった。
−３８Ｂの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた。表４に示
すように、ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂのモノ
クローナル抗体は、ヒトＩｇＧ４には反応するが、他の
ＩｇＧサブクラスには反応しなかった。
（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂはマ
ウスＩｇＧ１（ｋ）に属した。
ローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８Ｂはマ
ウスＩｇＧ１（ｋ）に属した。
（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。
モノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８
Ｂは、ブタのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよび
サルのＩｇＧには反応しなかった。
モノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ４−３８
Ｂは、ブタのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよび
サルのＩｇＧには反応しなかった。
実施例７ （１）抗ＩｇＧサブクラスアフィニティーカラムの調製 ヒトＩｇＧ４とは反応するが他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体ＨＧ４−５３Ｇ［特願昭
６０−１２７８４４］、ヒトＩｇＧ３とは反応するが他
のＩｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体
ＨＧ３−７ＣおよびヒトＩｇＧ４には反応しないが他の
ＩｇＧサブクラスとは反応するモノクローナル抗体ＨＧ
３−１３Ｆ（実施例３で別に得られた）を、ぞれぞれ臭
化シアン活性化セファロース（ファルマシア社）に加え
て固相化した。いずれもセファロース１ml当りに５mgの
モノクローナル抗体を反応させた。得られたモノクロー
ナル抗体固相化セファロースをカラムに充填し、それぞ
れ抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラム、抗ヒトＩｇＧ
３アフィニティーカラムおよび抗ヒトＩｇＧ１、２、３
アフィニティーカラムを調製した。
反応しないモノクローナル抗体ＨＧ４−５３Ｇ［特願昭
６０−１２７８４４］、ヒトＩｇＧ３とは反応するが他
のＩｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体
ＨＧ３−７ＣおよびヒトＩｇＧ４には反応しないが他の
ＩｇＧサブクラスとは反応するモノクローナル抗体ＨＧ
３−１３Ｆ（実施例３で別に得られた）を、ぞれぞれ臭
化シアン活性化セファロース（ファルマシア社）に加え
て固相化した。いずれもセファロース１ml当りに５mgの
モノクローナル抗体を反応させた。得られたモノクロー
ナル抗体固相化セファロースをカラムに充填し、それぞ
れ抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラム、抗ヒトＩｇＧ
３アフィニティーカラムおよび抗ヒトＩｇＧ１、２、３
アフィニティーカラムを調製した。
（２）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種
の調製 ヒトγ−グロブリン(Cohn Fr．II)２０ｇを０．０１Ｍ
リン酸緩衝生理食塩液（pH７．４）２００mlに溶かした
液につき、先ず、抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラム
（２．５×９．５cm）を通して、吸着成分を３Ｍチオシ
アン酸カリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液
（pH７．４）で溶出し、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩
液（pH７．４）で透析したあと、抗ヒトＩｇＧ１、２、
３アフィニティーカラム（２．５×６．０cm）を通し
て、素通り画分にポリクローナルヒトＩｇＧ４精製品を
７３mg得た。次に、抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラ
ムの素通り画分につき、抗ヒトＩｇＧ３アフィニティー
カラム（２．５×６．５cm）を通して、吸着成分を３Ｍ
チオシアン酸カリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩液（pH７．４）で溶出し、０．０１Ｍリン酸緩衝生
理食塩液（pH７．４）で透析したあと、プロティンＡ−
セファロースカラム（ファルマシア社、２．５×１４．
５cm）を通して、素通り画分に、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧ３精製品を５３mg得た。抗ヒトＩｇＧ３アフィニテ
ィーカラムの素通り画分は、更に、抗ヒトＩｇＧ４アフ
ィニティーカラムと抗ヒトＩｇＧ３アフィニティーカラ
ムを素通りさせ、ポリクローナルヒトＩｇＧとＩｇＧ２
の混合物１７．５ｇを得た。この混合物５００μｇをプ
ロティンＡ−セファロースカラムに添加し、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７．０）を通したあと、０．１Ｍクエン
酸緩衝液でpH５．０から３．０にグラジェント溶出する
とＩｇＧ１がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出される。Ｉ
ｇＧ１とＩｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で再度クロ
マト溶出することにより、ポリクローナルヒトＩｇＧ１
およびＩｇＧ２の精製品をそれぞれ３５５および５３mg
得た。
の調製 ヒトγ−グロブリン(Cohn Fr．II)２０ｇを０．０１Ｍ
リン酸緩衝生理食塩液（pH７．４）２００mlに溶かした
液につき、先ず、抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラム
（２．５×９．５cm）を通して、吸着成分を３Ｍチオシ
アン酸カリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液
（pH７．４）で溶出し、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩
液（pH７．４）で透析したあと、抗ヒトＩｇＧ１、２、
３アフィニティーカラム（２．５×６．０cm）を通し
て、素通り画分にポリクローナルヒトＩｇＧ４精製品を
７３mg得た。次に、抗ヒトＩｇＧ４アフィニティーカラ
ムの素通り画分につき、抗ヒトＩｇＧ３アフィニティー
カラム（２．５×６．５cm）を通して、吸着成分を３Ｍ
チオシアン酸カリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩液（pH７．４）で溶出し、０．０１Ｍリン酸緩衝生
理食塩液（pH７．４）で透析したあと、プロティンＡ−
セファロースカラム（ファルマシア社、２．５×１４．
５cm）を通して、素通り画分に、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧ３精製品を５３mg得た。抗ヒトＩｇＧ３アフィニテ
ィーカラムの素通り画分は、更に、抗ヒトＩｇＧ４アフ
ィニティーカラムと抗ヒトＩｇＧ３アフィニティーカラ
ムを素通りさせ、ポリクローナルヒトＩｇＧとＩｇＧ２
の混合物１７．５ｇを得た。この混合物５００μｇをプ
ロティンＡ−セファロースカラムに添加し、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７．０）を通したあと、０．１Ｍクエン
酸緩衝液でpH５．０から３．０にグラジェント溶出する
とＩｇＧ１がＩｇＧ２よりも少し遅れて溶出される。Ｉ
ｇＧ１とＩｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条件で再度クロ
マト溶出することにより、ポリクローナルヒトＩｇＧ１
およびＩｇＧ２の精製品をそれぞれ３５５および５３mg
得た。
（３）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種
の評価 得られたポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４
種について、ノルディック(Nordic)社のヒツジ抗ヒトＩ
ｇＧサブクラス４種およびブタ抗ヒトＩｇＧサブクラス
４種並びにマイルス(Miles)社とセロテック(Serotec)社
のヒツジ抗ヒトＩｇＧ１およびヒツジ抗ヒトＩｇＧ２を
用いた免疫二重拡散法を行い、それぞれ対応するサブク
ラス抗体との間に沈降線の生成を認めた。このとき、寒
天プレートはディフコ(Difco)社のAgar Noble１．２％
であり、２％ポリエチレングリコール（平均分子量４０
００）が含まれている。
の評価 得られたポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４
種について、ノルディック(Nordic)社のヒツジ抗ヒトＩ
ｇＧサブクラス４種およびブタ抗ヒトＩｇＧサブクラス
４種並びにマイルス(Miles)社とセロテック(Serotec)社
のヒツジ抗ヒトＩｇＧ１およびヒツジ抗ヒトＩｇＧ２を
用いた免疫二重拡散法を行い、それぞれ対応するサブク
ラス抗体との間に沈降線の生成を認めた。このとき、寒
天プレートはディフコ(Difco)社のAgar Noble１．２％
であり、２％ポリエチレングリコール（平均分子量４０
００）が含まれている。
ロべらが作製したモノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラ
ス［Ｊ．ロベ(Lowe)ら、イムノロジー(Immunology)47,3
29(1982)］のうち、ライマーらが多数のミエローマ血清
由来ヒトＩｇＧサブクラスを用いて各サブクラスに対す
る反応特異性を確証したモノクローナル抗体４種［Ｃ．
Ｂ．ライマー(Reimer)ら、ハイブリドーマ (Hybridoma)3,263(1984)］ユニバス (Unipath)社から購入し、ポリクローナルヒトＩｇＧサ
ブクラス精製品４種の評価に用いた。ポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス精製品を１０μｇ／mlまたは２μｇ
／ml濃度でマイクロタイマープレートのウェルに固相化
し、各モノクローナル抗体の腹水をそれぞれ至適倍数に
希釈して反応させた後、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法
で評価した。表６に示すように、各ポリクローナルヒト
ＩｇＧサブクラス精製品はそれぞれ対応するモノクロー
ナル抗ヒトＩｇＧサブクラスと特に強く反応し、他のサ
ブクラスに対するモノクローナル抗体との反応は充分に
小さかった。
ス［Ｊ．ロベ(Lowe)ら、イムノロジー(Immunology)47,3
29(1982)］のうち、ライマーらが多数のミエローマ血清
由来ヒトＩｇＧサブクラスを用いて各サブクラスに対す
る反応特異性を確証したモノクローナル抗体４種［Ｃ．
Ｂ．ライマー(Reimer)ら、ハイブリドーマ (Hybridoma)3,263(1984)］ユニバス (Unipath)社から購入し、ポリクローナルヒトＩｇＧサ
ブクラス精製品４種の評価に用いた。ポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス精製品を１０μｇ／mlまたは２μｇ
／ml濃度でマイクロタイマープレートのウェルに固相化
し、各モノクローナル抗体の腹水をそれぞれ至適倍数に
希釈して反応させた後、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法
で評価した。表６に示すように、各ポリクローナルヒト
ＩｇＧサブクラス精製品はそれぞれ対応するモノクロー
ナル抗ヒトＩｇＧサブクラスと特に強く反応し、他のサ
ブクラスに対するモノクローナル抗体との反応は充分に
小さかった。
更に、マイルス(Miles)社の定量用免疫拡散キット「ヒ
トＩｇＧサブクラス」を用いて、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧサブクラスを定量した結果、ヒトＩｇＧ１は９０
％、ヒトＩｇＧ２は１０８％、ヒトＩｇＧ３は１００
％、ヒトＩｇＧ４は８５％であり、いずれも１００％に
近似していた。
トＩｇＧサブクラス」を用いて、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧサブクラスを定量した結果、ヒトＩｇＧ１は９０
％、ヒトＩｇＧ２は１０８％、ヒトＩｇＧ３は１００
％、ヒトＩｇＧ４は８５％であり、いずれも１００％に
近似していた。
参考例１ ユニバス社製モノクローナル抗体の動物ＩｇＧに対する
反応性 実施例１に準じて、ＪＬ−５１２腹水を１０００倍、Ｇ
ＯＭ１腹水を２７００倍、ＺＧ４腹水を８１００倍、Ｒ
Ｊ４腹水を８１００倍に希釈したものについてＥＬＩＳ
Ａ法により、動物ＩｇＧに対する反応性を調べた。その
結果を表７に示す。
反応性 実施例１に準じて、ＪＬ−５１２腹水を１０００倍、Ｇ
ＯＭ１腹水を２７００倍、ＺＧ４腹水を８１００倍、Ｒ
Ｊ４腹水を８１００倍に希釈したものについてＥＬＩＳ
Ａ法により、動物ＩｇＧに対する反応性を調べた。その
結果を表７に示す。
参考例２ ａ）固相ヒトＩｇＧサブクラスに対する親和定数ポリス
チレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに、ポリ
クローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種をそれぞれ
０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．１）に溶かした溶液（２
μｇ／ml）５０μｌを入れ、３７℃で１時間放置した
後、１０％牛胎児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（pH７．４）１００μｌを加え、３７℃で２０分間ブロ
ックした。０．０５％ツイーン２０を含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７．４）で洗浄し、ヒトＩｇＧサブクラ
ス固相ウェルを作製した。ヒトＩｇＧサブクラス固相ウ
ェルに、１２５Ｉ標識モノクローナル抗体ＨＧ４−３
Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂを２４０〜
０．２４mg/mlの濃度範囲となるように１０％牛胎児血
清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．４）で希釈し
て５０μｌ加え、２５℃で１時間インキュベートし、同
様に洗浄後、γ−カウンターで計測した。親和定数はス
キャッチャード法により求めた。
チレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに、ポリ
クローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種をそれぞれ
０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．１）に溶かした溶液（２
μｇ／ml）５０μｌを入れ、３７℃で１時間放置した
後、１０％牛胎児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（pH７．４）１００μｌを加え、３７℃で２０分間ブロ
ックした。０．０５％ツイーン２０を含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７．４）で洗浄し、ヒトＩｇＧサブクラ
ス固相ウェルを作製した。ヒトＩｇＧサブクラス固相ウ
ェルに、１２５Ｉ標識モノクローナル抗体ＨＧ４−３
Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂを２４０〜
０．２４mg/mlの濃度範囲となるように１０％牛胎児血
清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．４）で希釈し
て５０μｌ加え、２５℃で１時間インキュベートし、同
様に洗浄後、γ−カウンターで計測した。親和定数はス
キャッチャード法により求めた。
ｂ）液相ヒトＩｇＧサブクラスに対する親和定数ポリス
チレン製チューブに１０％牛胎児血清を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（pH７．４）１００μｌと、同緩衝液に溶
かした１２５Ｉ標識モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆ、
ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ（４０mg/ml）５
０μｌと、同緩衝液で２．５〜０．００５μｇ／mlの濃
度範囲となるように希釈したモノクローナル抗体ＨＧ４
−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ（５０μ
ｌ）および２．５μｇ／mlのヒトＩｇＧサブクラス精製
品５０μｌを加えて、２５℃で１６時間インキュベート
した。この反応液にセファデックス結合モノクローン抗
ヒトＬ鎖抗体を適当量（６００μｇ／ml、１００μｌ）
を加えて、２５℃で１時間インキュベートし、生理食塩
液で３回洗浄後、γ−カウンターで計測した。親和定数
はスキャッチャード法により求めた。
チレン製チューブに１０％牛胎児血清を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（pH７．４）１００μｌと、同緩衝液に溶
かした１２５Ｉ標識モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆ、
ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ（４０mg/ml）５
０μｌと、同緩衝液で２．５〜０．００５μｇ／mlの濃
度範囲となるように希釈したモノクローナル抗体ＨＧ４
−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ（５０μ
ｌ）および２．５μｇ／mlのヒトＩｇＧサブクラス精製
品５０μｌを加えて、２５℃で１６時間インキュベート
した。この反応液にセファデックス結合モノクローン抗
ヒトＬ鎖抗体を適当量（６００μｇ／ml、１００μｌ）
を加えて、２５℃で１時間インキュベートし、生理食塩
液で３回洗浄後、γ−カウンターで計測した。親和定数
はスキャッチャード法により求めた。
以上の結果を表８に示が、同じＩｇＧサブクラスに対す
るモノクローナル抗体でも、その親和性は互いに異な
る。
るモノクローナル抗体でも、その親和性は互いに異な
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，47（２），329 −336（1982) Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３（３），263− 276（1984) Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，10（３− ４），223−252（1985) Ｍｏｎｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ，19，71 −85（1986)
Claims (1)
- 【請求項１】ヒトＩｇＧ２に結合するが、他のヒトＩｇ
Ｇサブクラスには実質的に結合せず、ニワトリ、ウシ、
ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよ
びサルのＩｇＧには実質的に結合せず、マウスＩｇＧ１
（ｋ）に属するモノクローナル抗体ＨＧ２−５６Ｆ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61043068A JPH066068B2 (ja) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP61043068A JPH066068B2 (ja) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 |
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| JPS62201596A JPS62201596A (ja) | 1987-09-05 |
| JPH066068B2 true JPH066068B2 (ja) | 1994-01-26 |
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ID=12653536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP61043068A Expired - Fee Related JPH066068B2 (ja) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 |
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| JP (1) | JPH066068B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN114717197A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-08 | 长春博迅生物技术有限责任公司 | 分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株单克隆抗体及应用 |
-
1986
- 1986-02-27 JP JP61043068A patent/JPH066068B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
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|---|
| Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３（３），２６３−２７６（１９８４） |
| Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１０（３−４），２２３−２５２（１９８５） |
| Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４７（２），３２９−３３６（１９８２） |
| Ｍｏｎｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ，１９，７１−８５（１９８６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62201596A (ja) | 1987-09-05 |
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