JPH066079B2 - Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト - Google Patents
Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツトInfo
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- JPH066079B2 JPH066079B2 JP29471186A JP29471186A JPH066079B2 JP H066079 B2 JPH066079 B2 JP H066079B2 JP 29471186 A JP29471186 A JP 29471186A JP 29471186 A JP29471186 A JP 29471186A JP H066079 B2 JPH066079 B2 JP H066079B2
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- acetylneuraminic acid
- ana
- acid
- amdh
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明はＮ−アセチルノイラミン酸（以下N-ANAとい
う）の酵素的定量方法及びその定量用キットに関するも
のである。
う）の酵素的定量方法及びその定量用キットに関するも
のである。
＜従来の技術＞ 最近、臨床検査の分野において血清中のN-ANAの測定が
行なわれており、急性及び慢性炎症、ショック、外傷、
心筋梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等の病態を診断する
のに重要な役割を持っている。
行なわれており、急性及び慢性炎症、ショック、外傷、
心筋梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等の病態を診断する
のに重要な役割を持っている。
このN-ANAを測定するにあたって大別して化学法と酵素
法がある。
法がある。
化学法は特異性や操作性、更には危険薬品類の使用等、
望ましくない点が多いため徐々に精度の高い酵素法に移
って来ているのが実情である。
望ましくない点が多いため徐々に精度の高い酵素法に移
って来ているのが実情である。
酵素法には現在大きく別けてＡ、Ｂ２つの方法が提案さ
れている。
れている。
N-ANAにノイラミン酸アルドラーゼを作用させ、Ｎ−ア
セチルマンノサミン（以下N-AMという）とピルビン酸に
分解する過程は同一であるが、Ａ法はN-AMをアシルグル
コサミン−２−エピメラーゼとＮ−アセチルヘキソサミ
ンオキシダーゼで過酸化水素を生成させて測定するもの
であり、Ｂ法はピルビン酸からピルビン酸オキシダーゼ
または乳酸脱水素酵素（LDH）で、それぞれ過酸化水素
を生成させ、またはＮＡＤＨを減少させて測定するもの
である。
セチルマンノサミン（以下N-AMという）とピルビン酸に
分解する過程は同一であるが、Ａ法はN-AMをアシルグル
コサミン−２−エピメラーゼとＮ−アセチルヘキソサミ
ンオキシダーゼで過酸化水素を生成させて測定するもの
であり、Ｂ法はピルビン酸からピルビン酸オキシダーゼ
または乳酸脱水素酵素（LDH）で、それぞれ過酸化水素
を生成させ、またはＮＡＤＨを減少させて測定するもの
である。
＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、Ａ法はアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ
が介在する分だけ系は複雑となり、Ｂ法は内因性のピル
ビン酸の影響を受けるという欠点がある。
が介在する分だけ系は複雑となり、Ｂ法は内因性のピル
ビン酸の影響を受けるという欠点がある。
本発明者等は操作が簡単でしかも精度の高いN-ANAの定
量法について検討したところ、土壌から分離したフラボ
バクテリウム属に属する１細菌が、N-AMに作用してＮ−
アセチルマンノサミノラクトンにすると共に、NADをNAD
Hに還元する新規な酵素を生産し、この酵素がN-ANAの定
量に有効に利用出来るということを見出し本発明を完成
した。
量法について検討したところ、土壌から分離したフラボ
バクテリウム属に属する１細菌が、N-AMに作用してＮ−
アセチルマンノサミノラクトンにすると共に、NADをNAD
Hに還元する新規な酵素を生産し、この酵素がN-ANAの定
量に有効に利用出来るということを見出し本発明を完成
した。
すなわち本発明はN-ANA含有試料にＮ−アセチルノイラ
ミン酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルマンノサミン脱水
素酵素を順次又は同時に作用させ、生成するNADHを測定
することを特徴とするN-ANAの定量方法であり、またＮ
−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素、NAD及び緩衝液を含むN-ANA定量
用キットである。
ミン酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルマンノサミン脱水
素酵素を順次又は同時に作用させ、生成するNADHを測定
することを特徴とするN-ANAの定量方法であり、またＮ
−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素、NAD及び緩衝液を含むN-ANA定量
用キットである。
＜問題点を解決するための手段＞ 以下本発明を具体的に説明する。
本発明の測定原理は下記に示す通りである。
すなわちN-ANAをノイラミン酸アルドラーゼによってN-A
Mとピルビン酸に分解し、生じたN-AMにＮ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素（以下N-AMDHという）を作用さ
せ、この生成されたNADHを公知の測定方法、例えば紫外
部340nmの吸光度を測定する方法等によって測定するこ
とができる。
Mとピルビン酸に分解し、生じたN-AMにＮ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素（以下N-AMDHという）を作用さ
せ、この生成されたNADHを公知の測定方法、例えば紫外
部340nmの吸光度を測定する方法等によって測定するこ
とができる。
また各々の酵素を固体に保持させて試料と接触させるこ
とにより、生成したNADHを同様に測定することもでき
る。また生存するLDHの影響を防ぐために必要であれば
オキサミド酸や蓚酸等の阻害剤を適量添加することもで
きる。
とにより、生成したNADHを同様に測定することもでき
る。また生存するLDHの影響を防ぐために必要であれば
オキサミド酸や蓚酸等の阻害剤を適量添加することもで
きる。
本発明に用いるノイラミン酸アルドラーゼとしては、エ
ッシェリシア・コリ、クロストリジウム属、肝臓等から
精製されるものがあり、いずれの起源によるものでも良
いが、特に微生物から精製されたものが好ましく、例え
ば市販のノイラミン酸アルドラーゼ（半井化学製）を好
適に用いることができる。
ッシェリシア・コリ、クロストリジウム属、肝臓等から
精製されるものがあり、いずれの起源によるものでも良
いが、特に微生物から精製されたものが好ましく、例え
ば市販のノイラミン酸アルドラーゼ（半井化学製）を好
適に用いることができる。
また本発明に用いるN-AMDHは、いかなる起源のものでも
使用できるが、例えば微生物殊にフラボバクテリウム属
に属する細菌から選ばれた菌を培養して得られるN-AMDH
を用いることが好ましい。
使用できるが、例えば微生物殊にフラボバクテリウム属
に属する細菌から選ばれた菌を培養して得られるN-AMDH
を用いることが好ましい。
フラボバクテリウム属に属する上記酵素生産菌として
は、例えばフラボバクテリウムsp.No.141-8等が挙げら
れる。フラボバクテリウムsp.No.141-8は本発明者等が
土壌中より分離した新菌株であり、その菌学的性質は下
記の通りである。
は、例えばフラボバクテリウムsp.No.141-8等が挙げら
れる。フラボバクテリウムsp.No.141-8は本発明者等が
土壌中より分離した新菌株であり、その菌学的性質は下
記の通りである。
(a)形態 顕微鏡的観察（30℃加糖ブイヨン培地、16時間培養） 細胞の大きさ：0.45〜0.5×0.5〜11ミクロンの桿菌 細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で相互につながった短い連鎖状態も
散見する。
ものまである。末端で相互につながった短い連鎖状態も
散見する。
運動性：認められない。
胞子の有無：形成せず。
グラム染色性：陰性 抗酸性：陰性 (b)各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：30℃、２日間で直径0.5mmの円形
平滑で半透明なコロニーを作る。生育は比較的よくな
い。
平滑で半透明なコロニーを作る。生育は比較的よくな
い。
加糖肉汁寒天平板培養：30℃、２日間で直径0.8mmの
円形平滑で半透明なコロニー、５日間で2.0〜2.5mmの乳
白色の粘液状のコロニーを作る。色素の生成は認められ
ない。
円形平滑で半透明なコロニー、５日間で2.0〜2.5mmの乳
白色の粘液状のコロニーを作る。色素の生成は認められ
ない。
加糖肉汁寒天斜面培地：30℃、２日間で乳濁した粘液
状になり、３日間での培養では下方に流下し底部にたま
る。
状になり、３日間での培養では下方に流下し底部にたま
る。
加糖肉汁液体培地：30℃、２日間の培養で少し生育す
る。
る。
肉汁ゼラチン穿刺培養：30℃、２日間でわずかに生育
するが液化はしない。
するが液化はしない。
リトマスミルク：変化なし、凝固もしない。
(c)生理的性質 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陰性 ＭＲテスト：陰性。ただし好気的培養では陽性。
ＶＰテスト：陰性。
インドールの生成：陰性。
硫化水素の生成：陰性 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：アンモニアは利用するが硝酸は利
用しない。
用しない。
色素の生成：陰性 ウレアーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲：15℃〜41℃（至適温度30℃） pH4.5〜8.5（至適pH6.5付近） 酸素に対する態度：好気性であるが嫌気的にもわずか
に生育する。
に生育する。
Ｏ−Ｆテスト：変化なし、又は極めて弱い醗酵。
糖類から酸及びガスの生成：※は好気的培養による。
(d)その他の性質 ペニシリン耐性：100単位／ｍでも生育する。
食塩耐性：２％以上で生育しない。
コロニー辺縁部の運動性：流動性は見られない。
Tween 80分解：陰性 エクスリンの分解：陰性 以上の新規なN-AMDH生産能を有する本菌の分類学的諸性
質を「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と対比
すると、本菌はグラム染色性が陰性、好気性の無胞子桿
菌で運動性を持たず、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽
性で多くの糖から好気的条件で酸を生成する。ペニシリ
ン耐性であるなどの性質からフラボバクテリウム属に属
すると思われる。
質を「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と対比
すると、本菌はグラム染色性が陰性、好気性の無胞子桿
菌で運動性を持たず、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽
性で多くの糖から好気的条件で酸を生成する。ペニシリ
ン耐性であるなどの性質からフラボバクテリウム属に属
すると思われる。
好気的条件での糖から酸を生成する性質から、フラボバ
クテリウム・スピリッチボラン（Flavobacterium spiri
tivorum）に近縁と思われるが、エスクリンの分解、硝
酸塩の還元、Tween 80の分解などの点で異なっており、
従来知られていない新規な菌株と思われる。
クテリウム・スピリッチボラン（Flavobacterium spiri
tivorum）に近縁と思われるが、エスクリンの分解、硝
酸塩の還元、Tween 80の分解などの点で異なっており、
従来知られていない新規な菌株と思われる。
以上の理由により本菌をフラボバクテリウムsp.No.141-
8と命名した。なお、フラボバクテリウムsp.No.141-8は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第1222号（FERMBP−1222）として寄託されている。
8と命名した。なお、フラボバクテリウムsp.No.141-8は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第1222号（FERMBP−1222）として寄託されている。
次に本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース、
キシロース、グリセリン等を用いることができる。窒素
源としてはアンモニウム塩の他にペプトン、カゼイン消
化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース、
キシロース、グリセリン等を用いることができる。窒素
源としてはアンモニウム塩の他にペプトン、カゼイン消
化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。
本発明においては、N-AMDH生産能を有する菌株をN-AMま
たはＮ−アセチルグルコサミンを含有する培地で培養ま
たは浸漬したときにN-AMDHが収量よく得られる。該培養
培地の好適な例としては、N-AM0.5％、肉エキス0.1％、
ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.2％、食塩0.14％、燐
酸水素一カリウム0.1％、pH6.8の培地例が挙げられる。
そして該培地で30℃、36時間通気攪拌培養した場合は、
N-AMを他の炭素源におきかえた場合の10〜100倍の生産
力価を得ることができる。
たはＮ−アセチルグルコサミンを含有する培地で培養ま
たは浸漬したときにN-AMDHが収量よく得られる。該培養
培地の好適な例としては、N-AM0.5％、肉エキス0.1％、
ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.2％、食塩0.14％、燐
酸水素一カリウム0.1％、pH6.8の培地例が挙げられる。
そして該培地で30℃、36時間通気攪拌培養した場合は、
N-AMを他の炭素源におきかえた場合の10〜100倍の生産
力価を得ることができる。
培養温度は通常20〜40℃の範囲で好適には30〜33℃の範
囲で行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の範囲で好
適には７付近である。この様な条件下で20〜40時間振盪
又は深部攪拌培養を行なうか、またはN-AMまたはＮ−ア
セチルグルコサミンを含有しないが、生育に好適な他の
培地に生育した菌体を高濃度に分散させ１〜10時間好気
的にそれらと共に浸漬すれば、該培養物または菌体懸濁
液中にN-AMDHが生成蓄積する。
囲で行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の範囲で好
適には７付近である。この様な条件下で20〜40時間振盪
又は深部攪拌培養を行なうか、またはN-AMまたはＮ−ア
セチルグルコサミンを含有しないが、生育に好適な他の
培地に生育した菌体を高濃度に分散させ１〜10時間好気
的にそれらと共に浸漬すれば、該培養物または菌体懸濁
液中にN-AMDHが生成蓄積する。
N-AMDHは通常は菌体中に存在するので培養物を遠心分
離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するのが好ま
しい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶化す
ることによって溶液中に放出させる。
離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するのが好ま
しい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶化す
ることによって溶液中に放出させる。
菌体の破壊方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的なものや、トリトンＸ−100、ラウリル硫酸
ソーダ、EDTA等の化学的方法、リゾチーム等の酵素的な
方法を単独または併用して用いることができる。この様
にして得られた菌体破壊液から核酸を常法によって除去
し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きN-AMDHを
得る。
等の物理的なものや、トリトンＸ−100、ラウリル硫酸
ソーダ、EDTA等の化学的方法、リゾチーム等の酵素的な
方法を単独または併用して用いることができる。この様
にして得られた菌体破壊液から核酸を常法によって除去
し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きN-AMDHを
得る。
更にN-AMDHは必要により酵素の単離精製の常法に従っ
て、例えば(1)DEAE−セルロース塔によるカラムクロマ
トグラフィー、(2)硫安による分画沈殿、(3)DEAE−セフ
ァデックス塔によるカラムクロマトグラフィー、(4)
５′−AMPセファロース塔によるカラムクロマトグラフ
ィー、(5)セファデックスによるゲル濾過等の方法、ま
たはその他の方法を必要に応じ組合わせて用いることに
より、精製されたN-AMDHを得ることができる。
て、例えば(1)DEAE−セルロース塔によるカラムクロマ
トグラフィー、(2)硫安による分画沈殿、(3)DEAE−セフ
ァデックス塔によるカラムクロマトグラフィー、(4)
５′−AMPセファロース塔によるカラムクロマトグラフ
ィー、(5)セファデックスによるゲル濾過等の方法、ま
たはその他の方法を必要に応じ組合わせて用いることに
より、精製されたN-AMDHを得ることができる。
こうして得られる新規酵素N-AMDHの理化学的性質は下記
の通りである。
の通りである。
(1)作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、N-AMとNADの共存下でN-A
MをＮ−アセチルマンノサミノラクトンに酸化すると共
に、NADをNADHに還元する。
MをＮ−アセチルマンノサミノラクトンに酸化すると共
に、NADをNADHに還元する。
Ｎ−アセチルマンノサミノラクトンは水中では更に自動
的に加水分解されてＮ−アセチルマンノサミン酸にな
る。故に反応は事実上不可逆的である。他の中性糖やヘ
キソサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル
ガラクトサミンに対しては全く、もしくはほとんど作用
しない。またNADPや2,6−ジクロロフェノールインドフ
ェノール等を電子受容体として、ほとんど利用しない。
的に加水分解されてＮ−アセチルマンノサミン酸にな
る。故に反応は事実上不可逆的である。他の中性糖やヘ
キソサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル
ガラクトサミンに対しては全く、もしくはほとんど作用
しない。またNADPや2,6−ジクロロフェノールインドフ
ェノール等を電子受容体として、ほとんど利用しない。
(2)至適pH及び安定pH範囲 トリス−塩酸緩衝液を用いた場合、至適pHは8.0〜9.0で
ある。
ある。
またリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグ
リシン−苛性ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した
結果は第１図に示すとおりである。
リシン−苛性ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した
結果は第１図に示すとおりである。
安定pH範囲は第２図に示すごとく8.5〜9.5である。
使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
(3)作用適温の範囲 第３図に示すごとく35〜50℃である。
(4)pH、温度等による失活の条件 第４図に示すごとく10分間の熱処理では45℃まで安定で
あり、それ以上の温度では急速に失活する。45℃、10分
間の熱処理ではpH8.5〜9.5で安定であり、pH７以下では
特に不安定である。
あり、それ以上の温度では急速に失活する。45℃、10分
間の熱処理ではpH8.5〜9.5で安定であり、pH７以下では
特に不安定である。
(5)阻害剤の影響及び安定化 上表は各種金属イオン及び阻害剤を２ｍＭの濃度で含有
する反応液中での酵素活性を測定したものである。活性
化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られてい
ない。
する反応液中での酵素活性を測定したものである。活性
化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られてい
ない。
(6)精製方法 本酵素の単離・精製は常法に従って行なうことができ、
例えばDEAE−セルロースを用いたカラムクロマトグラフ
ィー、硫安沈殿、DEAE−セファデックスを用いたカラム
クロマトグラフィー、５′−AMPセファロースを用いた
カラムクロマトグラフィー、セファデックスによるゲル
濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせて使用す
る。
例えばDEAE−セルロースを用いたカラムクロマトグラフ
ィー、硫安沈殿、DEAE−セファデックスを用いたカラム
クロマトグラフィー、５′−AMPセファロースを用いた
カラムクロマトグラフィー、セファデックスによるゲル
濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせて使用す
る。
(7)分子量 0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液（0.1Ｍ NaCl含有）を用い
てセファデックスＧ−200のカラムによるゲル濾過法に
より測定した値は約11万〜12万である。
てセファデックスＧ−200のカラムによるゲル濾過法に
より測定した値は約11万〜12万である。
(8)ポリアクリルアミドゲル電気泳動 7.5％ポリアクリルアミドゲルを用いて常法によってア
クリルアミドディスク電気泳動を行なった結果、第５図
に示すごとく、ほぼ単一のバンドが認められた。４ｍＡ
で１時間20分後の泳動距離は28mmである。
クリルアミドディスク電気泳動を行なった結果、第５図
に示すごとく、ほぼ単一のバンドが認められた。４ｍＡ
で１時間20分後の泳動距離は28mmである。
(9)等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は4.
9である。
9である。
(10)活性の測定法 0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.2）1.8ｍに60ｍＭ
NAD溶液0.1ｍを加える。37℃に10分間保った後、酵素
液10μを加え、0.3Ｍ N-AM溶液0.1ｍを加えて混合
し、反応を始める。直ちに37℃に保った吸光度測定用セ
ル（1cm光路）に移し、340nmの波長で１分ごとに５分ま
たは必要であればそれ以上の時間にわたって吸光度を測
定する。１単位は１分間に１μモルのNADHを生成させる
酵素量である。
NAD溶液0.1ｍを加える。37℃に10分間保った後、酵素
液10μを加え、0.3Ｍ N-AM溶液0.1ｍを加えて混合
し、反応を始める。直ちに37℃に保った吸光度測定用セ
ル（1cm光路）に移し、340nmの波長で１分ごとに５分ま
たは必要であればそれ以上の時間にわたって吸光度を測
定する。１単位は１分間に１μモルのNADHを生成させる
酵素量である。
以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。
従来全く知られていない新規な酵素である。
N-ANAにＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを作用
させてN-AMとピルビン酸に分解し、この分解液に上記N-
AMDHを作用させる場合には、pH７〜10及び温度50℃以
下、好ましくはpH８〜9.5及び温度30〜45℃の条件で、
通常は２〜20分間程度反応させる。pHの調整には前記pH
範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害しない
任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ緩衝
液、炭酸ナトリウム緩衝液等が好適に使用できる。
させてN-AMとピルビン酸に分解し、この分解液に上記N-
AMDHを作用させる場合には、pH７〜10及び温度50℃以
下、好ましくはpH８〜9.5及び温度30〜45℃の条件で、
通常は２〜20分間程度反応させる。pHの調整には前記pH
範囲を維持することができ、かつ酵素反応を阻害しない
任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソーダ緩衝
液、炭酸ナトリウム緩衝液等が好適に使用できる。
また本発明に供される試料中のN-ANAは遊離の状態にあ
ることが必要であり、血清や血しょう、組織の一部等の
様に蛋白質や糖脂質に結合しているシアル酸を測定する
場合にはノイラミニダーゼを作用させて遊離状態にす
る。この場合に使用するノイラミニダーゼは、いかなる
起源のものでも良いが、クロストリジウム属、アスロバ
クター属、コリネバクテリウム属、ストレプトコッカス
属等に属する微生物から産生するものが好適である。
ることが必要であり、血清や血しょう、組織の一部等の
様に蛋白質や糖脂質に結合しているシアル酸を測定する
場合にはノイラミニダーゼを作用させて遊離状態にす
る。この場合に使用するノイラミニダーゼは、いかなる
起源のものでも良いが、クロストリジウム属、アスロバ
クター属、コリネバクテリウム属、ストレプトコッカス
属等に属する微生物から産生するものが好適である。
N-AMDHの作用により生成されるNADHの定量はいかなる方
法を用いても良いが、最も一般的に用いられている方法
は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法であ
る。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法は
フェナジンメトサルフェートとニトロブルーテトラゾリ
ウムと共に反応させて生成したダイホルマザンの570nm
における吸光度を測定するものや、NADH酸化酵素〔Ｊ．
Biochem 98 1433（1985）〕やフェナジンメトサルフェ
ートまたそれに類する作用をする電子伝達体または金属
イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシダ
ーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適な
波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に導
かれたものはルミノールと共に発光させて検出すること
もできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬と
電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量的
に検出することも可能である。これらの検出方法はその
特徴によって使いわければ良い。
法を用いても良いが、最も一般的に用いられている方法
は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法であ
る。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法は
フェナジンメトサルフェートとニトロブルーテトラゾリ
ウムと共に反応させて生成したダイホルマザンの570nm
における吸光度を測定するものや、NADH酸化酵素〔Ｊ．
Biochem 98 1433（1985）〕やフェナジンメトサルフェ
ートまたそれに類する作用をする電子伝達体または金属
イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシダ
ーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適な
波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に導
かれたものはルミノールと共に発光させて検出すること
もできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬と
電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量的
に検出することも可能である。これらの検出方法はその
特徴によって使いわければ良い。
本発明のN-ANA定量用キットはＮ−アセチルノイラミン
酸アルドラーゼ、N-AMDH、NADと生成されるNADHを定量
するための酵素や試薬類及びこれらの反応を円滑に勧め
るための緩衝用試薬からなっている。この試薬類、酵素
類は液剤、固形剤もしくは凍結乾燥剤とし、必要に応じ
て使用前に緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
酸アルドラーゼ、N-AMDH、NADと生成されるNADHを定量
するための酵素や試薬類及びこれらの反応を円滑に勧め
るための緩衝用試薬からなっている。この試薬類、酵素
類は液剤、固形剤もしくは凍結乾燥剤とし、必要に応じ
て使用前に緩衝液に溶解混合して測定用試薬とする。
測定方法は試料に先ずＮ−アセチルノイラミン酸アルド
ラーゼを作用させ、N-AMを生成させ、次にN-AMDHを作用
させることによってNADHを生成させる。そしてこれをそ
のまま、あるいはNADH定量用試薬を加えることによって
NADHを測定する。本発明では測定方法は１試薬系でも２
試薬系でも良く、さらに何試薬系で測定しても良い。
ラーゼを作用させ、N-AMを生成させ、次にN-AMDHを作用
させることによってNADHを生成させる。そしてこれをそ
のまま、あるいはNADH定量用試薬を加えることによって
NADHを測定する。本発明では測定方法は１試薬系でも２
試薬系でも良く、さらに何試薬系で測定しても良い。
＜発明の効果＞ 本発明によれば操作が簡単でしかも内因性ピルビン酸の
影響を受けない正確性の高いN-ANAの定量が可能とな
り、シアル酸の臨床検査の診断分野において極めて有意
義である。
影響を受けない正確性の高いN-ANAの定量が可能とな
り、シアル酸の臨床検査の診断分野において極めて有意
義である。
次に本発明を実施例により説明する。
＜実施例＞ 実施例１ 溶液中のN-ANAの濃度を下記試薬を用いて下記方法によ
り定量した。
り定量した。
１．試薬 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0） 610μ Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ （半井化学製）（10単位／ｍ） 300μ NAD （60ｍＭ） 53μ N-AMDH（123 単位／ｍ） 60μ 試料溶液 20μ ２．定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、37℃で10分間反
応させ340nmで吸光度を測定し、同様にしてＮ−アセチ
ルノイラミン酸アルドラーゼのかわりに水を同量加えて
反応させた場合の吸光度を差しひいて試料溶液の吸光度
とした。別に既知濃度のN-ANA溶液を同様にして得た検
量線から試料溶液中のN-ANAの濃度を求めた。第６図に
検量線を示す。
応させ340nmで吸光度を測定し、同様にしてＮ−アセチ
ルノイラミン酸アルドラーゼのかわりに水を同量加えて
反応させた場合の吸光度を差しひいて試料溶液の吸光度
とした。別に既知濃度のN-ANA溶液を同様にして得た検
量線から試料溶液中のN-ANAの濃度を求めた。第６図に
検量線を示す。
実施例２ 溶液中のN-ANAの濃度を下記試薬を用いて下記方法によ
り定量した。
り定量した。
１．試薬 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）（0.1％トリトンＸ−100含
有） 100μ フェナジンメトサルフェート（１mg／ｍ） ５μ ニトロブルーテトラゾリウム（10mg／ｍ） ５μ NAD （40mg／ｍ） 20μ Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ （半井化学製）（10単位／ｍ） 40μ N-AMDH（123 単位／ｍ） 10μ 試料溶液 10μ ２．定量方法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37℃で15分間
反応させた。その後0.3規定塩酸2.0ｍを添加して良く
攪はんした。生成した色素を570nmで吸光度を測定し
た。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼのかわりに
水を同量添加して同様に反応処理したものの吸光度をブ
ランクとして差しひき、試料の吸光度とした。別に既知
濃度のN-ANA溶液を同様にして得た検量線から試料溶液
中のN-ANAの濃度を求めた。
有） 100μ フェナジンメトサルフェート（１mg／ｍ） ５μ ニトロブルーテトラゾリウム（10mg／ｍ） ５μ NAD （40mg／ｍ） 20μ Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ （半井化学製）（10単位／ｍ） 40μ N-AMDH（123 単位／ｍ） 10μ 試料溶液 10μ ２．定量方法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37℃で15分間
反応させた。その後0.3規定塩酸2.0ｍを添加して良く
攪はんした。生成した色素を570nmで吸光度を測定し
た。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼのかわりに
水を同量添加して同様に反応処理したものの吸光度をブ
ランクとして差しひき、試料の吸光度とした。別に既知
濃度のN-ANA溶液を同様にして得た検量線から試料溶液
中のN-ANAの濃度を求めた。
実施例３ 血清中のシアル酸量を下記試薬を用い、下記方法によっ
て定量した。
て定量した。
１．試薬 Ａ． 10ｍＭリン酸緩衝液（pH6.6） １ｍ ノイラミニダーゼ（５単位／ｍ） １ｍ Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（10単位／ｍ
） １ｍ
Ｂ．0.1リン酸緩衝液（pH8.0） 5.7ｍ N-AMDH（123単位／ｍ） 0.6ｍ NAD（60ｍＭ） 0.5ｍ オキサミド酸 4.4mg ２．定量方法 血清20μを試験管にとり、試薬Ａ．300μを加え、3
7℃で15分間反応させた後、試薬Ｂ．680μを加え、更
に10分間反応を続けた。これについて340nmで吸光度を
測定し、試薬A.のかわりに水を用いて、同様に処理して
得た吸光度をブランクとして差しひいた。別に既知濃度
のＮ−アセチルノイラミニルラクトースの溶液を同様に
して得た検量線から血清中のシアル酸の濃度を求めた。
） １ｍ
Ｂ．0.1リン酸緩衝液（pH8.0） 5.7ｍ N-AMDH（123単位／ｍ） 0.6ｍ NAD（60ｍＭ） 0.5ｍ オキサミド酸 4.4mg ２．定量方法 血清20μを試験管にとり、試薬Ａ．300μを加え、3
7℃で15分間反応させた後、試薬Ｂ．680μを加え、更
に10分間反応を続けた。これについて340nmで吸光度を
測定し、試薬A.のかわりに水を用いて、同様に処理して
得た吸光度をブランクとして差しひいた。別に既知濃度
のＮ−アセチルノイラミニルラクトースの溶液を同様に
して得た検量線から血清中のシアル酸の濃度を求めた。
第１図は本酵素の至適pHを示すグラフであり、第２図は
安定pHを示すグラフである。第３図は本酵素の作用適温
の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安定性
を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバンドを
示す図である第６図は実施例１における検量線である。
なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそれぞれ
リン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス−塩酸緩衝液
（△−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（●−●）
である。
安定pHを示すグラフである。第３図は本酵素の作用適温
の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安定性
を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバンドを
示す図である第６図は実施例１における検量線である。
なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそれぞれ
リン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス−塩酸緩衝液
（△−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（●−●）
である。
Claims (2)
- 【請求項１】Ｎ−アセチルノイラミン酸含有試料にＮ−
アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びＮ−アセチルマ
ンノサミン脱水素酵素を順次又は同時に作用させ、生成
するNADHを測定することを特徴とするＮ−アセチルノイ
ラミン酸の定量方法。 - 【請求項２】Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、
Ｎ−アセチルマンノサミン脱水素酵素、NAD及び緩衝液
を含むＮ−アセチルノイラミン酸定量用キット。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29471186A JPH066079B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト |
| US07/121,916 US4960701A (en) | 1986-12-04 | 1987-11-17 | N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis |
| DE19873741198 DE3741198A1 (de) | 1986-12-04 | 1987-12-04 | N-acetylmannosamindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylmannosamin oder sialylsaeure und gebinde fuer die quantitative analyse |
| DE3744830A DE3744830C2 (ja) | 1986-12-04 | 1987-12-04 | |
| US07/486,052 US5037739A (en) | 1986-12-04 | 1990-02-27 | N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29471186A JPH066079B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63148998A JPS63148998A (ja) | 1988-06-21 |
| JPH066079B2 true JPH066079B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17811318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29471186A Expired - Lifetime JPH066079B2 (ja) | 1986-12-04 | 1986-12-12 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066079B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118995880A (zh) * | 2024-09-05 | 2024-11-22 | 北京国科星联科技有限公司 | 一种检测唾液酸的方法 |
-
1986
- 1986-12-12 JP JP29471186A patent/JPH066079B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63148998A (ja) | 1988-06-21 |
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