JPS6368099A

JPS6368099A - ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬

Info

Publication number: JPS6368099A
Application number: JP21366686A
Authority: JP
Inventors: Kazuki Yamamoto; 山本　和已; Toshiro Kikuchi; 俊郎菊地; Shigenori Aisui; 愛水　重典
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1986-09-10
Publication date: 1988-03-26
Anticipated expiration: 2009-05-25
Also published as: JPH0638756B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規な熱安定性ピルビン酸オキシダーゼ、す
なわちｐＨ７，０，１０分間処理で４５℃まで熱に安定
なピルビン酸オキシダーゼを用いる分析法、特にピルビ
ン酸の測定法及びそのための試薬に関するも・のである
。

本発明によれば、ピルビン酸の測定ばかりではなく、特
に基質及びピルビン酸形成反応を触媒する酵素の測定に
も利用することができる。測定の代表例は以下の通りで
ある。

■グルタミン酸−ピルピン酸トランスアミナーゼ又はσ
−ケトグルタル酸 ■ダルタミン酸−オキザｐ酢酸トランスアミナーゼ ■乳酸デヒドロゲナーゼ又は乳酸 ■ピルビン酸キナーゼ又はＡＤＰ（従来の技術）ピルビン酸オキシダーゼは酵素番号Ｅ　Ｃ１，２，３，
３に分類され、ピルビン酸、リン酸および酸素からアセ
チルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応
を触媒する酵素であり、ラフトノくチルス・デルブリッ
チイ（酵素ハンドブック、丸尾文治、田宮信雄監修、発
行所：朝食書店）、ラクトバチルス會プランタラム（Ｊ
、Ｂａｃｔｓｒｉｏｌ、　１６０巻２７３〜２７８頁（
１９８４））及びペディオコッカス属、スシレプトコッ
カス属、アエロコツカス属の微生物（特公昭５８−４０
４６５号公報）、ロイコノストック属の微生物（特開昭
５９−１５９７７７号公報）など、各種の微生物が生産
することが知られてし）る。

しかしながらいずれの菌株の生産するピルビン酸オキシ
ダーゼも耐熱性が十分ではなく、こねら酵素を用いるピ
ルビン酸測定試薬の安定性に問題があった。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者は上記の背景を踏まえて、安定性の優れたより
実用的なピルビン酸測定試薬を見い出そうとした。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、福井県敦賀市内の土壌から分離したラク
トバチルス属に属する微生物と同定されたＴＥ−６１０
３株が、従来のピルビン酸オキシダーゼよりも熱安定性
に優れたピルビン酸オキシダーゼを産出することを見い
出し既に特詐出願した。

さらにこの菌株より得られたピルビン酸オキシダーゼが
、有効にピルビン酸を測定し得ることを見い出し、加え
てピルビン酸を生成する酵素反応系の酵素活性の測定、
ピルビン酸を生成する酵素反応系の酵素の定量及びピル
ビン酸を生成する酵素反応系の基質の定量をなし得るこ
とを見い出し本発明に到達した。さらに、上記のピルビ
ン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェー
ト、リン酸塩及びマグネシウムイオン、コバルトイオン
、マンガンイオン、カルシウムイオンのうち少なくとも
１種の金属イオンからなる反応系をピルビン酸含有試料
系と反応させることにより、良好に試料系中のピルビン
酸を測定することができ、またこの反応系に過酸化水素
の検出系を加えることにより、簡便かつ良好にピルビン
酸を測定できることを見出し、本発明に到達した。すな
わち本発明は下記理化学的性質を有する熱安定性の優れ
たピルビン酸オキシダーゼを使用することを特徴とする
分析法である。

■伶用：ビルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチル
リン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒
する。

■基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−
ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的で
ある。

■熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７，０，１０分間処理） ■至適ｐＨ：５．７付近 ■ｂ値：約４Ｘ１０−−４Ｍ（ピルビン酸）■分子量：
約１６０．０００　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３０
０でのゲル濾過法） ■等電点：約４　、４　（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏ
ｌｙｔｅによる焦点電気原動法） ■コファクター：　ＦＡＤおよびチアミンビ四フォスフ
ェートまた本発明は上記ピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チ
アミンピロフォスフェート、リン酸塩及びマグネシウム
イオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カルシウム
イオンのうち少なくとも１種の金属イオンを含有するこ
とを特徴とする分析用試薬である。

本発明は試料中の成分、特にピルビン酸を測定するもの
であるが、試料としては人血清、食品などに限られない
。また本発明ではピルビン酸を直接に測定することによ
り、試料中のピルビン酸を形成する物質、例えばα−ケ
トグルタル酸、乳酸ＡＤＰなど、またピルビン酸形成反
応を触媒する酵素、例えばＧＰＴ、ＧＯＴ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの測定も可能とな
る。

本発明に使用される熱安定性の優れたピルビン醗オキシ
ダーゼとしては、ｐＨ７，０、１０分間蝙理で４５℃ま
で熱に安定で、ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からア
七チルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応
を触媒する酵素であればヨく、好ましくはラクトバチル
ス・ニス・ビーＴＥ６１０３の生産するピルビン醗オキ
シダーゼがある。

この分離・同定した上記菌株Ｔ　Ｅ　６１０３株の菌学
的性質を以下に示す。

（ａ）形　　態大きさ：０．５〜０．７　Ｘ　５〜６μｍ（桿菌）ダラ
ム染色ニゲラム陽性抗酸性ニー運動性ニー胞　子ニー（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養３０℃、４８時間で小さな円形のコロニーを形成する。

表面は平滑で光沢はない。色は淡黄色であり可溶性色素
は形成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養生育弱い（３）肉汁液体培地３０℃、２４時間培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養穿刺線に沿って生育する。ゼラチンは液化しない。

（５）リドマス争ミルり変化なしくｃ）生理学的性質（３）インドールの生成；陰性（４）硫化水素の生成：陰性（５）デンプンの加水分解；陰性（６）色素の生成：なしく７）クエン酸の利用；陰性（８）ウレアーゼ；陰性（９）カタラーゼ；陰性儂Ｑオキシダーゼ；陰性（ロ）生育の範囲：生育温度２０℃〜４５℃（財）酸素
に対する態度；通性嫌気性（財）Ｏ−Ｆテスト；発酵（ロ）糖からの酸の生成Ｌ−アラビノースニーＤ−キシロースニーＤ−グルコース二十Ｄ−マンノース：＋Ｄ−フルクトース：＋Ｄ−ガラクトースニー麦　　　　芽　　　糖：＋シ　　　　　　　テ　　　　糖　：　＋乳　　　　　　
　　　糖ニート　レレハ　ロ・弘　ス　　：　− Ｄ−ソルビットニーＤ−マンニット：十イノシラ）ニーラムノース：一メリビオース：＋（ハ）その他 β−ガラクトシダーゼニ陰性アルギニンジヒドラーゼ：陰性リシンデカルボキシラーゼ：陰性オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性トリプトン１ンデアミナーゼ：陰性上記菌学的性質の同定のための実験法は主として長谷用
武治編著、「微生物の分類と同定」学会出版センター（
１９７５年）によって行なった。また分類同定の基準と
してパージエイズ・マニュアル・オブ・デタミネイティ
ブΦバクテリオロジー第８版（１９７４年）を参考にし
た。

以上の菌学的性状における本菌ＴＫ−６１０３株はグラ
ム陽性桿菌でカタラーゼ、オキシダーゼ陰性で、グルコ
ースから発酵的に酸を産生ずるが、グルコースからガス
を産生じないことなどから、パージエイズ・マニュアル
・オブ争デタミネイテイブ・バクテリオロジー第８版（
１９７４年）により検索するとラクトバチルス属に属す
るとみなされる。さらにラクトバチルス・デルブリッチ
イ（Ｌｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｊｉ　）とよく一致するが、Ｄ−マンニットやメリビ
オースからの酸の産生において相違が認められる。従っ
て本菌株はラクトバチルス・ニス・ピーＴＥ６１０３株
と命名した。本菌は工業技術院微生物工業研究所に微生
物受託番号微工研菌寄第８８８６号として寄託されてい
る。

本発明に使用する微生物としては、例えば上記のラクト
バチルス・ニス・ビーＴＥ６１０３が挙ケられるが、こ
の菌だけに限らずラクトバチルス属に属し、熱安定性に
優れたピルビン酸オキシダーゼを生産する菌は、すべて
本発明において使用することができる。熱安定性の優れ
たピルビン酸オキシダーゼ生産菌は酵素を生産する通常
の方法でる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地い
ずれも使用できる。例えば炭素源としてはグルコース、
シュクロース、デキストリン、ピルビン酸、糖蜜などが
使用される。窒素源としては例えばペプトン、肉エキス
、酵母エキス、カゼイン加水分解物などのＭ素含有天然
物や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム
、グルタミン酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の
窒素化合物が使用される。

培養は通常振盪培養あるいは通気攪拌培養で行う。培養
温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃付近、培
養ｐＨは５〜８の範囲、好ましくはｐ）１６〜７に制御
するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が
生育すれば実施できる。

培養期間は通常１〜４日間で生育し、菌体内にピルビン
酸オキシダーゼが生成蓄積される。

本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば、抽出法には、超音波破砕、ガラスピーズを
用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤など
いず、れを用いてもよい。

さらに抽出液については公知の硫安や芒硝などの塩析法
、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法
、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さら
にはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファレース、
ＣＭ（カルボキシメチル）セフ　７　’Ｏ−スなどのイ
オン交換体クロマト法などにより精製することができる
。ピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通りであ
る。

０．１５Ｍ　　Ｋ−リン酸緩衝液ｐＨ７，０１０ｄ０．
３％　　４−アミノアンチピリン　　　１ゴ０．６％　
フェノール　　　　　　　　　１７！６ｍＭ　チアミン
ピロフォスフェート　１−０．３ｍＭ　　Ｆ　Ａ　Ｄ−
ＮＡ２　　　　　　　　１−１５０Ｕ／−ペルオキシダ
ーゼ　　　　　　１−３０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　・Ｎａ２
　　　　　　　　１　ｄＯ，３ＭＭｇＳＯ４１ｍｌ蒸　　留　水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３−上記反応混液を調製した後、２．５　ｔｎｔを試
験管に分取Ｌ、０．３Ｍピルビン酸カリウムを０．５−
加えて３７℃で５分間予備加温する。酵素溶液０．０５
＋Ｉ！７！を添加し、ゆるやかに混和後、水に対照に３
７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化
を記録し、その初期直線部分から１分間当りの吸光度変
化を求める（△ＯＤｔｅｇｔ　）。

盲検は酵素溶液の代りに５０　ｍＭＫ　−！Ｊン酸緩衝
液ｐＨ７，０を０．０５ｍ加え、上記同様に操作を行な
って１分間当りの吸光度変化を求める（△０Ｄｂｌａｎ
ｋ）。

ピルビン酸オキシダーゼ活性の表示は、上記条件下で１
マイクロモルの過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）
とした。

本発明で使用したピルビン酸オキシダーゼは次の方法で
単離した。

１、培　養肉エキス０．２％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．
４％Ｔｗｅｅｎ　８００．１％（ｖ／ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ
４−３Ｈ２００，２５％、Ｎａ−７セテートー　３Ｈ２
００，５％、クエン酸ジアンモニウム２％、ＭｇＳＯ４
−７Ｈ２００，０２％、ＭｎＳＯ４Φ７Ｈ２００，０２
％を含む培地（ｐＨ７，０）　９０−をｓｏｏｍｇ容坂
ロフラスコに移し、１２１℃１５分間オートクレーブを
行なった。放冷した後、濾過除菌した５％ピルビン酸ナ
トリウム水溶液を無菌的に１０耐添加した。種菌として
ラクトバチルス・ニス・ビーＴＥ６１０３株を同培地に
一白金耳接種し、３０℃で２４時間振盪培養し種培養液
とした。次に同培地５．４ｔを１０ｔジヤーフアメンタ
ーに移し、１２１℃１５分間オートクレーブを行ない、
放冷後、濾過除菌した５％ピルビン酸ナトリウム水溶液
を無菌的に６００ｔｄ添加した。これに種培養液１００
ｄを移し、３００　ｒｐｍ　％通気ｆ４２ｔ／馴、３０
℃で２１．　４時間培養した。　ｐＨは６．５以上に１
０　Ｎ　ＮａＯＨで制御した。培養時のピルビン酸オキ
シダーゼ活性は２３　ｍＵ７ｍｌ−ｂｒｏｔｈであった
。

２、単　離培養液６ｔを遠心分離機にて集菌し、５０ｍＭＫ　−Ｉ
Ｊン酸緩衝液ｐＨ７，０１００７！にて懸濁した。超音
波破砕機（海上電気極、１９ＫＨｚ）にて１５分間処理
し、遠心分離して上清液を得た。上清液を５０　ｍ　Ｍ
　Ｋ　−リン酸緩衝液ｐＨ７、０にて平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファロースＧＬ−６Ｂ（ファルマシア製）カラム
クロマトグラフィーに供し、０〜０．５ＭＮａＣＬ溶出
画分にピルビン酸オキシダーゼ活性を得た。溶出液を限
外濾過機にて濃縮した後、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，０にて平衡化したセファデックスＧ−２００（フ
ァルマシア製）にてゲル濾過を行った。その結果５４１
Ｊのピルビン酸オキシダーゼが得られた。得られた酵素
のｐＨ活性を第１図に、熱安定性を第２図に示す。ｐＨ
活性の測定はｐＨ５〜６．５の範囲では５０ｍＭ酢酸緩
衝液、ｐＨ６〜８の範囲では５０　ｍ　Ｍ　Ｋ−リン酸
緩衝液を用いて行なった。熱安定性の測定は、ｐＨ７，
０，１０分間処理した後の残存活性で示した。

本発明に用いた酵素の理化学的性質を次に示す。

作用：ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒す
る。

ＣＨｓＣＯＣ００Ｈ＋ＨＯＰＯａ２　＋０２→ＣＨａＣ
ＯＯＰＯ３２＋Ｃ０ｒ）Ｈ２０２至適ｐＨ：５．７付近熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７，０，１０分間処理）ｈ
値：約４Ｘ１０−−４Ｍ（ピルビン酸）分子＊：約１６
０，０００　（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００でのゲ
ル濾過法）等電点：約４．４　（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙ
ｔｃによる焦点電気泳動法）基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、α−ケ
トグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的であ
る。

フッアフター：　ＦＡＤおよびチアミンビルフォスフェ
ート本発明では試料に、上記ピルビン酸オキシダーゼ、無機
リン酸を含有する試薬を添加して、生成する過酸化水素
、二酸化炭素又はアセチルリン酸の生成量を測定するか
、又は酸素又は無機リン酸の消費量を測定することによ
り、試料中のピルビン酸の量を知ることができる。特に
本発明の熱安定性に優れたピルビン酸オキシダーゼを含
有する反応系においては、ピルビン酸との酵素反応を良
好に行なわせるため、ピルビン酸オキシダーゼと共にＦ
ＡＤ、チアミンビυフォスフヱート、リン酸塩及びマグ
ネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、カ
ルシウムイオンのうち少なくとも１種の金属イオンを用
いればよく、さらにまたこの反応による生成物である過
酸化水素の検出系を用いる場合は、必要により色原体を
適宜選択使用すればよい。過酸化水素測定系としては、
例えば次のような系が考えられる。

（１）ペルオキシダーゼと発色剤一・ペルオキシダーゼ、チアミノアンチピリンおよびフェ
ノールＯペルオキシダーゼ、チアミノアンチピリンおよびＮ、
Ｎ−ジメチルアニリンＯペルオキシダーゼ、メチルベンゾチアシリ邑ンヒドラゾン（ＩＦＢＴＨ）およびＮ−エチル−Ｎ−ス
ルホブ四ピルーｍ−アニシジン（ＥＳＰＡＳ　）一〇ペルオキシダーゼ、チアミノアンチピリンおよびＮ−
エチル−Ｎ−（２−ヒトルキシー３−スルホプロピル）
　−ｍ　−）ルイジン（ＥＭＳＰＴ　）（２）過酸化水素電極法本発明では酵素の使渭量としては、酵素反応が充分に進
行する量であればよく、また試料系中のピルビン酸の含
量、酵素反応の温度、時間などにより適宜変更されるも
のであるが、例えば本発明試薬は熱安定性に優れたピル
ビン酸オキシダーゼ０．１〜２０ｕ／−程度、リン酸５
〜５０ｍＭ程度、ＦＡＤ　１〜２０μＭＷ度、チアミン
ピロ７オスフヱート１００〜５００μＭ程度、金属イオ
ン１〜５０ｍＭ程度、緩衝剤ｐＨ６〜７．５並びに過酸
化水素検出系として４・−アミノアンチピリンｏ、ｏ　
ｏ　ｓ〜０゜０５％程度、フェノール０．０１〜０．１
％程度及びペルオキシダーゼ１〜１０　ｕ／−程度を含
有する。ピルビン酸を形成する物質又はピルビン酸形成
反応を触媒する酵素を測定するには、本発明の試薬は従
来公知のピルビン酸へ誘導する試薬を組合せて使用する
。

（実施例）以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何ら
これらによって限定されるものではない。

実施例ＩＰ　Ｉ　ＦＥＳ緩衝液ｐＨ７，０５０ｍＭＦ　Ａ　Ｄ　
Ｎａ２　　　　　　　　　　　　１０　ｔｔＭ’チアミ
ンピロフォスフェート０．２ｍＭＭｇ５Ｏ＜　　　　　
　　　　　　　　　　１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４５ｍＭ４−アミノアンチピリン　　　　　　０．０１％フェノ
ール　　　　　　　　　　　　　０．０２％ペルオキシ
ダーゼ　　　　　　　　　５ｕ／−ピルビン酸オキシダ
ーゼ　　　　　　２　ＬＶｆＲｔ上記の組成よりなる反
応液：（ｄを分取し・３７℃で約５分間予備加温し、こ
れにピルビンｍｊＪ＋）ラム水溶液（３〜１５ｍＭ）２
０μｔを添加した後３７℃、１０分間反応させ、反応後
５００ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果は第３
図に示す通り良好な直線性が得られた。

実施例２ＰＩＦＢＳ緩衝液、ｐＨ７，０５０ｍＭＦＡＤ・Ｎａ２
　　　　　　　　　　　１０μＭチアミンビロフォスフ
ェー）　　　　　０．２ｍＭＭｇ５Ｏ＜　　　　　　　
　　　　　　　　１０ｍＭＫＨｚＰＯ＜　　　　　　　
　　　　　　　　５ｍＭホスホエノールピルビンＩＩ　
　　　　　Ｏ，５ｍＭピルビン酸キナーゼ　　　　　　
　　　１０ｕ／ｌ１１７！４−アミノアンチピリン　　
　　　　０．０１％フェノール　　　　　　　　　　　
　　０．０２％ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　ｓ
　Ｉ）／ａｔピルビン酸オキシダーゼ　　　　　　２　
ｕ／ｓｇ上記の組成よりなる度応液３−を分取し、３７
℃で約５分間予備加温し、これにＡＤＰ水溶液（３〜１
５ｍＭ）２０ｐＬを添加した後３７℃、１゜分間反応さ
せ、反応後５００ｎｍにおける吸光度を測定した。その
結果、第４図に示す通り良好な直線性が得られた。

（発明の効果）本発明では、従来のピルビン酸オキシダーゼより熱安定
性に優れたピルビン酸オキシダーゼを使用することによ
り、優れた溶液安定性を有する分析用試薬、例えばピル
ビン酸測定用試薬を製造することができる。

また固定化酸素、例えば電極用膜、ビーズ等として用い
ることにより、広範囲の測定系が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの至適ｐＨを
示す。第２ｖｌは本発明のピルビン酸オキシダーゼの熱安定性
を示す。第３図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたピル
ビン酸の検量線を示す。第４図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いたＡＤ
Ｐの検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１、下記理化学的性質を有する熱安定性の優れたピルビ
ン酸オキシダーゼを使用することを特徴とする分析法。（１）作用：ピルビン酸、無機リン酸及び酸素から、ア
セチルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応
を触媒する。（２）基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、
α−ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異
的である。（３）熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０、１０分間処
理）（４）至適ｐＨ：５．７付近（５）Ｋｍ値：約４×１０＾−＾４Ｍ（ピルビン酸）（
６）分子量：約１６０，０００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　
Ｓ−３００でのゲル濾過法）（７）等電点：約４．４（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏ
ｌｙｔｅによる焦点電気泳動法）（８）コファクター：ＦＡＤおよびチアミンピロフォス
フェート２、特許請求の範囲第１項に記載されるピルビン酸オキ
シダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート、リン
酸塩及びマグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガ
ンイオン、カルシウムイオンのうち少なくとも１種の金
属イオンを含有することを特徴とする分析用試薬。