JPH0662438B2 - 殺細胞性抗体複合体及びその製造方法 - Google Patents
殺細胞性抗体複合体及びその製造方法Info
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- JPH0662438B2 JPH0662438B2 JP62-504967A JP50496787A JPH0662438B2 JP H0662438 B2 JPH0662438 B2 JP H0662438B2 JP 50496787 A JP50496787 A JP 50496787A JP H0662438 B2 JPH0662438 B2 JP H0662438B2
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、殺細胞性抗体複合体に関する。
更に詳しくは、殺すべき細胞のもつ特定の抗原と選択的
に結合する抗体またはその抗原結合部位を含むフラグメ
ントに、オリゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似
体が結合されている殺細胞性抗体複合体とその製造方法
に関する。
に結合する抗体またはその抗原結合部位を含むフラグメ
ントに、オリゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似
体が結合されている殺細胞性抗体複合体とその製造方法
に関する。
背景技術
葉酸拮抗性葉酸類似体とは、葉酸と化学構造が類似し、
葉酸またはその誘導体の作用の一部または全部を妨げる
物質をいう。このような物質は数多く合成されていて、
一部は白血病やガンなどの悪性腫瘍の化学療法に応用さ
れている。
葉酸またはその誘導体の作用の一部または全部を妨げる
物質をいう。このような物質は数多く合成されていて、
一部は白血病やガンなどの悪性腫瘍の化学療法に応用さ
れている。
従来抗体に葉酸拮抗性葉酸類似体が結合されている殺細
胞性抗体複合体に関しては、抗体にメソトレキセート
を、縮合剤の水溶性カルボジイミドを用いて結合させる
方法、並びに、メソトレキセートの活性エステルを用い
て結合する方法が知られている（ピー・エヌ・クルカル
ニ（Ｐ．Ｎ．Kulkarni）ら、キヤンサー・リサーチ（Ca
ncer Res．）第４１巻，２７００〜２７０６頁，１９８
１年）。また、抗体にメソトレキセートを、血清アルブ
ミンを薬物中間支持体として結合する方法が知られてい
る（エム・シー・ガーネツト（Ｍ．Ｃ．Garnett）ら、
インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー
（Int.J.Cancer），第３１巻，６６１〜６７０頁，１９
８３年）。しかるに、抗体またはそのフラグメントに、
オリゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体を結合
する方法は知られていないし、そうした殺細胞性抗体複
合体も知られていない。従来の抗体にメソトレキセート
を直接結合させる方法で得られる複合体では、殺細胞性
や抗腫瘍性の活性の強さと選択性が不十分であり、オリ
ゴペプチドを介する複合体ではこの点の改善が期待され
る。
胞性抗体複合体に関しては、抗体にメソトレキセート
を、縮合剤の水溶性カルボジイミドを用いて結合させる
方法、並びに、メソトレキセートの活性エステルを用い
て結合する方法が知られている（ピー・エヌ・クルカル
ニ（Ｐ．Ｎ．Kulkarni）ら、キヤンサー・リサーチ（Ca
ncer Res．）第４１巻，２７００〜２７０６頁，１９８
１年）。また、抗体にメソトレキセートを、血清アルブ
ミンを薬物中間支持体として結合する方法が知られてい
る（エム・シー・ガーネツト（Ｍ．Ｃ．Garnett）ら、
インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー
（Int.J.Cancer），第３１巻，６６１〜６７０頁，１９
８３年）。しかるに、抗体またはそのフラグメントに、
オリゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体を結合
する方法は知られていないし、そうした殺細胞性抗体複
合体も知られていない。従来の抗体にメソトレキセート
を直接結合させる方法で得られる複合体では、殺細胞性
や抗腫瘍性の活性の強さと選択性が不十分であり、オリ
ゴペプチドを介する複合体ではこの点の改善が期待され
る。
発明の開示
本発明者らは、抗体またはそのフラグメントに、オリゴ
ペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体を結合する方
法を開発すべく、またその方法によつて有用な殺細胞性
抗体複合体を開発すべく鋭意研究した。葉酸拮抗性葉酸
類似体にオリゴペプチドをそのＮ末端側で結合して得ら
れる中間体では、オリゴペプチドのＣ末端の他に葉酸拮
抗性葉酸類似体にもカルボキシル基があり、そのままで
は前者のカルボキシル基で選択的に、これを抗体または
そのフラグメントに結合することはできない。そこで、
上記中間体を適切な反応性誘導体に導くことを含め、抗
体またはそのフラグメントとの反応様式を開発すること
が必要である。
ペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体を結合する方
法を開発すべく、またその方法によつて有用な殺細胞性
抗体複合体を開発すべく鋭意研究した。葉酸拮抗性葉酸
類似体にオリゴペプチドをそのＮ末端側で結合して得ら
れる中間体では、オリゴペプチドのＣ末端の他に葉酸拮
抗性葉酸類似体にもカルボキシル基があり、そのままで
は前者のカルボキシル基で選択的に、これを抗体または
そのフラグメントに結合することはできない。そこで、
上記中間体を適切な反応性誘導体に導くことを含め、抗
体またはそのフラグメントとの反応様式を開発すること
が必要である。
本発明者らは、ハロゲン（特に沃素，臭素）化アセチル
ヒドラジド化合物は、抗体またはそのフラグメントのア
ミノ基との反応性が高いこと、並びに、葉酸拮抗性葉酸
類似体はオリゴペプチド結合部を介して、ハロゲン化ア
セチルヒドラジド誘導体に導き得ることを知見し、本発
明に到達した。
ヒドラジド化合物は、抗体またはそのフラグメントのア
ミノ基との反応性が高いこと、並びに、葉酸拮抗性葉酸
類似体はオリゴペプチド結合部を介して、ハロゲン化ア
セチルヒドラジド誘導体に導き得ることを知見し、本発
明に到達した。
即ち、本発明は、抗体またはそのフラグメントに、オリ
ゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体が結合して
いる殺細胞性抗体複合体であり、好ましくは、一般式
〔Ｉ〕 で表わされる、優れた殺細胞性と抗腫瘍性を有する殺細
胞性抗体複合体である。
ゴペプチドを介して、葉酸拮抗性葉酸類似体が結合して
いる殺細胞性抗体複合体であり、好ましくは、一般式
〔Ｉ〕 で表わされる、優れた殺細胞性と抗腫瘍性を有する殺細
胞性抗体複合体である。
また、前記のものを含む殺細胞性抗体複合体を製造する
ための、一般的な方法、即ち、抗体またはそのフラグメ
ントを、一般式〔II〕 RCONHNHCOCH2X ………〔II〕 で表わされる殺細胞性物質のハロゲン化アセチルヒドラ
ジド誘導体と反応させることを特徴とする、一般式〔II
I〕 （RCONHNHCOCH2NHnAb ………〔III〕 で表わされる殺細胞性抗体複合体の製造方法が挙げられ
る。
ための、一般的な方法、即ち、抗体またはそのフラグメ
ントを、一般式〔II〕 RCONHNHCOCH2X ………〔II〕 で表わされる殺細胞性物質のハロゲン化アセチルヒドラ
ジド誘導体と反応させることを特徴とする、一般式〔II
I〕 （RCONHNHCOCH2NHnAb ………〔III〕 で表わされる殺細胞性抗体複合体の製造方法が挙げられ
る。
本発明には、一般式［II］及び［III］の中のＲＣＯ
が、下記一般式［IV］ で表わされる場合として、抗体またはそのフラグメント
を、下記一般式［II′］ で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のハロゲン化アセチ
ルヒドラジドと反応させることを特徴とする、前記式
［Ｉ］で表わされる殺細胞性抗体複合体の製造方法が含
まれる。
が、下記一般式［IV］ で表わされる場合として、抗体またはそのフラグメント
を、下記一般式［II′］ で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のハロゲン化アセチ
ルヒドラジドと反応させることを特徴とする、前記式
［Ｉ］で表わされる殺細胞性抗体複合体の製造方法が含
まれる。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、抗体は、殺すべき細胞（以下、標的細
胞という）のもつている特定の抗原と選択的に結合して
得る免疫グロブリンをいう。かかる抗体は、例えば次の
様にして製造される。即ち、腫瘍細胞あるいは特定をリ
ンパ球等の標的細胞で免疫されたサル，ウマ，ウシ，ヤ
ギ，ヒツジ，ウサギ，ニワトリ等の動物から分離された
抗血清より、エタノール分画，硫安分画，イオン交換あ
るいは分子篩カラムクロマトグラフイー，プロテインＡ
−セフアロースカラムクロマトグラフイー等の公知の手
段によつて製造される。また、例えば、標的細胞で免疫
した動物より採取されたリンパ球を、ウイルスで形質転
換して得られた性質転換細胞や、このリンパ球と骨髄腫
細胞等とを細胞融合させて得られた特定の抗体産生性融
合細胞（ハイブリドーマ）を、細胞培養してその培養液
から、またはこれらの細胞を動物に接種して後、その血
清または腹腔液からも本発明で用いる抗体を得ることが
できる。なお、上記の抗血清あるいは抗体産生性リンパ
球を得るための免疫に用いる抗原としては、標的細胞の
他に、標的細胞より抽出された抗原物質、あるいは、人
工的に合成された標的細胞の抗原を用いることもでき
る。さらに、上記の抗体の製造において、形質転換また
は細胞融合に用いられる抗体産生性リンパ球としては、
ヒトから得られ、必要に応じ抗原物質で処理した抗原に
感作されたリンパ球も用いることができる。抗体には、
IgG，IgA，IgM，IgD，IgEの５種類があることが知られ
ているが、そのどれでも本発明に用いることができる。
胞という）のもつている特定の抗原と選択的に結合して
得る免疫グロブリンをいう。かかる抗体は、例えば次の
様にして製造される。即ち、腫瘍細胞あるいは特定をリ
ンパ球等の標的細胞で免疫されたサル，ウマ，ウシ，ヤ
ギ，ヒツジ，ウサギ，ニワトリ等の動物から分離された
抗血清より、エタノール分画，硫安分画，イオン交換あ
るいは分子篩カラムクロマトグラフイー，プロテインＡ
−セフアロースカラムクロマトグラフイー等の公知の手
段によつて製造される。また、例えば、標的細胞で免疫
した動物より採取されたリンパ球を、ウイルスで形質転
換して得られた性質転換細胞や、このリンパ球と骨髄腫
細胞等とを細胞融合させて得られた特定の抗体産生性融
合細胞（ハイブリドーマ）を、細胞培養してその培養液
から、またはこれらの細胞を動物に接種して後、その血
清または腹腔液からも本発明で用いる抗体を得ることが
できる。なお、上記の抗血清あるいは抗体産生性リンパ
球を得るための免疫に用いる抗原としては、標的細胞の
他に、標的細胞より抽出された抗原物質、あるいは、人
工的に合成された標的細胞の抗原を用いることもでき
る。さらに、上記の抗体の製造において、形質転換また
は細胞融合に用いられる抗体産生性リンパ球としては、
ヒトから得られ、必要に応じ抗原物質で処理した抗原に
感作されたリンパ球も用いることができる。抗体には、
IgG，IgA，IgM，IgD，IgEの５種類があることが知られ
ているが、そのどれでも本発明に用いることができる。
本発明において、抗体はそのままでも、あるいは抗原と
結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラグメン
ト（例えば、Fab，Fab′，F(ab′)2)でも用いることが
できる。
結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラグメン
ト（例えば、Fab，Fab′，F(ab′)2)でも用いることが
できる。
なお、本発明において、抗体とは、必要に応じて例えば
アシル化等の化学修飾を施したものも包含する。
アシル化等の化学修飾を施したものも包含する。
本発明の殺細胞性抗体複合体は、一般的に、抗体または
そのフラグメントを、一般式〔II〕 で表わされる殺細胞性物質のハロゲン化アセチルヒドラ
ジド誘導体と反応させることによつて得られる。
そのフラグメントを、一般式〔II〕 で表わされる殺細胞性物質のハロゲン化アセチルヒドラ
ジド誘導体と反応させることによつて得られる。
一般式〔II〕において、Ｒは隣接して記されているＣＯ
と一緒になつて殺細胞性物質に由来する１価の有機基を
表わすが、かかる殺細胞性物質としては、元々カルボキ
シル基を持つか、カルボキシル基を持つ誘導体に導かれ
ている限りにおいて広範囲の物質を用いることができ
る。好適に用いられる、かかる細胞毒性物質として、例
えば、次の物質を挙げることができる。
と一緒になつて殺細胞性物質に由来する１価の有機基を
表わすが、かかる殺細胞性物質としては、元々カルボキ
シル基を持つか、カルボキシル基を持つ誘導体に導かれ
ている限りにおいて広範囲の物質を用いることができ
る。好適に用いられる、かかる細胞毒性物質として、例
えば、次の物質を挙げることができる。
ニトロソウレア誘導体
クロラムブシル
マイトマイシン−Ｃ誘導体
５−フルオロ−２′−デオキシウリジン誘導体
デスアセチルビンブラスチン誘導体
本発明において、特に好ましく用いられる殺細胞性物質
は、葉酸拮抗性葉酸類似体である。葉酸拮抗性葉酸類似
体とは、細胞内において葉酸の作用を拮抗阻害する物質
で、下記の葉酸の構造 と類似した構造をしたカルボキシル基を持つ物質をい
う。かかる物質の例としては、メソトレキセート，アミ
ノプテリン，１０−エチル−１０−デアザアミノプテリ
ンを挙げることができる。
は、葉酸拮抗性葉酸類似体である。葉酸拮抗性葉酸類似
体とは、細胞内において葉酸の作用を拮抗阻害する物質
で、下記の葉酸の構造 と類似した構造をしたカルボキシル基を持つ物質をい
う。かかる物質の例としては、メソトレキセート，アミ
ノプテリン，１０−エチル−１０−デアザアミノプテリ
ンを挙げることができる。
一般式〔Ｉ〕において、Ｒ′は隣接して記されているＣ
Ｏと一緒になつて、葉酸拮抗性葉酸類似体残基を表わ
す。即ち、葉酸拮抗性葉酸類似体よりカルボキシル基１
個を除いた１価の有機基であり、かかる有機基の例とし
ては、(1)メソトレキセート残基の および (2)アミノプテリン残基の および (3)１０−エチル−１０−デアザアミノプテリン残基の および 等を挙げることができる。
Ｏと一緒になつて、葉酸拮抗性葉酸類似体残基を表わ
す。即ち、葉酸拮抗性葉酸類似体よりカルボキシル基１
個を除いた１価の有機基であり、かかる有機基の例とし
ては、(1)メソトレキセート残基の および (2)アミノプテリン残基の および (3)１０−エチル−１０−デアザアミノプテリン残基の および 等を挙げることができる。
本発明において用いられるオリゴペプチドとしては、ア
ミノ酸残基の数が３〜６個のものが挙げられる。その好
適な例としては、例えば、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル
−Ｌ−ロイシン，Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−アラニン，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンが挙げられる。なお、その
他の参考例として，グリシルグリシルグリシン，グリシ
ル−Ｌ−フエニルアラニン−Ｌ−ロイシル−グリシン，
グリシル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ン−Ｌ−ロイシン等を挙げることができる。
ミノ酸残基の数が３〜６個のものが挙げられる。その好
適な例としては、例えば、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル
−Ｌ−ロイシン，Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−アラニン，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンが挙げられる。なお、その
他の参考例として，グリシルグリシルグリシン，グリシ
ル−Ｌ−フエニルアラニン−Ｌ−ロイシル−グリシン，
グリシル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ン−Ｌ−ロイシン等を挙げることができる。
一般式〔IIまたII′〕において、Ｘで表わされるハロゲ
ン原子としては、沃素，臭素，塩素原子が好ましく、中
でも沃素原子，臭素原子が特に好ましい。
ン原子としては、沃素，臭素，塩素原子が好ましく、中
でも沃素原子，臭素原子が特に好ましい。
また、本発明において、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−ロイシンを含むオリゴペプチドとは、Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンが細胞内において開裂す
るのを妨げない限りにおいて特に制限を受けないが、Ｌ
−ロイシン，Ｌ−アラニン以外に構成アミノ酸を持つ場
合には、かかるアミノ酸は化学反応性に富んだ官能基を
持たないアミノ酸であることが望ましい。Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンを含むオリゴペプチドで
特に好ましいのは、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
ロイシン，Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニン，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−ロイシン等である。
Ｌ−ロイシンを含むオリゴペプチドとは、Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンが細胞内において開裂す
るのを妨げない限りにおいて特に制限を受けないが、Ｌ
−ロイシン，Ｌ−アラニン以外に構成アミノ酸を持つ場
合には、かかるアミノ酸は化学反応性に富んだ官能基を
持たないアミノ酸であることが望ましい。Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンを含むオリゴペプチドで
特に好ましいのは、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
ロイシン，Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル
−Ｌ−アラニン，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−ロイシン等である。
なお、本発明において用いられる一般式〔II〕と〔IV〕
で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・
ハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体は、例えば下記
式、 Ｒ′−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＣＯ−ＯＣＨ３ 〔Ｒ′およびＹの定義は式〔IV〕に同じ。〕 で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・
エステル誘導体をヒドラジン水和物で処理してヒドラジ
ド誘導体とした後、ハロゲン化酢酸の活性エステルと反
応させることによつて製造することができる。
で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・
ハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体は、例えば下記
式、 Ｒ′−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＣＯ−ＯＣＨ３ 〔Ｒ′およびＹの定義は式〔IV〕に同じ。〕 で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・
エステル誘導体をヒドラジン水和物で処理してヒドラジ
ド誘導体とした後、ハロゲン化酢酸の活性エステルと反
応させることによつて製造することができる。
本発明方法において、抗体またはそのフラグメント１モ
ルに対して、式〔II〕と〔IV〕で表わされる葉酸拮抗性
葉酸類似体のオリゴペプチド・ハロゲン化アセチルヒド
ラジト誘導体は１〜１００モル使用するのが好ましく、
反応は、例えば、抗体またはそのフラグメントのpH６〜
９の緩衝液の溶液（蛋白濃度は好ましくは１〜４０mg／
mlに調節する）に、０〜３７℃で撹拌しながら、少量の
溶媒、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等に溶か
した葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・ハロゲン
化アセチルヒドラジト誘導体を添加し、１５分〜２４時
間行なわれる。その後反応混合物をゲル過あるいは透
析することによつて、未反応の葉酸拮抗性葉酸類似体の
オリゴペプチド・ハロゲン化アセチルヒドラジト誘導体
を除き、式〔Ｉ〕で表わされる殺細胞性抗体複合体を精
製することができる。
ルに対して、式〔II〕と〔IV〕で表わされる葉酸拮抗性
葉酸類似体のオリゴペプチド・ハロゲン化アセチルヒド
ラジト誘導体は１〜１００モル使用するのが好ましく、
反応は、例えば、抗体またはそのフラグメントのpH６〜
９の緩衝液の溶液（蛋白濃度は好ましくは１〜４０mg／
mlに調節する）に、０〜３７℃で撹拌しながら、少量の
溶媒、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等に溶か
した葉酸拮抗性葉酸類似体のオリゴペプチド・ハロゲン
化アセチルヒドラジト誘導体を添加し、１５分〜２４時
間行なわれる。その後反応混合物をゲル過あるいは透
析することによつて、未反応の葉酸拮抗性葉酸類似体の
オリゴペプチド・ハロゲン化アセチルヒドラジト誘導体
を除き、式〔Ｉ〕で表わされる殺細胞性抗体複合体を精
製することができる。
以下に本発明を実施例により詳述する。
実施例 １
(イ) 殺細胞性抗体複合体の製造
マウス乳癌細胞MM46に対するマウスモノクローナル抗体
IgG2a ９．１mgを０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）１．１mlに溶解し、
これに、下記式〔II−１〕、 で表わされるメソトレキセート（以下ＭＴＸという）誘
導体と下記式〔II−２〕 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕で表わされるＭＴ
Ｘ誘導体の混合物のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液
（４８．８mg／ml）５０μを添加して、室温で１７時
間反応させた。反応後、リン酸緩衝化食塩水（以下ＰＢ
Ｓという）に充分透析し、抗MM46抗体１分子当り、平均
９．４個のＭＴＸ誘導体を結合した殺細胞性抗体複合体
６．８mgを得た。なおIgGに対するＭＴＸの結合数は２
８０nmと３７２nmの吸光度（それぞれＡ280 とＡ372 と
いう）を測定することにより求めた。即ち、Ａ372 から
ＭＴＸの濃度を求め、またＡ280 をＭＴＸ濃度で補正し
てIgG濃度を求め、IgG１分子当りのＭＴＸの平均結合数
を求めた。
IgG2a ９．１mgを０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）１．１mlに溶解し、
これに、下記式〔II−１〕、 で表わされるメソトレキセート（以下ＭＴＸという）誘
導体と下記式〔II−２〕 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕で表わされるＭＴ
Ｘ誘導体の混合物のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液
（４８．８mg／ml）５０μを添加して、室温で１７時
間反応させた。反応後、リン酸緩衝化食塩水（以下ＰＢ
Ｓという）に充分透析し、抗MM46抗体１分子当り、平均
９．４個のＭＴＸ誘導体を結合した殺細胞性抗体複合体
６．８mgを得た。なおIgGに対するＭＴＸの結合数は２
８０nmと３７２nmの吸光度（それぞれＡ280 とＡ372 と
いう）を測定することにより求めた。即ち、Ａ372 から
ＭＴＸの濃度を求め、またＡ280 をＭＴＸ濃度で補正し
てIgG濃度を求め、IgG１分子当りのＭＴＸの平均結合数
を求めた。
なお、前記ＭＴＸ誘導体は、まずＭＴＸに、通常のペプ
チド合成法で合成したペプチドＬ−ロイシル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン・メチルエステルを
縮合剤（Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド）
を用いて縮合させ、得られた縮合体のペプチドのメチル
エステルをヒドラジン水和物を用いてヒドラジドとし、
次いで、ヒドラジン残基をヨード酢酸・パラニトロフエ
ニルエステルでヨードアセチル化することによつて得
た。
チド合成法で合成したペプチドＬ−ロイシル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン・メチルエステルを
縮合剤（Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド）
を用いて縮合させ、得られた縮合体のペプチドのメチル
エステルをヒドラジン水和物を用いてヒドラジドとし、
次いで、ヒドラジン残基をヨード酢酸・パラニトロフエ
ニルエステルでヨードアセチル化することによつて得
た。
(ロ) 殺細胞性抗体複合体の培養腫瘍細胞に対する殺細
胞効果 マウス乳癌MM46細胞を、２．５×１０４細胞／mlとなる
よう１０％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に懸濁
し、９６穴平底プレートの各穴に０．２mlずつ分注し
た。次に、上記培地に溶解した種々の濃度の殺細胞性抗
体複合体（上記(イ)にて製造）を０．０２ml添加して撹
拌し、５％ＣＯ２雰囲気下に、３７℃で３日間培養し
た。以上の操作は無菌的に実施した。培養後、３％トリ
パンブルー溶液０．０２mlを添加し、トリパンブルーで
染色されない生細胞を顕微鏡下に計数した。
胞効果 マウス乳癌MM46細胞を、２．５×１０４細胞／mlとなる
よう１０％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に懸濁
し、９６穴平底プレートの各穴に０．２mlずつ分注し
た。次に、上記培地に溶解した種々の濃度の殺細胞性抗
体複合体（上記(イ)にて製造）を０．０２ml添加して撹
拌し、５％ＣＯ２雰囲気下に、３７℃で３日間培養し
た。以上の操作は無菌的に実施した。培養後、３％トリ
パンブルー溶液０．０２mlを添加し、トリパンブルーで
染色されない生細胞を顕微鏡下に計数した。
結果は第１表にまとめた。MM46細胞は、何も添加しなか
つた場合、３日間培養すると約１×１０６／mlまで増殖
したが、(イ)にて製造した殺細胞性抗体複合体を添加す
ると、添加量に依存して生細胞数が減少した。
つた場合、３日間培養すると約１×１０６／mlまで増殖
したが、(イ)にて製造した殺細胞性抗体複合体を添加す
ると、添加量に依存して生細胞数が減少した。
特に、ＭＴＸ相当１０μＭでは、生細胞数は、抗体複合
体を添加しないで培養した場合の１％以下という非常に
高い殺細胞効果が示された。
体を添加しないで培養した場合の１％以下という非常に
高い殺細胞効果が示された。
(ハ) メソトレキセートのヨードアセチルヒドラジド誘
導体が抗体（免疫グロブリン）分子のアミノ基と反応し
ていることの証明 前記式〔II−１〕で表わされるメソトレキセートのヨー
ドアセチルヒドラジド誘導体（ＭＴＸ誘導体）のＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド溶液（１３．４mg／ml）１００
μを、ウサギγ−グロブリン（以下、ＲＧＧと言う）
溶液（５mg／ml，０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に溶解したもの）１ml
に添加して反応させた。この時、１つの実験では、予め
ＲＧＧ溶液に１Ｍエタノールアミンを、また他の実験で
は０．９％塩化ナトリウムを、それぞれ１００μ添加
しておいた。
導体が抗体（免疫グロブリン）分子のアミノ基と反応し
ていることの証明 前記式〔II−１〕で表わされるメソトレキセートのヨー
ドアセチルヒドラジド誘導体（ＭＴＸ誘導体）のＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド溶液（１３．４mg／ml）１００
μを、ウサギγ−グロブリン（以下、ＲＧＧと言う）
溶液（５mg／ml，０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に溶解したもの）１ml
に添加して反応させた。この時、１つの実験では、予め
ＲＧＧ溶液に１Ｍエタノールアミンを、また他の実験で
は０．９％塩化ナトリウムを、それぞれ１００μ添加
しておいた。
室温にて１４時間反応させた後、反応液を０．１４Ｍ塩
化ナトリウムを含む１０Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）
（以下、ＰＢＳと言う）に充分透析して、低分子の試薬
類を除去した。透析内液を遠心分離して、上清の２８０
nmと３７２nmの吸光度を測定した。Ａ372からＭＴＸの
濃度を求め、またＡ280をＭＴＸの吸収で補正して、Ｒ
ＧＧ濃度を求めた。こうして、ＭＴＸ誘導体の反応率及
び、ＲＧＧに対するＭＴＸの結合比を求めた。
化ナトリウムを含む１０Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）
（以下、ＰＢＳと言う）に充分透析して、低分子の試薬
類を除去した。透析内液を遠心分離して、上清の２８０
nmと３７２nmの吸光度を測定した。Ａ372からＭＴＸの
濃度を求め、またＡ280をＭＴＸの吸収で補正して、Ｒ
ＧＧ濃度を求めた。こうして、ＭＴＸ誘導体の反応率及
び、ＲＧＧに対するＭＴＸの結合比を求めた。
結果を第２表に示した。上記の条件で、ＭＴＸ誘導体
は、エタノールアミン非添加で、ＲＧＧ１分子当り平均
５．８個結合した。ところが、エタノールアミンを添加
すると、０．６個と著しく反応が抑制された。このこと
から、ＭＴＸ誘導体とＲＧＧの反応が、アミノ基を介す
るものであることが証明された。
は、エタノールアミン非添加で、ＲＧＧ１分子当り平均
５．８個結合した。ところが、エタノールアミンを添加
すると、０．６個と著しく反応が抑制された。このこと
から、ＭＴＸ誘導体とＲＧＧの反応が、アミノ基を介す
るものであることが証明された。
実施例 ２
抗MM46殺細胞性抗体複合体，非特異的グロブリン複合
体，およびグロブリン結合前のＭＴＸ誘導体の殺細胞性
の比較 抗MM46の代りに正常（非特異的）マウス−γ−グロブリ
ンを用い、実施例１(イ)と同様の方法によつて、実施例
１に記載したＭＴＸ誘導体をグロブリン１分子当り平均
７．９個結合した非特異的グロブリン複合体を得た。
体，およびグロブリン結合前のＭＴＸ誘導体の殺細胞性
の比較 抗MM46の代りに正常（非特異的）マウス−γ−グロブリ
ンを用い、実施例１(イ)と同様の方法によつて、実施例
１に記載したＭＴＸ誘導体をグロブリン１分子当り平均
７．９個結合した非特異的グロブリン複合体を得た。
実施例１(イ)で製造した抗MM46殺細胞性抗体複合体，非
特異的グロブリン複合体，およびグロブリン結合前のＭ
ＴＸ誘導体につき、実施例１(ロ)の如くして、培養MM46
細胞に対する殺細胞効果を調べた。
特異的グロブリン複合体，およびグロブリン結合前のＭ
ＴＸ誘導体につき、実施例１(ロ)の如くして、培養MM46
細胞に対する殺細胞効果を調べた。
結果を第３表にまとめた。抗MM46殺細胞性抗体複合体
は、他の二者に比し、はるかに低い濃度で、殺細胞効果
を発現した。即ち、Ｌ1210生細胞数を、抗体複合体を添
加しないで培養した場合の５０％に抑制するのに必要な
抗体複合体の濃度（ＭＴＸ相当）は、抗MM46抗体複合体
では非特異的複合体の約１０分の１であつた。
は、他の二者に比し、はるかに低い濃度で、殺細胞効果
を発現した。即ち、Ｌ1210生細胞数を、抗体複合体を添
加しないで培養した場合の５０％に抑制するのに必要な
抗体複合体の濃度（ＭＴＸ相当）は、抗MM46抗体複合体
では非特異的複合体の約１０分の１であつた。
更に、テトラペプチドを介してＭＴＸを結合させる本発
明方法によつて製造した抗MM46複合体の対応する非特異
的複合体の活性の差を、ＭＴＸの活性エステルを用いて
直接結合させる従来法によつて製造した抗MM46複合体と
対応する非特異的複合体の活性の差と比較したところ、
前者の方が４倍大きかつた。
明方法によつて製造した抗MM46複合体の対応する非特異
的複合体の活性の差を、ＭＴＸの活性エステルを用いて
直接結合させる従来法によつて製造した抗MM46複合体と
対応する非特異的複合体の活性の差と比較したところ、
前者の方が４倍大きかつた。
実施例 ３
抗ヒトメラノーマ殺細胞性抗体複合体の製造とその抗腫
瘍性評価 抗MM46抗体の代りにヒト・メラノーマ細胞に対するマウ
スモノクローナル抗体IgG2a並びに正常（非特異的）ウ
サギ−γ−グロブリンを用い、実施例１(イ)と同様の方
法によつて、実施例１に記載したＭＴＸ誘導体をIgG１
分子当り、それぞれ５．４個，４．４個結合した抗ヒト
メラノーマ殺細胞性抗体複合体並びに非特異的グロブリ
ン複合体を得た。これらの複合体を用い以下に記す抗腫
瘍性評価試験を行つた。
瘍性評価 抗MM46抗体の代りにヒト・メラノーマ細胞に対するマウ
スモノクローナル抗体IgG2a並びに正常（非特異的）ウ
サギ−γ−グロブリンを用い、実施例１(イ)と同様の方
法によつて、実施例１に記載したＭＴＸ誘導体をIgG１
分子当り、それぞれ５．４個，４．４個結合した抗ヒト
メラノーマ殺細胞性抗体複合体並びに非特異的グロブリ
ン複合体を得た。これらの複合体を用い以下に記す抗腫
瘍性評価試験を行つた。
１群５匹の、ヒトメラノーマ細胞ＫＨｍ−１を腹側部皮
下に移植したヌードマウスに、腫瘍移植１０日目より５
日おきに３回、抗ヒトメラノーマ殺細胞性抗体複合体、
非特異的グロブリン複合体、並びに、抗ヒトメラノーマ
殺細胞性抗体複合体に含まれていると同量の抗ヒトメラ
ノーマ抗体とＭＴＸの混合物を投与した。
下に移植したヌードマウスに、腫瘍移植１０日目より５
日おきに３回、抗ヒトメラノーマ殺細胞性抗体複合体、
非特異的グロブリン複合体、並びに、抗ヒトメラノーマ
殺細胞性抗体複合体に含まれていると同量の抗ヒトメラ
ノーマ抗体とＭＴＸの混合物を投与した。
検体を投与しないヌードマウス（１０匹）を対照群とし
た。腫瘍移植３０日目に腫瘍を摘出しその重量を計測し
た。抗ヒトメラノーマ殺細胞性抗本複合体投与群のみ、
著しい腫瘍増殖の抑制がみられ、その平均重量は対照群
の２７％であつた。
た。腫瘍移植３０日目に腫瘍を摘出しその重量を計測し
た。抗ヒトメラノーマ殺細胞性抗本複合体投与群のみ、
著しい腫瘍増殖の抑制がみられ、その平均重量は対照群
の２７％であつた。
実施例 ４
実施例１における式〔II−１〕で表わされるＭＴＸ誘導
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代りに、下記式〔II−３〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされるアミノプテリン（以下ＡＭＮという）誘導
体と下記式〔II−４〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り７．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代りに、下記式〔II−３〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされるアミノプテリン（以下ＡＭＮという）誘導
体と下記式〔II−４〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り７．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
実施例 ５
実施例１における式〔II−１〕で表わされるＭＴＸ誘導
体の混合物の代りに、下記式〔II−５〕、 で表わされるＭＴＸ誘導体と下記式〔II−６〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物を用いて、実施例
(イ)と同様の方法によつて、ＭＴＸ誘導体をIgG１分子当
り５．７個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
体の混合物の代りに、下記式〔II−５〕、 で表わされるＭＴＸ誘導体と下記式〔II−６〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物を用いて、実施例
(イ)と同様の方法によつて、ＭＴＸ誘導体をIgG１分子当
り５．７個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
実施例 ６
実施例１における抗MM46抗体の代りに実施例３で用いた
抗ヒト・メラノーマ抗体を、また、式〔II−１〕で表わ
されるＭＴＸ誘導体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ
誘導体の混合物の代りに、下記式〔II−７〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体と下記式〔II−８〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り６．１個結合した抗ヒト・メラノーマ殺細胞性抗体複
合体を製造した。
抗ヒト・メラノーマ抗体を、また、式〔II−１〕で表わ
されるＭＴＸ誘導体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ
誘導体の混合物の代りに、下記式〔II−７〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体と下記式〔II−８〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り６．１個結合した抗ヒト・メラノーマ殺細胞性抗体複
合体を製造した。
実施例 ７
実施例１における式〔II−１〕で表わされるＭＴＸ誘導
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−９〕、 で表わされるＭＴＸ誘導体と下記式〔II−10〕、 〔Ｇの定義は式〔II−９〕に同じ。〕 で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＭＴＸ誘導体をIgG１分子当
り８．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−９〕、 で表わされるＭＴＸ誘導体と下記式〔II−10〕、 〔Ｇの定義は式〔II−９〕に同じ。〕 で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＭＴＸ誘導体をIgG１分子当
り８．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
実施例 ８
実施例１における式〔II−１〕で表わされるＭＴＸ誘導
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−11〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされる１０−エチル−１０−デアザアミノプテリ
ン（以下１０−ＥｄＡＭという）誘導体と下記式〔II−
12〕、 〔Ａの定義は式〔II−11〕に同じ。〕 で表わされる10−ＥｄＡＭ誘導体の混合物を用いて、実
施例１(イ)と同様の方法によつて、10−ＥｄＡＭ誘導体
をIgG１分子当り８．１個結合した抗ヒト・メラノーマ
殺細胞性抗体複合体を製造した。
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−11〕、 〔Ａの定義は式〔II−１〕に同じ。〕 で表わされる１０−エチル−１０−デアザアミノプテリ
ン（以下１０−ＥｄＡＭという）誘導体と下記式〔II−
12〕、 〔Ａの定義は式〔II−11〕に同じ。〕 で表わされる10−ＥｄＡＭ誘導体の混合物を用いて、実
施例１(イ)と同様の方法によつて、10−ＥｄＡＭ誘導体
をIgG１分子当り８．１個結合した抗ヒト・メラノーマ
殺細胞性抗体複合体を製造した。
実施例 ９
実施例１における式〔II−１〕で表わされるＭＴＸ誘導
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−13〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体と下記式〔II−14〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り２．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
体と式〔II−２〕で表わされるＭＴＸ誘導体の混合物の
代わりに、下記式〔II−13〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体と下記式〔II−14〕、 〔Ｅの定義は式〔II−５〕に同じ。〕 で表わされるＡＭＮ誘導体の混合物を用いて、実施例１
(イ)と同様の方法によつて、ＡＭＮ誘導体をIgG１分子当
り２．２個結合した抗MM46殺細胞性抗体複合体を製造し
た。
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フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭51−126281（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−186924（ＪＰ，Ａ)
特表 昭61−501449（ＪＰ，Ａ)
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏ
ｌ．35，Ｎｏ．３，Ｐ．1128−1137（1987
年３月発行)
Claims (5)
- 【請求項１】上記一般式［Ｉ］で表わされる殺細胞性抗
体複合体 - 【請求項２】抗体がモノクローナル抗体である、請求の
範囲第１項記載の殺細胞性抗体複合体。 - 【請求項３】オリゴペプチドがＬ−ロイシル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシン、またはＬ−
ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシンである請求の範
囲第１項または第２項記載の殺細胞性抗体複合体。 - 【請求項４】葉酸拮抗性葉酸類似体がメソトレキセー
ト、アミノプテリン、または１０−エチル−１０−デア
ザアミノプテリンである請求の範囲第１項から第３項ま
でのいずれかに記載の殺細胞性抗体複合体。 - 【請求項５】抗体またはそのフラグメントを、下記一般
式［II′］ で表わされる葉酸拮抗性葉酸類似体のハロゲン化アセチ
ルヒドラジドと反応させることを特徴とする下記一般式
［Ｉ］ で表わされる殺細胞性抗体複合体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-504967A JPH0662438B2 (ja) | 1986-08-28 | 1987-08-24 | 殺細胞性抗体複合体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20014286 | 1986-08-28 | ||
| JP61-200142 | 1986-08-28 | ||
| JP61-273953 | 1986-11-19 | ||
| JP27395386 | 1986-11-19 | ||
| JP16855987 | 1987-07-08 | ||
| JP62-168559 | 1987-07-08 | ||
| JP62-504967A JPH0662438B2 (ja) | 1986-08-28 | 1987-08-24 | 殺細胞性抗体複合体及びその製造方法 |
| PCT/JP1987/000625 WO1988001513A1 (fr) | 1986-08-28 | 1987-08-24 | Complexe d'anticorps cytocide et procede de production |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO1988001513A1 JPWO1988001513A1 (ja) | 1988-06-02 |
| JPH0662438B1 JPH0662438B1 (ja) | 1994-08-17 |
| JPH0662438B2 true JPH0662438B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=27474205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62-504967A Expired - Lifetime JPH0662438B2 (ja) | 1986-08-28 | 1987-08-24 | 殺細胞性抗体複合体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662438B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51126281A (en) * | 1975-02-04 | 1976-11-04 | Searle & Co | Cytootoxic substance |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
-
1987
- 1987-08-24 JP JP62-504967A patent/JPH0662438B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．３５，Ｎｏ．３，Ｐ．１１２８−１１３７（１９８７年３月発行） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662438B1 (ja) | 1994-08-17 |
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