JPH0662675B2 - ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法 - Google Patents
ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法Info
- Publication number
- JPH0662675B2 JPH0662675B2 JP58030938A JP3093883A JPH0662675B2 JP H0662675 B2 JPH0662675 B2 JP H0662675B2 JP 58030938 A JP58030938 A JP 58030938A JP 3093883 A JP3093883 A JP 3093883A JP H0662675 B2 JPH0662675 B2 JP H0662675B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- toxin
- salt
- precipitate
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 7
- 108700017751 botulinum toxin type C Proteins 0.000 title 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 28
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 24
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims description 12
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims description 12
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims description 12
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 14
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はボツリヌス菌が産生するＣ型毒素の精製法に関
する。
する。
従来ボツリヌス菌が産生するＣ型毒素はキジ、ミンク、
牛、羊などのワクチンとして利用されている。しかしな
がら従来の精製法ではＣ型毒素の純度が低く充分な抗体
が得られない欠点があつた。
牛、羊などのワクチンとして利用されている。しかしな
がら従来の精製法ではＣ型毒素の純度が低く充分な抗体
が得られない欠点があつた。
従来ボツリヌス菌が産生するＣ型毒素の精製法として
は、ボツリヌス菌を強化クツクトミート培地（炭酸カル
シウム0.5％、硫安1.0％、ブドウ糖1.0％、酵母エキス
1.0％、システイン0.1％）（pH7.6）を使用して３７℃
で２日間培養し、芽胞産生を確認した後硫安を加えて沈
殿させ、これをカラムクロマトグラフイーおよびゲル
過を行つて精製する方法が採用されている。
は、ボツリヌス菌を強化クツクトミート培地（炭酸カル
シウム0.5％、硫安1.0％、ブドウ糖1.0％、酵母エキス
1.0％、システイン0.1％）（pH7.6）を使用して３７℃
で２日間培養し、芽胞産生を確認した後硫安を加えて沈
殿させ、これをカラムクロマトグラフイーおよびゲル
過を行つて精製する方法が採用されている。
しかしながらかかる従来法は前記したようにＣ型毒素の
精製が充分でなく且つ収量が少ないためにワクチンとし
て使用するには不充分であつた。
精製が充分でなく且つ収量が少ないためにワクチンとし
て使用するには不充分であつた。
本発明者はこれら従来の欠点を解決すべく種種研究を重
ねた結果、本発明を完成するに至つた。
ねた結果、本発明を完成するに至つた。
すなわち本発明は、クロストリジウム属に属するボツリ
ヌス菌のＣ型毒素を産出する生産菌株を培養して得られ
たＣ型毒素含有培養液を水で４〜６倍に希釈した後リボ
核酸を加え、酸でpH3.8〜4.0に調整し、得られた沈殿物
をpH7.0〜8.0の食塩含有緩衝液で毒性成分を溶出し、こ
の溶液をpH3.8〜4.0の酸緩衝液溶媒と半透膜を介して接
触させる透析処理を行い、次いで前記食塩含有緩衝液か
ら生成した沈殿物を分離し、それを食塩、酸含有緩衝液
に溶解し、この溶液をプロタミンで処理した後さらに限
外濾過してボツリヌス菌Ｃ型毒素を取得することを特徴
とするボツリヌス菌Ｃ型毒素の精製法に関する。
ヌス菌のＣ型毒素を産出する生産菌株を培養して得られ
たＣ型毒素含有培養液を水で４〜６倍に希釈した後リボ
核酸を加え、酸でpH3.8〜4.0に調整し、得られた沈殿物
をpH7.0〜8.0の食塩含有緩衝液で毒性成分を溶出し、こ
の溶液をpH3.8〜4.0の酸緩衝液溶媒と半透膜を介して接
触させる透析処理を行い、次いで前記食塩含有緩衝液か
ら生成した沈殿物を分離し、それを食塩、酸含有緩衝液
に溶解し、この溶液をプロタミンで処理した後さらに限
外濾過してボツリヌス菌Ｃ型毒素を取得することを特徴
とするボツリヌス菌Ｃ型毒素の精製法に関する。
そこで本発明はまずクロストリジウム属に属するボツリ
ヌス菌を培養して芽胞を産生させた後に、その培養液を
分別する。分別した培養液に水を加えて４〜６倍に希釈
する。この希釈倍率が４倍未満であると培養液中の蛋白
質濃度が高く、また希釈倍率が６倍を超えると蛋白質濃
度が低くなりいずれの場合もボツリヌス菌Ｃ型毒素の収
量を高めることはできない。
ヌス菌を培養して芽胞を産生させた後に、その培養液を
分別する。分別した培養液に水を加えて４〜６倍に希釈
する。この希釈倍率が４倍未満であると培養液中の蛋白
質濃度が高く、また希釈倍率が６倍を超えると蛋白質濃
度が低くなりいずれの場合もボツリヌス菌Ｃ型毒素の収
量を高めることはできない。
次に希釈された培養液にリボ核酸を加え、これに例えば
硫酸のような酸類を添加してpH3.8〜4.0に調整するとＣ
型毒素を含有した沈殿が生成する。得られた沈殿物をpH
7.0〜8.0の食塩含有緩衝液で処理して毒性成分を溶出す
る。この際用いる食塩含有緩衝液としては食塩含有トリ
ス塩酸緩衝液が挙げられる。次にこの溶液をpH3.8〜4.0
の酸緩衝液と半透膜を介して接触させる透析処理に付す
ると食塩含有緩衝液中に沈殿が生成する。この沈殿物を
食塩酸含有液に溶解し、これをプロタミンで処理して過
剰のリボ核酸を除去する。得られた抽出液は好ましくは
分子量30,000程度で分画できる過膜を使用して限外
過を行う。この限外過に使用する過膜としては例え
ばアミコンPM30（アミコン・コーポレイシヨン製品）、
UK-50〔東洋紙（株）製品〕が挙げられる。
硫酸のような酸類を添加してpH3.8〜4.0に調整するとＣ
型毒素を含有した沈殿が生成する。得られた沈殿物をpH
7.0〜8.0の食塩含有緩衝液で処理して毒性成分を溶出す
る。この際用いる食塩含有緩衝液としては食塩含有トリ
ス塩酸緩衝液が挙げられる。次にこの溶液をpH3.8〜4.0
の酸緩衝液と半透膜を介して接触させる透析処理に付す
ると食塩含有緩衝液中に沈殿が生成する。この沈殿物を
食塩酸含有液に溶解し、これをプロタミンで処理して過
剰のリボ核酸を除去する。得られた抽出液は好ましくは
分子量30,000程度で分画できる過膜を使用して限外
過を行う。この限外過に使用する過膜としては例え
ばアミコンPM30（アミコン・コーポレイシヨン製品）、
UK-50〔東洋紙（株）製品〕が挙げられる。
前記のようにして得られたボツリヌス菌Ｃ型毒素は所望
によりさらにカラムクロマトグラフイー、ゲル過等の
処理を行つて純度を高めることができる。このカラムク
ロマトグラフイーに使用する充填物としては例えばSP-
セフアデツクス（フアルマシア社製品）等の強酸性イオ
ン交換体が挙げられ、またゲル過処理にはセフアデツ
クスG-200（フアルマシア社製品）等のデキストランゲ
ルが使用できる。
によりさらにカラムクロマトグラフイー、ゲル過等の
処理を行つて純度を高めることができる。このカラムク
ロマトグラフイーに使用する充填物としては例えばSP-
セフアデツクス（フアルマシア社製品）等の強酸性イオ
ン交換体が挙げられ、またゲル過処理にはセフアデツ
クスG-200（フアルマシア社製品）等のデキストランゲ
ルが使用できる。
本発明方法によればボツリヌス菌Ｃ型毒素の純度および
収量が高められるために例えばキジ１羽当りの接種量を
２１μｇとすると１万羽分の精製ワクチン製造に必要な
培養液は５で充分であるのに対し、従来法では４０
を必要とする。
収量が高められるために例えばキジ１羽当りの接種量を
２１μｇとすると１万羽分の精製ワクチン製造に必要な
培養液は５で充分であるのに対し、従来法では４０
を必要とする。
次に本発明をさらに詳細に説明するために実施例を掲げ
るが本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
るが本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１ 酵母エキス１％、硫酸アンモニウム１％、ブドウ糖１
％、可溶性殿粉0.5％、炭酸カルシウム0.5％およびｌ−
システイン塩酸塩0.1％を含有する基礎培地６００mlに
クツクトミート培地７５ｇを加えてなる炭酸カルシウム
含有クツクトミート培地を１２０℃で１５分間高圧滅菌
した。この培地にボツリヌス菌を接種し３７℃において
２日間培養した。この培養液から上清液４７７mlを得、
得られた上清液に蒸留水を1908ml添加して希釈液を調製
する。希釈液にリボ核酸0.95ｇを加えて希硫酸でpH3.9
に調整する。生成した沈殿を分取して沈殿物を得た。こ
の沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.
5)で処理するとＣ型毒素は溶出されて毒素を含む溶液14
0mlが得られる。この溶液をpH4.0の半透膜製の袋に入れ
てそれをpH4.0の0.05Ｍ酢酸緩衝液に浸漬して透析処理
すると袋中に沈殿が生成する。この沈殿物を分離して、
それを１Ｍ食塩含有酢酸緩衝液に溶解し不溶物を除去し
て、溶液65mlを得る。この溶液に等量の１Ｍ食塩含有0.
05Ｍクエン酸緩衝液(pH4.5)を加え、分光光度計で測定
しながら２８０〜２６０nmの読みが同じになるまでプロ
タミンを加えるとリボ核酸がプロタミンと結合して沈殿
物として沈降する。プロタミン処理された処理液の上清
液１３６mlをアミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ
食塩含有酢酸緩衝液(pH4.5)で希釈し、遠心分離して上
清液を得る。
％、可溶性殿粉0.5％、炭酸カルシウム0.5％およびｌ−
システイン塩酸塩0.1％を含有する基礎培地６００mlに
クツクトミート培地７５ｇを加えてなる炭酸カルシウム
含有クツクトミート培地を１２０℃で１５分間高圧滅菌
した。この培地にボツリヌス菌を接種し３７℃において
２日間培養した。この培養液から上清液４７７mlを得、
得られた上清液に蒸留水を1908ml添加して希釈液を調製
する。希釈液にリボ核酸0.95ｇを加えて希硫酸でpH3.9
に調整する。生成した沈殿を分取して沈殿物を得た。こ
の沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.
5)で処理するとＣ型毒素は溶出されて毒素を含む溶液14
0mlが得られる。この溶液をpH4.0の半透膜製の袋に入れ
てそれをpH4.0の0.05Ｍ酢酸緩衝液に浸漬して透析処理
すると袋中に沈殿が生成する。この沈殿物を分離して、
それを１Ｍ食塩含有酢酸緩衝液に溶解し不溶物を除去し
て、溶液65mlを得る。この溶液に等量の１Ｍ食塩含有0.
05Ｍクエン酸緩衝液(pH4.5)を加え、分光光度計で測定
しながら２８０〜２６０nmの読みが同じになるまでプロ
タミンを加えるとリボ核酸がプロタミンと結合して沈殿
物として沈降する。プロタミン処理された処理液の上清
液１３６mlをアミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ
食塩含有酢酸緩衝液(pH4.5)で希釈し、遠心分離して上
清液を得る。
一方、SP-セフアデツクスが充填されたカラム（2.5×１
５cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH4.0)を流下さ
せて平衝化を行う。このカラムに前記限外過して得ら
れた上清液１１０mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
５cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH4.0)を流下さ
せて平衝化を行う。このカラムに前記限外過して得ら
れた上清液１１０mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
次に0.2〜0.5Ｍの食塩含有酢酸緩衝液で濃度勾配クロマ
ト処理を実施してＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５
０mlを分取する。得られたフラクシヨンを一旦限外過
により濃縮しセフアデツクスG-200を充填したカラム
（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
ト処理を実施してＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５
０mlを分取する。得られたフラクシヨンを一旦限外過
により濃縮しセフアデツクスG-200を充填したカラム
（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
次に各操作工程における分析結果を示せば下記のとおり
である。
である。
実施例２ 実施例１と同様にして培養した培養液を分別し上清液４
７７mlを得た。得られた上清液に蒸留水1431mlを添加し
て希釈液を調製する。希釈液にリボ核酸0.57ｇを加えて
希硫酸でpH3.8に調整する。生成した沈殿を分取した。
この沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH
7.0)に加えて処理するとＣ型毒素が抽出される。この溶
液140mlを0.05Ｍ酢酸緩衝液(pH3.8)を用いて透析処理を
行い沈殿物を得る。この沈殿物を１Ｍ食塩含有0.05Ｍ酢
酸緩衝液(pH3.8)を用いて抽出して抽出液６８mlを得
る。この抽出液に等量の１Ｍ食塩含有0.05Ｍクエン酸緩
衝液(pH4.0)を加え分光光度計で測定しながら２８０〜
２６０nmの読みが同じになるまでプロタミンを加えると
リボ核酸がプロタミンと結合して沈殿物として沈降す
る。プロタミン処理された処理液の上清液１６０mlをア
ミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ食塩含有酢酸緩
衝液(pH4.0)で希釈しそして遠心分離して上清液を得
る。
７７mlを得た。得られた上清液に蒸留水1431mlを添加し
て希釈液を調製する。希釈液にリボ核酸0.57ｇを加えて
希硫酸でpH3.8に調整する。生成した沈殿を分取した。
この沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH
7.0)に加えて処理するとＣ型毒素が抽出される。この溶
液140mlを0.05Ｍ酢酸緩衝液(pH3.8)を用いて透析処理を
行い沈殿物を得る。この沈殿物を１Ｍ食塩含有0.05Ｍ酢
酸緩衝液(pH3.8)を用いて抽出して抽出液６８mlを得
る。この抽出液に等量の１Ｍ食塩含有0.05Ｍクエン酸緩
衝液(pH4.0)を加え分光光度計で測定しながら２８０〜
２６０nmの読みが同じになるまでプロタミンを加えると
リボ核酸がプロタミンと結合して沈殿物として沈降す
る。プロタミン処理された処理液の上清液１６０mlをア
ミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ食塩含有酢酸緩
衝液(pH4.0)で希釈しそして遠心分離して上清液を得
る。
一方、SP-セフアデツクスが充填されたカラム（2.5×１
５cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH4.5)を流下さ
せて平衝化を行う。このカラムに前記限外過によって
得られた上清液80mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
５cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH4.5)を流下さ
せて平衝化を行う。このカラムに前記限外過によって
得られた上清液80mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
次に0.2〜0.5Ｍの食塩含有酢酸緩衝液で濃度勾配クロマ
ト処理を実施してＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５
０mlを分取する。得られたフラクシヨンをいつたん限外
過により濃縮してセフアデツクスG-200を充填したカ
ラム（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
ト処理を実施してＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５
０mlを分取する。得られたフラクシヨンをいつたん限外
過により濃縮してセフアデツクスG-200を充填したカ
ラム（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
実施例３ 実施例１と同様にして培養した培養液を分別して上清液
４７７mlを得た。得られた上清液に蒸留水2385mlを添加
して希釈液を調製する。希釈液にリボ核酸1.14ｇを加え
希硫酸でpH4.0に調整する。生成した沈殿を分取し沈殿
物を得た。この沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸
緩衝液(pH8.0)で処理してＣ型毒素を溶出する。この溶
液120mlを0.05Ｍ酢酸緩衝液(pH4.0)を用いて透析処理を
行い沈殿物を得る。この沈殿物を１Ｍ食塩含有0.05Ｍ酢
酸緩衝液(pH4.0)を用いて抽出して抽出液６８mlを得
る。この抽出液に等量の１Ｍ食塩含有0.05Ｍクエン酸緩
衝液(pH4.5)を加え、分光光度計で測定しながら２８０
〜２６０nmの読みが同じになるまでプロタミンを加える
とリボ核酸がプロタミンと結合して沈殿物として沈降す
る。プロタミン処理された処理液の上清液１４０mlをア
ミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ食塩含有酢酸緩
衝液(pH4.5)で希釈し遠心分離して上清液を得る。
４７７mlを得た。得られた上清液に蒸留水2385mlを添加
して希釈液を調製する。希釈液にリボ核酸1.14ｇを加え
希硫酸でpH4.0に調整する。生成した沈殿を分取し沈殿
物を得た。この沈殿物を0.5Ｍ食塩含有0.1Ｍトリス塩酸
緩衝液(pH8.0)で処理してＣ型毒素を溶出する。この溶
液120mlを0.05Ｍ酢酸緩衝液(pH4.0)を用いて透析処理を
行い沈殿物を得る。この沈殿物を１Ｍ食塩含有0.05Ｍ酢
酸緩衝液(pH4.0)を用いて抽出して抽出液６８mlを得
る。この抽出液に等量の１Ｍ食塩含有0.05Ｍクエン酸緩
衝液(pH4.5)を加え、分光光度計で測定しながら２８０
〜２６０nmの読みが同じになるまでプロタミンを加える
とリボ核酸がプロタミンと結合して沈殿物として沈降す
る。プロタミン処理された処理液の上清液１４０mlをア
ミコンPM30を用いて限外過し、0.2Ｍ食塩含有酢酸緩
衝液(pH4.5)で希釈し遠心分離して上清液を得る。
一方、SP-セフアデツクスが充填されたカラム（2.5×15
cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH5.0)を流下させ
て平衝化を行う。このカラムに前記限外過によつて得
られた上清液90mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
cm）を予め0.2Ｍ食塩含有酢酸緩衝液(pH5.0)を流下させ
て平衝化を行う。このカラムに前記限外過によつて得
られた上清液90mlを通してＣ型毒素を吸着させる。
次に0.2〜0.5Ｍの食塩含有酢酸緩衝液で濃度勾配クロマ
ト処理を実施しＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５０
mlを分取する。得られたフラクシヨンを一旦限外過に
より濃縮し、セフアデツクスG-200を充填したカラム
（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
ト処理を実施しＣ型毒素を含有するフラクシヨン１５０
mlを分取する。得られたフラクシヨンを一旦限外過に
より濃縮し、セフアデツクスG-200を充填したカラム
（2.5×９５cm）を通して溶出液８０mlを得る。
Claims (1)
- 【請求項１】クロストリジウム属に属するボツリヌス菌
のＣ型毒素を産生する生産菌株を培養して得られたＣ型
毒素含有培養液を水で４〜６倍に希釈した後リボ核酸を
加え、酸でpH3.8〜4.0に調整し、得られた沈殿物をpH7.
0〜8.0の食塩含有緩衝液で毒性成分を溶出し、この溶液
をpH3.8〜4.0の酸緩衝液溶媒と半透膜を介して接触させ
る透析処理を行い、次いで前記食塩含有緩衝液から生成
した沈殿物を分離し、それを食塩、酸含有緩衝液に溶解
し、この溶液をプロタミンで処理した後さらに限外濾過
してボツリヌス菌Ｃ型毒素を取得することを特徴とする
ボツリヌス菌Ｃ型毒素の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58030938A JPH0662675B2 (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58030938A JPH0662675B2 (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59157030A JPS59157030A (ja) | 1984-09-06 |
| JPH0662675B2 true JPH0662675B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=12317614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58030938A Expired - Lifetime JPH0662675B2 (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662675B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE7809880L (sv) * | 1978-09-20 | 1980-03-21 | Zemlyakova Valentina Porfiriev | Vaccin for profylax och behandling av clostridiosis hos djur och fjederfe |
-
1983
- 1983-02-28 JP JP58030938A patent/JPH0662675B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 村田良介編「タンパク毒素上」講談社発行（１９７６）Ｐ．２２３〜２３７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59157030A (ja) | 1984-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS63501291A (ja) | 組換え体ポリペプチドを生物学的活性形態で単離する方法 | |
| Burke | The purification of interferon | |
| JPH0231687A (ja) | 血清アルブミンの純化方法 | |
| JP2549225B2 (ja) | 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法 | |
| Wadström et al. | Studies on extracellular proteins from Staphylococcus aureus: VI. Production and purification of β-haemolysin in large scale | |
| US4563303A (en) | Method for purification of filamentous hemagglutinin | |
| Gmeiner | The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains | |
| Kawashima et al. | Studies on fraction I protein: II. Comparison of physical, chemical, immunological and enzymatic properties between spinach and tobacco fraction I proteins | |
| JP7454507B2 (ja) | ボツリヌス毒素の製造方法 | |
| EP0175841B1 (en) | Method for the production of pertussis component vaccine and combined vaccine of pertussis antigen; diphtheria toxoid and tetanus toxoid | |
| EP0446582A1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
| US5045203A (en) | Separation of protein antigens of Bordetella bacteria by affinity chromatography | |
| EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
| EP1306383B1 (en) | Method of purifying a calcium ion-binding protein | |
| NO142961B (no) | Steroidbindende globulin til anvendelse ved in vitro-diagnostikk og ved fremstilling av antisera | |
| US3477912A (en) | Method of production of urokinase | |
| JPS59157030A (ja) | ボツリヌス菌ｃ型毒素の精製法 | |
| CA1239104A (en) | Method for the purification of lpf-ha | |
| FI58500B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett giftfritt immunogent fragment b ur tetanustoxin | |
| WO2000027876A1 (en) | Method for the isolation of lectins and the obtained purified lectins for use as a medicament | |
| JP2598802B2 (ja) | 菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ | |
| JPH0413697A (ja) | 生理活性ペプチド | |
| DE2708384A1 (de) | Proteinasen aus trypanosomen, verfahren zu deren herstellung sowie ihre verwendung | |
| Tavasolian et al. | Isolation and purification of lectin from Iranian Ricinus communis seeds | |
| JPS608226A (ja) | 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤 |