JPH0664055B2 - Ｓｈ化合物の定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は主として臨床検査の分野での利用を目的とした
ＳＨ化合物の定量方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、ＳＨ基を有するＳＨ化合物のＳＨ基の定量方法に
は種々のものがあるが、中でも放射化学的方法やメルカ
プチド生成反応による方法は操作が繁雑な事や、前者は
放射性物質、後者は水銀化合物を用いるため安全面や公
害の点などから問題があり、現在ではＳＨ−ＳＳ交換反
応が最もよく用いられている。

ＳＨ−ＳＳ交換反応によるＳＨ基の定量方法は、ＳＨ化
合物がＳＳ化合物と反応し、ＳＨ基の存在によりＳＳ化
合物はそのＳＨ基の量に相当する量のＳＳ結合が切断さ
れてチオールを生成することから、そのチオールの量を
分光光学的に吸収を測定することによって、ＳＨ基を定
量するものである。このようなＳＳ化合物としては一般
には、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
（以下、ＤＴＮＢと略）、２，２′−ジチオジピリジ
ン、４，４′−ジチオジピリジン、６，６′−ジチオジ
ニコチンなどが知られている。

これらは分子吸光係数が大きく感度が高いため微量のＳ
Ｈ基の定量が可能で、なかでもＤＴＮＢはエールマン試
薬とも呼ばれ、これ自体は３２５nmに吸収極大を持つ
が、ＳＨ基との反応により生成されるチオールの吸収極
大はそれとは重ならない４１２nmにあるという利点から
よく利用されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、ＳＨ−ＳＳ交換反応によるＳＨ基の定量方法を
臨床検査に用いた場合は次のような問題がある。すなわ
ち、臨床検査で検体とする血液、特に血清にはタンパク
質を始め種々のＳＨ基を有する化合物、いわゆる内因性
ＳＨ化合物が混在しており、これが非特異反応を与え、
当該定量における特異性を低下させる原因となることで
ある。そのため、まず内因性ＳＨ化合物とＳＳ化合物と
を反応させて、非特異反応を除去してから、本来定量を
目的とするＳＨ化合物による特異反応を生起させてＳＨ
基の定量を行う必要がある。ところが、一般に内因性Ｓ
Ｈ化合物は、ＳＳ化合物との反応性に欠けることが多
く、反応に長時間を要するのが実情である。従って、従
来は定量全体の反応時間としてはこのような内因性ＳＨ
化合物の影響を避けるだけでも約３０分間を要すること
になる。もし、この内因性ＳＨ化合物による非特異反応
を除去する時間を省略して直ちに目的とするＳＨ基の測
定すれば、このような内因性ＳＨ化合物をも加えて定量
したことになり、特異性が低下する。従って短時間に測
定する場合には、このような内因性ＳＨ化合物の影響を
避けることが不可能となり問題がある。

本発明の目的は、従来のＳＨ−ＳＳ交換反応によるＳＨ
基の定量方法を改良し、検体中の内因性ＳＨ化合物の影
響を受けることなく短時間で測定できるようにすること
にある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、このような問題を解決し上述の目的を達
成するため鋭意研究を進めた結果、ＳＨ−ＳＳ交換反応
によるＳＨ基の定量の際に、界面活性剤の存在下では、
内因性ＳＨ化合物とＳＳ化合物との反応が著しく促進さ
れて、一般的には１分程度で当該反応が終了することを
見い出し、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はＳＨ−ＳＳ交換反応によりＳＨ基を
定量するＳＨ化合物の定量方法において、界面活性剤の
存在下に、検体中に存在する非特異反応を生起する物質
とＳＳ化合物とを反応させて非特異反応を除去する工程
を含むことを特徴とするＳＨ化合物の定量方法に関する
ものである。

本発明に用いる界面活性剤としては本発明の目的を満足
するものはすべて用いることができるが、中でも非イオ
ン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性イオン界面活
性剤の群から選択することができる。そのような界面活
性剤の種類の例としては、ポリオキシエチレンアルキル
エーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸エステル、第２級直鎖アルコールエトキシレート、ノ
ニルフェノールエトキシレート等の非イオン界面活性剤
や、ポリオキシアルキル硫酸エステル塩、アルキルベン
ゼンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキ
ルナフタレンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸
エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、脂肪酸塩等のア
ニオン界面活性剤があり、両性イオン界面活性剤の種類
としてはアルキルベタイン等があげられるが、これらの
例に限定されるものではない。なお本発明で用いる界面
活性剤は通常１種類で良いが、２種類以上を併用して用
いることもできる。また、本発明で用いる界面活性剤の
濃度は反応条件により一概に限定されないが、通常は0.
001〜４０ｗ／ｖ％、好ましくは0.002〜２０ｗ／ｖ％を
用いることができる。

本発明の方法はＳＨ−ＳＳ交換反応によるＳＨ基の定量
において、内因性ＳＨ化合物による非特異反応を防止す
るために、まずＳＳ化合物と内因性ＳＨ化合物とを反応
させて非特異反応を除去するに際して、当該反応を界面
活性剤の存在下に行うものである。かくして、当該反応
は検体や添加した界面活性剤によりやや異なるが、反応
の短い場合ではほとんど瞬時にその反応を終了させるこ
とができる。

上記の反応で非特異反応を除去した後、本来のＳＨ基の
定量が行われる。たとえば、生体内酵素による基質の分
解によって生成したＳＨ化合物を定量して生体内酵素を
定量する場合を例にとる。まず、上述の反応で非特異反
応を除去された検体中に基質をいれると、基質は当該酵
素によって分解されてＳＨ化合物を生成するが、このＳ
Ｈ化合物はＳＳ化合物とＳＨ−ＳＳ交換反応を起こして
ＳＳ化合物のＳＳ結合が切断される。かくして生じたチ
オール化合物を定量すれば、基質の分解によって生じた
ＳＨ化合物ひいては生体内の酵素を定量することが出来
る。かくして、内因性ＳＨ化合物による非特異反応を伴
わない、正確なＳＨ基の迅速な定量が可能となる。

本発明において、その定量の目的とされるＳＨ基を有す
るＳＨ化合物には、特に限定はないが、好ましくは臨床
検査において、生体内における酵素などの作用で基質か
ら遊離したＳＨ化合物が例示され、具体的には、アセチ
ルチオコリンハライド、ブチリルチオコリンハライド、
２，３−ジメトキシベンゾイルチオコリンハライド、イ
ソブチリルチオコリンハライド、シクロヘキサンカルボ
ニルチオコリンハライド、プロピオニルチオコリンハラ
イド、サクシニルチオコリンハライド、２，３−ジメル
カプトプロパン−１−オール、トリブチロエイトなどが
例示される。ここに生体内における酵素としては、たと
えばコリンエステラーゼ、リパーゼ、エステラーゼなど
が例示される。従って、本発明における検体としては、
体液、なかでも血液、特に血清や血漿、及び尿などが代
表的なものとして例示される。

また、本発明で使用されるＳＳ化合物としては、たとえ
ば上述したＳＨ化合物とＳＨ−ＳＳ交換反応を起こすも
の、たとえばＤＴＮＢ、２，２′−ジチオジピリジン、
４，４′−ジチオジピリジン、６，６′−ジチオジニコ
チンなどが例示される。

〔発明の作用・効果〕

本発明により、内因性ＳＨ化合物とＳＳ化合物との反応
をごく短時間に終了させることができるので、定量を目
的とするＳＨ化合物との反応を短時間で開始させること
ができる。たとえば、検体中の酵素コリンエステラーゼ
の作用で基質から遊離したＳＨ化合物を定量し、該酵素
の活性を測定する場合、従来は先に述べたように検体中
の内因性ＳＨ化合物との反応に長時間を要するため、自
動分析装置には応用できないか、あるいは無理に応用し
た場合は特異性が低くなる問題があった。それが本発明
では内因性ＳＨ化合物との反応をごく短時間に終了させ
ることができることから、自動分析装置でコリンエステ
ラーゼをその特異性を低くすることなく測定することが
可能となった。

特に近年臨床検査は高速の自動分析装置が普及し、より
迅速な方法が要求されているため、本発明は臨床検査に
広く汎用できる方法として有用なものである。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。

実施例１ ＤＴＮＢを１５mg／ｄ含む１００mMトリス緩衝液（pH
8.0）にそれぞれ界面活性剤としてポリオキシエチレン
アルキルフェノールエーテル系の商品名：ＨＳ−２４０
〔日本油脂（株）製品〕、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル系の商品名：Triton X-100〔片山化学
（株）製品〕、第２級直鎖アルコールエトキシレート系
の商品名：アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０〔旭
電化工業（株）製品〕、アルキル硫酸エステル塩系のラ
ウリル硫酸ナトリウム、アルキルベタイン系の商品名：
アンヒトール（登録商標）２４Ｂ〔花王アトラス（株）
製品〕を１ｇ／ｄ添加する。これをそれぞれ2.5mlと
り、更に検体として血清を３例準備し、各0.1mlをそれ
ぞれ添加して反応させた。このときの各界面活性剤の濃
度は、それぞれ0.96（ｗ／ｖ）％である。反応温度３７
℃で波長４１２nmにおける吸光度をチェックして反応の
開始から終了までの反応所要時間を調べた。その結果は
表１のようになり、いずれも１分間以内で反応が終了す
ることがわかった。なお、界面活性剤を添加しない場合
は２０分間程度反応が持続した。

実施例２ 実施例１で用いた界面活性剤ＨＳ−２４０についてその
添加濃度を変化させ、実施例１と同様に操作して反応所
要時間を調べた。その結果は表２のようになり、添加濃
度0.05ｗ／ｖ％から反応所要時間の短縮が認められ、特
に1.0ｗ／ｖ％を越えると非常に短い時間で反応が終了
することがわかった。

実施例３ ＤＴＮＢを１２mg／ｄ含む１００mMトリス緩衝液（pH
8.0）に界面活性剤ＨＳ−２４０を１ｇ／ｄ添加す
る。（なお対照として界面活性剤を添加しないものを準
備し以下同様に操作する。）これを2.4mlとり、これに
検体として血清１０例を0.1mlそれぞれ添加し、３７℃
で５分間加温する。このとき界面活性剤ＨＳ−２４０の
濃度は、0.8（ｗ／ｖ）％である。更に２，３−ジメト
キシベンゾイルチオコリンヨーダイドを0.25ｇ／ｄ含
む水溶液を0.5ml加えて波長４１２nmにおける吸光度の
上昇を測定した後、それぞれについてあらかじめ得られ
た検量線からコリンエステラーゼの活性値に換算した。
その結果は表３のようになり、界面活性剤を無添加の場
合のほうがすべて高値を示し、検体中の内因性ＳＨ化合
物の影響を受けていることが示唆された。

数値はコリンエステラーゼ活性値（ＩＵ／）を示す。

実施例４ 実施例３で用いた血清のうち３例（No.１〜３）につい
てそれぞれ検体中の内因性ＳＨ化合物の量を測定し、そ
れをコリンエステラーゼの活性値に換算した（検体ブラ
ンク）。すなわち、ＤＴＮＢを１２mg／ｄ含む１００
mMトリス緩衝液（pH8.0）を2.4mlとり、検体として血清
（No.１〜３）を0.1mlそれぞれ添加し、３７℃で３０分
間加温する。更に精製水を0.5ml加えて波長４１２nmに
おける吸光度の上昇を測定した後、それぞれについてあ
らかじめ得られた検量線からコリンエステラーゼの活性
値に換算した。その結果は表４のようになり、実施例３
で界面活性剤を無添加の場合の値からこの検体ブランク
値を差し引くと、界面活性剤を添加した場合の値とほと
んど一致することがわかった。このことから、本発明の
方法はコリンエステラーゼの活性値の測定に際して、検
体中の内因性ＳＨ化合物の影響を受けないことが認めら
れた。

数値はコリンエステラーゼ活性値（ＩＵ／）に相当量
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＳＨ−ＳＳ交換反応によりＳＨ基を定量す
   るＳＨ化合物の定量方法において、界面活性剤の存在下
   に、検体中に存在する非特異反応を生起する物質とＳＳ
   化合物とを反応させて非特異反応を除去する工程を含む
   ことを特徴とするＳＨ化合物の定量方法。