JPH0665300A - 新規な糖誘導体及びこれを基質として用いる生理活性物質の活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、下記一般式(1) Ｒ1−Ａ−ＮＨ−Ｒ2 (1) （式中、Ｒ1は糖鎖を表わし、Ａはアミノ酸残基又はペ
プチド残基を表わし、Ｒ2は末端にピリジルアミノ基を
有する有機残基を表わす。）で示される糖誘導体、及び
上記一般式(1)で示される糖誘導体を基質として用いる
ことを特徴とする生理活性物質の活性測定法の発明であ
る。 【効果】本発明は、糖鎖の生合成に重要な働きを有し、
最近では腫瘍マーカーとしても注目されている糖転移酵
素等に代表される糖質に作用する生理活性物質の基質と
成り得る新規な糖誘導体と、それを基質として用いる生
理活性物質の簡便で且つ定量性に優れた活性測定法を提
供するものであり、斯業に貢献するところ大なる発明で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明は、生体成分中に含まれる、
例えば糖修飾酵素等の生理活性物質の活性測定用基質と
して有用な糖誘導体及びそれを基質として用いた生理活
性物質の測定法に関する。

【０００２】

【発明の背景】生体中には種々の生理活性物質が存在す
ることはよく知られており、糖質に作用する生理活性物
質としては、例えば糖転移酵素、糖加水分解酵素、糖異
性化酵素等の糖修飾酵素が知られている。

【０００３】これら糖修飾酵素は、生体内での糖質の生
合成や代謝等に於いて重要な役割を担っている酵素であ
る。そのため、これら酵素の活性を測定することによっ
て、生理学上の重要な知見、例えば腫瘍マーカーとして
の臨床的意義等が得られると考えられている。

【０００４】これらの含有量は少ないため、精度よく測
定するためには検出感度の高い物質で標識された基質を
使用する必要がある。基質の標識方法としては、放射性
標識方法と非放射性標識方法とがあるが、測定の簡便さ
や設備の制約、人体への安全性等を考慮すると非放射性
標識方法の方が望ましく、測定感度を考慮に入れればそ
の中でも蛍光標識方法がより望ましい。

【０００５】しかしながら、従来から用いられている蛍
光標識化試薬、即ちフルオレッセンイソチオシアネート
（FITC）、エオシン、クマリンイソチオシアネート等の
蛍光標識化試薬は、それ自体の水溶性が低いため種々の
問題点を有していた。即ち、例えば上記した如き蛍光標
識化試薬は一旦極性有機溶媒に溶解して用いなければな
らないため、蛍光標識化操作が煩雑であることや、上記
した如き蛍光標識化試薬を用いて調製された蛍光標識化
物質はそれ自体の水溶性が低下するため、例えば上記蛍
光標識化試薬を用いて調製された蛍光標識基質を利用し
て他の物質の検出を行う場合に必要濃度の水溶液を調製
することができない場合があること、等である。

【０００６】これらの問題点を解決する目的で、例えば
スルホ基、カルボキシル基等の水溶性基を導入した、例
えばダンシルクロライド、ルシファーイエロー、o-フタ
ルアルデヒド等の水溶性蛍光標識化試薬が開発された。
しかしながら、これらの試薬は、それ自体の保存安定性
が悪く、しかもこれらを用いて調製された蛍光標識化さ
れた物質も、水溶性という面では改善されたものの、そ
れ自体の保存安定性が悪いため、調製後の保存ができな
いという問題点を有していた。

【０００７】一方、例えば2-アミノピリジン、3-アミノ
ピリジン等のアミノピリジンは、それ自体水溶性で且つ
非常に安定な蛍光物質であり、これにより標識された物
質も保存安定性に優れ、且つ標識対象物質が水溶性のも
のの場合には水溶性がそのまま維持されるため、糖質等
への蛍光標識物質として近時広く利用されている化合物
である（Biochemical and Biophysical Research Commu
nications 85,257頁,1978等)。

【０００８】しかしながら、アミノピリジンそのもの
を、糖質等の標識物質として用いるには問題があった。
即ち、アミノピリジンを用いた蛍光標識化方法として
は、標識対象物質のアルデヒド基にシッフ塩基を介して
結合させる方法が一般的であるが、該方法を利用してア
ミノピリジンを糖質に結合させた場合には、糖質の還元
末端側の糖残基の環が開環してしまうため、蛍光標識化
した糖質を糖転移酵素や糖分解酵素等の基質として用い
るためには目的の構造を有する糖質の還元末端側に更に
もう一つ余分な糖残基を結合させておかなければならな
いと言う問題がそれである（Biochem. Biophys. Res. C
ommun.,vol.152, 107-112, 1988）。

【０００９】そのため、ピリジルアミノ基等の蛍光を有
する基を、穏和な条件下で、且つ還元末端側の糖残基の
環を開環させることなく容易に糖質等に導入し得る蛍光
標識化試薬の開発とこれを用いた新規な蛍光標識化方法
の出現が待ち望まれていた。

【００１０】池中らは、上記問題を解決するため、糖質
の還元末端の一位の水酸基に蛍光を有する置換アミノア
ルキル基をグリコシド結合により結合させる方法を開発
した（特開平１−４２４９６号公報）。

【００１１】この方法は、穏和な条件下で、しかも糖質
の還元末端側の糖残基の環を開環させることなく糖質の
還元末端の一位の水酸基に蛍光を有する置換アミノアル
キル基を導入し得る方法なので、従来の方法に比較して
明らかに有利な方法ではある。

【００１２】しかしながら、この方法により調製された
蛍光標識化基質を用いて生理活性物質の活性測定を行っ
た場合でも、例えば糖転移酵素の活性測定に於いては、
糖受容体糖鎖の還元末端に結合した、アスパラギン残
基、セリン残基、トレオニン残基等のアミノ酸残基やこ
れらを含むペプチド残基が活性測定に影響を与える場合
があって（International Immunology,vol.2, 105-112,
1989等）、目的の生理活性物質の活性測定を充分には
行い得ないこともある、と言う問題がある。

【００１３】また、糖鎖にアミノ酸残基やペプチド残基
が結合した糖ペプチドは極めて親水性が高く極性有機溶
媒にも溶解しないため、従来の蛍光標識化試薬を使用す
ると目的の蛍光標識化を実施し難いと言う問題もあり、
蛍光標識され且つアミノ酸残基又はペプチド残基を有す
る糖質の開発が望まれていた。

【００１４】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑み成さ
れたもので、例えば糖修飾酵素等の生理活性物質の活性
測定用基質として有用な蛍光標識糖誘導体及びそれを基
質として用いた高感度な生理活性物質の測定法を提供す
ることを目的とする。

【００１５】

【発明の構成】本発明は、下記一般式(1) Ｒ1−Ａ−ＮＨ−Ｒ2 (1) （式中、Ｒ1は糖鎖を表わし、Ａはアミノ酸残基又はペ
プチド残基を表わし、Ｒ2は末端にピリジルアミノ基を
有する有機残基を表わす。）で示される糖誘導体、及び
上記一般式(1)で示される糖誘導体を基質として用いる
ことを特徴とする生理活性物質の活性測定法の発明であ
る。

【００１６】即ち、本発明者らは、上記した如き問題を
解決するために鋭意研究の途上、上記一般式(1)で示さ
れる糖誘導体が、例えば糖修飾酵素等の生理活性物質の
活性測定用基質として極めて有用性が高く、これを基質
として用いることにより糖修飾酵素等の活性測定を高精
度且つ高感度で実施し得ることを見い出し、本発明を完
成するに至った。

【００１７】本発明の一般式(1)で示される糖誘導体の
Ｒ1は糖鎖を表わし、その構成糖の種類及び数には特に
制限はないが、例えばグルコース，マンノース，ガラク
トース，フコース，シアル酸，N-アセチルグルコサミ
ン，N-アセチルガラクトサミン等の糖残基から構成さ
れ、その糖残基の数が２〜１０個程度のものが好ましく
挙げられる。また、糖鎖の糖残基間の結合の種類にも特
に制限はなく、例えばα１→４，β１→４，α１→６，
α２→３，β１→２，β１→３，α２→６，α１→３，
α１→２，β１→６等何れにてもよい。但し、Ｒ1は目
的とする生理活性物質、例えば糖転移酵素、糖加水分解
酵素、糖異性化酵素等の糖修飾酵素の基質と成り得る糖
鎖構造を成していることは言うまでもない。

【００１８】また、本発明の一般式(1)で示される糖誘
導体のＡはアミノ酸残基又はペプチド残基を表わし、ア
ミノ酸残基の種類及びペプチド残基の構成アミノ酸残基
の種類及び数には特に制限はないが、例えばアスパラギ
ン残基、セリン残基、トレオニン残基等のアミノ酸残基
等やこれらを含むペプチド残基が好ましく挙げられる
が、目的の酵素活性測定の際の分離・分析の面から考え
るとアミノ酸残基であることが望ましい。尚、Ａも目的
とする生理活性物質、例えば糖転移酵素、糖加水分解酵
素、糖異性化酵素等の糖修飾酵素の基質として使用する
に際して目的の活性測定を充分に行い得るような構造を
成していることは言うまでもない。Ｒ2としては、末端
に例えば2-ピリジルアミノ基，3-ピリジルアミノ基等の
ピリジルアミノ基を有し、且つ他方の末端には例えばカ
ルボニル基、低級アルキレン基等の基を有する有機残基
であれば特に限定されることなく挙げられるが、例えば
2-ピリジルアミノエチルスクシナモイル基，N-(2-ピリ
ジル)-スクシナモイルアミノプロピオニル基，N-(2-ピ
リジル)-β-アラニルアミノプロピオニル基，2-ピリジ
ルアミノメチル基，2-ピリジルアミノエチル基等が好ま
しく挙げられる。

【００１９】本発明の一般式(1)で示される糖誘導体
は、例えば以下の如くして容易に合成し得る。即ち、一
般式(2) Ｒ1−Ａ−ＮＨ₂ (2) （式中、Ｒ1及びＡは前記に同じ。）で示されるアミノ
酸残基又はペプチド残基を有する糖誘導体に、該糖誘導
体１モルに対して通常１〜10モル、好ましくは１〜５モ
ル、より好ましくは２〜４モルの、例えば一般式(3)、
(4)又は(5) Ｒ3ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ4 (3) Ｒ3ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ4 (4) Ｒ3-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ4 (5) （式中、Ｒ3は2-ピリジルアミノ基又は3-ピリジルアミ
ノ基を表わし、Ｒ4は活性エステル化剤に起因する基を
表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表わ
す。）で示される化合物等に代表される、一方の末端に
ピリジルアミノ基が結合し他方の末端にアミノ基に対し
て反応性を有する基（例えばコハク酸イミドオキシカル
ボニル基、フタル酸イミドオキシカルボニル基、5-ノル
ボルネン-2,3-ジカルボキシイミドオキシカルボニル
基、p-ニトロフェニルオキシカルボニル基、ホルミル
基、トレシルアルキル基、トシルアルキル基等）が結合
した化合物とを、水、又は例えばメタノール，エタノー
ル等のアルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメ
チルホルムアミド等の極性有機溶媒、或はこれら極性有
機溶媒と水との混合溶媒（以下、これらを総称して「水
溶媒等」と略記する。）中で反応させ、要すれば還元処
理（末端にホルミル基を有する化合物を使用した場合
等。）等を行った後、常法により精製等を行うことによ
り容易に合成し得る。

【００２０】尚、上記反応を実施する際の水溶媒等のp
Ｈとしては、一般式(2)で示される糖誘導体の安定性に
影響がない範囲であれば特に限定されないが、例えば一
般式(3)〜(5)で示される化合物の反応性を勘案すると、
pＨ６〜10程度（弱酸性〜弱アルカリ性）が望ましい。
また、上記反応液中には、一般式(2)で示される糖誘導
体と、一般式(3)、(4)、(5)等で示される化合物に代表
される、一方の末端にピリジルアミノ基が結合し他方の
末端にアミノ基に対して反応性を有する基が結合した化
合物との反応を阻害しないものであれば、例えばリン酸
塩，重炭酸塩等の１級アミノ基を有さない緩衝剤や、防
腐剤、界面活性剤、安定化剤等が共存していてもよい。

【００２１】一般式(2)で示される糖誘導体は、常法に
より合成された目的の構造を有する糖鎖に、目的のアミ
ノ酸残基又はペプチド残基を常法により結合させること
により容易に得ることができるし、天然糖タンパク質か
ら酵素処理（例えばプロテアーゼ処理、グリコシダーゼ
処理等）や化学的処理（例えば酸やアルカリによる加水
分解処理等）により調製することもできるし、天然糖タ
ンパク質から酵素処理や化学的処理により得られたアミ
ノ酸残基又はペプチド残基を有する糖誘導体を更に化学
的及び／又は酵素的に修飾して目的の構造を有するもの
に変換することによっても得ることができる。尚、一般
式(2)で示される化合物を大量に得たいのであれば、天
然の糖タンパク質を原料として酵素処理や化学的処理す
る方法が、より具体的には例えばイムノグロブリン，卵
白アルブミン，トランスフェリン，甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ），ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hＣＧ），卵
胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）
等の糖蛋白質を例えばトリプシン，キモトリプシン，ペ
プシン，パパイン，Ｖ８プロテアーゼ等のプロテアーゼ
や例えばβ-ガラクトシダーゼ，ノイラミニダーゼ，N-
アセチル-β-グルコサミニダーゼ，α-マンノシダーゼ
Ｉ，α-マンノシダーゼII等のグリコシダーゼによる処
理や、化学的処理、要すれば更に化学的及び／又は酵素
的に修飾する方法が好ましく挙げられる。

【００２２】また、一般式(3)、(4)及び(5)で示される
化合物は、例えば以下の如くして合成したものを用いれ
ばよい。先ず、一般式(3)で示される化合物は、例えば
下記の合成ルートに従って容易に合成し得る。

【式１】 （上記反応スキーム中、Ｘはハロゲン原子を表わし、
ｍ、ｎ及びＲ4は前記と同じ。）即ち、先ず例えば2-ク
ロロピリジン，2-ブロモピリジン，3-クロロピリジン，
3-ブロモピリジン等の2-又は3-ハロピリジンと、該2-又
は3-ハロピリジンに対して10〜20倍モルのアルキレンジ
アミン（例えばエチレンジアミン，1,3-プロパンジアミ
ン，1,4-ブタンジアミン等）とを80〜120℃で８〜 24時
間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、
目的物をクロロホルム、ジクロロエタン等で抽出し、溶
媒留去後、残渣を、適当な溶媒（例えばベンゼン−石油
エ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化して、上記一般式
(3a)で示されるアミノアルキルアミノピリジンを得る。
次いで、該アミノアルキルアミノピリジンとこれに対し
て１〜３倍モルのジカルボン酸無水物（例えば無水コハ
ク酸，無水グルタ−ル酸，無水マレイン酸等）又は、ジ
カルボン酸（例えばコハク酸，グルタ−ル酸，マレイン
酸等）の２分子間脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-Ｃ
Ｏ]₂Ｏ}（式中ｎは前記に同じ）とを、例えばメタノ−
ル、エタノ−ル、イソプロパノール等の溶媒中、０〜30
℃で２〜６時間撹拌下に反応させる。反応後、析出晶を
濾取、乾燥させて、上記一般式(3b)で示される化合物
（以下、化合物(3b)と略記する。）を得る。＄ 次い
で、この化合物(3b)を、該化合物に対して１〜３倍モル
の活性エステル化剤［例えばN-ヒドロキシ-5-ノルボル
ネン-2,3-ジカルボキシイミド（以下、ＨＯＮＢと略記
する。）、N-ヒドロキシコハク酸イミド（以下、ＨＯＳ
ｕと略記する。）等］と、例えばジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサ
ン等の溶媒中、例えば、化合物(3b)に対して１〜３倍モ
ルのトリフェニルホスフィンと、これと等モルのジスル
フィド化合物［例えば2,2'-ジチオジピリジン（以下、2
-ＰＤＳと略記する。）、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等］と、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に反応さ
せる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を、
適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル混合
溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(3)で示
される化合物が得られる。尚、上記の反応に於いて、ト
リフェニルホスフィンとジスルフィド化合物との組合せ
試薬を用いる代りに、例えばジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等の縮合試薬を
用いても、同様に一般式(3)で示される化合物が得られ
る。

【００２３】また、一般式(4)で示される化合物は、例
えば下記の如き合成ルートに従って容易に合成し得る。

【式２】 （上記反応スキーム中、Ｒはアルキル基を表わし、ｍ、
ｎ及びＲ4は前記と同じ。）即ち、先ず例えば2-アミノ
ピリジン，3-アミノピリジン等のアミノピリジンと、該
アミノピリジンに対して１〜３倍モルのジカルボン酸無
水物（例えば無水コハク酸，無水グルタ−ル酸，無水マ
レイン酸等）又はジカルボン酸（例えばコハク酸，グル
タ−ル酸，マレイン酸等）の２分子間脱水縮合物{[ＨＯ
ＯＣ-(ＣＨ2)n-ＣＯ]2Ｏ}（式中ｎは前記に同じ）と
を、例えばエタノ−ル、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等
の溶媒中、60〜100℃で２〜４時間、次いで10〜30℃で
２〜４時間撹拌下に反応させる。反応後、析出晶を濾
取、乾燥させて、上記一般式(4a)で示される化合物（以
下、化合物(4a)と略記する。）を得る。

【００２４】次いで、得られた化合物(4a)と、該化合物
に対して１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリ
シンエチルエステル，β−アラニンメチルエステル等）
とを、例えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、化合物(4
a)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィンと、
これと等モルのジスルフィド化合物（例えば2-ＰＤＳ，
2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等）の存在下、０
〜40℃で２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、不溶
物を瀘去し、溶媒を留去して得られた残渣を、例えばク
ロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒で抽出し、抽出液
を例えば飽和重ソウ水，炭酸ナトリウム水溶液等のアル
カリ溶液、次いで水で順次洗浄する。その後、抽出液を
例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム等に
より乾燥し、溶媒を留去して得られた残渣を適当な溶媒
（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を
用いて結晶化する等により、上記一般式(4b)で示される
化合物を得る。これを、常法により鹸化してエステルを
加水分解すれば一般式(4c)で示される化合物（以下、化
合物(4c)と略記する。）が得られる。尚、上記化合物(4
a)と反応させるアミノ酸エステルは、例えば塩酸塩，硫
酸塩等の鉱酸塩となっているものでも良いが、その場合
は、通常これと等モルの塩基（例えばトリエチルアミ
ン，N-メチルモルホリン等）が併せて用いられる。ま
た、上記化合物(4a)とアミノ酸エステルとの脱水縮合反
応は、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合物の
組合せ試薬を用いる方法の代りに、例えばＤＣＣ，ＷＳ
Ｃ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸無水物法、アジド
法等のペプチドの合成の際に用いられる常法により行っ
てもよいことは言うまでもない。

【００２５】次いで、得られた化合物(4c)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(4c)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テ
ル混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式
(4)で示される化合物が得られる。尚、上記反応に於い
て、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合物の組
合せ試薬を用いる代りに、例えばＤＣＣ、ＷＳＣ等の縮
合試薬を用いても、同様に一般式(4)で示される化合物
が得られる。

【００２６】また、一般式(5)で示される化合物の内、
ｍが２である化合物は、例えば下記の合成ルートに従っ
て容易に且つ収率良く合成し得る。

【式３】 （上記反応スキーム中、Ｒ'はアルキル基を表わし、ｎ
及びＲ4は前記と同じ。）即ち、例えば2-アミノピリジ
ン，3-アミノピリジン等のアミノピリジンと、該アミノ
ピリジンに対して１〜３倍モルの不飽和脂肪酸エステル
（例えばアクリル酸メチル，アクリル酸エチル等）と
を、例えば2,5-ジ-tert-ブチルヒドロキノン等の重合禁
止剤の存在下、60〜100℃で12〜36時間撹拌下に反応さ
せる。反応後、反応液を、例えばベンゼン、トルエン等
の溶媒中に注入して、析出した結晶を瀘去し、溶媒を留
去して得られた残渣を、適当な溶媒（例えばベンゼン−
ヘキサン混合溶媒等）から再結晶することにより、上記
一般式(5a)で示される化合物を得る。次いで、これを、
常法により鹸化してエステルを加水分解すれば、一般式
(5b)で示される化合物（以下、化合物(5b)と略記す
る。）が得られる。

【００２７】得られた化合物(5b)と、該化合物に対して
１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリシンエチ
ルエステル，β−アラニンメチルエステル等）とを、例
えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、例えば、該化合物
に対して１〜３倍モルの例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合
試薬の存在下、０〜30℃で12〜36時間撹拌下に反応させ
る。反応後、不溶物を瀘去し、濾液を減圧濃縮して得ら
れた残渣を例えばクロロホルム、ジクロロメタン等の溶
媒で抽出し、抽出液を例えば飽和重ソウ水、炭酸ナトリ
ウム水溶液等のアルカリ溶液、次いで水で順次洗浄す
る。抽出液を例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグ
ネシウム等により乾燥後、溶媒を留去して、得られた残
渣を適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル
混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(5c)
で示される化合物を得る。次いで、これを、常法により
鹸化してエステルを加水分解すれば、一般式(5d)で示さ
れる化合物（以下、化合物(5d)と略記する。）が得られ
る。尚、上記化合物(5b)と反応させるアミノ酸エステル
は、例えば塩酸塩，硫酸塩等の鉱酸塩となっているもの
でも良いが、その場合は、通常これと等モルの塩基（例
えばトリエチルアミン，N-メチルモルホリン等）が併せ
て用いられる。また、上記化合物(5b)とアミノ酸エステ
ルとの脱水縮合反応は、トリフェニルホスフィンとジス
ルフィド化合物の組合せ試薬を用いる方法の代りに、例
えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸
無水物法、アジド法等のペプチドの合成の際に用いられ
る常法により行ってもよいことは言うまでもない。

【００２８】次いで、得られた化合物(5d)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(5d)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ等により精製す
れば、一般式(5e)で示される化合物（一般式(5)で示さ
れる化合物の内、ｍ＝２である化合物）が得られる。
尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフィンとジ
スルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代りに、例え
ばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いても、同様に一般
式(5e)で示される化合物が容易に得られる。

【００２９】尚、一般式(5)で示される化合物の一般的
な製法としては、例えば下記の合成ルートが挙げられ
る。

【式４】 （上記反応スキーム中、Ｒ'はアルキル基を表わし、Ｘ
はハロゲン原子を表わし、ｍ、ｎ及びＲ4は前記と同
じ。）即ち、例えば2-アミノピリジン，3-アミノピリジ
ン等のアミノピリジンと、該アミノピリジンに対して１
〜３倍モルのモノハロカルボン酸エステル（例えばモノ
ブロモ酢酸エチル、4-クロロ酪酸メチル、5-クロロ吉草
酸エチル等）とを、例えばＤＭＦ、クロロホルム、ベン
ゼン等の溶媒中、適当な塩基（例えば水素化ナトリウ
ム、N,N'-ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルア
ミン等）の存在下、０〜40℃で３〜８時間撹拌下に反応
させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣から目的物を例えばクロロホルム、ジクロロメタン等
の溶媒を用いて抽出する。得られた抽出液を、例えば0.
1〜２規定塩酸，10%クエン酸水溶液等の酸溶液、例えば
飽和重ソウ水，炭酸ナトリウム水溶液等のアルカリ溶
液、水で順次洗浄する。次いで、例えば無水硫酸ナトリ
ウム、無水硫酸マグネシウム等で乾燥し、溶媒留去し、
得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー等で精製
することにより、上記一般式(5f)で示される化合物を得
る。次いで、これを、常法により鹸化してエステルを加
水分解すれば、一般式(5g)で示される化合物（以下、化
合物(5g)と略記する。）が得られる。

【００３０】得られた化合物(5g)と、該化合物に対して
１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリシンエチ
ルエステル，β−アラニンメチルエステル等）とを、例
えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、例えば、該化合物
に対して１〜３倍モルの例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合
試薬の存在下、０〜30℃で12〜36時間撹拌下に反応させ
る。反応後、不溶物を瀘去し、濾液を減圧濃縮して得ら
れた残渣を例えばクロロホルム、ジクロロメタン等の溶
媒で抽出し、抽出液を例えば飽和重ソウ水、炭酸ナトリ
ウム水溶液等のアルカリ溶液、次いで水で順次洗浄す
る。抽出液を例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグ
ネシウム等により乾燥後、溶媒を留去して、得られた残
渣を適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル
混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(5h)
で示される化合物を得る。次いで、これを、常法により
鹸化してエステルを加水分解すれば、一般式(5i)で示さ
れる化合物（以下、化合物(5i)と略記する。）が得られ
る。尚、上記化合物(5g)と反応させるアミノ酸エステル
は、例えば塩酸塩，硫酸塩等の鉱酸塩となっているもの
でも良いが、その場合は、通常これと等モルの塩基（例
えばトリエチルアミン，N-メチルモルホリン等）が併せ
て用いられる。また、上記化合物(5g)とアミノ酸エステ
ルとの脱水縮合反応は、トリフェニルホスフィンとジス
ルフィド化合物の組合せ試薬を用いる方法の代りに、例
えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸
無水物法、アジド法等のペプチドの合成の際に用いられ
る常法により行ってもよいことは言うまでもない。

【００３１】次いで、得られた化合物(5i)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(5i)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ等により精製す
れば、一般式(5)で示される化合物が得られる。尚、上
記の反応に於いて、トリフェニルホスフィンとジスルフ
ィド化合物との組合せ試薬を用いる代りに、例えばＤＣ
Ｃ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いても、同様に一般式(5)
で示される化合物が容易に得られる。

【００３２】尚、上記一般式(3)〜(5)で示される化合物
に於けるＲ4の活性エステル化剤に起因する基として
は、カルボキシル基の活性化剤に起因する基であって１
級アミノ基に対して反応性を有するものであれば何れに
てもよいが、具体的には例えばコハク酸イミド基、フタ
ル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミ
ド基、p-ニトロフェニル基等が好ましく挙げられる。

【００３３】本発明の糖誘導体を用いることにより測定
可能な生理活性物質としては、本発明の糖誘導体を基質
とする生理活性物質であれば特に限定することなく挙げ
られるが、具体的には、例えばフコース（α１→２）転
移酵素，フコース（α１→３）転移酵素，フコース（α
１→４）転移酵素，フコース（α１→６）転移酵素，シ
アル酸（α２→３）転移酵素，シアル酸（α２→６）転
移酵素，ガラクトース（β１→３）転移酵素，ガラクト
ース（β１→４）転移酵素，ガラクトース（α１→３）
転移酵素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→２）転移
酵素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→４）転移酵
素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→６）転移酵素，
マンノース（α１→２）転移酵素，マンノース（α１→
３）転移酵素，マンノース（α１→６）転移酵素，マン
ノース（β１→４）転移酵素，キシロース（β１→２）
転移酵素等の糖転移酵素、例えばシアリダーゼ，β（又
はα）−ガラクトシダーゼ，β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ，α（又はβ）−マンノシダーゼ，α−フコ
シダーゼ，α（又はβ）−Ｎ−アセチルガラクトシダー
ゼ，キシロシダーゼ等の糖加水分解酵素（エンド型、エ
キソ型の何れでも可。）、例えばグルコースイソメラー
ゼ等の糖異性化酵素等の糖修飾酵素が好ましく挙げられ
る。

【００３４】尚、糖修飾酵素等の生理活性物質の由来は
限定されず、例えばヒトを含む動物の血清、血漿、尿、
髄液等の体液や生体組織、動物（又は植物）細胞抽出
液、細胞培養液等およそ生理活性物質が存在すると思わ
れるものに由来するものは全て挙げられる。

【００３５】本発明の生理活性物質の活性測定法は、本
発明の糖誘導体を基質として用いる以外は、文献（例え
ばJ.Biol.Chem.,vol.246,5154-5161,1071、Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,vol.136,563-569,1986等）に記載さ
れた自体公知の常法で用いられる試薬類を用い、自体公
知の常法における操作に準じてこれを行えば足りる。

【００３６】尚、以下に糖転移酵素の活性測定を行う場
合を例にとり、本発明の活性測定法をより具体的に説明
する。即ち、先ず例えばシチジン一リン酸ノイラミン
酸，ウリジン二リン酸ガラクトース，ウリジン二リン酸
グルコース，ウリジン二リン酸Ｎ-アセチルグルコサミ
ン，グアノシン二リン酸マンノース，グアノシン二リン
酸フコース等の糖ヌクレオチドから目的に応じて適宜選
択された糖供与体としての糖ヌクレオチドと、測定対象
の糖転移酵素の特異性に応じて調製された本発明の糖誘
導体を糖受容体として含む測定用試液を調製し、該試液
と測定対象の糖転移酵素を含む試料とを混合して反応を
開始させ、一定時間経過後に酵素反応生成物量（又は残
存する糖受容体量）を蛍光法により測定する。得られた
測定値を、予め同様の操作法を行って作成した測定対象
の酵素量と酵素反応生成物量（又は残存する糖受容体
量）との関係を示す検量線に当てはめることにより、容
易に実施することができる。尚、上記の測定法に於い
て、糖供与体としての糖ヌクレオチドや糖受容体として
の本発明の糖誘導体の濃度は目的の活性測定を実施し得
る濃度であれば特に限定されないが、糖ヌクレオチドの
濃度としては酵素反応時の濃度として通常約0.1〜20mM
の範囲から、また、本発明の糖誘導体の濃度としては酵
素反応時の濃度として通常約１〜1,000μMの範囲から適
宜選択される。

【００３７】また、本発明の測定法を実施する際の反応
温度は特に限定されないが、通常約25〜40℃の範囲から
適宜選択すればよいし、反応時間も目的により適宜選択
すればよく特に限定されない。反応のpＨは、目的とす
る生理活性物質の性質により若干異なるが、通常約４〜
９、好ましくは６〜８の範囲から適宜選択される。ま
た、pＨを維持する目的で用いられる緩衝剤は、目的と
する酵素反応を妨げないものものの中から適宜選択する
ことができ、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン−塩酸、カコジル酸−水酸化ナトリウム、グッドの緩
衝剤等が好ましく挙げられる。

【００３８】生理活性物質の作用により生ずる反応生成
物の分離・定量方法としては特に限定されないが、操作
の簡便性、測定時間が短い等の利点を有する高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲルパーミエーシ
ョン法、逆相法、イオン交換法或はアフィニティクロマ
トグラフ法等が好ましく挙げられる。

【００３９】ＨＰＬＣの条件の一例を示せば、逆相クロ
マトグラフィではオクタデシルシラン基やアミド基等を
導入した化学結合型シリカゲルを充填剤として用いる方
法が挙げられる。該方法に於ける溶離液としては目的に
応じて適当な緩衝液を適宜選択して用いればよいが、例
えば1ーブタノール、アセトニトリル或はメタノールを0.
01〜80%含有する 0.1M酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ3.0
〜8.0）等が好ましく挙げられ、流速は用いられる分離
カラムの直径に応じて0.1〜3.0ml/min.の範囲で適宜選
択されるが特にこれらに限定されるものではない。ま
た、検出は当然のことながら蛍光法で行われる。尚、シ
アル酸関連修飾酵素の活性測定の場合等、生成物が荷電
を有するものであるときは、イオン交換カラムを利用し
たＨＰＬＣ法や電気泳動による分離・定量法も有効であ
る。

【００４０】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定さ
れるものではない。

【実施例】

【００４１】参考例１．2-ピリジルアミノエチルスクシ
ナミン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエ
ステル（ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ）の合成 1)2-(2-アミノエチル)アミノピリジン（ＰＡＥＡ）の合
成 2-クロルピリジン85gとエチレンジアミン450gとを、120
℃で８時間還流下に反応させた。反応終了後、反応液を
減圧濃縮し、クロロホルムにより目的物を抽出した。抽
出液からクロロホルムを留去し、残渣をベンゼン−石油
エ−テル（１：５）で再結晶して、ＰＡＥＡ86gを得た
（収率83.7％）。 融点：36〜40℃。 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3500〜3100(NH)、3000〜2800(-C
H₂-)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、CDCl₃）δppm：1.64(bs,2H,N
H₂)、2.82〜3.58(m,4H,-CH₂CH₂-)、6.40〜8.24(m,4H,ピ
リジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 137（Ｍ⁺）。 2)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸（ＰＡＥ−Ｓ
ｕｃ−ＯＨ）の合成 上記1)で得たＰＡＥＡ10gと無水コハク酸7.3gとをエタ
ノ−ル300mlに溶解し、室温にて２時間撹拌下に反応さ
せた。反応終了後、析出晶を濾取し、乾燥させてＰＡＥ
−Ｓｕｃ−ＯＨ13.6gを得た（収率78.6％）。 融点：128〜130℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、1700(カルボン
酸)、1660,1560(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.32(t,2H,Suc
-CH₂-,J=6.48Hz)、2.34(t,2H,Suc-CH₂-,J=6.48Hz)、3.2
0〜3.30(m,4H,AEA-CH₂-CH₂-)、6.43〜7.95(m,4H,ピリジ
ン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。 3)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸 5-ノルボル
ネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル（ＰＡＥ−Ｓｕ
ｃ−ＯＮＢ）の合成 上記2)で得たＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＨ 2.37gと、N-ヒドロ
キシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド（ＨＯＮ
Ｂ）1.8gとを、ＤＭＦ50mlに溶解し、これに、2,2'-ジ
チオジピリジン（2ーＰＤＳ）2.2gと、トリフェニルホス
フィン2.6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で
４時間撹拌下に反応させた。反応終了後、ＤＭＦを減圧
留去し、得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化
して、下記化学式で示されるＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ2.
5gを得た（収率62.5％）。

【化１】 融点：122℃〜(dec.)。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3100(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1780(エステル)、1660,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.60(m,2H,N
B)、2.50〜2.88(m,4H,AEA-CH₂CH₂-)、3.33〜3.60(m,8H,
Suc-CH₂CH₂- and NB)、6.23(s,2H,NB)、6.50〜8.16(m,4
H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。

【００４２】参考例２．N-(2-ピリジル)スクシナモイル
アミノプロピオン酸 コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−
Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ）の合成 1)2-ピリジルスクシナミン酸（Ｐｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ）の
合成 2-アミノピリジン131gと無水コハク酸139gとを、トルエ
ン２ｌに懸濁させた後、90℃で１時間、更に室温で１時
間撹拌下に反応させた。反応終了後、析出晶を濾取し、
乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ195gを得た（収率72.2
％）。 融点：171〜172℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、1700(カルボン
酸)、1620,1580(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：1.84(dd,2H,-C
H₂-,J=6.21)、1.98(dd,2H,-CH₂-,J=6.21)、6.35〜7.62
(m,4H,ピリジン環)、9.72(s,1H,NH)、11.36(s,1H,カル
ボン酸)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 194（Ｍ⁺）。 2)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプロピオン酸
メチルエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭｅ）の合
成 上記1)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ 9.7gとβ-アラニン
メチルエステル塩酸塩7.0gとをＤＭＦ250mlに溶解し、
これにトリエチルアミン7.0mlを加えた後、2-ＰＤＳ11.
0gとトリフェニルホスフィン13.1gを含むＤＭＦ溶液100
mlを加えて、室温で６時間撹拌下に反応させた。反応終
了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をクロロホル
ムで抽出、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水で順次洗
浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸エチル
−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭ
ｅ11.7gを得た（収率84.0％）。 融点：135〜139℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3100(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1740(エステル）、1660,1580(アミド)、780(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.36〜2.51(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.2
1)、3.26(t,2H,AlaN-CH₂-,J=6.21)、3.60(s,3H,CH₃)、
7.02〜8.28(m,5H,ピリジン環 and NH)、10.41(s,1H,N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 279（Ｍ⁺）。 3)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプロピオン酸
（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記2)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭｅ 15.4gと水
酸化ナトリウム2.5gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解し、室温で８時間撹拌下に反応させた。
反応終了後、1N-塩酸62mlで中和し、液量が100mlになる
まで減圧濃縮した。析出した結晶を濾取し、水、アセト
ンで順次洗浄した後乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＨ12.1gを得た（収率82.5％）。 融点：186〜189℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3500〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1680〜1550(アミド)、800(ピ
リジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.42(m,
4H,Suc-CH₂CH-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.4
8)、3.24(dd,2H,AlaN-CH₂-J=6.48)、7.03〜8.08(m,5H,
ピリジン環 and NH)、10.42(s,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 265（Ｍ⁺）。 4)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプロピオン酸
コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳ
ｕ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ 2.7gとN-ヒ
ドロキシコハク酸イミド1.2gとを、ＤＭＦ50mlに溶解
し、これに、2-ＰＤＳ2.2gとトリフェニルホスフィン2.
6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で４時間撹
拌下に反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、
得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化して、下
記化学式で示されるＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ3.4g
を得た（収率93.1％）。

【化２】 融点：172〜176℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1790(エステル)、1660,1580(アミド)、790(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.42〜2.59(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.83(s,4H,Su)、2.83〜2.97
(m,2H,Ala-CH₂CO)、3.24〜3.42(dd,2H,AlaN-CH₂-,J=6.2
1)、7.00〜8.45(m,4H,ピリジン環)、10.47(b,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 362（Ｍ⁺）。

【００４３】参考例３．N-(2ーピリジル)ーβ-アラニルア
ミノプロピオン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシ
イミドエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ）の合
成 1)N-(2-ピリジル)-β-アラニン メチルエステル（Ｐｙ
−Ａｌａ−ＯＭｅ）の合成 2-アミノピリジン94gにアクリル酸メチル100mlと2,5-ジ
-tert-ブチルヒドロキノン1.1gを加え、撹拌下24時間還
流反応させた。反応終了後、反応液をベンゼン１ｌに注
ぎ、０℃で５時間放置した。析出した結晶を瀘去し、瀘
液を濃縮して得られた残渣をベンゼン−ヘキサン（１：
５）で結晶化して、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＭｅ64.5gを得た
（収率35.8％）。 融点：48〜49℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1760(エステル)、1610,1580(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.57(t,2H,-CH
₂CO-,J=7.02)、3.48(dd,2H,NCH₂-,J=7.02)、3.60(s,3H,
CH₃)、6.44〜7.98(m,4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 180（Ｍ⁺）。 2)N-(2-ピリジル)-β-アラニン（Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＨ）
の合成 上記1)で得たＰｙ−Ａｌａ−０Ｍｅ 62.1gを水620mlに
懸濁し、撹拌下24時間還流反応させた。反応終了後、水
を減圧留去し、得られた残渣をエタノ−ルで再結晶し
て、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＨ43.1gを得た（収率75.2％）。 融点：136〜138℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、3000〜2800(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1640,1550(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ-ＮＭＲ（270MHz、DMSOーd6）δppm：2.50(t,2H,-CH₂
CO,J=6.75)、3.45(m,2H,NCH₂-,J=6.75)、6.44〜7.98(m,
4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 166（Ｍ⁺）。 3)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロピオン酸 メ
チルエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＭｅ）の合成 ＤＭＦ60mlに、上記2)で得たＰｙ−Ａｌａ−ＯＨ 3.3g
とβ-アラニン メチルエステル塩酸塩 2.8g及びＤＣＣ
4.1gを加え、これに更にトリエチルアミン2.8mlを加え
て、室温で24時間撹拌下に反応させた。反応終了後、不
溶物を瀘去し、瀘液を減圧濃縮して得られた残渣をクロ
ロホルムで抽出し、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水
で順次洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウム
で乾燥後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸
エチル−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ＯＭｅ4.3gを得た（収率86.5％）。 融点：68〜70℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1730(エステル)、1650,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.69(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.30〜3.57(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、3.
59(s,3H,CH₃)、6.33〜8.02(m,6H,ピリジン環 and 2×N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 251（Ｍ⁺）。 4)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロピオン酸（Ｐ
ｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＭｅ 16.0gと水
酸化ナトリウム2.6gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解した後、室温で24時間撹拌下に反応させ
た。反応終了後、1N-塩酸64mlで中和し、減圧濃縮し
た。得られた残渣を水−エタノ−ル（１：５）で再結晶
して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ14.7gを得た（収率9
7.4％）。 融点：146〜149℃ ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300(NH)、3000〜2800(-CH₂-)、1
680(カルボン酸)、1630,1550(アミド)、760(ピリジン
環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：2.20〜2.59(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.64(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、6.
38〜8.09(ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。 5)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロピオン酸 5-
ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドエステル（Ｐｙ−
Ａｌａ−Ａｌａ−０ＮＢ）の合成 上記4)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ 3.6gとＨＯ
ＮＢ 2.7gとを、ＤＭＦ75mlに溶解し、次いで、これ
に、2-ＰＤＳ 3.3gとトリフェニルホスフィン3.9gを含
むＤＭＦ溶液30mlを加えた後、室温で６時間撹拌下に反
応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（溶出液；クロロホ
ルム−アセトン＝１：１の混合溶媒）にて精製し、下記
化学式で示されるＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ2.4gを
油状物質として得た（収率40.5％）。

【化３】 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3600〜3200(NH)、3100〜2900(-C
H₂-)、1780(エステル)、1700,1580(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.29(s,2H,N
B)、2.41〜2.85(m,4H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.68(m,8
H,2×AlaNCH₂- and NB)、6.15(s,2H,NB)、6.44〜7.97
(m,6H,ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。

【００４４】実施例１．蛍光標識糖誘導体の合成 (1)ヒト血清由来トランスフェリンからの糖ペプチドの
調製 ヒト血清トランスフェリン（シグマ社製）１gを50mMト
リス塩酸（pＨ8.0、１mMの塩化カルシウム含有）40mlに
溶解したものに、プロナーゼ（ベーリンガーマンハイム
社製）20mgを加え、30℃で24時間反応させた。24時間経
過後に10mgのプロナーゼを追加し、更に30℃で24時間反
応させた。反応終了後、反応液をトヨパール40Sカラム
（東ソー社製、2.5×140cm。）を用いたクラマトグラフ
ィー（溶離液：0.1N-酢酸）により精製した。回収され
た各画分の内、フェノール硫酸法により橙色を呈する画
分を集め、凍結乾燥し糖ペプチド標品とした。尚、上記
で得られた糖ペプチド標品２mgを6N-塩酸適当量に溶解
し、110℃で24時間加水分解反応させ、生じたアミノ酸
をPTCアミノ酸分析法により分析した。その結果、本糖
ペプチド標品からは、アスパラギン、リジン及びグルコ
サミンのピークが検出された。この結果とヒト血清トラ
ンスフェリンの１次構造を比較した結果、上記糖ペプチ
ドの構造はAsn⁴¹³-（糖鎖）-Lysと推定された。 (2)糖ペプチドへの蛍光標識 上記(1)で得られた糖ペプチド10mgを0.1M 炭酸水素ナト
リウム溶液２mlに溶解したものに、参考例１で得られた
ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ 250mgを加え37℃で３時間反応
させた。反応終了後、反応液を、Wakopak 5C18カラム
（4.6×150mm、和光純薬工業(株)製）を用いた逆相カラ
ムクロマトグラフィーにより分画・精製して、目的の蛍
光標識糖ペプチドを得た。尚、カラムクロマトグラフィ
ーの測定条件は下記の通り。 ・装置：SHIMADSU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・溶離液 Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ4.
0）。 ・溶離液 Ｂ：12% アセトニトリルを含む溶離液 Ａ ・グラジェント条件：Ａ→Ｂ ０〜10分 Ｂ 10〜12分 ・流速：1.5ml／分 ・カラム温度：55℃ ・検出：励起波長：320nm及び測定波長：400nmによる蛍
光検出により行った。 (3)酵素消化による糖鎖の修飾 a)ノイラミニダーゼ消化 上記(2)で得られた蛍光標識糖ペプチド10μgを0.1M リ
ン酸緩衝液（pＨ6.0、γ-ガラクトノラクトンを20mM含
有）100μｌに溶解したものに、ノイラミニダーゼ（ス
トレプトコッカス属由来、東洋紡績(株)製）0.1国際単
位を加え、37℃で18時間反応させた。反応終了後、Wako
pak 5C18カラム（4.6×150mm、和光純薬工業(株)製）を
用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより用いて分画
・精製して、目的の蛍光標識糖ペプチドを得た。尚、カ
ラムクロマトグラフィーの測定条件は上記(2)と同じ。 b)β-ガラクトシダーゼ消化 上記a)で得られたノイラミニダーゼ消化した蛍光標識糖
ペプチドを0.1M 酢酸緩衝液（pＨ3.5）100μｌに溶解し
たものに、β-ガラクトシダーゼ（ナタマメ由来、生化
学工業(株)製）0.1国際単位をくわえ、37℃で18時間反
応させた。反応終了後、Wakopak 5C18カラム（4.6×150
mm、和光純薬工業(株)製）を用いた逆相カラムクロマト
グラフィーにより用いて分画・精製して、目的の蛍光標
識糖誘導体を得た。尚、カラムクロマトグラフィーの測
定条件は上記(2)と同じ。上記(1)で確認された糖ペプチ
ド構造から、これら２種類のエキソグリコシダーゼ消化
により得られた蛍光標識糖ペプチド中の糖鎖構造は、図
１に示す如くであると考えられる。また、該蛍光標識糖
誘導体（酢酸アンモニウム緩衝液中から再結晶）につい
て質量分析を行った結果は次の通りである。 ＭＳ：ｍ／Ｚ 1794.7（Ｍ＋ＮＨ₄）。 ＊計算値：Ｃ₇₁Ｈ₁₁₅Ｎ₁₁Ｏ₄₁ ＝ 1777。 尚、上記(2)の反応に於いて、ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ
の代りに、参考例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＳｕ又は参考例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−
ＯＮＢを蛍光標識化試薬として用い、それ以外は、ＰＡ
Ｅ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの場合と全く同様にして反応及び後
処理を行い、上記で得られたのと同じ糖ペプチド構造を
有する蛍光標識糖ペプチドが得られた。

【００４５】実施例２．α１→６フコース転移酵素（Ｆ
Ｔ16）活性測定 （ＦＴ16酵素源）肝細胞癌患者血清を使用した。 （糖供与体溶液）グアノシン二燐酸−β−フコース（住
友精化製、分子量589.3）を１mMとなるように水に溶解
したものを糖供与体溶液とした。 （糖受容体溶液）実施例１で得られた蛍光標識糖誘導体
（以下、ＦＴ16Ａと略記する。）を147μMとなるように
50mM リン酸緩衝液（pＨ7.0、150mM 塩化ナトリウム及
び0.2%牛血清アルブミンを含有）に溶解したものを糖受
容体溶液とした。 （反応緩衝液）アデノシン５’-三燐酸二ナトリウム・
三水和物（オリエンタル酵母社製）605mg、アジ化ナト
リウム（和光純薬工業(株)製）125mg、塩化マグネシウ
ム・六水和物（和光純薬工業(株)製）１g及び3-(N-モル
ホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）２gを水に溶解し、
pＨを7.5に調製した後、最終液量を100mlとしたものを
反応緩衝液とした。 （ＨＰＬＣ条件） ・装置：SHIMADSU LC-9A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：ＴＳＫgel Amide80（4.6×250mm、東ソー
製）。 ・溶離液Ａ：60％ アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液（pＨ4.0）。 ・溶離液Ｂ：54％ アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液（pＨ4.0）。 ・グラジェント：Ａ→Ｂ ０〜10分。 Ｂ 10〜12分。 ・流速：１ml／分。 ・カラム温度：45℃。 ・検出：励起波長：320nm及び測定波長：400nmによる蛍
光検出により行った。 （操作法）糖供与体溶液２μｌ、糖受容体溶液５μｌ、
反応緩衝液８μｌに、下記表１に示す組成の試料５μｌ
を加え、37℃で16時間反応させた。反応終了後、反応液
に溶離液Ａ200μｌを加えてよく攪拌し、この100μｌを
ＨＰＬＣにより分析した。

【表１】 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、未反応のＦＴ16Ａ
は10.9分後に溶出され、ＦＴ16の作用によりフコースが
ＦＴ16Ａの還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基に
付加した生成物は、11.3分後に溶出されることが判っ
た。該生成物のピークの高さと添加したＦＴ16酵素源液
量との関係を示す検量線を図２に示す。図２から明らか
な如く、該生成物は、ＦＴ16酵素源液量に比例して、即
ちＦＴ16酵素量に比例して生成することが判る。また、
ＦＴ16Ａの還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基以外
の糖残基にフコースが付加した物質は、今回のＨＰＬＣ
による分析条件下ではＦＴ16Ａよりも速く溶出する事が
確認されているので、本発明の測定法によりＦＴ16活性
測定が可能であることが判る。尚、本実施例に於いて、
基質としてＦＴ16を用いる代りに、上記実施例１の(2)
の反応に於いてＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの代りに、参考
例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ又は参考
例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢを蛍光標
識化試薬として用いてＦＴ16と同様にして得られた蛍光
標識糖ペプチドを基質として用いた場合も、上記と同様
の結果が得られた。

【００４６】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、糖鎖の生合
成に重要な働きを有し、最近では腫瘍マーカーとしても
注目されている糖転移酵素等に代表される糖質に作用す
る生理活性物質の基質と成り得る新規な糖誘導体と、そ
れを基質として用いる生理活性物質の簡便で且つ定量性
に優れた活性測定法を提供するものであり、斯業に貢献
するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた蛍光標識糖ペプチド中の糖
鎖構造を示す。

【図２】実施例２で得られた、試料中のＦＴ16酵素源液
量と、ＦＴ16酵素の反応による生成物のピークの高さと
の関係を示す検量線を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年８月２５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】また、一般式(3)、(4)及び(5)で示される
化合物は、例えば以下の如くして合成したものを用いれ
ばよい。先ず、一般式(3)で示される化合物は、例えば
下記の合成ルートに従って容易に合成し得る。

【式１】（上記反応スキーム中、Ｘはハロゲン原子を表
わし、ｍ、ｎ及びＲ4は前記と同じ。）即ち、先ず例え
ば2-クロロピリジン，2-ブロモピリジン，3-クロロピリ
ジン，3-ブロモピリジン等の2-又は3-ハロピリジンと、
該2-又は3-ハロピリジンに対して10〜20倍モルのアルキ
レンジアミン（例えばエチレンジアミン，1,3-プロパン
ジアミン，1,4-ブタンジアミン等）とを80〜120℃で８
〜 24時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を減圧
濃縮し、目的物をクロロホルム、ジクロロエタン等で抽
出し、溶媒留去後、残渣を、適当な溶媒（例えばベンゼ
ン−石油エ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化して、上
記一般式(3a)で示されるアミノアルキルアミノピリジン
を得る。次いで、該アミノアルキルアミノピリジンとこ
れに対して１〜３倍モルのジカルボン酸無水物（例えば
無水コハク酸，無水グルタ−ル酸，無水マレイン酸等）
又は、ジカルボン酸（例えばコハク酸，グルタ−ル酸，
マレイン酸等）の２分子間脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ
₂)n-ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは前記に同じ）とを、例えばメ
タノ−ル、エタノ−ル、イソプロパノール等の溶媒中、
０〜30℃で２〜６時間撹拌下に反応させる。反応後、析
出晶を濾取、乾燥させて、上記一般式(3b)で示される化
合物（以下、化合物(3b)と略記する。）を得る。次い
で、この化合物(3b)を、該化合物に対して１〜３倍モル
の活性エステル化剤［例えばN-ヒドロキシ-5-ノルボル
ネン-2,3-ジカルボキシイミド（以下、ＨＯＮＢと略記
する。）、N-ヒドロキシコハク酸イミド（以下、ＨＯＳ
ｕと略記する。）等］と、例えばジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサ
ン等の溶媒中、例えば、化合物(3b)に対して１〜３倍モ
ルのトリフェニルホスフィンと、これと等モルのジスル
フィド化合物［例えば2,2'- ジチオジピリジン（以下、
2-ＰＤＳと略記する。）、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等］と、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に反応さ
せる。反応後、反応液 を減圧濃縮し、得られた残渣
を、適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル
混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(3)
で示される化合物が 得られる。尚、上記の反応に於い
て、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合物との
組合せ試薬を用いる代りに、例えばジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（Ｗ ＳＣ）等の縮合
試薬を用いても、同様に一般式(3)で示される化合物が
得られる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】本発明の糖誘導体を用いることにより測定
可能な生理活性物質としては、本発明の糖誘導体を基質
とする生理活性物質であれば特に限定することなく挙げ
られるが、具体的には、例えばフコース（α１→２）転
移酵素，フコース（α１→３）転移酵素，フコース（α
１→４）転移酵素，フコース（α１→６）転移酵素，シ
アル酸（α２→３）転移酵素，シアル酸（α２→６）転
移酵素，ガラクトース（β１→３）転移酵素，ガラクト
ース（β１→４）転移酵素，ガラクトース（α１→３）
転移酵素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→２）転移
酵素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→４）転移酵
素，Ｎ-アセチルグルコサミン（β１→６）転移酵素，
マンノース（α１→２）転移酵素，マンノース（α１→
３）転移酵素，マンノース（α１→６）転移酵素，マン
ノース（β１→４）転移酵素，キシロース（β１→２）
転移酵素等の糖転移酵素、例えばシアリダーゼ，β（又
はα）−ガラクトシダーゼ，β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ，α（又はβ）−マンノシダーゼ，α−フコ
シダーゼ，α（又はβ）−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ，キシロシダーゼ等の糖加水分解酵素（エンド
型、エキソ型の何れでも可。）、例えばグルコースイソ
メラーゼ等の糖異性化酵素等の糖修飾酵素が好ましく挙
げられる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】本発明の生理活性物質の活性測定法は、本
発明の糖誘導体を基質として用いる以外は、文献（例え
ばJ.Biol.Chem.,vol.246,5154-5161,1971、Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,vol.136,563-569,1986等）に記載さ
れた自体公知の常法で用いられる試薬類を用い、自体公
知の常法における操作に準じてこれを行えば足りる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】また、本発明の測定法を実施する際の反応
温度は特に限定されないが、通常約25〜40℃の範囲から
適宜選択すればよいし、反応時間も目的により適宜選択
すればよく特に限定されない。反応のpＨは、目的とす
る生理活性物質の性質により若干異なるが、通常約４〜
９、好ましくは６〜８の範囲から適宜選択される。ま
た、pＨを維持する目的で用いられる緩衝剤は、目的と
する酵素反応を妨げないものの中から適宜選択すること
ができ、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン−
塩酸、カコジル酸−水酸化ナトリウム、グッドの緩衝剤
等が好ましく挙げられる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４４】実施例１．蛍光標識糖誘導体の合成 (1)ヒト血清由来トランスフェリンからの糖ペプチドの
調製 ヒト血清トランスフェリン（シグマ社製）１gを50mMト
リス塩酸（pＨ8.0、１mMの塩化カルシウム含有）40mlに
溶解したものに、プロナーゼ（ベーリンガーマンハイム
社製）20mgを加え、30℃で24時間反応させた。24時間経
過後に10mgのプロナーゼを追加し、更に30℃で24時間反
応させた。反応終了後、反応液をトヨパール40Sカラム
（東ソー社製、2.5×140cm。）を用いたクロマトグラフ
ィー（溶離液：0.1N-酢酸）により精製した。回収され
た各画分の内、フェノール硫酸法により橙色を呈する画
分を集め、凍結乾燥し糖ペプチド標品とした。尚、上記
で得られた糖ペプチド標品２mgを6N-塩酸適当量に溶解
し、110℃で24時間加水分解反応させ、生じたアミノ酸
をPTCアミノ酸分析法により分析した。その結果、本糖
ペプチド標品からは、アスパラギン、リジン及びグルコ
サミンのピークが検出された。この結果とヒト血清トラ
ンスフェリンの１次構造を比較した結果、上記糖ペプチ
ドの構造はAsn⁴¹³-（糖鎖）-Lysと推定された。 (2)糖ペプチドへの蛍光標識 上記(1)で得られた糖ペプチド10mgを0.1M 炭酸水素ナト
リウム溶液２mlに溶解したものに、参考例１で得られた
ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ 250mgを加え37℃で３時間反応
させた。反応終了後、反応液を、Wakopak 5C18カラム
（4.6×150mm、和光純薬工業(株)製）を用いた逆相カラ
ムクロマトグラフィーにより分画・精製して、目的の蛍
光標識糖ペプチドを得た。尚、カラムクロマトグラフィ
ーの測定条件は下記の通り。 ・装置：SHIMADZU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・溶離液 Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ4.
0）。 ・溶離液 Ｂ：12% アセトニトリルを含む溶離液 Ａ ・グラジェント条件：Ａ→Ｂ ０〜10分 Ｂ 10〜12分 ・流速：1.5ml／分 ・カラム温度：55℃ ・検出：励起波長：320nm及び測定波長：400nmによる蛍
光検出により行った。 (3)酵素消化による糖鎖の修飾 a)ノイラミニダーゼ消化 上記(2)で得られた蛍光標識糖ペプチド10μgを0.1M リ
ン酸緩衝液（pＨ6.0、γ-ガラクトノラクトンを20mM含
有）100μｌに溶解したものに、ノイラミニダーゼ（ス
トレプトコッカス属由来、東洋紡績(株)製）0.1国際単
位を加え、37℃で18時間反応させた。反応終了後、Wako
pak 5C18カラム（4.6×150mm、和光純薬工業(株)製）を
用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより用いて分画
・精製して、目的の蛍光標識糖ペプチドを得た。尚、カ
ラムクロマトグラフィーの測定条件は上記(2)と同じ。 b)β-ガラクトシダーゼ消化 上記a)で得られたノイラミニダーゼ消化した蛍光標識糖
ペプチドを0.1M 酢酸緩衝液（pＨ3.5）100μｌに溶解し
たものに、β-ガラクトシダーゼ（ナタマメ由来、生化
学工業(株)製）0.1国際単位をくわえ、37℃で18時間反
応させた。反応終了後、Wakopak 5C18カラム（4.6×150
mm、和光純薬工業(株)製）を用いた逆相カラムクロマト
グラフィーにより用いて分画・精製して、目的の蛍光標
識糖誘導体を得た。尚、カラムクロマトグラフィーの測
定条件は上記(2)と同じ。上記(1)で確認された糖ペプチ
ド構造から、これら２種類のエキソグリコシダーゼ消化
により得られた蛍光標識糖ペプチド中の糖鎖構造は、図
１に示す如くであると考えられる。また、該蛍光標識糖
誘導体（酢酸アンモニウム緩衝液中から再結晶）につい
て質量分析を行った結果は次の通りである。 ＭＳ：ｍ／Ｚ 1794.7（Ｍ＋ＮＨ₄）。 ＊計算値：Ｃ₇₁Ｈ₁₁₅Ｎ₁₁Ｏ₄₁ ＝ 1777。 尚、上記(2)の反応に於いて、ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ
の代りに、参考例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＳｕ又は参考例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−
ＯＮＢを蛍光標識化試薬として用い、それ以外は、ＰＡ
Ｅ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの場合と全く同様にして反応及び後
処理を行い、上記で得られたのと同じ糖ペプチド構造を
有する蛍光標識糖ペプチドが得られた。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４５】実施例２．α１→６フコース転移酵素（Ｆ
Ｔ16）活性測定 （ＦＴ16酵素源）肝細胞癌患者血清を使用した。 （糖供与体溶液）グアノシン二燐酸−β−フコース（住
友精化製、分子量589.3）を１mMとなるように水に溶解
したものを糖供与体溶液とした。 （糖受容体溶液）実施例１で得られた蛍光標識糖誘導体
（以下、ＦＴ16Ａと略記する。）を147μMとなるように
50mM リン酸緩衝液（pＨ7.0、150mM 塩化ナトリウム及
び0.2%牛血清アルブミンを含有）に溶解したものを糖受
容体溶液とした。 （反応緩衝液）アデノシン５’-三燐酸二ナトリウム・
三水和物（オリエンタル酵母社製）605mg、アジ化ナト
リウム（和光純薬工業(株)製）125mg、塩化マグネシウ
ム・六水和物（和光純薬工業(株)製）１g及び3-(N-モル
ホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）２gを水に溶解し、
pＨを7.5に調製した後、最終液量を100mlとしたものを
反応緩衝液とした。 （ＨＰＬＣ条件） ・装置：SHIMADZU LC-9A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：ＴＳＫgel Amide80（4.6×250mm、東ソー
製）。 ・溶離液Ａ：60％ アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液（pＨ4.0）。 ・溶離液Ｂ：54％ アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液（pＨ4.0）。 ・グラジェント：Ａ→Ｂ ０〜10分。 Ｂ 10〜12分。 ・流速：１ml／分。 ・カラム温度：45℃。 ・検出：励起波長：320nm及び測定波長：400nmによる蛍
光検出により行った。 （操作法）糖供与体溶液２μｌ、糖受容体溶液５μｌ、
反応緩衝液８μｌに、下記表１に示す組成の試料５μｌ
を加え、37℃で16時間反応させた。反応終了後、反応液
に溶離液Ａ200μｌを加えてよく攪拌し、この100μｌを
ＨＰＬＣにより分析した。

【表１】 （結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、未反応のＦＴ16Ａ
は10.9分後に溶出され、ＦＴ16の作用によりフコースが
ＦＴ16Ａの還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基に
付加した生成物は、11.3分後に溶出されることが判っ
た。該生成物のピークの高さと添加したＦＴ16酵素源液
量との関係を示す検量線を図２に示す。図２から明らか
な如く、該生成物は、ＦＴ16酵素源液量に比例して、即
ちＦＴ16酵素量に比例して生成することが判る。また、
ＦＴ16Ａの還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基以外
の糖残基にフコースが付加した物質は、今回のＨＰＬＣ
による分析条件下ではＦＴ16Ａよりも速く溶出する事が
確認されているので、本発明の測定法によりＦＴ16活性
測定が可能であることが判る。尚、本実施例に於いて、
基質としてＦＴ16を用いる代りに、上記実施例１の(2)
の反応に於いてＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの代りに、参考
例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ又は参考
例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢを蛍光標
識化試薬として用いてＦＴ16と同様にして得られた蛍光
標識糖ペプチドを基質として用いた場合も、上記と同様
の結果が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/533 6807−4Ｂ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式(1) Ｒ1−Ａ−ＮＨ−Ｒ2 (1) （式中、Ｒ1は糖鎖を表わし、Ａはアミノ酸残基又はペ
   プチド残基を表わし、Ｒ2は末端にピリジルアミノ基を
   有する有機残基を表わす。）で示される糖誘導体。
2. 【請求項２】下記一般式(1) Ｒ1−Ａ−ＮＨ−Ｒ2 (1) （式中、Ｒ1は糖鎖を表わし、Ａはアミノ酸残基又はペ
   プチド残基を表わし、Ｒ2は末端にピリジルアミノ基を
   有する有機残基を表わす。）で示される糖誘導体を基質
   として用いることを特徴とする生理活性物質の活性測定
   法。
3. 【請求項３】生理活性物質が、糖修飾酵素である請求項
   ２に記載の測定法。
4. 【請求項４】糖修飾酵素が、糖転移酵素、糖加水分解酵
   素又は糖異性化酵素である請求項３に記載の測定法。