JPH0665406A - 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂 - Google Patents
酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂Info
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- JPH0665406A JPH0665406A JP4244054A JP24405492A JPH0665406A JP H0665406 A JPH0665406 A JP H0665406A JP 4244054 A JP4244054 A JP 4244054A JP 24405492 A JP24405492 A JP 24405492A JP H0665406 A JPH0665406 A JP H0665406A
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- acidic polysaccharide
- anion exchange
- fucoidan
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酸性多糖分解酵素の精製に有用なアフィニテ
ィー担体及び該担体を用いる酸性多糖分解酵素の簡便な
精製方法を提供する。 【構成】 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂。該
陰イオン交換樹脂を使用する酸性多糖分解酵素の精製方
法。例えばフコイダン結合陰イオン交換樹脂を用いて、
キタムラサキウニ（Strongylocentrotus nudus) の消化
管より、フコイダン分解酵素を簡便に精製することがで
きる。 【効果】 該陰イオン交換樹脂は、酸性多糖とイオン交
換樹脂のイオン結合が強固であり、酵素の結合、溶出に
伴う酸性多糖の溶出がないため繰返し使用が可能であ
る。
ィー担体及び該担体を用いる酸性多糖分解酵素の簡便な
精製方法を提供する。 【構成】 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂。該
陰イオン交換樹脂を使用する酸性多糖分解酵素の精製方
法。例えばフコイダン結合陰イオン交換樹脂を用いて、
キタムラサキウニ（Strongylocentrotus nudus) の消化
管より、フコイダン分解酵素を簡便に精製することがで
きる。 【効果】 該陰イオン交換樹脂は、酸性多糖とイオン交
換樹脂のイオン結合が強固であり、酵素の結合、溶出に
伴う酸性多糖の溶出がないため繰返し使用が可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酸性多糖の構造解析や
酸性多糖の分解及びオリゴ糖の製造等に利用できる酸性
多糖分解酵素の精製に有用なアフィニティ担体及びその
使用方法に関する。
酸性多糖の分解及びオリゴ糖の製造等に利用できる酸性
多糖分解酵素の精製に有用なアフィニティ担体及びその
使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フコイダン、コンドロイチン硫酸、ヘパ
リン、ラムナン硫酸、ガラクタン、デキストラン硫酸、
ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸等の酸性多糖類
は、動物組織、植物組織、海草等に広く存在している。
これら酸性多糖類は種々の生理活性を有することが知ら
れており、医薬品や食品に有効利用されている。これら
の酸性多糖類の研究やこれらの酸性多糖類からのオリゴ
糖類の作製等には、各々の多糖に作用する分解酵素の利
用が必要不可欠である。しかし、これらの酸性多糖分解
酵素は、種々の生物体にその存在が知られているもの
の、一般に、生体内には極く微量存在するだけなので、
これらの酵素を精製するには様々な精製方法を組合せて
用いる必要がある。よってこれらの酵素を工業的に有利
に得ることは困難である。またこれらの酸性多糖分解酵
素の、アフィニティーカラムによる簡便な精製方法につ
いてはほとんど報告されていない。
リン、ラムナン硫酸、ガラクタン、デキストラン硫酸、
ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸等の酸性多糖類
は、動物組織、植物組織、海草等に広く存在している。
これら酸性多糖類は種々の生理活性を有することが知ら
れており、医薬品や食品に有効利用されている。これら
の酸性多糖類の研究やこれらの酸性多糖類からのオリゴ
糖類の作製等には、各々の多糖に作用する分解酵素の利
用が必要不可欠である。しかし、これらの酸性多糖分解
酵素は、種々の生物体にその存在が知られているもの
の、一般に、生体内には極く微量存在するだけなので、
これらの酵素を精製するには様々な精製方法を組合せて
用いる必要がある。よってこれらの酵素を工業的に有利
に得ることは困難である。またこれらの酸性多糖分解酵
素の、アフィニティーカラムによる簡便な精製方法につ
いてはほとんど報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酸性
多糖分解酵素の精製に有用なアフィニティー担体及び該
担体を用いる酸性多糖分解酵素の簡便な精製方法を提供
することにある。
多糖分解酵素の精製に有用なアフィニティー担体及び該
担体を用いる酸性多糖分解酵素の簡便な精製方法を提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂に関する。また本発明の第２の発明は、酸性多糖
を結合させた陰イオン交換樹脂を使用することを特徴と
する酸性多糖分解酵素の精製方法に関する。
発明の第１の発明は、酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂に関する。また本発明の第２の発明は、酸性多糖
を結合させた陰イオン交換樹脂を使用することを特徴と
する酸性多糖分解酵素の精製方法に関する。
【０００５】本発明者らは上記課題にかんがみ、酸性多
糖分解酵素の精製方法に関して鋭意検討を行い、酸性多
糖を結合させた陰イオン交換樹脂が酸性多糖分解酵素の
精製に有効であることを見出し、本発明を完成した。
糖分解酵素の精製方法に関して鋭意検討を行い、酸性多
糖を結合させた陰イオン交換樹脂が酸性多糖分解酵素の
精製に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】以下本発明について、詳細に説明する。本
発明に使用される酸性多糖の種類は特に限定されるもの
ではなく、例えばフコイダン、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリン、ラムナン硫酸、ガラクタン、デキストラン硫
酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸等の酸性多
糖を用いることができる。これらの酸性多糖はどの様な
純度の物でも使用できるが、精製標品の使用が望まし
い。
発明に使用される酸性多糖の種類は特に限定されるもの
ではなく、例えばフコイダン、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリン、ラムナン硫酸、ガラクタン、デキストラン硫
酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン酸等の酸性多
糖を用いることができる。これらの酸性多糖はどの様な
純度の物でも使用できるが、精製標品の使用が望まし
い。
【０００７】本発明において用いられる陰イオン交換樹
脂は特に限定されるものではない。酸性多糖は、陰イオ
ン交換樹脂の活性基の種類、あるいは活性基の塩基性の
強弱あるいは担体の種類などには関わりなく強固に結合
しうる。陰イオン交換樹脂の活性基としては、例えばＤ
ＥＡＥ（ジエチルアミノエチル基）、ＱＡＥ〔ジエチル
（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基〕、Ｑ（又
はＴＥＡＥ）（トリエチルアミノエチル基）、ジメチル
（２−ヒドロキシエチル）アミノメチル基、ＰＡＢ（パ
ラアミノベンジル基）、ＡＥ（アミノエチル基）、ＧＥ
（グアニドエチル基）等が用いられており、これらを有
する陰イオン交換樹脂を用いることができる。陰イオン
交換樹脂の担体としては、例えばセルロース系の物質、
デキストラン系の物質、アガロース系の物質、スチレン
ジビニルベンゼン重合体や、親水性ビニルポリマー等の
合成ポリマー系の物質等が用いられており、いかなる担
体を用いた陰イオン交換樹脂でも用いることができる。
これらの活性基と担体とを組合せた市販の陰イオン交換
樹脂には、例えばＤＥＡＥ−セファロース系、ＤＥＡＥ
−セファセル系、ＤＥＡＥ−セファデックス系、ＱＡＥ
−セファデックス系、Ｑ−セファロースファストフロー
（以上ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−バイオゲル系、
ＡＧ系（以上バイオラッド社製）、ＴＳＫゲルトヨパー
ル系（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セルロファイン系（生
化学工業社製）、ダウエックス系（ダウケミカル社
製）、ＴＥＡＥ−セルロース（セルバ社製）、アンバー
ライト系（ローム アンド ハース社製）等があり、い
ずれも本発明に用いることができる。
脂は特に限定されるものではない。酸性多糖は、陰イオ
ン交換樹脂の活性基の種類、あるいは活性基の塩基性の
強弱あるいは担体の種類などには関わりなく強固に結合
しうる。陰イオン交換樹脂の活性基としては、例えばＤ
ＥＡＥ（ジエチルアミノエチル基）、ＱＡＥ〔ジエチル
（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基〕、Ｑ（又
はＴＥＡＥ）（トリエチルアミノエチル基）、ジメチル
（２−ヒドロキシエチル）アミノメチル基、ＰＡＢ（パ
ラアミノベンジル基）、ＡＥ（アミノエチル基）、ＧＥ
（グアニドエチル基）等が用いられており、これらを有
する陰イオン交換樹脂を用いることができる。陰イオン
交換樹脂の担体としては、例えばセルロース系の物質、
デキストラン系の物質、アガロース系の物質、スチレン
ジビニルベンゼン重合体や、親水性ビニルポリマー等の
合成ポリマー系の物質等が用いられており、いかなる担
体を用いた陰イオン交換樹脂でも用いることができる。
これらの活性基と担体とを組合せた市販の陰イオン交換
樹脂には、例えばＤＥＡＥ−セファロース系、ＤＥＡＥ
−セファセル系、ＤＥＡＥ−セファデックス系、ＱＡＥ
−セファデックス系、Ｑ−セファロースファストフロー
（以上ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−バイオゲル系、
ＡＧ系（以上バイオラッド社製）、ＴＳＫゲルトヨパー
ル系（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セルロファイン系（生
化学工業社製）、ダウエックス系（ダウケミカル社
製）、ＴＥＡＥ−セルロース（セルバ社製）、アンバー
ライト系（ローム アンド ハース社製）等があり、い
ずれも本発明に用いることができる。
【０００８】これらの陰イオン交換樹脂を適当な緩衝液
で平衡化し、次いで上記の酸性多糖を水、あるいは適当
な緩衝液に溶解した物を混ぜ合せる。このとき、陰イオ
ン交換樹脂を適当な緩衝液で平衡化したものをカラムに
詰めて、酸性多糖を水、あるいは適当な緩衝液に溶解し
たものをカラムに流しても良い。こうして、本発明の酸
性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂が得られる。この
とき用いる緩衝液のｐＨ、温度、組成等の条件は特に限
定されないが、例えば緩衝液のｐＨは、使用する酸性多
糖類の等電点以上であれば良く、例えば塩濃度は０〜５
００mM程度が望ましい。緩衝液の温度は特に限定されな
い。
で平衡化し、次いで上記の酸性多糖を水、あるいは適当
な緩衝液に溶解した物を混ぜ合せる。このとき、陰イオ
ン交換樹脂を適当な緩衝液で平衡化したものをカラムに
詰めて、酸性多糖を水、あるいは適当な緩衝液に溶解し
たものをカラムに流しても良い。こうして、本発明の酸
性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂が得られる。この
とき用いる緩衝液のｐＨ、温度、組成等の条件は特に限
定されないが、例えば緩衝液のｐＨは、使用する酸性多
糖類の等電点以上であれば良く、例えば塩濃度は０〜５
００mM程度が望ましい。緩衝液の温度は特に限定されな
い。
【０００９】本発明の酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂を用いて酸性多糖分解酵素を精製する際には、適
当な緩衝液で平衡化した、酸性多糖を結合させた陰イオ
ン交換樹脂と酸性多糖分解酵素を含む酵素溶液を混合
し、非吸着分を洗浄し、吸着した酸性多糖分解酵素を適
当な緩衝液で溶出する。この時平衡化に用いる緩衝液
は、特に限定されるものではないが、精製対象の酵素が
樹脂に結合させた酸性多糖に対して強い親和性を持ち得
るような、組成、ｐＨ、塩濃度、温度等の条件が望まし
い。一般に酸性多糖分解酵素が、基質となる酸性多糖に
対して強い親和性を持ち得る条件というのは、酵素が活
性を持つ条件とほぼ同条件である。
換樹脂を用いて酸性多糖分解酵素を精製する際には、適
当な緩衝液で平衡化した、酸性多糖を結合させた陰イオ
ン交換樹脂と酸性多糖分解酵素を含む酵素溶液を混合
し、非吸着分を洗浄し、吸着した酸性多糖分解酵素を適
当な緩衝液で溶出する。この時平衡化に用いる緩衝液
は、特に限定されるものではないが、精製対象の酵素が
樹脂に結合させた酸性多糖に対して強い親和性を持ち得
るような、組成、ｐＨ、塩濃度、温度等の条件が望まし
い。一般に酸性多糖分解酵素が、基質となる酸性多糖に
対して強い親和性を持ち得る条件というのは、酵素が活
性を持つ条件とほぼ同条件である。
【００１０】また、酸性多糖分解酵素を溶出する緩衝液
は、特に限定されるものではないが、精製する酸性多糖
分解酵素が樹脂に結合させた酸性多糖に対して親和性を
持たないような、組成、ｐＨ、塩濃度、温度等の条件が
望ましい。一般に酸性多糖分解酵素が、基質となる酸性
多糖に対して親和性を持たない条件というのは、酵素が
活性を持たない条件とほぼ同条件である。また別の溶出
方法として、酵素の拮抗阻害剤、酵素の基質、尿素など
の変性剤を溶出用の緩衝液に加えてもよい。
は、特に限定されるものではないが、精製する酸性多糖
分解酵素が樹脂に結合させた酸性多糖に対して親和性を
持たないような、組成、ｐＨ、塩濃度、温度等の条件が
望ましい。一般に酸性多糖分解酵素が、基質となる酸性
多糖に対して親和性を持たない条件というのは、酵素が
活性を持たない条件とほぼ同条件である。また別の溶出
方法として、酵素の拮抗阻害剤、酵素の基質、尿素など
の変性剤を溶出用の緩衝液に加えてもよい。
【００１１】本発明の酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂は、酸性多糖と陰イオン交換樹脂のイオン結合が
強固であり、酵素の結合、溶出に伴う酸性多糖の溶出が
ないばかりでなく吸着した酵素による酸性多糖の分解も
ほとんどないため、使用後適当な緩衝液で洗浄すること
により繰返し使用可能である。
換樹脂は、酸性多糖と陰イオン交換樹脂のイオン結合が
強固であり、酵素の結合、溶出に伴う酸性多糖の溶出が
ないばかりでなく吸着した酵素による酸性多糖の分解も
ほとんどないため、使用後適当な緩衝液で洗浄すること
により繰返し使用可能である。
【００１２】ある種の酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂を用いることにより、その種の酸性多糖を分解す
る酵素の精製を行うことができる。例えばフコイダンを
結合させた陰イオン交換樹脂を用いればフコイダン分解
酵素を簡便に精製することができる。同様に、例えばコ
ンドロイチン硫酸、ヘパリン、ラムナン硫酸、ガラクタ
ン、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペ
クチン酸を結合させた陰イオン交換樹脂を作製し、各々
の樹脂を用いて、コンドロイチン硫酸リアーゼ、ヘパリ
ナーゼ、ラムナン硫酸分解酵素、ガラクタン分解酵素、
デキストラン硫酸分解酵素、ヒアルロニダーゼ、アルギ
ナーゼ、ペクチナーゼ等を簡便に精製することができ
る。
換樹脂を用いることにより、その種の酸性多糖を分解す
る酵素の精製を行うことができる。例えばフコイダンを
結合させた陰イオン交換樹脂を用いればフコイダン分解
酵素を簡便に精製することができる。同様に、例えばコ
ンドロイチン硫酸、ヘパリン、ラムナン硫酸、ガラクタ
ン、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペ
クチン酸を結合させた陰イオン交換樹脂を作製し、各々
の樹脂を用いて、コンドロイチン硫酸リアーゼ、ヘパリ
ナーゼ、ラムナン硫酸分解酵素、ガラクタン分解酵素、
デキストラン硫酸分解酵素、ヒアルロニダーゼ、アルギ
ナーゼ、ペクチナーゼ等を簡便に精製することができ
る。
【００１３】本発明に基づいてフコイダン結合陰イオン
交換樹脂を作製し、該フコイダン結合陰イオン交換樹脂
を用いて、キタムラサキウニ（Strongylocentrotus nud
us)の消化管より、フコイダン分解酵素を簡便に精製す
ることができる。フコイダン結合陰イオン交換樹脂を作
製する際には、例えば市販のフコイダンを精製して用い
ることができる。陰イオン交換樹脂としては、例えばＤ
ＥＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシ
ア社製）、ＡＧ１−Ｘ２（バイオラッド社製）、ＴＳＫ
ゲル ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０（東ソー社製）等
を用いることができ、これらの陰イオン交換樹脂をカラ
ムに詰め、適当な緩衝液で平衡化し、精製したフコイダ
ン溶液を流して、フコイダンを結合させた陰イオン交換
樹脂を得ることができる。
交換樹脂を作製し、該フコイダン結合陰イオン交換樹脂
を用いて、キタムラサキウニ（Strongylocentrotus nud
us)の消化管より、フコイダン分解酵素を簡便に精製す
ることができる。フコイダン結合陰イオン交換樹脂を作
製する際には、例えば市販のフコイダンを精製して用い
ることができる。陰イオン交換樹脂としては、例えばＤ
ＥＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシ
ア社製）、ＡＧ１−Ｘ２（バイオラッド社製）、ＴＳＫ
ゲル ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０（東ソー社製）等
を用いることができ、これらの陰イオン交換樹脂をカラ
ムに詰め、適当な緩衝液で平衡化し、精製したフコイダ
ン溶液を流して、フコイダンを結合させた陰イオン交換
樹脂を得ることができる。
【００１４】これらのフコイダンを結合させた陰イオン
交換樹脂を用いて下記のようにキタムラサキウニの消化
管よりフコイダン分解酵素を精製することができる。す
なわち、キタムラサキウニの消化管壁及び消化管内容物
を集め、細胞を破砕して得た無細胞抽出液に例えば硫安
塩析、透析、ゲルろ過等の処理を行い、フコイダン分解
酵素を含む粗酵素液を調製し、上記のフコイダンを結合
させた陰イオン交換樹脂に該粗酵素液を流し、適当な条
件で溶出すると、フコイダン分解酵素の精製標品を得る
ことができる。
交換樹脂を用いて下記のようにキタムラサキウニの消化
管よりフコイダン分解酵素を精製することができる。す
なわち、キタムラサキウニの消化管壁及び消化管内容物
を集め、細胞を破砕して得た無細胞抽出液に例えば硫安
塩析、透析、ゲルろ過等の処理を行い、フコイダン分解
酵素を含む粗酵素液を調製し、上記のフコイダンを結合
させた陰イオン交換樹脂に該粗酵素液を流し、適当な条
件で溶出すると、フコイダン分解酵素の精製標品を得る
ことができる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって示すが、本発
明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００１６】実施例１ １−１ 酸性多糖の精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製、硫酸含
量は０．３５モル硫酸／１モルフコース当量）を５０ｍ
ｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で十
分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２０
０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦを詰めたカラムに流す。同カラム
を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜
３０００ｍＭの塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、
８００〜２０００ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過によ
り脱塩、濃縮し４０ｍｌの精製フコイダン溶液を得た。
この精製フコイダンの硫酸含量は、０．５２モル硫酸／
１モルフコース当量であった。
量は０．３５モル硫酸／１モルフコース当量）を５０ｍ
ｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で十
分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２０
０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦを詰めたカラムに流す。同カラム
を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜
３０００ｍＭの塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、
８００〜２０００ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過によ
り脱塩、濃縮し４０ｍｌの精製フコイダン溶液を得た。
この精製フコイダンの硫酸含量は、０．５２モル硫酸／
１モルフコース当量であった。
【００１７】１−２ 酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂の調製 以下の操作は２３℃で行った。５ｍｌのＤＥＡＥ−セフ
ァロースＦＦをガラス製のカラムに詰め、５０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ３．０）で平衡化し、このカラムに、上記の精製
フコイダン溶液の上清を流し、次に、平衡化に用いた緩
衝液で洗浄し、樹脂１ｍｌ当り約２０ｍｇのフコイダン
を結合させた陰イオン交換樹脂を得た。
換樹脂の調製 以下の操作は２３℃で行った。５ｍｌのＤＥＡＥ−セフ
ァロースＦＦをガラス製のカラムに詰め、５０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ３．０）で平衡化し、このカラムに、上記の精製
フコイダン溶液の上清を流し、次に、平衡化に用いた緩
衝液で洗浄し、樹脂１ｍｌ当り約２０ｍｇのフコイダン
を結合させた陰イオン交換樹脂を得た。
【００１８】１−３ 酸性多糖分解酵素を含む粗酵素液
の調製 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニの消化管
壁及び消化管内容物１９２ｇを常法によりアセトンパウ
ダー（２０ｇ）とし、３００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ２．５）に懸濁し、２時間かくはん
後遠心分離し上清を得た。その上清に７０％飽和となる
ように硫安を加え１時間かくはん後遠心分離し沈殿を得
た。その沈殿を２０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ２．５）に溶解後、５０ｍＭの塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．
０）で透析した。この酵素液を遠心分離した上清に、５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファ
ロースＦＦ２５ｍｌを加えかくはん後ガラスフィルター
でろ過したろ液３０ｍｌを、フコイダン分解酵素を含む
粗酵素液とした。本粗酵素液の比活性は３．６６ｍＵ／
ｍｇ・タンパク質であった。
の調製 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニの消化管
壁及び消化管内容物１９２ｇを常法によりアセトンパウ
ダー（２０ｇ）とし、３００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ２．５）に懸濁し、２時間かくはん
後遠心分離し上清を得た。その上清に７０％飽和となる
ように硫安を加え１時間かくはん後遠心分離し沈殿を得
た。その沈殿を２０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ２．５）に溶解後、５０ｍＭの塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．
０）で透析した。この酵素液を遠心分離した上清に、５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファ
ロースＦＦ２５ｍｌを加えかくはん後ガラスフィルター
でろ過したろ液３０ｍｌを、フコイダン分解酵素を含む
粗酵素液とした。本粗酵素液の比活性は３．６６ｍＵ／
ｍｇ・タンパク質であった。
【００１９】１−４ 酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂によるフコイダン分解酵素の精製 以下の操作は２３℃で行った。上記の、カラムに詰めた
フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂に、上記のフ
コイダン分解粗酵素液を流し、次に、５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３．０）で洗浄し、非吸着分を除いた。この後、２００
ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）を流して溶出してくるタンパク質を
集め、精製フコイダン分解酵素１５５ｍＵを得た。精製
した酵素の比活性は８．０ｍＵ／ｍｇ・タンパク質であ
った。また、精製したフコイダン分解酵素はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により均一なバンドを呈した。以
上の精製工程の各結果を表１に示す。
換樹脂によるフコイダン分解酵素の精製 以下の操作は２３℃で行った。上記の、カラムに詰めた
フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂に、上記のフ
コイダン分解粗酵素液を流し、次に、５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３．０）で洗浄し、非吸着分を除いた。この後、２００
ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）を流して溶出してくるタンパク質を
集め、精製フコイダン分解酵素１５５ｍＵを得た。精製
した酵素の比活性は８．０ｍＵ／ｍｇ・タンパク質であ
った。また、精製したフコイダン分解酵素はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により均一なバンドを呈した。以
上の精製工程の各結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】 表 １ 工 程 総タンパク 総活性 比活性 収 率 (mg) (mU) (mU/mg) （％） ──────────────────────────────────── アセトンパウダー抽出液* 2280 − − − 硫安塩析 28.7 105*** 3.0 100 DEAE−セファロースFF処理 26.9 120*** 3.7 114 カラムクロマトグラフィー** 21.3 155*** 8.0 148 ────────────────────────────────────
【００２１】* 還元性物質が多いため酵素活性の測定
ができない。 ** フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂によるカ
ラムクロマトグラフィー *** 酵素反応を阻害する物質が共存するため、見掛上酵
素活性が低く観察されている。精製が進むに従って阻害
物質が除去されるので、酵素活性が上昇する。
ができない。 ** フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂によるカ
ラムクロマトグラフィー *** 酵素反応を阻害する物質が共存するため、見掛上酵
素活性が低く観察されている。精製が進むに従って阻害
物質が除去されるので、酵素活性が上昇する。
【００２２】実施例２ ２−１ 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂の調製 以下の操作は２３℃で行った。３０ｍｌのＡＧ１−Ｘ２
（バイオラッド社製）をガラス製のカラムに詰め、５０
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化した。このカラムに、実
施例１−１で得た精製フコイダン溶液を流し、次に、平
衡化に用いた緩衝液で洗浄し、樹脂１ｍｌ当り約０．６
ｍｇのフコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂を得
た。
（バイオラッド社製）をガラス製のカラムに詰め、５０
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化した。このカラムに、実
施例１−１で得た精製フコイダン溶液を流し、次に、平
衡化に用いた緩衝液で洗浄し、樹脂１ｍｌ当り約０．６
ｍｇのフコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂を得
た。
【００２３】２−２ 酸性多糖を結合させた陰イオン交
換樹脂によるフコイダン分解酵素の精製 以下の操作は２３℃で行った。実施例２−１で得たカラ
ムに詰めたフコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂
に、実施例１−３で得たフコイダン分解酵素を含む粗酵
素液を流し、次に、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄し、
非吸着分を除いた。この後、２００ｍＭ塩化ナトリウム
を含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
を流して溶出してくるタンパク質を集め、精製フコイダ
ン分解酵素１３０ｍＵを得た。精製した酵素の比活性は
８．２ｍＵ／ｍｇ・タンパク質であった。また、精製し
たフコイダン分解酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳
動により均一なバンドを呈した。
換樹脂によるフコイダン分解酵素の精製 以下の操作は２３℃で行った。実施例２−１で得たカラ
ムに詰めたフコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂
に、実施例１−３で得たフコイダン分解酵素を含む粗酵
素液を流し、次に、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄し、
非吸着分を除いた。この後、２００ｍＭ塩化ナトリウム
を含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
を流して溶出してくるタンパク質を集め、精製フコイダ
ン分解酵素１３０ｍＵを得た。精製した酵素の比活性は
８．２ｍＵ／ｍｇ・タンパク質であった。また、精製し
たフコイダン分解酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳
動により均一なバンドを呈した。
【００２４】なお、フコイダン分解酵素の活性の測定は
以下の様にして行った。実施例１−１に得た精製フコイ
ダン溶液１００μｌと１２５ｍＭの塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１
００μｌを加え、適当に希釈したフコイダン分解酵素を
５０μｌ加えてよくかくはんし３７℃で１８時間保温す
る。別に対照としてフコイダン溶液の代りに水を加えた
ものと、酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝液を
加えたものも同条件で保温する。これらの反応液に含ま
れる還元糖量をソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson )
法〔福井作蔵著、「還元糖の定量法」（第２版）第９
頁、学会出版センター、１９９０年〕により測定し、別
にＬ−フコースを標準物質として作成した検量線よりＬ
−フコース当量を求める。その後、下記の式（数１）よ
り酵素溶液の活性を求める。
以下の様にして行った。実施例１−１に得た精製フコイ
ダン溶液１００μｌと１２５ｍＭの塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１
００μｌを加え、適当に希釈したフコイダン分解酵素を
５０μｌ加えてよくかくはんし３７℃で１８時間保温す
る。別に対照としてフコイダン溶液の代りに水を加えた
ものと、酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝液を
加えたものも同条件で保温する。これらの反応液に含ま
れる還元糖量をソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson )
法〔福井作蔵著、「還元糖の定量法」（第２版）第９
頁、学会出版センター、１９９０年〕により測定し、別
にＬ−フコースを標準物質として作成した検量線よりＬ
−フコース当量を求める。その後、下記の式（数１）よ
り酵素溶液の活性を求める。
【００２５】
【数１】 〔（Ｔ−Ｅ−Ｆ）×０．２５×ｄｆ〕／（０．０５×１８×６０） ＝（Ｕ／ｍｌ）
【００２６】 Ｔ ：反応液中に生成した還元力のＬ−フコース
当量（μｍｏｌ） Ｅ ：フコイダンの代りに水を用いた反応液中に
生成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ） Ｆ ：酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝
液を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当
量（μｍｏｌ） ０．２５ ：反応液の液量（ｍｌ） ０．０５ ：反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） １８×６０：反応時間（分） ｄｆ ：酵素溶液の希釈倍率 １単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏ
ｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させる酵素量とす
る。
当量（μｍｏｌ） Ｅ ：フコイダンの代りに水を用いた反応液中に
生成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ） Ｆ ：酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝
液を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当
量（μｍｏｌ） ０．２５ ：反応液の液量（ｍｌ） ０．０５ ：反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） １８×６０：反応時間（分） ｄｆ ：酵素溶液の希釈倍率 １単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏ
ｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させる酵素量とす
る。
【００２７】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、酸性多糖分解酵素の精製
に有用な酸性多糖結合陰イオン交換樹脂、及び酸性多糖
結合陰イオン交換樹脂を用いた酸性多糖分解酵素の精製
方法が提供された。本発明の酸性多糖を結合させた陰イ
オン交換樹脂は、酸性多糖とイオン交換樹脂のイオン結
合が強固であり、酵素の結合、溶出に伴う酸性多糖の溶
出がないため使用後、洗浄することにより繰返し使用が
可能である。
に有用な酸性多糖結合陰イオン交換樹脂、及び酸性多糖
結合陰イオン交換樹脂を用いた酸性多糖分解酵素の精製
方法が提供された。本発明の酸性多糖を結合させた陰イ
オン交換樹脂は、酸性多糖とイオン交換樹脂のイオン結
合が強固であり、酵素の結合、溶出に伴う酸性多糖の溶
出がないため使用後、洗浄することにより繰返し使用が
可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 遠藤 正彦 青森県弘前市富士見町18の７
Claims (2)
- 【請求項１】 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹
脂。 - 【請求項２】 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂
を使用することを特徴とする酸性多糖分解酵素の精製方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4244054A JPH0665406A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4244054A JPH0665406A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0665406A true JPH0665406A (ja) | 1994-03-08 |
Family
ID=17113048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4244054A Pending JPH0665406A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | 酸性多糖を結合させた陰イオン交換樹脂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0665406A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001002693A (ja) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | デアミノノイラミン酸誘導体、デアミノノイラミニダーゼの精製方法及びデアミノノイラミン酸結合性物質の検出方法 |
| CN103382229A (zh) * | 2013-06-21 | 2013-11-06 | 中国药科大学 | 一种具有免疫调节作用的新型海胆黄多糖的制备方法及结构鉴定 |
-
1992
- 1992-08-21 JP JP4244054A patent/JPH0665406A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001002693A (ja) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | デアミノノイラミン酸誘導体、デアミノノイラミニダーゼの精製方法及びデアミノノイラミン酸結合性物質の検出方法 |
| CN103382229A (zh) * | 2013-06-21 | 2013-11-06 | 中国药科大学 | 一种具有免疫调节作用的新型海胆黄多糖的制备方法及结构鉴定 |
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