JPS6031478B2 - 純コンドロイチナ−ゼｂの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコンドロィチン硫酸Ｂタイプ分解酵素であるコ
ンドロィチナーゼＢの製造法に関するものであり、さら
に詳しくは、コンドロイチナーゼＢの部分精製液をコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したへパリン固定化アガ
ロースを分離剤とするカラムタロマトグラフィーに付す
ることを特徴とする純コンドロィチナーゼＢの製造法に
関するものである。

コンドロィチン硫酸Ｂタイプは動物の皮膚や脈管などに
へパリチン硫酸と共に見出される酸性ムコ多糖体の一種
で、その保水性により細胞の新陳代謝を円滑ならしめ、
他方血管壁に見出されることから血液凝固阻止機構に関
与しているなど生体内において重要な役割を果している
ものと推測されているが、その構造、物性、生物活性な
どについては不明な部分が多く、例えばその構造につい
ても一応推定されてはいるが確立されていない。

コンドロィチン硫酸Ｂタイプの構造を明確にすることは
、コンドロィチン硫酸Ｂタイプの生体内における役割の
追求、さらに生理機序を明らかにする上で極めて望まし
いことであり、これらを明らかにすることは期待される
コンドロィチン硫酸Ｂタイプの医薬用あるいは化粧用へ
の用途開発の推進に大きく寄与するものと考えられる。
このようにコンドロィチン硫酸Ｂタイプの研究において
、温和な条件下であるためにこれを必要以上に痛めるこ
となく分解するコンドロィチナ−ゼＢに対する期待は大
きく、コンドロイチナーゼＢの果す役割は大きいものが
ある。

コンドロィチナーゼＢに関しては、フラボバクテリウム
属の細菌をコンドロィチン硫酸を添加した培地で培養（
Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｐ．、ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｊｏｌ．Ｃ
ｈｅｍへ ２３５、３０６６、１９６０）することによ
って該菌体内にコンドロイチナーゼＢが産生されること
が知られており、菌体内に産生されたコンドロイチナー
ゼＢの分離精製に関してはミケラシーらのァガロースを
支持体とする露気泳動による方法（Ｙ．Ｍ．Ｍｊｃｈｅ
ｌａｃｃｉ ＆ Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｅｈ：Ｂ．Ｂ．
Ｒ．Ｃ．、５６、９７３（１９７４））が知られている
。

しかし、この方法では雷気泳動という手法であるために
、コンドロィチナーゼＢを大量に分離精製するには通し
た方法とは云い難い。本発明者らはこのような従来法の
難点を解決し、他の酵素を含まない高純度のコンドロィ
チナーゼＢを大量に分離精製する方法について鋭意研究
を行なった結果、コンドロィチナーゼＢの部分精製液を
コンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したへパリン固定化
アガロースを用いたカラムクロマトグラフィーを行なう
ことによって、容易に大量の高純度コンドロィチナーゼ
Ｂが得られることを見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明の目的は他の酵素を含まない高純度の
コンドロィチナーゼＢを大量に、かつ容易に得ることに
あり、本発明の目的は本発明の方法に従って分離精製を
行なうことによって、容易にその目的をを達することが
できる。

次に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明はコンドロィチナーゼＢの部分精製液を、コンド
ロィチン硫酸Ｂタイプで処理を行なったへパリン固定化
アガロースを分離剤とするカラムクロマトグラフィーに
よってさらに精製し、高純度のコンドロィチナーゼＢを
製造する方法にあるが、本発明におるコンドロィチナー
ゼＢの部分精製液とは、コンドロィチナーゼＢ産生菌体
を破壊した得られる抽出液を、例えばプロタミン硫酸処
理した後ヒドロキシアパタィトカラムクロマトグラフィ
ー、ゲル７戸週法、分別沈澱法等によって部分的に精製
して得られるコンドロィチナーゼＢ含有画分をいうが、
なかでもヒドロキシアパタィトカラムクロマトグラフイ
ーによる分画が好ましい。

コンドロィチナーゼＢ産生菌体としてはフラボバクテリ
ウム属の菌、なかでも特にフラボバクテリウム・ヘパリ
ナム（ＦｌａＶｏ戊ｃｔｅｒー皿ｈｅｐａｒ皿ｕｍ）が
挙げられるが、培養に際しては、培地にコンドロィチン
硫酸またはへパリンを添加すると菌体内に高濃度にコン
ドロィチナーゼＢが蓄積される。

したがって本発明のコンドロィチナーゼＢの部分精製液
としてはコンドロィチン硫酸またはへバリンを添加した
培地を用いて培養したフラボバクテリウム属の菌体を破
壊した得られる抽出液をプロタミン硫酸処理し、ヒドロ
キシアパタイトを用いたカラムクロマトグラフイーによ
って部分的に精製したものが最も適している。フラボバ
クテリウム・ヘパリナムをコンドロイチン硫酸を添加し
た培地を用いて培養すると該菌体内にコンドロィチナー
ゼＢ、コンドロィチナーゼＣ、コンドロィチナーゼＡＣ
などの諸酵素が産生される。また、コンドロィチン硫酸
の代りにへパリンを添加した培地を用いても、該菌体内
にコンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、ヘパ
リナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＡＣな
どの諸酵素が産生される。このようにして得られた菌体
を超音波処理などの通常の方法によって菌体を破壊し、
得られる抽出液のｐＨを調整してプロタミン硫酸を加え
遠心分離して得られる上清液をヒドロキシアパタィトカ
ラムに負荷し、次いで緩衝液に添加した塩化ナトリウム
の濃度を０．３Ｍまで、または塩化ナトリウムを添加す
ることなく緩衝液の濃度を０．１８のまで直線的に高め
ながら溶出を行なうとコンドロィチナーゼＢ含有画分が
溶出してくる。

このとき、コンドロィチン硫酸を添加した培地を用いて
培養した菌体を用いた場合にはコンドロィチナーゼＣお
よびコンドロィチナーゼＡＣが、ヘパリンを添加した培
地を用いて培養した菌体の抽出液を用いた場合にはへパ
リナーゼおよびへパリナーゼが該画分に共存している。
本分画で用いるヒドロキシアパタィトは目から調製した
ものを用いても、または市販品を用いても何ら差し支え
ない。

本分画で用いる緩衝液は中性附近にｐＨのあるものであ
れば何れを用いても差し支えない。

中性以外のＰＨ域ではコンドロィチナーゼＢが失活する
恐れがあるので好ましくない。また緩衝液の濃度は０．
０９Ｍ以下でなければならない。０．０９Ｍを超える濃
度でコンドロィチナーゼＢが溶出する恐れがあるので好
ましくない。

また、緩衝液に添加された塩化ナトリウムの濃度が０．
３Ｍを超える濃度、または緩衝液の濃度が０．１３りを
超える濃度ではへパリチナーゼあるいはコンドロイチナ
ーゼＡＣの混入量が増えるので好しくない。次いで、ヘ
パリンを固定化したビーズ状のアガロースにさらにコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプを結合せしめられたものを充填
したカラムに該画分を負荷し、緩衝液に添加された塩化
ナトリウムの濃度を０．１秋まで、または緩衝液の濃度
を０．０８Ｍまで直線的に高めながら熔出を行なうこと
によって、共存する他酵素を含まない高純度のコンドロ
ィチナーゼＢを容易に得ることができる。

本精製に用し、るへパリン固定化用のアガロースとして
は官能基としてカルボキシル基、ェポキシ基またはァミ
ノ基を有するアガロースであれば何れを用いても差し支
えないが、ビーズ状に形成されたアガロースが特に好ま
しい。

このような官能性を有するアガロースを目から調製した
ものを用いても、または市販されているもの、例えばＡ
Ｈ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）砥、活性ェポ
キシセフアロース（Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）紐、活性シァノゲンフロマィドファ
ロース（ＣＮＢｒ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）のあるいは紐（以上何れもスェーデン国フアルマ
シヤ・ファイン・ケミカルズ社の商標名）などを用いて
何ら差し支えない。

このようなアガロースにへパリンを固定化する方法は既
に知られているィンマンの方法（Ｊ．Ｋ．ｌｎｍａｎ：
Ｍｅ比ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３４、３
０、１９７４）に準じて行なう。

すなわち、官能基を有するアガロースの懸濁液にへパリ
ン液を加え、これにカルボジィミド類を加えて反応せし
めた後、アガロースを分取することによって容易にへパ
リン固定化アガロースを得ることができる。このように
て得られたへパリン固定化アガロースにコンドロィチン
硫酸Ｂタイプを加えて処理する。

すなわち、カラムにへパリン固定化アガロースを充填し
、コンドロィチン硫酸Ｂタイプ溶液を流してコンドロィ
チン硫酸Ｂタイプで処理する。また、この処理はへパリ
ン固定化アガロースをコンドロィチン硫酸Ｂタイプ溶液
中に浸潰しても良い。この際用いる緩衝液は濃度が０．
３Ｍ未満で、ｐＨが６〜８の範囲にあるものであれば何
れを用いても差しつかえない。

緩衝液の濃度が０．３Ｍ以上の濃度ではコンドロィチン
硫酸Ｂタイプの結合量が低下するので好ましくない。ま
た６未満および８を超えるｐＨ城ではコンドロィチン硫
酸Ｂタイプの結合量が低下するので好ましくない。へパ
リン固定化アガロースにさらにコンドロィチン硫酸Ｂタ
イプで処理したアガロースを用いることによってのみ、
コンドロィチナーゼＢは収率よく、かつ高純度に精製す
ることができる。

このコンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したへパリン固
定化アガロースを用いると高い収率を与える。また、こ
のようにさらにコンドロィチン硫酸Ｂタイプ処理を行な
ったへパリン固定化アガロースを用いて精製することは
、高純度のコンドロィチナーゼＢが効率よく得られるば
かりでなく、連続使用に際して適宜コンドロィチン硫酸
Ｂタイプ処理を行なうことによって簡単に再生すること
ができ、ヘパリンのアガロースへの固定化から始める必
要がないので、中途で簡単な再生法を導入することによ
って長期にわたる連続精製が可能であるという大きな利
点を有するものである。次いで、ヘパリンを固定化した
好ましくはビーズ状のアガロースにさらにコンドロィチ
ン硫酸Ｂタイプで処理したものを充填したカラムに該画
分を負荷し、緩衝液に添加された塩化ナトリウムの濃度
を０．１８ のまで、または緩衝液の濃度を０．０斑け
まで直線的に高めながら溶出を行なうことによって、共
存する他酵素を含まない高純度のコンドロィチナーゼＢ
を容易に得ることができる。

この場合塩化ナトリウムの濃度が０．１９Ｍを超える濃
度、あるいは緩衝液の濃度が０．惚Ｍを超える濃度では
共存する他酵素が溶出混入してくる恐れがあるので好ま
しくない。溶出に用いる緩衝液は濃度が０．００５Ｍ以
下、ＰＨが中性附近にあるものであれば何れを用いても
差し支えない。

０．００９けを超える濃度ではコンドロィチナーゼＢが
港出してくる恐れがあり、中性以外のｐＨ城ではコンド
ロイチナーゼＢが失活するので好ましくない。

このように、さらにコンドロィチン硫酸Ｂタイプを結合
せしめたへパリン固定化アガロースを用いて精製したコ
ンドロィチナーゼＢは、精製前のものに比して約１１倍
という高い精製度を示し、また回収率は約６１％という
高い値を示した。

このようにして得られたコンドロイチナーゼＢはコンド
ロィチン硫酸Ｂタイプのみを分解し、他のコンドロィチ
ン硫酸Ａ、Ｃの各タイプ、ヘパリチン硫酸などは分解し
ない。また、その作用至適温度は２０午０、作用至適ｐ
Ｈは８．０で、ミケラシーりのコンドロイチナーゼ８（
Ｙ．Ｍ．Ｍｉｃｈ−ｅｌａｃｃｉ＆ Ｃ．Ｐ．Ｄｉｔｒ
ｉｃｈ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍへ ２５１、１１５４
、１９７６）と同じ値を示す。次に本発明を調製例、実
施例および比較例によってさらに詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限りこれらによって限定され
るものではない。

調製例 １ 菌体の培養 べプトン１．５％、肉エキス０．４５％、酵母エキス１
．０％、麦芽エキス１．０％、コンドロィチン硫酸Ｃタ
イプ（Ｓ含量７．１％）１．０を含む液体塔地（ＰＨ７
．０）にフラボバクテリウム・ヘパリナムＡＴＣＣＩ３
１２５を接種し、３０つＣにおし、２餌時間振濠培養を
行ない、培養液を同液体塔地に３％になるように加え、
３０００において２斑時間振濠培養を行なった。

調製例 ２ 菌体の培養 べプトン１．５％、肉エキス０．４５％、酵母エキス１
．０％、麦芽エキス１．０％を含む液体渚地（ｐＨ７．
０）にフラボバクテリウム・ヘパリナムＡＴＣＣＩ３１
２５を接種し、３０００において２餌時間振糧培養を行
ない、培養液を同液体培地に３％になるように加え、３
０００において培養を行ない。

培養１雛時間目にへパリン（半井化学（株）製、１５０
国際単位／の９）を０．０２％になるように加え、さら
に６時間培養を行なった。調製例 ３ 菌体抽出液の調製 調製例１によって得られたフラボバクテリウム・ヘパリ
ナムＡＴＣＣＩ３１２５を常法に従って遠心分離して繭
体を集め、洗液後０．７Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）
３０柵に菌体５夕を懸濁し、１０キロサィクル／秒で１
５分間超音波処理を行ない、遠心分離して細胞壁を除き
、菌体抽出液を得た。

調製例 ４ 繭体抽出液の調製 調製例２によって得られフラボバクテリウム・へパリナ
ムＡＴＣＣＩ３１２５を調製例３と同様に処理して菌体
抽出液を得た。

調製例 ５ へパリン固定化アガロースの調製 へパリン（半井化学（株）製、１５の国際単位／雌）５
０の９を含む溶液１叫を、予めｐＨを４．７５に調整し
たＡＨ−セファロースの１夕を含む懸濁液６の‘に加え
、１ーエチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド１５の９を含む溶液０．５の‘を加え、ｐＨ
を４．７５に保ちながら一夜室温に保ち、炉過後洗絶し
てへパリン固定化アガロース１．０５夕を得た。

実施例 １ 粗コンドロイチナーゼＢ画分の調製 調製例３によって得られた菌体抽出液をヴィスキングチ
ューブを用いて、流水に対して４℃において一夜透析を
行ない、透析内液８０の【に０．１Ｍになるように酢酸
ナトリウムを加え、ｐＨを６．５に調整した後プロタミ
ン硫酸７５雌を加えて１時間放置し、遠心分離して生じ
た沈澱を除き、水を加えて２倍に希釈し、ベルナルディ
の方法（Ｇ．ＢやｒＭｒｄｉ：Ｍｅ比。

ｄ ｉｎ Ｅ舵Ｍｍ。ｌｏｇｙ、２２、３２５、１９７
１）に従って調製したヒドロキシアパタィトを充填した
カラム（２・２×８．０肌）を予め０．０９Ｍ燐酸塩緩
衝液（ｐＨ６．８）を用いて平衡化した後負荷し、次い
で同緩衝液に塩化ナトリウムを加え、その濃度を０．弧
４まで直線的に高めながら１時間当り３５の上の流速で
溶出を行ない、溶出液第２５０〜６００の‘の函分３５
０の‘にコンドロィチナーゼＢを得た。該画分のコンド
ロィチナーゼＢは全活性９０１単位、蛋白１雌当り１４
８単位であった。コンドロィチナーゼＢの活性は、酵素
液０．２の‘に１０ｍＭ酢酸カルシウム溶液０．１叫を
加え、これにコンドロィチン硫酸Ｂタイプを１の‘に当
り１０ｗ９含む基質溶液０．１の‘を加え、２０ｏｏに
１時間保った後直ちに２分間煮沸し、０．０鮒塩酸２２
．５のとを加え、遠心分離して得られる上清液の２３初
肌における吸収を測定する。

空試験として酵素液の代りに水を用いて同様に処理して
吸光度を測定した。このときき吸光度の差が１のときを
１単位とした。該画分にはコンドロィチナーゼＢの他に
コンドロィチナーゼＣ、コンドロィチナーゼＡＣが検出
された。

実施例 ２ へパリン固定化アガロースのコンドロィチン硫酸Ｂタイ
プ処理調製例３によって得られたへパリン固定化アガロ
ース１．０５夕を０．００５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．
８）１０泌に懸濁し、これをカラム（１×５肌）に流し
込んでへパリン固定化アガロースを充填し、次いでコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプ５０雌を含む同緩衝液３叫を負
荷し、同緩衝液１００机を１時間当り３５の【の流速で
流して過剰のコンドロィチン硫酸Ｂタイプを除いた。

負荷したコンドロィチン硫酸Ｂタイプ５０の９に対して
、洗液中に回収したコンドロィチン硫酸Ｂタイプは１０
の９であった。

このことから差し引き４０のｃのコンドロィチン硫酸Ｂ
タイプがへパリン固定化アガロースを結合したことにな
る。コンドロィチン硫酸Ｂタイプはビツタ−およびミュ
アーのカルバゾール法（Ｊ．Ｂｉｔにｒ、日．ＭＭｕｉ
ｒ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４、３３０、１９６
２）に従ってコンドロィチン硫酸Ｂタイプ水溶液０．５
の‘に０．９５％のホウ砂を含む濃硫酸３泌を加え、１
００つ０に１び分保ち、０．１２５％カルバゾールェタ
ノール溶液０．１の‘を加え、１００００に１５分保し
、冷却後５３印肌の吸光度を測定し、得られるウロン酸
量からコンドロィチン硫酸Ｂタイプ量を算出した。

実施例 ３ コンドロィチナーゼＢの精製 実施例１によって得られた粗コンドロィチナ−ゼＢ溶液
３５０の‘（全活性〜９０１単位、１４８単位／雌蛋白
）をヴィスキングチューブを用いて水に対して４℃にお
いて透析した後、実施例２によって得られたコンドロィ
チン硫酸Ｂタイプ処理を行なったへパリン固定化アガロ
ースカラム（１×５肌）に負荷し、０．００８Ｍ燐酸塩
緩衝液（ｐＨ６．８）に塩化ナトリウムを加え、その濃
度を０．１８Ｍまで直線的に高めながら１時間当り３０
叫の流速で港出を行ない、溶出液第３５０〜５５０叫の
画分２００叫にコンドロィチナーゼＢを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＢは全活性５５山単位で回
収率は約６０％、また蛋白１の９当り１．６２３単位で
約１１倍という高い精製度を示した。また、該画分には
コンドロィチナーゼＣおよびコンドロイチナーゼＡＣは
見出されなかつた。実施例 ４ 粗コンドロィチナーゼＢ画分の調製 調製例４によって得られた菌体抽出液を、実施例１と同
様に透析、プロタミン硫酸処理を行なつた後、ヒドロキ
シアパタィトカラムクロマトグラフィを行ない、溶出液
第４００〜５５０の上の画分１５０仇【にコンドロィチ
ナーゼＢを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＢは全活性５４山単位、蛋
白１の９当り１５山単位であった。また該画分にはへパ
リナーゼおよびへパリチナーゼが検出された。実施例
５ コンドロィチナーゼＢの精製 実施例４によって得られた粗コンドロィチナーゼＢ溶液
１５０の‘（全活性５４０単位、１５の単位／雌蛋白）
を実施例３と同様に、コンドロィチン硫酸Ｂタイプ処理
を行なったへパリン固定化アガロースを用いたカラムク
ロマトグラフィを行ない、溶出液第３５０〜５５０の‘
の画分２００羽にコンドロィチナーゼＢを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＢは全活性３３山単位で回
収率は約６０％、また蛋白Ｉｍｐ当り１．６５０単位で
約１１倍という高い精製度を示した。また該画分にはへ
パリナーゼおよびへパリチナーゼは見出されなかった。
比較例 １〜２ ヒドロキシアパタィトを用いた分画によって得られたコ
ンドロィチナーゼＢ画分１７５泌（全活性４５亀単位、
１４８単位／双９蛋白）を透析後、ヘパリン固定化アガ
ロースおよびさらにコンドロィチン硫酸Ｂタイプを結合
せしめたへパリン固定化アガロ−スをそれぞれ充填した
カラム（ｌｘ５肌）に負荷し、０．００別１燐酸塩緩衝
液（ｐＨ６．８）に塩化ナトリウムを添加し、その濃度
を０．１９Ｍまで直線的に高めながら１時間当り３０Ｍ
の流速で溶出を行ない、共存する他酵素を含まないコン
ドロィチナーゼＢを得た。

その結果は次の通りである。言王、 コンドロィチナー
ゼの欄の数値はコンドロィチナーゼＢの単位数で表した
。比較例１はへパリン固定化アガロースを用いた。

比較例２はへパリン固定化アガロースを、さらにコンド
ロィチン硫酸Ｂタイプ５０の９を含むｏ．００Ｍ燐酸塩
緩衝液（ＰＨ６．８）３の‘を負荷、コンドロイチン硫
酸Ｂタイプ処理し、洗修して過剰のコンドロイチン硫酸
Ｂタイプを除いた後用いた。

以上の結果から明らかな如く、比較的２では全量４９単
位のコンドロィチナーゼＢしか得られず、回収率が１０
％であったのに対して、比較例２では全量２７０単位の
コンドロィチナーゼＢが得られ、６０％という高い回収
率を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コンドロイチナーゼＢの部分精製液を、コンドロイ
   チン硫酸Ｂタイプで処理したヘパリン固定化アガロース
   を分離剤とするカラムクロマトグラフイーに付すること
   を特徴とする純コンドロイチナーゼＢの製造法。 ２ コンドロイチナーゼＢの部分精製液が、コンドロイ
   チナーゼＢ産生菌体を破壊した後得られる抽出液をプロ
   タミン硫酸処理しさらにヒドロキシアパタイトを用いて
   分画されたコンドロイチナーゼＢ含有液である特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。 ３ コンドロイチナーゼＢ産生菌体がコンドロイチン硫
   酸またはヘパリンを添加した培地を用いて培養したフラ
   ボバクテリウム属の菌体である特許請求の範囲第２項記
   載の方法。