JPH066613B2 - 重合体粒子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は疎水性粒子表面を有し、かつ水媒体中で分散安
定性のよい重合体粒子の製造方法である。特に酵素，蛋
白質，及び免疫活性物質などを吸着固定化して診断用試
薬として好適に使用し得る重合体粒子の製造方法を提供
するものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応，補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてお
り、遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検出する反
応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の高い抗血
清が得られることによって、特異性の高い抗体を血球粒
子，ベントナイト粒子，カオリン粒子，ラテックス粒子
などの粒子担体に固定させておき、対応する抗原を凝集
反応によって検査するなど、臨床検査における応用範囲
が著しく拡大している。

免疫学凝集反応用としての担体は種々のものが公知で、
該担体を使用した種々の診断用試薬が知られている。こ
れらを大別すると免疫活性物質を物理的に吸着した診断
用試薬と免疫活性物質を共有結合で結合された診断用試
薬になる。これらの試薬にはそれぞれ一長一短があり現
在なお完全に満足出来る診断用試薬は存在しない。

しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定量分析の発展と共に免疫学的凝集反応
は鋭敏性と迅速性が増加し、非特異的凝集反応が起こら
ない、しかもより保存安定性に優れた等の性状を有する
診断用試薬の開発が要望されている。

診断用試薬の担体としては、一般に重合体粒子が用いら
れており、診断用試薬に適した重合体粒子の製造方法の
開発が望まれている。重合体粒子の製造方法としては、
例えば、高分子論文集３８巻４８５〜４９１頁（1981
年）には、乳化剤の存在下にグリシジルメタアクリレー
トとエチルアクリレートを水媒体中で乳化重合した（第
１段重合工程）後に、エチルアクリレートを添加して重
合を行なう（第２段重合工程）方法が記載されている。
しかしながら、この方法により得られた重合体粒子に免
疫活性物質を吸着させて診断用試薬として使用すること
は困難である。即ち、得られた重合体粒子の遠心分離に
よる洗浄工程で重合体粒子同志の融着がおこり、再分散
が極めて困難になる。例え、再分散させても凝集した粒
子が多いためめに鋭敏性，分散安定性に著しく劣る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、免疫診断用試薬の担体として好適な重合
体粒子の製造方法について鋭意研究を重ねてきた結果、
驚くべきことに、特定の疎水性ビニル系単量体を用いる
ことによって、得られた重合体粒子に免疫活性物質を吸
着した診断用試薬の分散安定性が著しく向上し、しかも
診断用試薬として極めて重要な性質である鋭敏性及び迅
速性が優れることを見い出し本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明は水１００重量部に対する溶解度が３重量
部以下であり、且つガラス転移温度が４０℃以上の重合
体を与える疎水性ビニル系単量体とグリシジル（メタ）
アクリレートとを乳化剤及び水溶性ラジカル開始剤の存
在下、水媒体中で重合を行なう第１段重合と、該第１段
重合で得られた重合体の存在下に上記の疎水性ビニル系
単量体の重合を行なう第２段重合とよりなる重合体粒子
の製造方法である。

本発明の方法により得られた重合体粒子は、エポキシ基
が重合体粒子の特定部位に局在化しており、またガラス
転移温度が４０℃以上の重合体となる疎水性ビニル系単
量体からなる重合体粒子であるため、免疫活性物質の吸
着固定化に有効な疎水性表面が保たれ、かつ洗浄工程に
於ける重合体粒子の融着が無いために、免疫血清学適凝
集反応の鋭敏性と迅速性が大きい。また、該重合体粒子
のエポキシ基を加水分解してジヒドロキシル基に変換す
ることにより分散安定性が向上するという特徴がある。

本発明で使用するグリシジル（メタ）アクリレートの使
用量は、特に限定されないが、得られた重合体粒子を診
断用試薬として用いる場合、その分散安定性、鋭敏性及
び迅速性の観点から、全単量体に対して０．０１〜３０
モル％の範囲にあることが好ましく、０．０１〜３モル
％、更には０．１〜１モル％の範囲にあることがより好
ましい。

本発明で使用する疎水性ビニル系単量体は水１００重量
部に対して溶解度が３重量部以下でなければならない。
水１００重量部に対する溶解度が３重量部より大きいビ
ニル系単量体を用いると、エポキシ基を粒子の特定筒所
に局在化させられないばかりでなく、粒度分布の揃った
重合体粒子を得ることができなくなるので、本発明の効
果が得られない。該疎水性ビニル系単量体としては、水
１００重量部に対する溶解度が１重量部以下であるもの
が好ましい。また、該疎水性ビニル系単量体は、重合体
のガラス転移温度が４０℃以上、好ましくは６０℃以上
となる単量体でなければならない。ガラス転移温度が４
０℃より低い場合には重合体粒子の洗浄工程あるいは免
疫活性物質を吸着固定化するインキュベーションの間に
非特異的に凝集してもはや再分散できなくなるので好ま
しくない。本発明で用いられる疎水性ビニル系単体の代
表的なものを挙げれば、スチレン，ビニルトルエン，ク
ロルメチルスチレン，クロルスチレン等のアリール基又
はハロゲン化アリール基を有するビニル化合物；塩化ビ
ニル等のハロゲン化ビニル化合物；メチルメタクリレー
ト，エチルメタクリレート，シクロヘキシルメタクリレ
ート等のアクリレート又はメタクリレート；ターシヤリ
ブトキシエチレン，ネオペンチルオキシエチレン等のビ
ニルエーテル等である。これらの単量体は単独あるいは
混合して用いることができる。これらの疎水性ビニル系
単量体の中でもアリール基又はハロゲン化アリール基を
有するビニル化合物は、得られる重合体粒子を免疫診断
用試薬として用いたときに、鋭敏性及び迅速性に優れて
いるために好適に用いられている。

第１段重合に於いては、上記の疎水性ビニル系単量体、
及びグリシジル（メタ）アクリレートの他に、少量の水
溶性ビニル系単量体又はガラス転移温度の低い重合体を
与える単量体を混合して重合することができる。例え
ば、メタクリル酸，アクリル酸，スチレンスルホン酸，
スチレンスルホン酸ナトリウム，２−ヒドロキシエチル
（メタ）アクリレート，ビニルピロリドン，ポリエチレ
ングリコール（メタ）アクリル酸エエステル等の水溶性
ビニル系単量体又はガラス転移温度が４０℃未満の重合
体を与える単量体を、グリシジル（メタ）アクリレート
に対して０〜２０モル％の範囲で添加することができ
る。

第１段重合で重合する疎水性ビニル系単量体とグリシジ
ル（メタ）アクリレートの合計量は、第１段重合及び第
２段重合で重合する全単量体の２〜５０重量％、さらに
５〜２０重量％であることが好ましい。上記の合計量が
２重量％より少ない時には粒度分布が悪くなることがあ
る。また５０重量％より多い時には、グリシジル（メ
タ）アクリレート疎水性ビニル系単量体のランダム共重
合体と類似し、グリシジル（メタ）アクリレート含量の
多い重合体粒子で鋭敏性が低下することがある。

本発明に用いる水溶性ラジカル開始剤は特に限定的でな
く公知のものが使用される。例えば、過硫酸ナトリウ
ム，過硫酸カリウム，過硫酸アンモニウム等の過硫酸
塩，又は過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム，チオ硫酸カリ
ウム，チオ硫酸水素ナトリウム等のチオ硫酸化合物及び
銅イオン，鉄イオン等の分解促進剤を組み合わせたレド
ックス系触媒が好適に使用される。水溶性ラジカル開始
剤の濃度は重合温度，単量体濃度に依存するために限定
的でないが、０．０５乃至２０ミリモル／の範囲が好
適に採用される。

また、水溶性ラジカル開始剤は、第１段重合で添加した
単量体の重合速度を増加させて、第２段重合に添加した
単量体の、第１段重合で重合した重合体への吸収をよく
するために、第１段重合に全量添加することが望ましい
が、第１段重合の重合速度が充分大きくなる条件を設定
すれば、第１段重合と第２段重合に分割して添加しても
よい。

本発明に用いる乳化剤としては特に限定的でなく公知の
ものが使用される。例えば、オレイン酸ナトリウム，樹
脂酸ナトリウム，ラウリル硫酸ナトリウム，ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム，モノブチルフエニルフエ
ノールスルホン酸ナトリウム，ジアシルスルホン化コハ
ク酸ナトリウム，ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク
酸ナトリウム，ポリエチレングリコールモノラウレー
ト，ポリエチレングリコールノニルフエニルエーテル，
オレイルポリエチレングリコールエーテル等が挙げられ
る。乳化剤の使用量は、特に制限されず、通常の乳化重
合で用いられる量で良いが、得られる重合体粒子の収率
を増加させるためには、全単量体１００重量部に対して
０．００１〜１重量部、さらに０．００５〜０．５重量
部の範囲から選択することが好ましい。

第１段重合に添加する単量体の水に対する濃度は、添加
した単量体の重合速度が小さくならないようにすること
が好ましく、重合温度，開始剤濃度に依存するが、通常
水に対して０．５乃至２０容量％、より好ましくは１乃
至１０容量％が望ましい。

第１段重合では、グリシジル（メタ）アクリレートの５
０モル％以上、好ましくは７０モル％以上の重合を行な
うことが好適である。

本発明において重合温度は４０℃乃至８５℃、より好ま
しくは５０℃乃至８０℃がよい。第１段重合の重合温度
と第２段重合の重合温度は同じであることが重合操作上
好ましいが、単量体組成によっては異なってもよい。ま
た第１段重合の重合時間は、重合温度，単量体の種類と
濃度などによって異なるが、一般には１０分乃至５時
間、より好ましくは２０分乃至３時間が好適に採用され
る。

第２段重合は、第１段重合に引き続いて、同じ重合槽中
で行なわれることが好ましいが、第１段重合で得られた
重合体を分離した後、別の重合槽で第２段重合を行なう
こともできる。第２段重合は、第１段重合で得られた重
合体の存在下に行なわれる。

第２段重合に添加する疎水性ビニル系単量体は、第１段
重合で得られた重合体によく吸収されるように、疎水性
ビニル系単量体の重合速度より速い速度で滴々添加する
ことが望ましいが、第１段重合に添加した単量体の割合
が多い場合には短時間で添加することもできる。

第２段重合には疎水性ビニル系単量体成分単独で添加す
ることが望ましいが、疎水性ビニル系単量体に対して０
〜２モル％のグリシジル（メタ）アクリレートを混合し
て使用することもできる。

第２段重合の重合時間は、添加する疎水性ビニル系単量
体の種類と濃度によって異なるが、一般には３０分乃至
５０時間、より好ましくは１時間乃至３０時間が好適に
採用される。

本発明において均一な重合体粒子を得ることと、第２段
重合に添加する単量体が第１段重合で生成した重合体粒
子に効率よく吸収されるように、効率のよい不断の撹拌
が好ましい。

本発明において、第１段重合と第２段重合の重合順序は
極めて重要である。即ち、本発明の疎水性ビニル系単量
体を水媒体中で乳化剤存在下に水溶性ラジカル開始剤を
添加して重合を行ない、次いでグリシジル（メタ）アク
リレートと本発明の疎水性ビニル系単量体との混合物を
添加して重合を行なっても、安定的に重合体粒子が得ら
れないばかりか、たとえ重合体粒子が得られても極めて
性質の異なった重合体粒子の混合物が得られたりするの
で、本発明の効果が発揮されない。

本発明で得られた重合体粒子は、エポキシ基を加水分解
してジヒドロキシル基に変換することにより、疎水性の
物質を吸着し易くかつ水媒体中で分散安定性がよいとい
う特徴を発揮する。エポキシ基の加水分解方法は、公知
の方法が採用される。例えば、重合体粒子を弱酸性また
は弱塩基性の水媒体に浸漬する方法、又は８０℃以上に
加熱する方法等が挙げられる。

本発明で得られた重合体粒子の粒子径は一般に０．０１
乃至０．５μｍである。

本発明により得られた重合体粒子はエポキシ基を加水分
解した後、水媒体中での疎水性有機化合物の吸着剤，生
体内での各種細胞，組織による貧食作用の観察用粒子，
及び酵素，蛋白質あるいは免疫活性物質の吸着固定用粒
子等に応用でき、特に免疫活性物質を吸着固定化した診
断用試薬は免疫活性物質の吸着固定化量が大きいため
に、免疫学的凝集反応性が大きいだけでなく、分散安定
性と保存安定性に優れる特徴がある。さらにまた、本発
明により得られた重合体粒子は粒表面のエポキシ基の反
応性を利用した応用（例えば、反応性アミノ基を有する
染料を結合した標識粒子）もできる。

以下に、本発明で得られた重合体粒子を診断用試薬とし
て用いた場合について説明する。

本発明で得られた重合体粒子に物理吸着によって固定化
する免疫活性物質としては、特に限定的でなく公知のも
のが使用出来る。代表的なものを例示すれば、例えば、
変性ガンマグロブリン，リウマチ因子，抗核因子，ヒト
アルブミン，抗ヒトアルブミン抗体，イムノグロブリン
Ｇ（ＩｇＧ），イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ），イムノ
グロブリンＭ（ＩｇＭ），ストレプトリジンＯ，抗スト
レプトリジンＯ抗体，Ｃ−反応性蛋白，抗Ｃ−反応性蛋
白抗体，アルフア−フエトプロテイン（ＡＦＰ），抗Ａ
ＦＰ抗体，癌胎児性抗原（ＣＥＡ），抗ＣＥＡ抗体，ヒ
ト胎盤ラクトゲン（ＨＰＬ），抗ＨＰＬ抗体，ヒト絨毛
ゴナドトロピン（ＨＣＧ），抗ＨＣＧ抗体，抗エストロ
ゲン抗体，抗インシュリン抗体，Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈ
ＢＳ），抗ＨＢＳ抗体，梅毒トレポネーマ抗原，風疹抗
原，補体成分Ｃ_1q，抗補体成分Ｃ_1q抗体，等の公知の免
疫活性物質をあげることができる。

本発明で得られた重合体粒子に吸着で固定化される該免
疫活性物質の量は、各検査項目に適している割合で重合
体粒子に固定化させればよく、一概に限定されない。一
般には、該免疫活性物質の量が多い程，診断用試薬の鋭
敏性及び迅速性が上がるため、鋭敏性及び迅速性を要求
する場合には、前記の重合体粒子に飽和する迄、免疫活
性物質を吸着させることが好ましい。

本発明により得られた重合体粒子は疎水性と親水性のバ
ランスが極めて良く調節されているので、該重合体粒子
表面に比較的多量の免疫活性物質を極めて容易に物理吸
着法で固定化できる特徴がある。例えば、抗原又は抗体
と重合体粒子を緩衝液又は生理食塩水などの水媒体中で
混合し、抗原又は抗体が化学的に変化しないように、そ
してそれらの免疫学的性質を保持させるように、非常に
温和な条件下に抗原又は抗体を重合体粒子表面に吸着さ
せることができる。重合体粒子表面に吸着された免疫活
性物質の量は、重合体粒子の疎水基の吸着部位を飽和又
はブロックされるように選ぶことが好ましいが、残存す
る吸着部位を適当な物質、例えば免疫学的に不活性な牛
血清アルブミン，ゼラチン等でブロックさせることがで
きる。

〔効 果〕

本発明により得られた重合体粒子は、特定の疎水性ビニ
ル系単量体を用いたために洗浄工程における重合体粒子
同志の凝集がおこらない。また、粒子径が比較的良くそ
ろっており、粒子径の分散値は１０％以下である。

従って、本発明により得られた重合体粒子を担体とする
免疫診断用試薬は、非特異的な凝集を起こすことなく、
分散安定性が極めて良好であり、且つ鋭敏性にも優れて
いるという特徴を有している。

さらに、乳化剤を添加しない不均一重合（ソープフリー
重合）では、親水性モノマーであるグリシジル（メタ）
アクリレートの含量を少なくして粒子径を０．３μｍ以
下の重合体粒子を製造する場合、単量体濃度を著しく減
少しなければ重合体粒子同志の凝集が生じる。即ち、グ
リシジル（メタ）アクリレート含量が小さく、例えば、
３モル％以下でかつ粒子径が０．３μｍ以下の重合体粒
子をソープフリー重合で製造するためには、単量体濃度
を下げなければならず、極めて収率が悪くなる欠点があ
る。しかしながら、本発明の乳化重合法では高濃度の単
量体を重合して１０〜４０重量％程度のスラリーを得る
ことが可能になるので、経済的に極めて効率がよい。ま
た、本発明の重合体粒子は他の乳化重合法により得られ
た粒子と比べて粒子径がそろうという特徴があるので、
粒子径が０．３μｍ以下の重合体粒子の製造に極めて好
適である。

よって、本発明の方法は、医療分野において、各種の診
断に用いられる免疫診断用試薬の担体を提供する方法と
して極めて優れた方法であり、また、工業的にも有利な
方法である。

実施例１〜４及び比較例１〜４ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ccを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、撹拌下に第１表に示す割合のジ−２−エチルヘキシ
ルスルホコハク酸ナトリウムと４ミリモル／濃度にな
るように過硫酸カリウムを添加した。次いで７０℃に加
温したグリシジルメタクリレートとスチレン（重合体の
ガラス転移温度＝１００℃）の混合物を第１表に示す割
合で添加して、７０℃で第１表に示す如く第１段重合を
行なった。その後第２段重合のスチレンを第１表に示す
割合で定量ポンプで滴々添加してから、所定時間，７０
℃で撹拌下に重合した。重合後、室温まで冷却してか
ら、得られた重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別して大
きな凝集体を除いた。更に粗い重合体粒子を遠心分離で
充分に除いた後、水蒸気蒸留を６時間行なうことによっ
て重合体粒子上のエポキシ基をジヒドロキシル基に変換
した。この加熱条件で全てのエポキシ基が加水分解して
ジヒドロキシル基が生成していることが赤外吸収スペク
トル及び塩酸付加法によるエポキシ基の分析で確認され
た。次いでイオン交換水で透析を７日間毎日回分処理し
た後遠心分離，蒸留水への再分散の操作を繰返した後
に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心
分離と洗浄を行なって重合体粒子を精製した。得られた
重合体粒子の粒子径を第１表に示す。

ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の調製 重合体粒子の調製で得られた本発明の重合体粒子を固型
分濃度１％でグリシン緩衝液に分散した。本発明に於い
てグリシン緩衝液とはグリシン０．１モル及び食塩０．
０５モルを水１に溶解し、次いで２規定水酸化ナトリ
ウム水溶液でｐＨを８．３に調製し、さらにアジ化ナト
リウムを１ｇ添加したものである。

本発明に於いてヒトＩｇＧは、ヒト血清を飽和硫安で塩
析し、さらに透析を行ない精製したものを用いた。

ヒトＩｇＧをグリシン緩衝液により希釈し１mg／mlに調
整する。次いで倍数希釈法によりヒトＩｇＧをグリシン
緩衝液により希釈してヒトＩｇＧ希釈液を調製する。１
％濃度重合体粒子分散液１容にヒトＩｇＧ希釈液１容を
加え撹拌し、室温下２時間放置する。次いでウシ血清ア
ルブミンを１％の濃度になるように添加し、４％に保ち
１夜放置してヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子を得
た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作
を繰り返えすことによりヒトＩｇＧを固定化した重合体
粒子を洗浄した。

さらに遠心分離した後、ヒトＩｇＧを固定化した重合体
粒子をウシ血清アルブミンを0.1％の濃度で添加したグ
リシン緩衝液に再分散し固型分濃度を０．５％に調整
し、４℃に保ち保存した。

抗原・抗体反応 ヒトＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇＧウサギ
全血清を６０℃，３０分非動化処理を行なった。この血
清を以下抗ヒトＩｇＧウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトＩｇＧウサギ血清をグリシン緩衝液で２０倍に希
釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトＩｇＧ
ウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒトＩｇＧウ
サギ血清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうた
めにガラス製１０穴のホールグラスを用意し、グリシン
緩衝液で希釈した抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに
０．０４ml加える。次いでヒトＩｇＧを固定化した重合
体粒子のグリシン緩衝液分散液を各ホールに０．０４ml
加える。この後直ちに平択製作所製テーハー式撹拌機に
よりホールグラスを１分間に１２０回転の速度で水平回
転し撹拌を来なう。抗原・抗体反応により重合体粒子を
凝集が認められるまでに要する時間、すなわち凝集像出
現時間及び所定時間撹拌後の重合体粒子の凝集の有無か
ら、ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の特性である迅
速性及び鋭敏性を評価した。ホールグラスを用いた重合
体粒子の凝集試験の結果を図１に示す。図１は１０分間
の撹拌後の凝集状態を示す。凝集が全く認められない場
合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合（±）、明ら
かに凝集が認められる場合凝集の強い順に+++，++，＋
と判定した。図中Ｃは抗原もしくは抗体を全く含まない
ことを示す。凝集試験の結果、明らかに凝集の認められ
たホールに於ける抗ヒトＩｇＧウサギ血清希釈液の最高
希釈倍数をもって、重合体粒子の鋭敏性を評価した。

重合体粒子の特性として、さらに重合体粒子の分散安定
性を評価した。すなわち、重合体粒子にヒトＩｇＧ希釈
液を加え室温で２時間放置した後の重合体粒子の分散状
態をもって重合体粒子のヒトＩｇＧ固定化時の分散安定
性を評価した。又ヒトＩｇＧ固定化後３ケ月経過した後
の重合体粒子の分散状態をもってヒトＩｇＧを固定化し
た重合体粒子の保存中の分散安定性を評価した。その結
果を第１表に示す。

実施例 ５ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００cc及びドデシルスルホン酸ソーダ０．２ｇを
加えて７５℃に保った後に、窒素雰囲気下、撹拌下に過
硫酸カリウム３ミリモル／，チオ硫酸ナトリウム３ミ
リモル／，硫酸銅０．２ミリモル／，及びα−メル
カプトエタノール０．５ccを添加した。次いで７５℃に
加温したグリシジルアクリレート２５ミリモル及びメチ
ルメタクリレート（重合体のガラス転移温度＝１０５
℃）５００ミリモルの混合物を添加して７５℃で３０分
間撹拌下に重合した。その後、メチルメタクリレート５
モルを定量ポンプで滴々添加して、更に７５℃で２時間
撹拌下に重合した。その後の操作は実施例１と同様の操
作を行なった。得られた重合体粒子の粒子径は０．１２
９ミクロンであった。また、粒子径の分散値は４．２％
であった。この重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒ
トＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清
との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１
日後×６４０，３ケ月×１２８０、また分散安定性は１
日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異滴凝集が認め
られなかった。

実施例 ６ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００cc及びジ−２−エチルヘキシルスルホコハク
酸０．６ｇを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／濃度になる
ように添加した。次いで７０℃に加温したグリシジルメ
タクリレート３０ミリモルとビニルトルエン（重合体の
ガラス転移温度＝９３℃）３７０ミリモルの混合物を添
加して７０℃で１．５時間撹拌下に重合した。その後ビ
ニルトルエン３．６モルを定量ポンプで逐次添加して、
更に７０℃で１時間撹拌下に重合した。その後の操作は
実施例１と同様の操作を行なった。得られた重合体粒子
の平均粒子径は、０．１４４ミクロンであり、粒子径の
分散値は４．２％であった。この重合体粒子を実施例１
と同様の操作でヒトＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒト
ＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体反応を行なった。その
結果、鋭敏性は１日後×１２８０，３ケ月後×１２８
０、また分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中で
全く非特異的凝集反応が認められなかった。

実施例 ７ 撹拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換した後
に、蒸留水２７００ccとジ−２−エチルヘキシルスルホ
コハク酸０．５ｇを加えて６５℃に保った後に、窒素雰
囲気下に過硫酸カリウム７ミリモル／濃度になるよう
に添加した。次いで６５℃に加温したグリシジルメタク
リレート４０ミリモルと塩化ビニルモノマー（重合体の
ガラス転移温度＝８１℃）５６０ミリモルの混合物を窒
素圧でオートクレーブに圧入して６０℃に撹拌下に３０
分間重合した。その後塩化ビニルモノマー４．４モルを
逐次添加して６０℃で５時間反下に重合した。次いで残
存する未反応の塩化ビニルモノマーをパージしてから、
得られた重合体粒子を瀘紙（No.２）で濾別して大きな
凝集体を除いた。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分
に除いた後に、ｐＨ＝３の酸性水溶液中で重合体粒子上
のエポキシ基を加水分解してジヒドロキシル基に変換し
た。次いでセロフアン膜で１ケ月間透析を行なった後
に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心
分離と洗浄を行なって重合体粒子を精製した。かくして
得られた重合体粒子の平均粒子径０．２５５ミクロンで
あり、粒子径の分散値は８．８％であった。この重合体
粒子を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧウサギ血清と
の抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１日
後×６４０，３ケ月後×１２８０，また分散安定性は１
日後０本，及び３ケ月後１本の非特異的凝集反応が認め
られた。

実施例 ８ 熱変性ヒトＩｇＧの固定化 ｐＨ８．３に調製したグリシン緩衝液に実施例１で用い
た重合体粒子を０．５％になるよう分散させた。次いで
６０℃で１０分間加熱処理したヒトｉｇＧをグリシン緩
衝液により希釈し１mg／mlに調整した。０．５％濃度の
重合体粒子分散液１容に熱変性したヒトＩｇＧ希釈液１
容を加え、撹拌し、室温下２時間放置した。その後ウシ
血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、４℃
に保ち１夜放置して熱変性ヒトＩｇＧを固定化した重合
体を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散
の操作を繰返して洗浄した後、熱変性ヒトＩｇＧを固定
化した重合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃
度で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃度を
０．５％に調整した。

リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性調節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として、実
施例１と同様にしてガラス製１０穴のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各
ホールに０．０４mlを加え、次いで熱変性ヒトＩｇＧを
固定化した重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈した分散
液を各ホールに０．０４ml加えて実施例１と同様の操作
で鋭敏性，迅速性及び分散安定性を調べた。その結果、
鋭敏性は１日後×６４０，３ケ月後×６４０，及び分散
安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的
凝集反応が認められなかった。

実施例 ９ アルフア−フエトプロテインの抗体の固定化 ｐＨ８．３に調製したグリシン緩衝液に実施例２で用意
した重合体粒子を１．０％になるように分散させた。次
いで家兎の産生したアルフア−フエトプロテイン（以下
α−ＦＰと略す）の抗体をアフイニテイ−クロマトグラ
フイーにより精製して得た精製α−ＦＰ抗体を、グリシ
ン緩衝液で５００μｇ／mlの濃度に希釈した。重合体粒
子分散液１容と精製α−ＦＰ抗体の希釈液１容とを加
え、撹拌し、室温下２時間放置した。その後ウシ血清ア
ルブミンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち
１夜放置してα−ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子を得
た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作
を繰り返して洗浄した後、α−ＦＰ抗体を固定化した重
合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加
したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％
に調整した。

アルフア−フエトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα−ＦＰの濃度が１０００μｇ
／mlであるものを原液とし、グリシン緩衝液で希釈系列
を調製した。実施例１と同様にして、ガラス製１０穴の
ホールグラスにグリシン緩衝液で希釈したα−ＦＰを各
ホールに０．０４ml加え、次いでα−ＦＰ抗体を固定化
した重合体粒子の分散液を各ホールに０．０４ml加え
て、実施例１と同様の操作で鋭敏性，分散安定性を調べ
た。その結果、鋭敏性は１日後３０μｇ／ml，３ケ月後
３０μｇ／mlであった。分散安定性は１日後及び３ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた重合体粒子を用いた診断
用試薬の凝集状態を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水１００重量部に対する溶解度が３重量部
   以下であり、且つガラス転移温度が４０℃以上の重合体
   を与える疎水性ビニル系単量体とグリシジル（メタ）ア
   クリレートとを乳化剤及び水溶性ラジカル開始剤の存在
   下、水媒体中で重合を行なう第１段重合と、該第１段重
   合で得られた重合体の存在下に上記の疎水性ビニル系単
   量体の重合を行なう第２段重合とよりなる重合体粒子の
   製造方法。