JPH0471922B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は疎水性粒子表面を有し、かつ水媒体中
で分散安定性のよい重合体粒子の製造方法に関す
る。特に酵素、蛋白質、及び免疫活性物質などを
吸着固定化して診断用試薬として好適に使用し得
る重合体粒子の製造方法を提供するものである。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査におい
て、凝集反応は沈降反応、補体結合反応と共に、
あるいはこれらに比して著しく簡便かつ鋭敏な反
応として利用されている。そして、凝集反応は、
遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検出する
反応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の
高い抗血清が得られることによつて、特異性の高
い抗体を血球粒子、ベントナイト粒子、カオリン
粒子、ラテツクス粒子などの粒子担体に固定させ
ておき、対応する抗原を凝集反応によつて検査す
るなど、臨床検査における応用範囲が著しく拡大
している。 免疫学的凝集反応用としての担体は種々のもの
が公知で、該担体を使用した種々の診断用試薬が
知られている。これらを大別すると免疫活性物質
を物理的に吸着した診断用試薬と免疫活性物質を
共有結合で結合させた診断用試薬になる。これら
の試薬にはそれぞれ一長一短があり現在なお完全
に満足出来る診断用試薬は存在しない。 診断用試薬の担体としては、一般に重合体粒子
が用いられており、診断用試薬に適した重合体粒
子の製造方法の開発が望まれている。カルボキシ
ル基を持つた水溶性ビニル系単量体と疎水性ビニ
ル系単量体を用いた重合体粒子の製造方法として
は、例えば、特公昭47−606号公報には、（メタ）
アクリル酸60〜100重量％とスチレン、アクリロ
ニトリル等の疎水性ビニル系単量体０〜40重量％
とを重合して得られる水溶性の線状重合体を乳化
剤として、疎水性ビニル系単量体を乳化重合する
方法が記載されている。しかしながら、この方法
により得られた重合体粒子は粒度分布が非常に広
いだけでなく、重合体粒子表面が極めて親水化さ
れるために、重合体粒子に免疫活性物質を吸着さ
せて診断用試薬として用いても、免疫学的凝集反
応の鋭敏性の上で満足できる結果が得られない。
また、高分子論文集33巻565〜574頁（1976年）に
は、乳化剤不存在下にアクリル酸とエチルアクリ
レートの混合物を水媒体中で不均一重合した後
に、スチレンを添加して重合する方法が記載され
ている。この方法により得られた重合体粒子は均
一な粒子であるが、該重合体粒子に免疫活性物質
を吸着させて診断用試薬として用いても、遠心分
離工程での再分散性あるいは保存時の分散安定性
の上で満足できる結果が得られない。この原因と
して、第１段目重合で得られたアクリル酸とエチ
ルアクリレート共重合体は重合体粒子表面に濃縮
される傾向が強く、かつガラス転移温度が低く柔
らかいために、遠心分離による精製工程で重合体
粒子を精製すると、重合体粒子同志の融着がおこ
ることが考えられる。また、この重合体粒子に免
疫活性物質を吸着固定化した診断用試薬も同様に
遠心分離工程だけでなく保存中に著しい非特異的
な凝集反応がおこるため、分散安定性が劣ると考
えられる。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記の重合体粒子の製造方法の
欠点を克服すべく鋭意研究を重ねてきた結果、驚
くべきことに、特定量の水溶性ビニル系単量体と
単独重合体のガラス転移温度が40℃以上となるよ
うな疎水性ビニル系単量体の混合物を乳化剤不存
在下に重合し、次いで該疎水性ビニル系単量体を
重合することによつて、得られた重合体粒子に免
疫活性物質を吸着固定化した診断用試薬の分散安
定性が著しく向上し、しかも診断用試薬として極
めて重要な性質である鋭敏性が優れたものとなる
ことを見い出し本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は(A)水100重量部に対する溶解度
が10重量部以上の水溶性ビニル系単量体１〜50重
量％と、(B)水100重量部に対する溶解度が３重量
部以下で、且つ、単独重合体のガラス転移温度が
40℃以上の疎水性ビニル系単量体99〜50重量％の
混合物を乳化剤不存在下の水媒体中で、水溶性ラ
ジカル重合開始剤の存在下に重合を行なつて（第
１段目重合）水に不溶性の重合体を得、次いで該
重合体の存在下に、上記(B)の疎水性ビニル系単量
体を重合する（第２段目重合）ことを特徴とする
重合体粒子の製造方法である。 本発明の方法により得られる重合体粒子を用い
た診断用試薬の分散安定性の向上には、重合体粒
子表面の親水基の濃度が大きく寄与しているもの
と考えられるが、一方、親水基の増大に伴つて免
疫活性物質の重合体粒子表面への吸着領域が著し
く狭くなり、診断用試薬の鋭敏性は低下すると考
えられる。 しかしながら、上記の予想に反して本発明で得
られた重合体粒子は、親水基濃度が増加しても免
疫活性物質を吸着固定化できる有効な疎水性表面
が保たれ、免疫血清学的凝集反応の鋭敏性が大き
い。その理由は明らかでないが、本発明者らは次
のように推測している。第１段目重合で得られた
重合体は水不溶性であることと、親水基が重合体
表面に存在しているために、第２段目重合で用い
る疎水性ビニル系単量体では膨潤するが、該疎水
性ポリマーとの相溶性が乏しくなり相分離が起こ
り易くなると考えられる。そのため、親水性の大
きい第１段目の重合体は重合体粒子の粒子表面に
より多く濃縮され、かつ粒子表面層で部分的に局
在化していることが考えられる。従つて、重合体
粒子の表面で、免疫活性物質を吸着固定化するに
必要な疎水性部分の占有面積を保つたまゝ重合体
粒子の親水基濃度を増加させることができると推
測される。かかる理由により、本発明で得られる
重合体粒子は免疫学的凝集反応用担体として優れ
た特性を発揮できる。 本発明の重合体粒子の製造方法は、乳化剤不存
在下に水媒体中で不均一重合することが極めて必
要である。乳化剤を添加すると本発明の効果が得
られない。 本発明で使用する水溶性ビニル系単量体は水
100重量部に対する溶解度が10重量部以上である
ことが必要である。水に対する溶解度が10重量部
より小さいと得られた重合体粒子の親水性が低く
なり、分散安定性が低下する欠点があるので好ま
しくない。本発明において使用される水溶性ビニ
ル系単量体は、ビニル基の他に、水溶性を付与す
るためにカルボキシル基、ヒドロキシル基、スル
ホン酸基、ホスホン酸基、又はアミノ基を有して
いることが好ましい。この内、カルボキシル基又
はヒドロキシル基を有する水溶性ビニル系単量体
が特に好適である。該水溶性ビニル系単量体の代
表的なものが挙げれば、アクリル酸、１−クロル
アクリル酸、２−メチルアクリル酸、メタクリル
酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ア
クリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）
メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタア
クリレート、グリセロールモノメタクリレート、
アリルアルコール、ポリエチレングリコールモノ
メタクリレート等である。 これらの単量体は単独あるいは混合して用いる
とよい。これらの中で、アクリル酸、メタクリル
酸、グリセロールモノメタクリレート、Ｎ−（２
−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ
エチレングリコールモノメタクリレート等のヒド
ロキシル基又はカルボキシル基を有する単量体が
好適に採用される。さらにまた、本発明の水溶性
ビニル系単量体の第１段目重合で使用する割合は
１〜50重量％であり、好ましくは５〜40重量％が
好適に採用される。水溶性ビニル系単量体が１重
量％より低い場合には重合体粒子の分散安定性が
低下する場合があるので好ましくない。また50重
量％より多い場合には重合体粒子が安定的に得ら
れないことが多いだけでなく、診断用試薬とした
場合の鋭敏性が著しく低くなるので好ましくな
い。本発明に於いて、第１段目重合で得られる重
合体が水に不溶性になることが必要である。重合
体が、水に可溶である場合には第２段目重合で得
られる重合体粒子の粒度分布が広くなるだけでな
く、免疫活性物質を吸着固定化した診断用試薬の
鋭敏性が低下するので好ましくない。従つて、水
溶性ビニル系単量体の添加量は、水溶性ビニル系
単量体の水に対する溶解度及び疎水性ビニル系単
量体の水に対する溶解度にも依存する。 本発明で使用する疎水性ビニル系単量体は水
100重量部に対して溶解度が３重量部以下でなけ
ればならない。水100重量部に対する溶解度が３
重量部より大きいビニル系単量体を用いると、親
水基を粒子表面層に濃縮させられないばかりでな
く、粒度分布の揃つた重合体粒子を得ることがで
きなくなるので、本発明の効果が得られない。該
疎水性ビニル系単量体としては、水100重量部に
対する溶解度が１重量部以下であるものが好まし
い。また、該疎水性ビニル系単量体は単独重合体
のガラス転移温度が40℃以上であることが必要で
ある。単独重合体のガラス転移温度が40℃より低
い場合には、重合体粒子を遠心分離して精製する
場合にはしばしば重合体粒子同志の融着がおこり
再分散が困難になるだけでなく、免疫活性物質を
吸着固定化した診断用試薬の保存安定性が著しく
低下することがあるので好ましくない。該疎水性
ビニル系単量体は、ビニル基、疎水性基としてア
リール基、ハロゲン化アリール基、アルキルエス
テル基又はハロゲン原子を有するものが好まし
い。特に疎水性基としてアリール基又はハロゲン
化アリール基を有するものがより好ましく使用さ
れる。水100重量部に対する溶解度が３重量部以
下でかつ単独重合体のガラス転移温度が40℃以上
である疎水性ビニル系単量体の代表的なものを挙
げれば、スチレン、ビニルトルエン、クロルスチ
レン、クロルメチルスチレン、塩化ビニル、メチ
ルメタクリレート、エチルメタクリレート、グリ
シジルメタクリレート、あるいは４−クロルフエ
ニルアクリレート等である。これらの中で、スチ
レン、ビニルトルエン、クロルスチレン、クロル
メチルスチレン等のアリール基又はハロゲン化ア
リール基をもつビニル系単量体が好適に採用され
る。 本発明において、第１段目重合と第２段目重合
の重合順序は極めて重要である。即ち、本発明の
疎水性ビニル系単量体を水媒体中で乳化剤不存在
下に水溶性ラジカル開始剤を添加して重合を行な
い、次いで水溶性ビニル系単量体と疎水性ビニル
系単量体との混合物を添加して重合を行なつて
も、安定的に重合体粒子が得られないばかりか、
たとえ重合体粒子が得られても極めて性質の異な
つた重合体粒子の混合物が得られたりするので、
本発明の効果が発揮されない。 本発明に用いる水溶性ラジカル開始剤は特に限
定的でなく公知のものが使用される。例えば、過
硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモ
ニウム等の過硫酸塩、又は過硫酸塩とチオ硫酸ナ
トリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナト
リウム等のチオ硫酸化合物及び銅イオン、鉄イオ
ン等の分解促進剤を組み合わせたレドツクス系触
媒が好適に使用される。水溶性ラジカル開始剤の
濃度は重合温度、単量体濃度に依存するために限
定的でないが、0.05乃至20ミリモル／の範囲が
好適に採用される。 また、水溶性ラジカル開始剤は、第１段目で重
合する単量体の重合速度を増加させて、第２段目
で重合する単量体の第１段目で重合した重合体へ
の吸収をよくするために、第１段目に全量添加す
ることが望ましいが、第１段目の重合速度が充分
大きくなる条件を設定すれば、第１段目と第２段
目に分割して添加してもよい。 本発明において重合温度は40℃乃至85℃より好
ましくは50℃乃至80℃がよい。第１段目の重合温
度と第２段目の重合温度は同じであることが重合
操作上好ましいが、単量体組成によつては異なつ
てもよい。 本発明において第１段目で重合する単量体の第
１段目及び第２段目で重合する全単量体に対する
構成量は、特に限定されないが、第１段目重合で
生成した重合体粒子に第２段目で重合する疎水性
ビニル系単量体が効率よく吸収されるように選択
することが好ましい。通常は１乃至40重量％、よ
り好ましくは２乃至20重量％の範囲から選択する
ことが好適である。 本発明において水溶性ビニル系単量体の全単量
体に対する割合は0.02〜20重量％、好ましくは
0.05〜10重量％が好適に採用される。 第１段目で重合する単量体の水に対する濃度
は、単量体の重合速度が小さくならないようにす
ることが好ましく、重合温度、開始剤濃度に依存
するが、通常水に対して0.5乃至20容量％、より
好ましくは１乃至10容量％が望ましい。 第１段目重合では、ビニル系単量体の50モル％
以上、好ましくは80モル％以上の重合を行なうこ
とが好適である。 上記のような重合を行なうために採用される第
１段目の重合時間は、重合温度、単量体の種類と
濃度などによつて異なるが、一般には20分乃至５
時間、より好ましくは30分乃至３時間が好適に採
用される。 第２段目重合は、第１段目重合に引き続いて、
同じ重合槽中で疎水性ビニル系単量体は添加して
行なうことが好ましいが、第１段目重合で得られ
た重合体を分離した後、別の重合槽に得られた重
合体を添加して第２段目重合を行なうこともでき
る。 第２段目重合は、第１段目重合で得られた重合
体の存在下に行なわれる。 第２段目で重合する疎水性ビニル系単量体は、
第１段目で重合した重合体によく吸収されるよう
に、疎水性ビニル系単量体の重合速度より速い速
度で滴々添加することが望ましいが、第１段目で
重合した単量体の割合が多い場合には短時間で添
加することもできる。 第２段目の重合時間は、重合する疎水性ビニル
系単量体の種類と濃度によつて異なるが、一般に
は30乃至50時間、より好ましくは１時間乃至30時
間が好適に採用される。 本発明において均一な重合体粒子を得ること
と、第２段目で重合する単量体が第１段目重合で
生成した重合体粒子に効率よく吸収されるよう
に、効率のよい不断の攪拌が好ましい。 本発明により得られた重合体粒子は、水媒体中
での疎水性有機化合物の吸着剤、生体内での各種
細胞、組織による貧食作用の観察用粒子、及び酵
素、蛋白質あるいは免疫活性物質の吸着固定用粒
子、等に応用でき、特に免疫活性物質を吸着固定
化した診断用試薬は免疫活性物質の吸着固定化量
が大きいために免疫学的凝集反応性が大きいだけ
でなく、分散安定性と保存安定性に優れる特徴が
ある。 以下に、本発明で得られた重合体粒子を診断用
試薬として用いた場合について説明する。 本発明で得られた重合体粒子に物理吸着によつ
て固定化する免疫活性物質としては、特に限定的
でなく公知のものが使用出来る。代表的なものを
例示すれば、例えば、変性ガンマグロブリン、リ
ウマチ因子、抗核因子、ヒトアルブミン、抗ヒト
アルブミン抗体、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、
イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリン
Ｍ（ＩｇＭ）ストレプトリジンＯ、抗ストレプト
リジンＯ抗体、Ｃ−反応性蛋白、抗Ｃ−反応性蛋
白抗体、アルフア−フエトプロテイン（α−
FP）、抗α−FP抗体、癌胎児性抗原（CEA）、抗
CEA抗体、ヒト胎盤ラクトゲン（HPL）、抗
HPL抗体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（HCG）、
抗HCG抗体、抗エストロゲン抗体、抗インシユ
リン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（HBS）、抗HBS
抗体、梅毒トレポネーマ抗原、風疹抗原、補体成
分C₁ｑ、抗補体成分C₁ｑ抗体、等の公知の免疫
活性物質をあげることができる。 本発明で得られた重合体粒子に吸着で固定化さ
れる該免疫活性物質の量は、各検査項目に適して
いる割合で重合体粒子に固定化させればよく、一
概に限定されない。一般には、該免疫活性物質の
量が多い程、診断用試薬の鋭敏性及び迅速性が上
がるため、鋭敏性及び迅速性を要求する場合に
は、前記の重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物
質を吸着させることが好ましい。 本発明の方法により製造した重合体粒子は、免
疫活性物質の飽和吸着量が多く、例えば、ヒトＩ
ｇＧの飽和吸着量は、重合体粒子の単位表面積当
り１mg／m²以上の値を示す。 本発明により得られた重合体粒子は疎水性と親
水性のバランスが極めて良く調節されているの
で、該重合体粒子表面に比較的多量の免疫活性物
質を極めて容易に物理吸着法で固定化できる特徴
がある。例えば、抗原又は抗体と重合体粒子を緩
衝液又は生理食塩水などの水媒体中で混合し、抗
原又は抗体が化学的に変化しないように、そして
それらの免疫学的性質を保持させるように、非常
に温和な条件下に抗原又は抗体を重合体粒子表面
に吸着させることができる。重合体粒子表面に吸
着された免疫活性物質の量は、重合体粒子の疎水
基の吸着部位を飽和又はブロツクされるように選
ぶことが好ましいが、残存する吸着部位を適当な
物質、例えば免疫学的に不活性な牛血清アルブミ
ン、ゼラチン等でブロツクさせることができる。 （効果） 本発明で得られた重合体粒子は、その精製工程
に於ける遠心分離操作を経ても、再分散性が良好
である。また、上記の重合体粒子に免疫活性物質
を吸着固定化した診断用試薬は、感作の後に精製
するために遠心分離操作を経ても分散安定性と保
存安定性が著しく優れている。特に、電解質を多
量に含む緩衝液中で十分安定であるため、免疫活
性物質の固定は電解質を含む緩衝液中で行なえ
る。従つて、上記の診断用試薬は被検体液と混合
時に非特異的凝集を防止できるという特徴をも有
している。しかも免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅
速性も良好である特徴を有する。 以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。 実施例１〜８及び比較例１〜７ (1) 重合体粒子の調製 攪拌付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、攪拌下に過硫酸カリウムを5.0ミリ
モル／濃度になるように添加した。次いで70℃
に加温した第１表に示す単量体混合物を第１表に
示す割合で添加して、70℃で第１表に示す如く第
１段目の重合を行なつた。その後第２段目重合の
スチレンを第１表に示す割合で定量ポンプで滴々
添加してから、所定時間、70℃で攪拌下に重合し
た。重合後、室温まで冷却してから、得られた重
合体粒子を濾紙（No.２）で濾別して大きな凝集体
を除いた。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分
に除いた後、水蒸気蒸留を３時間行なうことによ
つて残存する単量体を除いた。次いで遠心分離、
蒸留水への再分散の操作を繰返した後に、イオン
交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離
と洗浄を行なつて重合体粒子を精製した。得られ
た重合体粒子の粒子径を第１表に示す。 (2) ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の調製 (1)重合体粒子の調製で得られた本発明の重合体
粒子を固型分濃度１％でグリシン緩衝液に分散し
た。本発明に於いてグリシン緩衝液とはグリシン
0.05モル及び食塩0.05モルを水１に溶解し、次
いで２規定水酸化ナトリウム水溶液でPHを8.2に
調製し、さらにアジ化ナトリウムを１ｇ添加した
ものである。 本発明に於いてヒトＩｇＧは、ヒト血清を飽和
硫安で塩析し、さらに透析を行ない精製したもの
を用いた。 ヒトＩｇＧをグリシン緩衝液により希釈し１
mg／mlに調整する。次いで倍数希釈法によりヒト
ＩｇＧをグリシン緩衝液により希釈してヒトＩｇ
Ｇ希釈液を調製する。１％濃度の重合体粒子分散
液１容にヒトＩｇＧ希釈液１容を加え攪拌し、室
温下２時間放置する。次いでウシ血清アルブミン
を１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１
夜放置してヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子を
得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分
液の操作を繰り返えすことによりヒトＩｇＧを固
定化した重合体粒子を洗浄した。 さらに遠心分離した後、ヒトＩｇＧを固定化し
た重合体粒子をウシ血清アルブミンを0.1％の濃
度で添加したグリシン緩衝液に再分散し固型分濃
度を0.5％に調整し、４℃に保ち保存した。 (3) 抗原・抗体反応 ヒトＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇ
Ｇウサギ全血清を60℃、30分非動化処理を行なつ
た。この血清を以下抗ヒトＩｇＧウサギ血清と呼
ぶ。 抗ヒトＩｇＧウサギ血清をグリシン緩衝液で20
倍に希釈したものを原液とし、倍数希釈法により
抗ヒトＩｇＧウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈
して抗ヒトＩｇＧウサギ血清希釈液を調製する。
抗原・抗体反応を行なうためにガラス製10穴のホ
ールグラスを用意し、グリシン緩衝液で希釈した
抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに0.04ml加え
る。次いでヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の
グリシン緩衝液分散液を各ホールに0.04ml加え
る。この後直ちに平沢製作所製テーハー式攪拌機
によりホールグラスを１分間に120回転の速度で
水平回転し攪拌を行なう。抗原・抗体反応により
重合体粒子の凝集が認められるまでに要する時
間、すなわち凝集像出現時間及び所定時間攪拌後
の重合体粒子の凝集の有無から、ヒトＩｇＧを固
定化した重合体粒子の特性である迅速性及び鋭敏
性を評価した。ホールグラスを用いた重合体粒子
の凝集試験の結果を図１に示す。図１は10分間の
攪拌後の凝集状態を示す。凝集が全く認められな
い場合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合
（±）、明らかに凝集が認められる場合、凝集の強
い順に＋＋＋、＋＋、＋と判定した。図中Ｃは抗原
もしくは抗体を全く含まないことを示す。凝集試
験の結果、明らかに凝集の認められたホールに於
ける抗ヒトＩｇＧウサギ血清希釈液の最高希釈倍
数をもつて、重合体粒子の鋭敏性を評価した。 重合体粒子の特性として、さらに重合体粒子の
分散安定性を評価した。すなわち、重合体粒子に
ヒトＩｇＧ希釈液を加え、室温で２時間放置した
後の重合体粒子の分散状態をもつて重合体粒子の
ヒトＩｇＧ固定化時の分散安定性を評価した。又
ヒトＩｇＧ固定化後３ケ月経過した後の重合体粒
子の分散状態をもつてヒトＩｇＧを固定化した重
合体粒子の保存中の分散安定性を評価した。 尚、比較例として、ジ−２−エチルヘキシルス
ルホコハク酸1.5ｇを乳化剤として用いた他は実
施例１と同様に重合を行ない、その結果を第１表
に比較例１に示した。また、第１表に示す条件で
第１段目重合のみを行なつた以外は実施例１と同
様に重合を行ない、その結果も併せて第１表の比
較例２〜７に示した。 実施例 ９ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて75℃に保

【表】

【表】 つた後に、窒素雰囲気下、攪拌下に過硫酸カリウ
ム５ミリモル／、チオ硫酸ナトリウム５ミリモ
ル／、硫酸銅0.25ミリモル／、及びα−メル
カプトエタノール1.0c.c.を添加した。次いで75℃
に加温したメタクリル酸1.3ｇ及びメチルメタク
リレート20ｇの混合物を添加して75℃で30分間攪
拌下に重合した。その後、メチルメタクリレート
230ｇを定量ポンプで滴々添加して、更に75℃で
２時間攪拌下に重合した。その後の操作は実施例
１と同様の操作を行なつた。得られた重合体粒子
の粒子径は0.18ミクロンであつた。この重合体粒
子を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧを吸着し
て固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・
抗体反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１日後
×1280、３ケ月後×1280、また分散安定性は１日
後に１本、３ケ月後に２本非特異凝集が認められ
た。 実施例 10 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、攪拌下に過硫酸カリウムを10ミリモ
ル／濃度になるように添加した。次いで70℃に
加温したポリエチレングリコールモノメタクリレ
ート（エチレングリコール単位９量体）24ｇとク
ロルメチルスチレン40ｇの混合物を添加して70℃
で1.5時間攪拌下に重合した。その後クロルメチ
ルスチレン300ｇ及びジビニルベンゼン６ｇの混
合物を定量ポンプで逐次添加して、更に70℃で30
時間攪拌下に重合した。その後の操作は実施例１
と同様の操作を行なつた。得られた重合体粒子を
実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧを吸着して固
定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体
反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１日後×
1280、３ケ月後×1280、また分散安定性は１日後
及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応
が認められなかつた。 実施例 11 攪拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換
した後に、蒸留水2700c.c.を加えて65℃に保つた後
に、窒素雰囲気下に過硫酸カリウム10ミリモル／
濃度になるように添加した。次いで65℃に加温
したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクルア
ミド1.5ｇ、２−ヒドロキシメタクリレート２ｇ
及び塩化ビニルモノマー14ｇの混合物を窒素圧で
オートクレーブに圧入して65℃に攪拌下に1.5時
間重合した。その後塩化ビニルモノマー140ｇを
逐次添加して65℃で４時間攪拌下に重合した。次
いで残存する未反応の塩化ビニルモノマーをパー
ジしてから、得られた重合体粒子を濾紙（No.２）
で濾別して大きな凝集体を除いた。更に粗い重合
体粒子を遠心分離で充分に除いた。次いでセロフ
アン膜で１ケ月間透析を行なつた後に、イオン交
換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と
洗浄を行なつて重合体粒子を精製した。かくして
得られた重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒ
トＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサ
ギ血清との抗原・抗体反応を行なつた。その結
果、鋭敏性は１日後×2560、３ケ月後×2560、ま
た分散安定性は１日後１本、及び３ケ月後１本の
非特異的凝集反応が認められた。 実施例12と比較例８〜９ 熱変性ヒトＩｇＧの固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例２で
用いた重合体粒子を0.5％になるよう分散させた。
次いで60℃で10分間加熱処理したヒトＩｇＧをグ
リシン緩衝液により希釈し１mg／mlに調整した。
0.5％濃度の重合体粒子分散液１容に熱変性した
ヒトＩｇＧ希釈液１容を加え、攪拌し、室温下２
時間放置した。その後ウシ血清アルブミンを１％
の濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜放置
して熱変性ヒトＩｇＧを固定化した重合体を得
た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散
の操作を繰返して洗浄した後、熱変性ヒトＩｇＧ
を固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミンを
0.1％の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散
し、固型分濃度を0.5％に調整した。 リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール
血清をグリシン緩衝液で20倍に希釈したものを原
液として、実施例１と同様にしてガラス製10穴の
ホールグラスにグリシン緩衝液で希釈した慢性関
節リウマチ患者血清を各ホールに0.04mlを加え、
次いで熱変性ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子
をグリシン緩衝液で希釈した分散液を各ホールに
0.04ml加えて実施例１と同様の操作で鋭敏性を調
べた結果、鋭敏性は×1280であつた。 尚、比較例８として比較例１で得られた重合体
粒子を用いて上記実施例と同様の操作でテストす
ると、鋭敏性は×640であつた。 さらにまた、比較例９として比較例２で得られ
た重合体粒子を用いて上記実施例と同様の操作で
テストすると、鋭敏性は×80であつた。 実施例13と比較例10 アルフアーフエトプロテインの抗体の固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例７で
用意した重合体粒子を1.0％になるように分散さ
せた。次いで家兎の産生したアルフアーフエトプ
ロテイン（以下α−FPと略す）の抗体をアフイ
ニテイークロマトグラフイーにより精製して得た
精製α−FP抗体を、グリシン緩衝液で500μｇ／
mlの濃度に希釈した。重合体粒子分散液１容と精
製α−FP抗体の希釈液１容とを加え、攪拌し、
室温下２時間放置した。その後ウシ血清アルブミ
ンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち
１夜放置してα−FP抗体を固定化した重合体粒
子を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への
再分散の操作を繰り返して洗浄した後、α−FP
抗体を固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミ
ンを0.1％の濃度で添加したグリシン緩衝液に再
分散し、固型分濃度を0.5％に調整した。 アルフアーフエトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα−FPの濃度が1000μ
ｇ／mlであるものを原液とし、グリシン緩衝液で
10倍ごとの希釈系列を調製した。実施例１と同様
にして、ガラス製10穴のホールグラスにグリシン
緩衝液で希釈したα−FPを各ホールに0.04ml加
え、次いでα−FP抗体を固定化した重合体粒子
の分散液を各ホールに0.04ml加えて、実施例１と
同様の操作で鋭敏性、分散安定性を調べた。その
結果、鋭敏性は１日後20μｇ／mlであつた。 尚、比較例10として比較例１で得られた重合体
粒子を用いて上記実施例と同様の操作で試験する
と、鋭敏性は１日後100μｇ／mlであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた重合体粒子を用
いた診断用試薬の凝集状態を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (A) 水100重量部に対する溶解度が10重量部
   以上の水溶性ビニル系単量体１〜50重量％と (B) 水100重量部に対する溶解度が３重量部以下
   で、且つ、単独重量体のガラス転移温度が40℃
   以上の疎水性ビニル系単量体99〜50重量％ の混合物を乳化剤不存在下の水媒体中で、水溶性
   ラジカル重合開始剤の存在下に重合を行なつて水
   に不溶性の重合体を得、次いで該重合体の存在下
   に、上記(B)の疎水性ビニル系単量体を重合するこ
   とを特徴とする重合体粒子の製造方法。