JPH0666778A

JPH0666778A - 高精度分析法

Info

Publication number: JPH0666778A
Application number: JP24467891A
Authority: JP
Inventors: Shinji Satomura; 慎二里村; Kenji Nakamura; 賢治中村; Nobuko Imashiyou; 展子今荘
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1994-03-11
Anticipated expiration: 2013-06-25
Also published as: JP2768079B2

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｃ）による分析法に於いて、同一試料分析中に出現する
分析対象物以外のピークの出現時に於ける溶離液の流速
を、分析対象物のピーク出現時に於ける溶離液のそれよ
りも速くすることにより、分析の精度を高めることを特
徴とする該分析法の発明である。【効果】本発明は、従来のＨＰＬＣを使用する分析方法
に於いては例えば充填剤の種類、溶離液の組成、溶離液
のpＨ、グラジエント条件等を経験により種々変化させ
て主ピークと不要ピークとが充分分離し得るような最適
の測定条件を設定しなければ実施し得なかった分析を、
単に溶離液の流速を主ピーク出現時と不要ピーク出現時
とで変化させることにより高精度且つ短時間に実施し得
るようにした点に効果を奏する発明であり、斯業に貢献
するところ大なる発明である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高速液体クロマトグラ
フィ（以下、ＨＰＬＣと略記する。）による高精度の分
析法と、該方法に使用可能なＨＰＬＣ用分析装置に関す
る。

【０００２】

【発明の背景】ＨＰＬＣは、溶液中の微量成分を短時間
に精度良く分析・定量し得る方法として近年様々な分野
で利用されている分析方法の一つである。ＨＰＬＣによ
る分析に於いては、分析の精度を高めるために、分析対
象物のピークとその他の成分のピークとが充分分離し得
るような最適の測定条件を設定する必要がある。

【０００３】通常、この最適測定条件を設定するために
検討される要因としては、例えば充填剤の種類、溶離液
の組成、溶離液のpＨ、グラジエント条件等が挙げられ
る。しかしながら、試料によっては、これらの要因を種
々変化させても分析対象物のピークとその他の成分のピ
ークとを充分に分離し得る測定条件を設定することが難
しい場合が応々にしてある。

【０００４】例えば、溶液中の分析対象物の濃度に比較
して、その他の成分の濃度がかなり高くしかもこのピー
クが分析対象物のピークの直前や直後に出現する場合に
は、その他の成分のリーディング或はテーリングにより
分析対象物のピークが影響を受け、測定精度の低下を来
したり、検出可能領域の下限が高くなって検出限界の幅
が狭くなる等の現象を生じる。そのため、このような現
象を回避し得る新たな方法の出現が求められている現状
にある。

【０００５】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑み成さ
れたもので、ＨＰＬＣによる分析に於いて、同一試料分
析中に出現する分析対象物のピークとそれ以外のピーク
とを明確に分離する方法と、それによってもたらされる
高精度な分析法、並びに該方法に使用可能なＨＰＬＣ用
分析装置を提供することをその目的とする。

【０００６】

【発明の構成】本発明は、ＨＰＬＣによる分析法に於い
て、同一試料分析中に出現する分析対象物以外のピーク
の出現時に於ける溶離液の流速を、分析対象物のピーク
出現時に於ける溶離液のそれよりも速くすることによ
り、分析の精度を高めることを特徴とする該分析法、並
びに同一試料分析中に出現する分析対象物以外のピーク
の出現時に於ける溶離液の流速と、分析対象物のピーク
出現時に於ける溶離液のそれとを、予め設定した条件に
応じて自動的に変化させ得る手段を備えたことを特徴と
する、ＨＰＬＣ用分析装置である。

【０００７】即ち、本発明者らは、上記本発明の目的を
達成すべく鋭意研究の途上、分析対象物以外のピーク
（以下、不要ピークと略記する。）出現時に於ける溶離
液の流速を、分析対象物のピーク（以下、主ピークと略
記する。）出現時に於ける溶離液のそれよりも速くした
場合には、不要ピークのリーディングやテーリングによ
る主ピークへの影響が回避でき、高精度な分析が実施し
得ること、更にこのような条件で分析を実施することに
より測定時間の短縮を図れることを見出し本発明を完成
するに至った。

【０００８】本発明に於いて用いられるＨＰＬＣ用装置
としては、通常この分野に於いて用いられているもので
あれば、特に限定されることなく挙げることができる。
また、該装置に装着されるカラムの充填剤も通常この分
野で用いられる例えばゲル瀘過（ゲル瀘過クロマトグラ
フィ）用充填剤，イオン交換クロマトグラフィ用充填
剤，等電点クロマトグラフィ用充填剤，疎水クロマトグ
ラフィ用充填剤，逆相クロマトグラフィ用充填剤，ハイ
ドロキシアパタイト等の中から分析目的に応じて適宜選
択し使用すればよい。

【０００９】このようなＨＰＬＣ用装置に、予め設定し
た条件に応じて自動的に溶離液の流速を変化させるため
のマイクロコンピューター等を接続すれば、本発明のＨ
ＰＬＣ用装置とすることができる。

【００１０】本発明のＨＰＬＣ用装置を使用すれば、分
析対象物の分析を自動化することが可能となる。尚、分
析対象物が酵素活性を保有する物質であり、分析対象物
のピークの検出を該酵素活性を利用して行う場合には、
本願発明のＨＰＬＣ用装置に、ポストカラム反応装置を
接続しておくことが好ましい。また、溶離液を２種類用
いてグラジエントを行いながら本発明を実施する際に
は、溶離液を供給するポンプは、逆流防止弁がついた
もの、背圧の変化に拘わらず一定流速を保持できる性
能を有するもの、等であることが好ましいことは言うま
でもない。

【００１１】本発明の方法に於いて使用される溶離液と
しては、通常この分野に於いて使用されるものであれば
特に限定することなく挙げられるが、例えばリン酸塩，
酢酸塩，クエン酸塩，グッド（Good）の緩衝剤，トリス
（ヒドロキシエチル）アミノメタン等の緩衝剤、例えば
塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム等の
塩類、例えばメタノール，エタノール，イソプロピルア
ルコール，アセトニトリル，テトラヒドロフラン，トリ
フルオロ酢酸等の有機溶媒、界面活性剤等を適宜含有す
る水溶液が好ましく用いられる。

【００１２】本発明の方法により分析が可能な分析対象
物としては、通常ＨＰＬＣにより分析可能とされている
ものであれば特に限定されないが、例えば血清，血液，
血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等
の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物質、癌
関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものとして挙
げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，アルカ
リホスファターゼ，酸性ホスファターゼ，γ-グルタミ
ルトランスフェラーゼ（γ-GTP），リパーゼ，クレアチ
ンキナーゼ(CK)，乳酸脱水素酵素(LDH)，グルタミン酸
オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)，グルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)，レニン，プロテ
インキナーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばス
テロイドホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)，
プロラクチン，甲状腺刺激ホルモン(TSH)，黄体形成ホ
ルモン(LH)等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原(P
SA)，α -マクログロブリン，癌胎児性抗原(CEA)，α-
フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好ましく挙げられ
る。

【００１３】本発明を実施するには、例えば以下の如く
行えばよい。即ち、通常のＨＰＬＣによる分析対象物の
測定に於いて、主ピークが出現する前及び出現した後の
溶離液の流速を、主ピーク出現時の該流速よりも速くす
る以外は、通常のＨＰＬＣによる測定と同様にして実施
すれば足りる。この場合に、流速を変化させる方法とし
ては、手動でもよいし、本発明のＨＰＬＣ用装置を用い
て自動的に行わせても何れにてもよい。

【００１４】尚、溶離液の流速の上限は使用するカラム
の耐圧能により自ずから決定されるので、主ピーク出現
時の流速と不要ピーク出現時の流速は、この範囲内であ
って、且つ主ピーク出現時の流速と不要ピーク出現時の
流速とを変化させた際にこれらピークの分離を充分に行
い得る範囲から適宜選択すればよいが、通常、分析対象
物のピーク出現時の溶離液の流速１に対して、それ以外
のピーク出現時の溶離液のそれは、1.2〜10、好ましく
は1.5〜５の範囲から選択される。また、流速の変化
は、段階的（ステップ）であっても徐々に（グラジエン
トに）であっても何れにてもよい。

【００１５】本発明の方法は、分析対象物が酵素活性を
保有する物質であり、該分析対象物の検出を該酵素活性
を利用してポストカラム法で行う際に特にその効果を発
揮する。

【００１６】即ち、例えば分析対象物が特定の物質とこ
れに対して親和性を有する物質（例えば抗体、レクチ
ン、酵素に対するインヒビター、特定の核酸に相補的な
ポリヌクレオチド等）の酵素標識物（以下、酵素標識抗
体等と略記する。）との複合体であり、該複合体と遊離
の酵素標識抗体等との分離をＨＰＬＣにより行い、且つ
その検出をポストカラム法により行う場合に、特に効果
的である。

【００１７】即ち、この場合にＨＰＬＣにより分析する
試料中には、分析対象物である特定物質と酵素標識抗体
等との複合体と、遊離の酵素標識抗体等とが共存してお
り、しかも通常遊離の酵素標識抗体等の濃度の方が該複
合体の濃度よりも高い場合が多いので、遊離の酵素標識
抗体等により主ピーク（該複合体のピーク）が影響を受
けることが多い。本発明の方法により該試料について分
析を行うと、不要ピーク（遊離の酵素標識抗体等のピー
ク）は、通常のＨＰＬＣによる分析時よりもピーク面積
及びピーク高共に小さくなって、主ピークへの影響が殆
どなくなるのである。この理由は定かではないが、分析
対象物以外のピーク出現時の溶離液の流速を速くさせる
ことにより、例えば遊離の酵素標識抗体等のカラム内
での拡散の程度が減少する、ポストカラムでの反応時
間が短縮されるため酵素反応生成物が減少するのでピー
ク自体が見かけ上小さくなる、酵素反応用基質液の流
速は一定であるので、ポストカラムに於ける基質濃度が
減少し酵素反応が起こり難くなる、トータル流速が増
加することにより、検出器中に於ける溶離液の滞留時間
が減少するので、見かけの検出器感度が低下する、等の
要因が重なってこの様な効果が得られるのであろう。

【００１８】尚、上記のケースの如く、分析対象物の保
有する酵素活性を利用して、分析対象物の検出を行う場
合には、不要ピーク出現時の基質液の流速を低下させる
（若しくは０とする）ことによっても主ピークの検出感
度を上昇させることは可能である。しかしながら、この
方法では測定時間を短縮することはできない。

【００１９】従来の方法に於いては、ＨＰＬＣによる分
析の精度を高めるには、例えば充填剤の種類、溶離液の
組成、溶離液のpＨ、グラジエント条件等を経験により
種々変化させて主ピークと不要ピークとが充分分離し得
るような最適の測定条件を設定する必要があったが、本
発明の如く単に溶離液の流速を主ピーク出現時と不要ピ
ーク出現時とで変化させることによりＨＰＬＣによる分
析をこれほど高精度且つ短時間に行い得るとは意外なこ
とであった。

【００２０】以下に実施例及び比較例を示し本発明を更
に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。

【実施例】

【００２１】実施例１．（溶離液１）リン酸ナトリウム 4.2gと、リン酸２ナト
リウム 80.0gとを、精製水に溶解し、全量を５ｌとした
ものを溶離液１とした。（溶離液２）硫酸アンモニウムを溶離液１に1.70Ｍとな
るように溶解し、pＨを7.5に調整したものを溶離液２と
した。（反応用緩衝液）牛血清アルブミン（シグマ社製）0.2g
を溶離液１に溶解し、全量を100mlとしたものを反応用
緩衝液とした。（抗体溶液）抗ヒトα-フェトプロテイン（マウス）モ
ノクローナル抗体（和光純薬工業(株)社製）を常法によ
り処理してＦab'としたものに、常法によりペルオキシ
ダーゼ（POD）（TOYOBO社製）を標識して得た、POD標識
抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'を100nMとなるように
反応用緩衝液に溶解したものを抗体溶液とした。（基質液）3-(p-ヒドロキシフェニル)-プロピオン酸16.
6g及び35％過酸化水素水630mg（過酸化水素として220m
g）とを溶離液１に溶解し、全量を１ｌとしたものを基
質液とした。（試料）ヒトα-フェトプロテイン（シグマ社製）を150
ng/mlとなるように反応用緩衝液に溶解したものを試料
とした。（ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図３に示す。・カラム：φ4.6×30mm。・充填剤：ＭＣＡgel エチル（和光純薬工業(株)社
製）・溶離液及び流速：グラジエントパターンを実線で、流
速の変化を点線で、図２(1)に夫々示す。・基質液流速：0.1ml/min。・検出：励起波長；320nm、蛍光波長；404nmで蛍光を測
定した。（測定操作）抗体溶液50μlと試料50μlとを室温下に混
合、反応させた後、反応液の10μlを上記条件のＨＰＬ
Ｃにより分析した。（結果）得られた溶出パターンを図１(1)に示す。尚、
図中、１は遊離のPOD標識抗ヒトα-フェトプロテイン-
Ｆab'のピークを、２はヒトα-フェトプロテインとPOD
標識抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'との複合体のピ
ークを夫々示す。

【００２２】比較例１．溶離液の流速を１ml/minとし、
且つグラジエントパターンを図２(2)に於いて実線で示
す如くした以外は、実施例１と同じ試料及び試薬を用
い、同様の操作を行って、実施例１と同じ条件でＨＰＬ
Ｃによる分析を行った。得られた溶出パターンを図１
(2)に示す。尚、図中、１は遊離のPOD標識抗ヒトα-フ
ェトプロテイン-Ｆab'のピークを、２はヒトα-フェト
プロテインとPOD標識抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'
との複合体のピークを夫々示す。図１の結果から明らか
な如く、本発明の方法によれば、従来法で行うよりも高
精度且つ短時間で分析対象物の分析を実施し得ることが
判る。

【００２３】実施例２．レニン活性の測定尚、以下に於いて使用している略号の正式名称は以下の
通り。 His：ヒスチジン残基、Pro：プロリン残基、Phe：フェ
ニルアラニン残基、Leu：ロイシン残基、Val：バリン残
基、Ile：イソロイシン残基、Ala：アラニン残基。（溶離液１）10％のアセトニトリルを含む 50mM 酢酸-
酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ6.0）を溶離液１とした。（溶離液２）60％のアセトニトリルを含む 50mM 酢酸-
酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ6.0）を溶離液２とした。（基質液）500μMのピリジルグリシル-His-Pro-Phe-His
-Leu-Val-Ile-His-βAla-OH、３mMのo-フェナンスロリ
ン、１mMの弗化フェニルメチルスルホニルを含む 0.1M
3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液（p
Ｈ7.0）を基質液とした。（試料）新鮮ヒト血清を試料とした。（ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図６に示す。・カラム：φ4.6×10mm（40℃保温）。・充填剤：Wakosil 5C18（和光純薬工業(株)社製）・溶離液及び流速：グラジエントパターンを実線で、流
速の変化を点線で、図４(1)に夫々示す。・検出：励起波長；306nm、蛍光波長；358nmで蛍光を測
定した。（測定操作）基質液100μlと試料10μlとを室温下に混
合した後、37℃で１時間反応させた。得られた反応液の
60μlを上記条件のＨＰＬＣにより分析した。（結果）得られた溶出パターンを図５(1)に示す。尚、
図中、１はo-フェナンスロリンのピークを、２はレニン
の酵素作用生成物（ピリジルグリシル-His-Pro-Phe-His
-Leu-OH）のピークを、３はレニンの基質（ピリジルグ
リシル-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-βAla-OH）
のピークを夫々示す。

【００２４】比較例２．溶離液の流速を1.5ml/minと
し、且つグラジエントパターンを図４(2)に於いて実線
で示す如くした以外は、実施例２と同じ試料及び試薬を
用い、同様の操作を行って、実施例２と同じ条件でＨＰ
ＬＣによる分析を行った。得られた溶出パターンを図５
(2)に示す。尚、図中、１はo-フェナンスロリンのピー
クを、２はレニンの酵素作用生成物（ピリジルグリシル
-His-Pro-Phe-His-Leu-OH）のピークを、３はレニンの
基質（ピリジルグリシル-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile
-His-βAla-OH）のピークを夫々示す。図５の結果から
明らかな如く、本発明の方法によれば、従来法で行うよ
りも高精度且つ短時間で分析対象物の分析を実施し得る
ことが判る。

【００２５】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、従来のＨＰ
ＬＣを使用する分析方法に於いては例えば充填剤の種
類、溶離液の組成、溶離液のpＨ、グラジエント条件等
を経験により種々変化させて主ピークと不要ピークとが
充分分離し得るような最適の測定条件を設定しなければ
実施し得なかった分析を、単に溶離液の流速を主ピーク
出現時と不要ピーク出現時とで変化させることにより高
精度且つ短時間に実施し得るようにした点に顕著な効果
を奏する発明であり、斯業に貢献するところ大なる発明
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１(1)は、実施例１に於いて得られた高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の結果を、図１(2)
は、比較例１に於いて得られたＨＰＬＣの結果を夫々示
す。

【図２】図２(1)は、実施例１に於けるグラジエントパ
ターンと流速の変化を、図２(2)は、比較例１に於ける
グラジエントパターンを夫々示す。

【図３】図３は、実施例１及び比較例１に於いて使用さ
れたＨＰＬＣ用装置のシステムの概略を示したものでで
ある。

【図４】図４(1)は、実施例２に於いて得られたＨＰＬ
Ｃの結果を、図４(2)は、比較例２に於いて得られたＨ
ＰＬＣの結果を夫々示す。

【図５】図５(1)は、実施例２に於けるグラジエントパ
ターンと流速の変化を、図５(2)は、比較例２に於ける
グラジエントパターンを夫々示す。

【図６】図６は、実施例２及び比較例２に於いて使用さ
れたＨＰＬＣ用装置のシステムの概略を示したものであ
る。

【符号の説明】

図１の各図に於ける各番号は夫々以下のピークを示す。１：遊離のPOD標識抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'。２：ヒトα-フェトプロテインとPOD標識抗ヒトα-フェ
トプロテイン-Ｆab'との複合体。図２の各図に於いて、実線はグラジエントパターンを、
点線は流速の変化を夫々表わす。図４の各図に於ける各
番号は夫々以下のピークを示す。１：o-フェナンスロリン。２：レニンの酵素作用生成物（ピリジルグリシル-His-P
ro-Phe-His-Leu-OH）。３：レニンの基質（ピリジル
グリシル-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-βAla-O
H）。図４の各図に於いて、実線はグラジエントパターンを、
点線は流速の変化を夫々表わす。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年８月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】実施例１．（溶離液１）リン酸ナトリウム 4.2gと、リン酸２ナト
リウム 80.0gとを、精製水に溶解し、全量を５ｌとした
ものを溶離液１とした。（溶離液２）硫酸アンモニウムを溶離液１に1.70Ｍとな
るように溶解し、pＨを7.5に調整したものを溶離液２と
した。（反応用緩衝液）牛血清アルブミン（シグマ社製）0.2g
を溶離液１に溶解し、全量を100mlとしたものを反応用
緩衝液とした。（抗体溶液）抗ヒトα-フェトプロテイン（マウス）モ
ノクローナル抗体（和光純薬工業(株)社製）を常法によ
り処理してＦab'としたものに、常法によりペルオキシ
ダーゼ（POD）（TOYOBO社製）を標識して得た、POD標識
抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'を100nMとなるように
反応用緩衝液に溶解したものを抗体溶液とした。（基質液）3-(p-ヒドロキシフェニル)-プロピオン酸16.
6g及び35％過酸化水素水630mg（過酸化水素として220m
g）とを溶離液１に溶解し、全量を１ｌとしたものを基
質液とした。（試料）ヒトα-フェトプロテイン（シグマ社製）を150
ng/mlとなるように反応用緩衝液に溶解したものを試料
とした。（ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を図３に示す。・カラム：φ4.6×30mm。・充填剤：ＭＣＩgel エチル（三菱化成(株)社製）・溶離液及び流速：グラジエントパターンを実線で、流
速の変化を点線で、図２(1)に夫々示す。・基質液流速：0.1ml/min。・検出：励起波長；320nm、蛍光波長；404nmで蛍光を測
定した。（測定操作）抗体溶液50μlと試料50μlとを室温下に混
合、反応させた後、反応液の10μlを上記条件のＨＰＬ
Ｃにより分析した。（結果）得られた溶出パターンを図１(1)に示す。尚、
図中、１は遊離のPOD標識抗ヒトα-フェトプロテイン-
Ｆab'のピークを、２はヒトα-フェトプロテインとPOD
標識抗ヒトα-フェトプロテイン-Ｆab'との複合体のピ
ークを夫々示す。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年８月６日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（１）は、実施例１に於いて得られた高速
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の結果を、図１
（２）は、比較例１に於いて得られたＨＰＬＣの結果を
夫々示す。

【図２】図２（１）は、実施例１に於けるグラジエント
パターンと流速の変化を、図２（２）は、比較例１に於
けるグラジエントパターンを夫々示す。

【図３】図３は、実施例１及び比較例１に於いて使用さ
れたＨＰＬＣ用装置のシステムの概略を示したものであ
る。

【図４】図４（１）は、実施例２に於いて得られたＨＰ
ＬＣの結果を、図４（２）は、比較例２に於いて得られ
たＨＰＬＣの結果を夫々示す。

【図５】図５（１）は、実施例２に於けるグラジエント
パターンと流速の変化を、図５（２）は、比較例２に於
けるグラジエントパターンを夫々示す。

【符号の説明】図１の各図に於ける各番号は夫々以下のピークを示す。１：遊離のＰＯＤ標識抗ヒトα−フェトプロテイン−Ｆ
ａｂ’。２：ヒトα−フェトプロテインとＰＯＤ標識抗ヒトα−
フェトプロテイン−Ｆａｂ’との複合体。図２の各図に於いて、実線はグラジエントパターンを、
点線は流速の変化を夫々表わす。図４の各図に於ける各
番号は夫々以下のピークを示す。１：ｏ−フェナンスロリン。２：レニンの酵素作用生成物（ピリジルグリシル−Ｈｉ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ）。３：レニンの基質（ピリジルグリシル−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−
βＡｌａ−ＯＨ）。図４の各図に於いて、実線はグラジエントパターンを、
点線は流速の変化を夫々表わす。

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図５】

【図４】

【図６】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】高速液体クロマトグラフィによる分析法に
於いて、同一試料分析中に出現する分析対象物以外のピ
ークの出現時に於ける溶離液の流速を、分析対象物のピ
ーク出現時に於ける溶離液のそれよりも速くすることに
より、分析の精度を高めることを特徴とする該分析法。
【請求項２】高速液体クロマトグラフィによる分析をポ
ストカラム法で行う、請求項１に記載の分析法。
【請求項３】分析対象物が酵素活性を保有する物質であ
る、請求項１又は２に記載の分析法。
【請求項４】分析対象物が酵素活性を保有する物質であ
り、該分析対象物の検出を該酵素活性を利用して行う、
請求項３に記載の分析法。
【請求項５】同一試料分析中に出現する分析対象物以外
のピークの出現時に於ける溶離液の流速と、分析対象物
のピーク出現時に於ける溶離液のそれとを、予め設定し
た条件に応じて自動的に変化させ得る手段を備えたこと
を特徴とする、高速液体クロマトグラフィ用分析装置。
【請求項６】ポストカラム反応装置が接続されている、
請求項５に記載の高速液体クロマトグラフィ用分析装
置。