JPH0666797A - 臓器移植時の拒絶反応の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 臓器移植後の拒絶反応を、例えば血液、尿又
は血清等の生体試料について酵素免疫測定法等で診断す
る方法を提供する。 【構成】 臓器移植を受けた人又は動物から採取した生
体試料中の可溶性インタ−ロイキン−６レセプタ−濃度
を測定することによる、該人又は動物における臓器移植
時の拒絶反応の診断方法により、前記目的を達成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臓器移植を受けた動物
に拒絶反応が生じているか否かを診断する方法及び該診
断に使用する試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臓器移植は、先天的又は後天的に障害が
発生した臓器に対する最終的な治療方法である。例えば
心房や心室の不全、胆道閉鎖等は、臓器移植以外に適当
な治療法がなく、また例えば慢性腎不全等は人工透析等
で生命を維持することはできるものの、根本的な治療に
は臓器移植以外に方法がない。臓器移植は、欧米におい
ては確立された治療行為であり、我が国においても腎臓
や角膜移植が頻繁に行われている。

【０００３】臓器移植においては、臓器提供者と臓器移
植を受ける者が例え肉親関係にあったとしても、組織適
合性が完全に一致することはほとんどない。従って、臓
器移植を受けた者の体内では、その免疫機構が移植され
た非自己臓器を排除しようとする。この免疫機構による
非自己の排除作用が一般にいう拒絶反応であるが、拒絶
反応が起きた場合、移植された臓器の組織からの脱落等
が起こり、移植を受けた者に生命の危険が及ぶことにな
る。

【０００４】このような危険性を最小限にするため、臓
器移植を行う以前から臓器移植後に渡って免疫抑制剤を
移植を受ける（受けた）者に投与し、その者の免疫力を
低下させて拒絶反応が起こるのを防止する措置を行うの
が一般的である。しかしながら、免疫抑制剤の投与は、
本来動物に備わっている免疫機構の力を低下させるもの
に他ならず、副作用として日和見感染が発生する可能性
がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする技術】このように、免疫抑制
剤の使用は臓器移植を行う場合に必要と考えられるけれ
ども、いかなる強度の免疫抑制剤を使用するか、又は移
植を受ける者に対してどの程度の用量投与するか、とい
う問題は、特に移植後の拒絶反応の起こり具合を勘案し
つつ決定する必要があると考えられる。拒絶反応には臓
器移植後２〜３週間で生じる急性拒絶反応と臓器移植後
２〜３か月後に生じる慢性のものがあり、免疫抑制剤の
投与は長期間に渡って必要となることが多いことから
も、拒絶反応が起こらないような必要最小限度の免疫抑
制剤を使用することが好ましいと考えられる。免疫抑制
剤の使用を必要最小限度に抑えるためには、特に臓器移
植後の拒絶反応の起こり具合を迅速に把握することが必
要である。

【０００６】従来、拒絶反応の診断基準としては、発
熱、血液中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度の上
昇等の一般的な基準と、移植臓器の機能不全、例えば腎
移植であれば尿量の減少や血清クレアチニン値の上昇、
腎腫大等、から判断し、最終的には組織生検で確定して
いるのが現状である。これらの基準の内、発熱やＣＲＰ
濃度は、例えば感染症によっても上昇することがあり、
拒絶反応によるものか否かを正確に知ることができない
という課題がある。一方、移植臓器の機能不全等を基準
とする場合には、移植臓器に関する種々の機能を測定等
が必要となり、更に後に組織生検を行わなければならな
い等、拒絶反応が起こっているか否かを知るまでに相当
の時間がかかり、かつ、熟練した検査技師が必要である
等の課題がある。

【０００７】近年、ｖａｎ Ｏｅｒｓらは、腎移植後の
拒絶反応時に、移植を受けた者の血液中のクレアチニン
上昇に先立ち、血液や尿中のインタ−ロイキン−６（以
後ＩＬ−６と記載する）濃度が上昇することを報告して
いる（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７１巻、
３１４頁、１９８８年）。しかし、ＩＬ−６濃度は感染
症等によっても上昇するとの報告（日本臨床、２１巻、
８号、１２４３頁、１９８９年）もあり、特に拒絶反応
と紛らわしい症状を示す感染症との区別等、ＩＬ−６濃
度の測定による拒絶反応の診断にはなお改善されるべき
点が残されている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、臓器移植
を受けた者に拒絶反応が起こった場合、拒絶反応発症直
後から血液等の生体試料中のインタ−ロイキン−６レセ
プタ−（以後、ＩＬ−６Ｒと記載する）濃度が上昇する
ことを見出だし、本発明を完成するに至った。即ち本発
明は、臓器移植を受けた人又は動物から採取した生体試
料中のインタ−ロイキン−６レセプタ−濃度を測定する
ことによる、該人又は動物における臓器移植時の拒絶反
応の診断方法である。また本発明は、少なくとも一種の
抗可溶性インタ−ロイキン−６レセプタ−抗体又は少な
くとも一種の抗インタ−ロイキン６レセプタ−抗体を含
んでなる臓器移植時の拒絶反応の診断用試薬である。以
下に本発明を詳細に説明する。

【０００９】本発明では、人における拒絶反応の他、免
疫機構を有する動物に対して臓器移植を行った場合にお
ける拒絶反応についても診断することができる。しかし
ながら、本発明は人の臓器移植における拒絶反応を診断
することを主たる目的とするものである。生体試料とし
ては血液、尿あるいは血清等を例示できるが、可溶性Ｉ
Ｌ−６レセプタ−が最も多く存在し得る血清を試料とし
て用いることが好ましい。本発明で測定するのは、細胞
膜貫通部分等を欠損し、結果として血清等の生体試料中
に遊離状態で存在する可溶性ＩＬ−６レセプタ−（特開
平２−２８８８９８号、特開平３−１５７４００号）で
ある。可溶性ＩＬ−６レセプタ−の測定は、血清等の生
体試料に含まれる前記可溶性ＩＬ−６レセプタ−の濃度
を測定し得る方法であれば、例えば液体クロマトグラフ
ィ−や電気泳動等、いかなる形態及びメカニズムの測定
法であっても制限はないが、短時間で、かつ高精度に測
定し得る方法として、特開平４−８９５６８号に記載さ
れたような抗可溶性ＩＬ−６レセプタ−抗体を使用する
免疫測定法が特に好ましい。

【００１０】免疫測定法による可溶性ＩＬ−６レセプタ
−の測定について例を示せば、固体支持体に結合された
抗可溶性ＩＬ−６レセプタ−又は抗ＩＬ−６レセプタ−
抗体に生体試料を接触させ、当該試料中の可溶性ＩＬ−
６レセプタ−を結合させ（可溶性ＩＬ−６レセプタ−は
ＩＬ−６レセプタ−の一部が欠損したものだから、抗Ｉ
Ｌ−６レセプタ−抗体であっても、可溶性ＩＬ−６レセ
プタ−をも結合し得るものを使用すれば良い）、標識物
質を結合させた他の抗体を可溶性ＩＬ−６レセプタ−と
接触、結合させる等のいわゆるサンドイッチ法が例示で
きる。また、前記特開平２−２８８８９８号に従って人
工的に製造した可溶性ＩＬ−６レセプタ−の一定量を標
識物質と結合させておき、生体試料と共に固体支持体に
結合された抗可溶性ＩＬ−６レセプタ−又は抗ＩＬ−６
レセプタ−抗体と接触させる等のいわゆる競合法も例示
できる。固体支持体や標識物質等は一般の免疫測定法で
使用されるものを使用すれば良く、特別のものを使用す
る必要はない。

【００１１】可溶性ＩＬ−６レセプタ−を特異的に認識
する抗体としては、より短時間でかつ高精度の測定を行
なううえでモノクロ−ナル抗体を使用することが好まし
い。このようなモノクロ−ナル抗体としては、ＭＴ１８
やＰＭ１（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４３巻、２９００頁、１９８９年）に記載されたもの等
があるが、特開平２−２８８８９８号等の記載を参照し
て新たに調製しても良い。

【００１２】可溶性ＩＬ−６レセプタ−濃度の測定によ
り拒絶反応の診断が可能であるが、感染症等との区別を
より明確にするため、更に生体試料中のＩＬ−６濃度を
測定する操作を行い、前記のようにして測定された可溶
性ＩＬ−６レセプタ−濃度及びＩＬ−６濃度を関連付け
ることが好ましい。ＩＬ−６濃度を測定する方法は特に
制限されないが、短時間で、かつ高精度に測定し得る方
法としては、例えば特願平３−１２２８７９号等に記載
されたような、抗ＩＬ−６抗体を使用する免疫測定法が
好ましい。

【００１３】本発明の拒絶反応の診断のための試薬は、
少なくとも一種の抗可溶性ＩＬ−６レセプタ−抗体又は
少なくとも一種の抗ＩＬ−６レセプタ−抗体を含むもの
である。例えば前記した免疫測定による拒絶反応の診断
法中、競合法を行なうための試薬は、更に標識物質と結
合した可溶性ＩＬ−６レセプタ−を含み、例えばサンド
イッチ法を行なうための試薬は、更にもう一種の抗可溶
性ＩＬ−６レセプタ−抗体又は少なくとも一種の抗ＩＬ
−６レセプタ−抗体であって標識物質と結合した抗体等
から構成される。このように、少なくとも一種の抗可溶
性ＩＬ−６レセプタ−抗体又は少なくとも一種の抗ＩＬ
−６レセプタ−抗体を含む本発明の試薬は、例えば第２
抗体を使用する免疫測定法や標識物質を後から免疫複合
体に導入する測定法等を実施するため、適当な試薬等を
更に含んでいても良い。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００１５】実施例１ 腎移植患者血清中のＩＬ−６、
ＩＬ−６レセプタ−濃度の測定 腎移植患者血中のＩＬ−６濃度を次のようにして測定し
た。患者から採取した血液を常法に従って処理して血清
を取得し、希釈液（50 mM Tris-HCl pH8.1、１mM MgCl
₂ 、150 mMNaCl、0.05% Tween 20、0.02% NaN₃ 、1%ウ
シ血清アルブミン）で４倍に希釈して血液試料とした。
血液試料は、腎移植後拒絶反応がなく経過良好だった２
人の患者（Ａ、Ｂ）、後に拒絶反応を起こした２人の患
者（Ｃ、Ｄ）及び実際に移植手術後に拒絶反応及びウイ
ルス感染を起こした２人の患者（Ｅ、Ｆ）からの合計６
つである。なお、各患者において真に拒絶反応又は感染
症が起きたか否かは、組織生検及び血清診断により決定
された。

【００１６】試料中のＩＬ−６濃度の測定は、特願平３
−１２２８７９号に記載された方法を参照して行った。
即ち、96穴のプレート（NUNC社製）に抗ＩＬ−６モノク
ローナル抗体PAB118のF(ab')₂ 断片を入れて静置し、こ
れを壁面に吸着させた。0.5%ウシ血清アルブミンを含む
PBS でこのプレートをブロッキング処理し、0.05% Twee
n 20を含むPBS 溶液で３回各穴を洗浄後、血液試料また
はＩＬ−６を 0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25 p
g/ml濃度で含む標準液を各穴に加えて室温で２時間反応
させた。各穴を0.05% Tween 20を含むPBS 溶液で３回洗
浄し、アルカリフォスファターゼで標識した抗ＩＬ−６
抗体PAB101を2.5mA 含む液を加え、さらに２時間室温で
反応をおこなわせた。

【００１７】反応終了後各穴を洗浄し、0.4mg/mlのNADP
（SIGMA 社製）を含む0.1Mエタノールアミン緩衝液（pH
9.5）を 100μl 加えて30分間反応させ、 100μl の酵
素反応増幅液（1 mlあたり50μg のウマ肝臓由来アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、50μg のジアフォラーゼ、50μ
l のエタノール、0.5 mgのINT-Violet、を含むpH 7.0の
50mMリン酸緩衝液）を加えて10分間反応させ、492 nmの
吸光度を測定し、標準品から求めた標準曲線からサンプ
ル中のＩＬ−６濃度を決定した。

【００１８】試料中のＩＬ−６レセプタ−濃度の測定
は、以下のようにして測定した。抗ＩＬ−６Ｒモノクロ
ーナル抗体ＰＭ １をプレートに吸着させ、0.5 % ウシ
血清アルブミンを含むPBS でこのプレートをブロッキン
グ処理し、0.05% Tween 20を含むPBS 溶液で３回各穴を
洗浄後、血液試料又はＩＬ−６レセプタ−を 0、0.5 、
1.0 、2.0 、3.0 、7.8 、15.7、31.3、62.5 ng/ml濃度
で含む標準液を各穴に加えて室温で２時間反応させた。
各穴を0.05% Tween 20を含むPBS 溶液で３回洗浄し、ア
ルカリフォスファターゼで標識した抗ＩＬ−６レセプタ
−抗体ＭＴ １８を2.5 mA含む液を加え、さらに１時間
室温で反応を行わせ、ｐ−ニトロフェニルフォスフェー
トの発色を405 nmの吸光度で測定し、標準品から求めた
標準曲線からサンプル中のＩＬ−６レセプタ−濃度を決
定した。

【００１９】結果を図１から図６に示す。図１はＡにつ
いての、図２はＢについての、図３はＣについての、図
４はＤについての、図５はＥについての、図６はＦにつ
いての結果を示している。

【００２０】図１、図２において、図１では手術後０〜
４日に、図２では手術後１６〜２６日にＩＬ−６濃度が
高値を示している、これら患者では拒絶反応及び感染症
は起きていない。一方可溶性ＩＬ−６レセプタ−濃度
は、手術前に高い値を示したが、手術後は正常人におけ
る通常の濃度（６０−１２０μg ／ml）とほぼ同等の値
を示している。このように、図１、図２によれば、拒絶
反応が起きない場合にはＩＬ−６レセプタ−濃度に大き
な変化が生じないことが分かる。

【００２１】図３、図４において、図３では手術後１１
〜２１日に、図４では手術後５〜１５日及び１５〜２５
日にＩＬ−６レセプタ−濃度が高値を示している。これ
ら高値はそれぞれ、実際に起きた拒絶反応（図３では１
１〜２１日頃、図４では５〜１５日及び１５〜２１日
頃）に対応している。一方、ＩＬ−６濃度については、
図３及び図４において拒絶反応とは時期的なずれを伴っ
た高値が認められる。このように図３、図４によれば、
拒絶反応が起きた場合にはＩＬ−６レセプタ−濃度に変
化（上昇）が認められ、そのタイミングはＩＬ−６濃度
の変化に比較してより拒絶反応の時期に速応しているこ
とが分かる。

【００２２】図５、図６において、図５では手術後１０
〜２０日に、図６では１０〜２０日にＩＬ−６レセプタ
−濃度が高値を示している。これら高値はそれぞれ、実
際に起きた拒絶反応（図５では１０〜２０日頃、図６で
は１０日前後）に対応している。一方、ＩＬ−６濃度に
ついては、一応拒絶反応に対応した高値が示されている
が、感染症に対応した高値（図５では２０〜３０日頃の
感染に対応した高値、図６では１０〜２０日の感染に対
応した高値）も認められる。このように図５、図６によ
れば、ＩＬ−６濃度の変化（上昇）は一応拒絶反応に対
応しているものの、感染症が起こった場合にも変化する
こと、ＩＬ−６レセプタ−濃度は感染症には応答しない
ことが分かり、ＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−の濃度を
測定することで、拒絶反応をより明確に診断でき、か
つ、拒絶反応と感染症を区別し得ることが分かる。

【００２３】実施例 ２ 移植手術前のＩＬ−６又はＩ
Ｌ−６レセプタ−の濃度変化 腎移植手術前に、慢性腎不全状態であった実施例１の患
者Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＦの血液試料を取得し、手術後直
後の同試料と共に前記同様にしてＩＬ−６レセプタ−濃
度を測定した。その結果、手術前の濃度がそれぞれ 21
2.4（Ａ）、 153.3（Ｂ）、 254.7（Ｄ）、 262.5
（Ｅ）又は 132.6 ng/ml（Ｆ）であったのに対し、手術
後の濃度はそれぞれ、 144.6（Ａ）、90.0（Ｂ）、 18
2.4（Ｄ）、 171.6（Ｅ）又は 175.5 ng/ml（Ｆ）と低
下した。

【００２４】このことは、腎臓機能が悪化した場合にＩ
Ｌ−６レセプタ−濃度は高い値を示すことを示してお
り、ＩＬ−６レセプタ−濃度と拒絶反応の相関を示唆す
るものである。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、例えば通常の免疫測定
法等を利用して血液、尿又は血清等の生体試料中の可溶
性ＩＬ−６レセプタ−濃度を測定するだけで臓器移植後
の拒絶反応を診断することできる。従って、従来の、最
終的には組織生検等の方法に比較してより短い時間のう
ちに、より多数の試料について、より簡便に拒絶反応を
診断することが可能である。ＩＬ−６濃度を測定する方
法に比較しても、本発明はよりタイムリ−にかつ感染症
に影響されずに拒絶反応を診断することができる。

【００２６】拒絶反応と感染症を区別する、という点に
関して、本発明の診断方法に、更にＩＬ−６濃度の測定
を付加し、両者の濃度変化（上昇）を相関させること
で、より好適な拒絶反応の診断方法が提供される。

【００２７】本発明の試薬は、前記診断を免疫測定によ
り達成するためのものであり、高感度かつ迅速な診断を
実現するうえで好適なものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の実施例１における患者Ａから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）を、図中の線はＩＬ−６の濃度変化（白三角）又
はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四角）をそれぞれ
示す。

【図２】図２は、本発明の実施例１における患者Ｂから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）を、図中の線はＩＬ−６の濃度変化（白三角）又
はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四角）をそれぞれ
示す。

【図３】図３は、本発明の実施例１における患者Ｃから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）をそれぞれ示す。図中、線はＩＬ−６の濃度変化
（白三角）又はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四
角）を、Ｒの矢印は後に組織生検によって患者に拒絶反
応が起きたことが確認された時点を示している。

【図４】図１は、本発明の実施例１における患者Ｄから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）をそれぞれ示す。図中、線はＩＬ−６の濃度変化
（白三角）又はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四
角）を、Ｒの矢印は後に組織生検によって患者に拒絶反
応が起きたことが確認された時点を示している。

【図５】図５は、本発明の実施例１における患者Ｅから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）をそれぞれ示す。図中、線はＩＬ−６の濃度変化
（白三角）又はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四
角）を、Ｒの矢印は後に組織生検によって患者に拒絶反
応が起きたことが確認された時点を、ＨＢの矢印は血清
検査によって患者に感染症（Ｂ型肝炎）が起きたことが
確認された時点をそれぞれ示す。

【図６】図６は、本発明の実施例１における患者Ｆから
の血液試料についての測定結果を示すものである。横軸
は腎臓移植手術を行った日を０とした時の時間経過を、
手術前（マイナス）又は手術後（プラス）で、縦軸はＩ
Ｌ−６濃度（pg/ml ）又はＩＬ−６レセプタ−濃度（ng
/ml ）をそれぞれ示す。図中、線はＩＬ−６の濃度変化
（白三角）又はＩＬ−６レセプタ−の濃度変化（黒四
角）を、Ｒの矢印は組織生検によって患者に拒絶反応が
起きたことが確認された時点を、ＣＭＶの矢印は血清検
査によって患者に感染症（サイトメガロウイルス感染）
が起きたことが確認された時点をそれぞれ示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年１０月２１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】図３、図４において、図３では手術後１１
〜２１日に、図４では手術後５〜１５日及び１５〜２５
日にＩＬ−６レセプタ−濃度が高値を示している。これ
ら高値はそれぞれ、実際に起きた拒絶反応（図３では１
１〜２１日頃、図４では５〜１５日及び１５〜２１日
頃）に対応している。一方、ＩＬ−６濃度については、
図３及び図４において拒絶反応とは時期的なずれを伴っ
た高値が認められる。このように図３、図４によれば、
拒絶反応が起きた場合にはＩＬ−６レセプタ−濃度に変
化（上昇）が認められ、そのタイミングはＩＬ−６濃度
の変化に比較してより拒絶反応の時期に合致しているこ
とが分かる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図５】

【図４】

【図６】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 臓器移植を受けた人又は動物から採取し
   た生体試料中の可溶性インタ−ロイキン−６レセプタ−
   濃度を測定することによる、該人又は動物における臓器
   移植時の拒絶反応の診断方法。
2. 【請求項２】 更に、生体試料中のインタ−ロイキン−
   ６濃度を測定する操作を含み、測定された可溶性インタ
   −ロイキン−６レセプタ−濃度及びインタ−ロイキン−
   ６濃度を関連付けることを特徴とする請求項１の診断方
   法。
3. 【請求項３】 少なくとも一種の抗可溶性インタ−ロイ
   キン−６レセプタ−抗体又は少なくとも一種の抗インタ
   −ロイキン６レセプタ−抗体を含んでなる臓器移植時の
   拒絶反応の診断用試薬。