JPH0669397B2

JPH0669397B2 - パ−オキシダ−ゼ標識による測定方法

Info

Publication number: JPH0669397B2
Application number: JP4378587A
Authority: JP
Inventors: 哲川勝; 誠彦山崎
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1987-02-25
Publication date: 1994-09-07
Anticipated expiration: 2009-09-07
Also published as: JPS63209600A

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は、特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に関す
る。

【従来技術】生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて来ているが、それらの方法の中最も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プ
ロテインＡとIgG、ホルモンとレセプタ、酵素と基質等
の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変化
した該標識のシグナルを検出することにより特定成分の
測定が行われる。特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルロース膜上に転写担持し、標識体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、TLC
プレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反応
させシグナルを検出する方法、膜上でDNAと該DNAに対す
る標識した相補的DNAとを反応させシグナルを検出する
方法或は免疫組織化学染色法などである。これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ることができる。例えば電気泳動後膜上に転写、担持さ
れた蛋白質や核酸、またはTLC上に展開した脂質成分等
の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結合
させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特定
成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報がえられる。また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報がえられる。

【発明が解決しようとする問題点】

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分解能をもったものであることが必須である。特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等が用いられている。放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する煩雑な操作を要する欠
点がある。蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β‐ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持体
上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色素を
生成、沈着させる方法において、標識酵素としてパーオ
キシダーゼが主として用いられ、その際、基質として、
従来ジアミノベンジジン、o-ジアニジジン、4-クロロ‐
1-ナフトール等が使用されてきた。ジアミノベンジジンやo-ジアニジジンは毒性が強くバッ
クグランドが出やすい欠点がある。 4-クロロ‐ナフトールは他に比べやや感度が高いが、よ
り微量の特定成分を測定するため、もしくは、特定成分
に対するより多くの情報を明確に得るには、感度は充分
とは言えない。また、特開昭61-10772号によれば、基質として、4-メト
キシ‐1-ナフトールを用いれば、4-クロロ‐1-ナフトー
ルよりも分析感度、分解能が１桁以上上昇したと記載さ
れている。しかしこの方法は、ゲル支持体内での発色を
行わせる特殊な方法であり、かつ分析感度、分解能にお
いても不充分である。従って本発明の目的は、簡易に且つ高感度、高分解能で
ありしかも迅速な特定成分の測定方法を提供することで
ある。

【問題点を解決するための手段】

前記目的に沿って、種々検討した結果、測定対象の特定
成分を、パーオキシダーゼを標識として有している標識
体を用い、パーオキシダーゼの酵素反応により生成した
色素量によって測定する該特定成分の測定方法において
該酵素反応の基質として過酸化水素および4-アルコキシ
‐1-ナフトール（ただし、アルコキシ基は、エトキシ
基、プロポキシ基、イソプロポキシ基）を用いることに
より問題点が解消され、前記本発明の目的は、達成され
た。次に本発明を詳細に説明する。本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい。又、特定
成分を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめた
後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させて
もよいし、或は複合結合体を形成せしめた後に該複合結
合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめても
よい。更に標識体は該特定成分と複合結合体を形成し、
支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結合し
てもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介して結合し
てもよい。また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パーオ
キシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応の基質とし
ては、過酸化水素及び4-アルコキシ‐1-ナフトールを用
いる。パーオキシダーゼと過酸化水素の作用により4-ア
ルコキシ‐1-ナフトールは自己カップリングして色素が
生成する。従来の過酸化水素及び4-クロロ‐1-ナフトールを基質と
して用いるアナリティカルバイオケミストリ（Analytic
al Biochemistry）119、142-147（1982）に記載の方法
と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポットは
鮮明で感度は10倍以上上昇した。また、その結果、パー
オキシダーゼ標識体の量を低減する事ができコスト的に
も有利である。本発明において、対象とする特定成分
は、その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得
られる物質又は物質群である。たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。たとえば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖
類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素
の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられ
る。本発明に使用し得る支持体としては、セルロース、アセ
テート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、TLCプレート等のシリカゲル担体、
プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金
属、、繊維等が挙げられる。また組織化学染色において
は、組織そのものも支持体として使用できる。本発明に使用される4-アルコキシ‐1-ナフトールは、有
機合成化学協会誌第17巻第12号PP27〜30（1959）に記載
の方法に従って合成できる。支持体に担持された特定成分とパーオキシダーゼ標識体
との複合結合体上に色素を生成せしめるには、発色用基
質試液中に支持体を浸漬させれば良い。発色用基質試液
は、適当なpHの緩衝液中に過酸化水素、4-アルコキシ‐
1-ナフトールを溶解し、調整される。4-アルコキシ‐1-
ナフトールは、少量の親水性の有機溶剤たとえばメタノ
ール、エタノール、DMF等に溶解して加えてもよい。酵素反応により支持体上に色素が生成した後、未反応物
資を洗い流す事により反応を停止する。生成した色素についての情報は、目視にて、もしくは技
術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読み取る事
ができる。また、適当な有機溶剤を加え、色素を溶解し
た後、情報を読み取っても良い。

【実施例】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。実施例１：ニトロセルロース膜上での抗原の測定：純水にて洗浄後、風乾したニトロセルロース膜（バイオ
ラッド社製；ポアサイズ0.45μｍ）にリン酸緩衝液（以
下PBSと称す）にて段階希釈したヤギIgGの１μをスポ
ットした。風乾後１％牛血清アルブミン（BSA）‐PBS溶液により４
℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキシダー
ゼ標識ウサギ抗ヤギIgG抗体（カッペル社製;1％BSA-PSA
溶液により1500倍希釈したもの）と４℃２時間反応させ
た。0.05％Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート；和光純薬社製）‐PBS溶液にて５回洗浄
し発色用基質試液中に浸漬した。発色用基質試液として
次の３種を用い、比較した。（１）:3mgの4-クロロ‐1-ナフトールを1mlのメタノー
ルに溶解し、5mlの0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4,200m
MNacl含有；以下TBSと称す）を加え、さらに３％過酸化
水素20μを加える。（２）:3mgの4-メトキシ‐1-ナフトールを0.5mlのDMFに
溶解し、5.5mlのTBSを加え、さらに３％過酸化水素20μ
を加える。（３）;3mgの4-エトキシ‐1-ナフトールを0.5mlのDMFに
溶解し、5.5mlのTBSを加え、さらに３％過酸化水素20μ
を加える。発色用基質試液（２）は経時的に青色に着色したが、本
発明の発色用基質試液（３）は着色はなく安定であっ
た。 15分間反応後、充分水洗し、風乾した。発色用基質試液
（１）を用いた場合、スポットは灰紫色であり抗原であ
るヤギIgGの検出限界は10ngであり、発色用基質試液
（２）を用いた場合、スポットは青色で、検出限界は1n
gであった。一方、本発明の発色用基質試液（３）を用
いた場合、スポットは鮮かな青色であり、高い解像力を
有していた。検出限界は0.5ng以下であった。また、
（３）において、4-エトキシ‐1-ナフトールの代わりに
4-プロポキシ‐1-ナフトール又は4-イソプロポキシ‐1-
ナフトールを用いた場合も同様の高い解像力、感度を示
した。実施例２：抗体及びハイブリドーマのスクリーニング： α₁-アンチトリプシン50μｇをフロイントの完全アジュ
バントと共にBalb／Ｃマウス（雌、６週齢）の腹腔内に
注射した。３週間後、さらにα₁-アンチトリプシン50μ
ｇをフロイントの不完全アジュバンドと共に腹腔内に注
射し、さらに２週間後α₁-アンチトリプシン30μｇをPB
Sに溶解し、静脈注射した、最終免疫の３日後脾臓細胞
を取り出し、常法に従い、マウスミエローマ細胞×63.
6.5.3と融合した。96穴プレート５枚に分配しHAT選択培
地にて培養した。融合の３週間後ハイブリドーマのコロ
ニーが生成したウェルにてついて、抗体の測定を以下の
方法にて行った。ニトロセルロースを4mm角の正方形に切断し、おのおの
にα₁-アンチトリプシン500μｇ／mlPBS溶液１μをス
ポットした。96穴マイクロタイタープレート１穴当り１
枚ずつ加え、１％BSA-PBS溶液にて４℃、１晩ブロッキ
ングした。PBSにて洗浄後、ハイブリドーマの培養上清4
0μを加え、室温にて２時間反多させた。0.05％Tween
-20-PBS溶液にて３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標
識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製;1
％BSA-PBS溶液にて1500倍希釈したもの）を40μ加
え、室温にて２時間反応させた。0.05％Tween-20-PBS溶
液にて３回洗浄後、発色用基質試液を加え、ニトロセル
ロース上に色素が生成したものを抗体活性陽性とした。
発色用基質試液として（１）：実施例１の（１）と同様（２）：実施例１の（３）と同様の２種類を用い比較した。測定した350穴のうち（１）の試液を用いた場合は15穴
しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなかったが
本発明の（２）の試液を用いた場合23穴に抗体活性陽性
ハイブリドーマが検出できた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象の特定成分を、パーオキシダーゼ
を標識として有している標識体を用い、パーオキシダー
ゼの酵素反応により生成した色素量によって測定する該
特定成分の測定方法において該酵素反応の基質として過
酸化水素、および、4-アルコキシ‐1-ナフトール、（た
だし、アルコキシ基は、エトキシ基、プロポキシ基、イ
ソプロポキシ基）を用いることを特徴とする該特定成分
の測定方法。