JPH067187A - 保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ - Google Patents
保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰInfo
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- JPH067187A JPH067187A JP4278583A JP27858392A JPH067187A JP H067187 A JPH067187 A JP H067187A JP 4278583 A JP4278583 A JP 4278583A JP 27858392 A JP27858392 A JP 27858392A JP H067187 A JPH067187 A JP H067187A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｃ末端がリジンである保護ペプチドと該リジ
ンを介して融合したα−ｈＡＮＰ 【効果】 α−ｈＡＮＰ生産の前駆体としてＣ末端がリ
ジンである保護ペプチドと該リジンを介して融合したα
−ｈＡＮＰを用いることによってα−ｈＡＮＰを効率よ
く生産することが出来る。
ンを介して融合したα−ｈＡＮＰ 【効果】 α−ｈＡＮＰ生産の前駆体としてＣ末端がリ
ジンである保護ペプチドと該リジンを介して融合したα
−ｈＡＮＰを用いることによってα−ｈＡＮＰを効率よ
く生産することが出来る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はα−ヒト心房由来ナト
リウム排泄性ポリペプチド（α−ｈｕｍａｎａｔｒｉａ
ｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ
ｅ、以下“α−ｈＡＮＰ”と略称する）の新規な融合蛋
白に関する。さらに詳細には、Ｃ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰお
よびその製造法に関するものである。
リウム排泄性ポリペプチド（α−ｈｕｍａｎａｔｒｉａ
ｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ
ｅ、以下“α−ｈＡＮＰ”と略称する）の新規な融合蛋
白に関する。さらに詳細には、Ｃ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰお
よびその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術およびこの発明が解決しようとする問題
点】α−ｈＡＮＰは、利尿作用、ナトリウム排泄増加作
用、および降圧作用を有する公知のポリペプチドであ
り、利尿降圧剤として有用であり、
点】α−ｈＡＮＰは、利尿作用、ナトリウム排泄増加作
用、および降圧作用を有する公知のポリペプチドであ
り、利尿降圧剤として有用であり、
【化１】 なる構造を有する（バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第１１８
巻、第１３１ページ（１９８４年）参照）。そして、こ
のα−ｈＡＮＰを収率よく製造する方法が望まれてい
た。
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第１１８
巻、第１３１ページ（１９８４年）参照）。そして、こ
のα−ｈＡＮＰを収率よく製造する方法が望まれてい
た。
【０００３】
【発明の構成および効果】この発明者等はＣ末端がリジ
ンである保護ペプチドと該リジンを介して融合したα−
ｈＡＮＰをコードする合成遺伝子を含有する発現ベクタ
ーを用いる組換えＤＮＡ技術によるα−ｈＡＮＰの製造
法を新たに創出した。この方法によると、α−ｈＡＮＰ
を高収率で得ることができる。この発明では、（１）Ｃ
末端がリジンである保護ペプチドと該リジンを介して融
合したα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列をコードする遺伝子
を含有する発現ベクターにより形質転換された微生物を
培地に培養し、（２）得られる培養物より該保護ペプチ
ド融合α−ｈＡＮＰを採取し、（３）該保護ペプチド融
合α−ｈＡＮＰの保護ペプチド部分をアクロモバクター
・プロテアーゼΙ（ＡＰΙ）の存在下に除去することに
よりα−ｈＡＮＰが製造される。
ンである保護ペプチドと該リジンを介して融合したα−
ｈＡＮＰをコードする合成遺伝子を含有する発現ベクタ
ーを用いる組換えＤＮＡ技術によるα−ｈＡＮＰの製造
法を新たに創出した。この方法によると、α−ｈＡＮＰ
を高収率で得ることができる。この発明では、（１）Ｃ
末端がリジンである保護ペプチドと該リジンを介して融
合したα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列をコードする遺伝子
を含有する発現ベクターにより形質転換された微生物を
培地に培養し、（２）得られる培養物より該保護ペプチ
ド融合α−ｈＡＮＰを採取し、（３）該保護ペプチド融
合α−ｈＡＮＰの保護ペプチド部分をアクロモバクター
・プロテアーゼΙ（ＡＰΙ）の存在下に除去することに
よりα−ｈＡＮＰが製造される。
【０００４】以下に、上記製造法における詳細をさらに
詳しく説明する。形質転換される微生物は宿主細胞のこ
とであり、細菌、真菌、ヒトおよび動物培養細胞および
植物培養細胞を挙げることができる。微生物の好ましい
例としては、細菌、特に例えば Ｅ． ｃｏｌｉＨＢ１
０１（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｅ． ｃｏｌｉ２９４
（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｅ． ｃｏｌｉχ１７７６
（ＡＴＣＣ３１５３７）等のエシェリヒア属に属する菌
株を挙げることができる。発現ベクターは、通常少くと
もプロモーター・オペレーター領域、開始コドン、合成
保護ペプチド遺伝子、合成α−ｈＡＮＰ遺伝子、終止コ
ドンおよび複製可能なユニットを有するＤＮＡより成
る。プロモーター・オペレーター領域は、プロモータ
ー、オペレーターおよび例えばＡＡＧＧ等のシャイン−
ダルガーノ（ＳＤ）配列を含有する。ＳＤ配列−開始コ
ドン間の距離は、好ましくは８〜１２塩基対（ｂ．
ｐ．）であり、後記実施例に示されるような最も好まし
い例においては、ＳＤ配列−開始コドン間の距離は１１
ｂ．ｐ．である。プロモーター・オペレーター領域の例
としては、合成プロモーター・オペレーター領域の他
に、例えばラクトース・オペロン、ＰＬ−プロモータ
ー、ｔｒｐ−プロモーター等の通常用いられるプロモー
ター・オペレーター領域を挙げることができる。プロモ
ーター・オペレーター領域の好ましい例は、この発明者
等が新らたに合成した合成ｔｒｐプロモーターＩ、Ｉ
Ｉ、およびＩＩＩがあり、そのＤＮＡ配列を各々図１、
図２および図３に示す。この発明の製造法においては、
各発現ベクター毎に１〜３連のプロモーター・オペレー
ター領域を使用してもよい。
詳しく説明する。形質転換される微生物は宿主細胞のこ
とであり、細菌、真菌、ヒトおよび動物培養細胞および
植物培養細胞を挙げることができる。微生物の好ましい
例としては、細菌、特に例えば Ｅ． ｃｏｌｉＨＢ１
０１（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｅ． ｃｏｌｉ２９４
（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｅ． ｃｏｌｉχ１７７６
（ＡＴＣＣ３１５３７）等のエシェリヒア属に属する菌
株を挙げることができる。発現ベクターは、通常少くと
もプロモーター・オペレーター領域、開始コドン、合成
保護ペプチド遺伝子、合成α−ｈＡＮＰ遺伝子、終止コ
ドンおよび複製可能なユニットを有するＤＮＡより成
る。プロモーター・オペレーター領域は、プロモータ
ー、オペレーターおよび例えばＡＡＧＧ等のシャイン−
ダルガーノ（ＳＤ）配列を含有する。ＳＤ配列−開始コ
ドン間の距離は、好ましくは８〜１２塩基対（ｂ．
ｐ．）であり、後記実施例に示されるような最も好まし
い例においては、ＳＤ配列−開始コドン間の距離は１１
ｂ．ｐ．である。プロモーター・オペレーター領域の例
としては、合成プロモーター・オペレーター領域の他
に、例えばラクトース・オペロン、ＰＬ−プロモータ
ー、ｔｒｐ−プロモーター等の通常用いられるプロモー
ター・オペレーター領域を挙げることができる。プロモ
ーター・オペレーター領域の好ましい例は、この発明者
等が新らたに合成した合成ｔｒｐプロモーターＩ、Ｉ
Ｉ、およびＩＩＩがあり、そのＤＮＡ配列を各々図１、
図２および図３に示す。この発明の製造法においては、
各発現ベクター毎に１〜３連のプロモーター・オペレー
ター領域を使用してもよい。
【０００５】好ましい開始コドンとしてはメチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）を挙げることができる。保護ペプチド遺
伝子としては、α−ｈＡＮＰとの融合蛋白を形成するこ
とができ、且つ宿主細胞または培養物中の融合蛋白の望
ましくない分解を抑制するペプチドまたは蛋白のアミノ
酸配列に対応するＤＮＡ配列を有する遺伝子が挙げられ
る。その好ましい例は「ＬＨ蛋白遺伝子」に連結された
「ペプチドＣｄ遺伝子」（以下、「ＬＨ蛋白遺伝子を連
結したペプチドＣｄ遺伝子」を「ペプチドＣＬａ遺伝
子」と呼ぶ）であり、そのＤＮＡ配列を図４に示す。α
−ｈＡＮＰ遺伝子のＤＮＡ配列は、α−ｈＡＮＰのアミ
ノ酸配列から、多数の項目の非自明な基準に従ってデザ
インされる。α−ｈＡＮＰ遺伝子の好ましいＤＮＡ配列
の例を図５に示す。後記実施例においては、α−ｈＡＮ
Ｐ遺伝子と保護ペプチド遺伝子との間に、アミノ酸リジ
ンをコードするＤＮＡ配列を挿入した。
ドン（ＡＴＧ）を挙げることができる。保護ペプチド遺
伝子としては、α−ｈＡＮＰとの融合蛋白を形成するこ
とができ、且つ宿主細胞または培養物中の融合蛋白の望
ましくない分解を抑制するペプチドまたは蛋白のアミノ
酸配列に対応するＤＮＡ配列を有する遺伝子が挙げられ
る。その好ましい例は「ＬＨ蛋白遺伝子」に連結された
「ペプチドＣｄ遺伝子」（以下、「ＬＨ蛋白遺伝子を連
結したペプチドＣｄ遺伝子」を「ペプチドＣＬａ遺伝
子」と呼ぶ）であり、そのＤＮＡ配列を図４に示す。α
−ｈＡＮＰ遺伝子のＤＮＡ配列は、α−ｈＡＮＰのアミ
ノ酸配列から、多数の項目の非自明な基準に従ってデザ
インされる。α−ｈＡＮＰ遺伝子の好ましいＤＮＡ配列
の例を図５に示す。後記実施例においては、α−ｈＡＮ
Ｐ遺伝子と保護ペプチド遺伝子との間に、アミノ酸リジ
ンをコードするＤＮＡ配列を挿入した。
【０００６】このようにすると、融合蛋白の接合部をア
クロモバクター・プロテアーゼＩで切断することができ
る。終止コドンとしては、例えばＴＡＧ、ＴＧＡ等の通
常に用いられる終止コドンを挙げることができる。複製
可能なユニットとは、宿主細胞中で、それに属するＤＮ
Ａ配列全体を複製することができるＤＮＡ配列のことで
あり、天然プラスミド、例えば天然プラスミドより調製
したＤＮＡ断片等の人工修飾プラスミドおよび合成プラ
スミドを挙げることができる。さらにプラスミドの好ま
しい例としては、プラスミドｐＢＲ３２２またはその人
工修飾体（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得
られるＤＮＡ断片)を挙げることができる。複製可能な
ユニットは天然または合成ターミネーター(例えば合成
ｆｄファージ・ターミネーター等)を包含してもよい。
プロモーター・オペレーター領域、開始コドン、Ｃ末端
がリジンである保護ペプチド遺伝子、α−ｈＡＮＰ遺伝
子、終止コドン、ターミネーター等を合成する場合に
は、その合成法はポリヌクレオチドの製造に通常用いら
れる公知の方法で行うことができる。
クロモバクター・プロテアーゼＩで切断することができ
る。終止コドンとしては、例えばＴＡＧ、ＴＧＡ等の通
常に用いられる終止コドンを挙げることができる。複製
可能なユニットとは、宿主細胞中で、それに属するＤＮ
Ａ配列全体を複製することができるＤＮＡ配列のことで
あり、天然プラスミド、例えば天然プラスミドより調製
したＤＮＡ断片等の人工修飾プラスミドおよび合成プラ
スミドを挙げることができる。さらにプラスミドの好ま
しい例としては、プラスミドｐＢＲ３２２またはその人
工修飾体（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得
られるＤＮＡ断片)を挙げることができる。複製可能な
ユニットは天然または合成ターミネーター(例えば合成
ｆｄファージ・ターミネーター等)を包含してもよい。
プロモーター・オペレーター領域、開始コドン、Ｃ末端
がリジンである保護ペプチド遺伝子、α−ｈＡＮＰ遺伝
子、終止コドン、ターミネーター等を合成する場合に
は、その合成法はポリヌクレオチドの製造に通常用いら
れる公知の方法で行うことができる。
【０００７】プロモーター・オペレーター遺伝子、開始
コドン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、α
−ｈＡＮＰ遺伝子および終止コドンは、所望であれば適
当なＤＮＡ断片（例えばリンカー、その他の制限酵素作
用部位等）を用いて、常法（例えば制限酵素による消
化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるホスホリル
化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等）に
より、適当な複製可能なユニット（プラスミド）と連続
且つ環状に連結して、発現ベクターを得ることができ
る。発現ベクターは常法により微生物（宿主細胞）に挿
入することができる。挿入は、例えば形質転換、マイク
ロ・インジェクション等の常法によって行えば、形質転
換体を得ることができる。
コドン、Ｃ末端がリジンである保護ペプチド遺伝子、α
−ｈＡＮＰ遺伝子および終止コドンは、所望であれば適
当なＤＮＡ断片（例えばリンカー、その他の制限酵素作
用部位等）を用いて、常法（例えば制限酵素による消
化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるホスホリル
化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等）に
より、適当な複製可能なユニット（プラスミド）と連続
且つ環状に連結して、発現ベクターを得ることができ
る。発現ベクターは常法により微生物（宿主細胞）に挿
入することができる。挿入は、例えば形質転換、マイク
ロ・インジェクション等の常法によって行えば、形質転
換体を得ることができる。
【０００８】この発明の製法においてα−ｈＡＮＰを製
造するには、このようにして得た発現ベクターを含有す
る形質転換体を培地に培養することにより行なわれる。
培地としては、形質転換体が増殖するものであればよく
例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルク
トース、ラクトース等の炭素源および例えば硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵
母エキス、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフエ
キス等の窒素源を含有するのが通例であり、所望によ
り、例えばリン酸二水素ナトリウムまたはカリウム、リ
ン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム等の無機塩、例えばビタミンＢ1
等のビタミン、例えばアンピシリン等の抗生物質等の他
の成分も培地に加えてよい。形質転換体の培養は、通
常、ｐＨ５．５〜８．５（好ましくはｐＨ７〜７．
５）、１８〜４０℃（好ましくは２５〜３８℃）で５〜
５０時間行われる。
造するには、このようにして得た発現ベクターを含有す
る形質転換体を培地に培養することにより行なわれる。
培地としては、形質転換体が増殖するものであればよく
例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルク
トース、ラクトース等の炭素源および例えば硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵
母エキス、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフエ
キス等の窒素源を含有するのが通例であり、所望によ
り、例えばリン酸二水素ナトリウムまたはカリウム、リ
ン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム等の無機塩、例えばビタミンＢ1
等のビタミン、例えばアンピシリン等の抗生物質等の他
の成分も培地に加えてよい。形質転換体の培養は、通
常、ｐＨ５．５〜８．５（好ましくはｐＨ７〜７．
５）、１８〜４０℃（好ましくは２５〜３８℃）で５〜
５０時間行われる。
【０００９】このように製造されたＣ末端がリジンであ
る保護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮ
Ｐは通常培養された形質転換体の細胞中に存在するの
で、細胞を濾過あるいは遠心分離によって集め、その細
胞壁および／または細胞膜を常法（例えば超音波および
／またはリゾチームによる処理等）により破壊し、破壊
細胞を得る。この破壊物より、天然または合成蛋白の精
製および単離に通常用いられる常法（例えば８Ｍ尿素水
溶液、６Ｍグアニジン等の適当な溶媒による蛋白の溶
解、透析、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー等）でＣ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰを
精製および単離することができる。α−ｈＡＮＰは、こ
のようにして得られた保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ
を、アクロモバクター・プロテアーゼＩ（ＡＰＩ）によ
る処理により切断して調製することができる。ＡＰＩは
既知の酵素である［ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・
アクタ、６６０、５１（１９８１）］が、組換えＤＮＡ
技術により調製された融合蛋白をＡＰＩ処理により好ま
しく切断することができることは知られていない。この
方法は保護ペプチドとその分子内にリジンを有しない目
的ペプチドとの間にリジンを有するペプチドよりなる融
合蛋白の切断に好適に用いることができる。
る保護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮ
Ｐは通常培養された形質転換体の細胞中に存在するの
で、細胞を濾過あるいは遠心分離によって集め、その細
胞壁および／または細胞膜を常法（例えば超音波および
／またはリゾチームによる処理等）により破壊し、破壊
細胞を得る。この破壊物より、天然または合成蛋白の精
製および単離に通常用いられる常法（例えば８Ｍ尿素水
溶液、６Ｍグアニジン等の適当な溶媒による蛋白の溶
解、透析、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー等）でＣ末端がリジンである保
護ペプチドと該リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰを
精製および単離することができる。α−ｈＡＮＰは、こ
のようにして得られた保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ
を、アクロモバクター・プロテアーゼＩ（ＡＰＩ）によ
る処理により切断して調製することができる。ＡＰＩは
既知の酵素である［ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・
アクタ、６６０、５１（１９８１）］が、組換えＤＮＡ
技術により調製された融合蛋白をＡＰＩ処理により好ま
しく切断することができることは知られていない。この
方法は保護ペプチドとその分子内にリジンを有しない目
的ペプチドとの間にリジンを有するペプチドよりなる融
合蛋白の切断に好適に用いることができる。
【００１０】融合蛋白の切断は、ｐＨ５〜１０、２０〜
４０℃（好ましくは３５〜４０℃）で、例えば緩衝液、
尿素水溶液等の水溶液中で２〜１５時間行えばよい。後
記実施例において、融合蛋白は、先ず８Ｍ尿素を含有す
るｐＨ５の緩衝液中、次いで４Ｍ尿素を含有するｐＨ９
の緩衝液中でＡＰＩにより処理される。この条件下では
融合蛋白はリジン部位において切断され、産生したα−
ｈＡＮＰは自然に再構成される。このように産生された
α−ｈＡＮＰは、得られた培養物より、上記の常法で精
製、単離される。
４０℃（好ましくは３５〜４０℃）で、例えば緩衝液、
尿素水溶液等の水溶液中で２〜１５時間行えばよい。後
記実施例において、融合蛋白は、先ず８Ｍ尿素を含有す
るｐＨ５の緩衝液中、次いで４Ｍ尿素を含有するｐＨ９
の緩衝液中でＡＰＩにより処理される。この条件下では
融合蛋白はリジン部位において切断され、産生したα−
ｈＡＮＰは自然に再構成される。このように産生された
α−ｈＡＮＰは、得られた培養物より、上記の常法で精
製、単離される。
【００１１】以下に、この明細書に添付した図について
説明する。図中の若干のものにおいては、オリゴヌクレ
オチドは
説明する。図中の若干のものにおいては、オリゴヌクレ
オチドは
【化２】 の記号（記号中、・はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼに
よりホスホリル化された５′−末端を意味する）で示さ
れ、ブロックされたオリゴヌクレオチドは
よりホスホリル化された５′−末端を意味する）で示さ
れ、ブロックされたオリゴヌクレオチドは
【化３】 の記号（記号中、△はライゲートされた位置を意味す
る）で示される。
る）で示される。
【００１２】特に断わり書きのない限り、この明細書に
おいてＤＮＡ配列のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式：
おいてＤＮＡ配列のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式：
【化４】 を意味し、５’−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式：
【００１３】
【化５】 を意味し、３’−末端Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは各々式：
【００１４】
【化６】 を意味する。以下の実施例において、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃ
ｐ、Ｔｐは各々式：
ｐ、Ｔｐは各々式：
【００１５】
【化７】 を意味し、３’−末端ＡＯＨ、ＧＯＨ、ＣＯＨ、ＴＯＨ
は各々式：
は各々式：
【００１６】
【化８】 を意味し、５’末端ＨＯＡｐ、ＨＯＧｐ、ＨＯＣｐ、Ｈ
ＯＴｐは各々式：
ＯＴｐは各々式：
【００１７】
【化９】 を意味し、ＡBzｐｏ、ＧiBｐｏ、ＣBzｐｏ、Ｔｐｏ、Ｔ
Ｏは各々式：
Ｏは各々式：
【００１８】
【化１０】 を意味する。ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｃ
Ｅはシアノエチルである。オリゴヌクレオチドのモノ
（またはジまたはトリ）マーは、常法例えば広瀬らの方
法［蛋白質・核酸・酵素２５， ２２５（１９８０）］
により調製することができ、カップリングは、例えばセ
ルロースまたはポリスチレン・ポリマー上でホスホトリ
エステル法［ニュークレイック・アシッド・リサーチ、
９，１６９１（１９８１）、ニュークレイック・アシッ
ド・リサーチ、１０， １７５５（１９８２）］により
行うことができる。
Ｅはシアノエチルである。オリゴヌクレオチドのモノ
（またはジまたはトリ）マーは、常法例えば広瀬らの方
法［蛋白質・核酸・酵素２５， ２２５（１９８０）］
により調製することができ、カップリングは、例えばセ
ルロースまたはポリスチレン・ポリマー上でホスホトリ
エステル法［ニュークレイック・アシッド・リサーチ、
９，１６９１（１９８１）、ニュークレイック・アシッ
ド・リサーチ、１０， １７５５（１９８２）］により
行うことができる。
【００１９】以下の実施例はこの発明を説明するための
ものでありこれにより制限されるものではない。実施例
において、使用した酵素（例えば制限酵素）は市販品で
入手可能なものであり、酵素の使用条件は当業者にとっ
ては、例えば市販の酵素に添付の用法を参照すれば、自
明のことである。さらに、実施例において「ポリスチレ
ンポリマー」とはアミノメチル化ポリスチレン・ＨＣ
ｌ、ジビニルベンゼン含量１％、１００〜２００メッシ
ュ（販売元ペプチド・インスティテュート・インク）を
意味する。
ものでありこれにより制限されるものではない。実施例
において、使用した酵素（例えば制限酵素）は市販品で
入手可能なものであり、酵素の使用条件は当業者にとっ
ては、例えば市販の酵素に添付の用法を参照すれば、自
明のことである。さらに、実施例において「ポリスチレ
ンポリマー」とはアミノメチル化ポリスチレン・ＨＣ
ｌ、ジビニルベンゼン含量１％、１００〜２００メッシ
ュ（販売元ペプチド・インスティテュート・インク）を
意味する。
【００２０】実施例１ ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＡＨ７）の合成： （１）ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマーの合成ｉ）ＨＯＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマーの調製： 反応用シリンジ中のＤＭＴｒＯ−ＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマー（５１．８ｍｇ、１０．３７μモル）
［ニュークレイック・アシッド・リサーチ１０，１７５
５（１９８２）に記載の方法により調製］に、ジクロロ
メタン（２ｍｌ）中の５％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）溶液
を加える。１分間放置した後、混合物を窒素気流でガラ
スフィルターを通し濾過する。ＤＣＡ処理を２回以上繰
り返す。ポリマーをジクロロメタン（２ｍｌ×３）、メ
タノール（２ｍｌ×３）およびピリジン（２ｍｌ×３）
で順次洗浄し、窒素気流で乾燥して、ポリマー付加物Ｉ
を得る。
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＡＨ７）の合成： （１）ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマーの合成ｉ）ＨＯＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマーの調製： 反応用シリンジ中のＤＭＴｒＯ−ＴＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマー（５１．８ｍｇ、１０．３７μモル）
［ニュークレイック・アシッド・リサーチ１０，１７５
５（１９８２）に記載の方法により調製］に、ジクロロ
メタン（２ｍｌ）中の５％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）溶液
を加える。１分間放置した後、混合物を窒素気流でガラ
スフィルターを通し濾過する。ＤＣＡ処理を２回以上繰
り返す。ポリマーをジクロロメタン（２ｍｌ×３）、メ
タノール（２ｍｌ×３）およびピリジン（２ｍｌ×３）
で順次洗浄し、窒素気流で乾燥して、ポリマー付加物Ｉ
を得る。
【００２１】ii）ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−の調製： 蛋白質・核酸・酵素2５，２５５（１９８０）に記載の
方法で調製したＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−ＣＥ（３
２．４ｍｇ、８．１２μモル）を、室温で30分間トリエ
チルアミン−アセトニトリル混液（１：１ｖ／ｖ、５ｍ
ｌ）で処理する。このようにして得たホスホジエステル
ダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−）を乾燥し、水
はピリジンとの共沸混合物（２ｍｌ×２）として分離す
る。 iii）カップリング： ダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−）とメシチレン
スルホニルニトロチアゾリド（ＭＳＮＴ）（８０ｍｇ）
をピリジン（０．５ｍｌ）に溶解する。溶液をポリマー
付加物Ｉとともに反応用シリンジに加え混合物を室温で
１時間振盪する。反応混合物を窒素気流でガラスフィル
ターを通して濾過し、ピリジン（２ｍｌ×３）で洗浄
し、ポリマー付加物ＩＩを得る。 iv）反応していない５′−ヒドロキシ基のアセチル化： 上記で得られたポリマー付加物ＩＩに、ピリジン（０．
９ｍｌ）および無水酢酸（０．１ｍｌ）を加え、混合物
を１５分間振盪する。反応液をガラスフィルターを通し
て濾過し、得られたポリマーをピリジン（２ｍｌ×
３）、メタノール（２ｍｌ×３）およびジクロロメタン
（２ｍｌ×３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥する。こ
のポリマー付加物（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−ス
クシニルポリスチレンポリマー)は次のカップリング工
程に使用した。
方法で調製したＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−ＣＥ（３
２．４ｍｇ、８．１２μモル）を、室温で30分間トリエ
チルアミン−アセトニトリル混液（１：１ｖ／ｖ、５ｍ
ｌ）で処理する。このようにして得たホスホジエステル
ダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−）を乾燥し、水
はピリジンとの共沸混合物（２ｍｌ×２）として分離す
る。 iii）カップリング： ダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏ−）とメシチレン
スルホニルニトロチアゾリド（ＭＳＮＴ）（８０ｍｇ）
をピリジン（０．５ｍｌ）に溶解する。溶液をポリマー
付加物Ｉとともに反応用シリンジに加え混合物を室温で
１時間振盪する。反応混合物を窒素気流でガラスフィル
ターを通して濾過し、ピリジン（２ｍｌ×３）で洗浄
し、ポリマー付加物ＩＩを得る。 iv）反応していない５′−ヒドロキシ基のアセチル化： 上記で得られたポリマー付加物ＩＩに、ピリジン（０．
９ｍｌ）および無水酢酸（０．１ｍｌ）を加え、混合物
を１５分間振盪する。反応液をガラスフィルターを通し
て濾過し、得られたポリマーをピリジン（２ｍｌ×
３）、メタノール（２ｍｌ×３）およびジクロロメタン
（２ｍｌ×３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥する。こ
のポリマー付加物（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−ス
クシニルポリスチレンポリマー)は次のカップリング工
程に使用した。
【００２２】（２）ＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏ
ＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマー
の合成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＴｐｏ
ＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーとＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＣＥ（４４．９ｍｇ）よ
りＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴ
Ｏ−スクシニルポリスチレンポリマーを合成する。 （３）ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBz
ｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチ
レンポリマーの合成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−ス
クシニルポリスチレンポリマーとＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＣＥ（４８．５ｍｇ）より、ＤＭＴｒＯ
ＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーを合
成する。
ＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマー
の合成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＴｐｏ
ＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーとＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＣＥ（４４．９ｍｇ）よ
りＤＭＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴ
Ｏ−スクシニルポリスチレンポリマーを合成する。 （３）ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBz
ｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチ
レンポリマーの合成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−ス
クシニルポリスチレンポリマーとＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＣＥ（４８．５ｍｇ）より、ＤＭＴｒＯ
ＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーを合
成する。
【００２３】（４）ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏ
ＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーの合
成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏ
ＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーとＤＭＴｒＯＣ
BzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＣＥ（４５．１ｍｇ）より、ＤＭ
ＴｒＯＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐ
ｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシ
ニルポリスチレンポリマーを合成する。 （５）ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＧiB
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣ
BzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリマーの合
成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＧ
iBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏ
ＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレン
ポリマーとＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣＥ（４
５．１ｍｇ）より、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏ
ＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡ BzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポ
リスチレンポリマー（６０ｍｇ）を合成する。この最終
工程で、反応していない５′−ヒドロキシ基は、アセチ
ル基で保護する必要はない。
ＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーの合
成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＡBzｐｏＧ
iBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏ
ＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーとＤＭＴｒＯＣ
BzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＣＥ（４５．１ｍｇ）より、ＤＭ
ＴｒＯＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐ
ｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシ
ニルポリスチレンポリマーを合成する。 （５）ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＧiB
ｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣ
BzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリマーの合
成：上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＧ
iBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏ
ＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレン
ポリマーとＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣＥ（４
５．１ｍｇ）より、ＤＭＴｒＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏ
ＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBzｐｏＧiBｐｏＡ BzｐｏＴｐ
ｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＴＯ−スクシニルポ
リスチレンポリマー（６０ｍｇ）を合成する。この最終
工程で、反応していない５′−ヒドロキシ基は、アセチ
ル基で保護する必要はない。
【００２４】（６）ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの合成：ＤＭＴｒ
ＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣ
BzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマー（６０ｍ
ｇ）を、封管中、３７℃で、１Ｍ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチレングアニジウム・ピリジン−２−アルド
キシメート［ジオキサン−水（１：１ｖ／ｖ、１ｍｌ）
中］で２０時間処理する。反応混合物に２８％（ｗ／
ｗ）アンモニア水（１２ｍｌ）を加え、混合物を６０℃
で５時間加熱する。固体ポリマーを濾別し、水（１０ｍ
ｌ）で洗浄する。濾液と洗液を蒸発乾固し、残渣を室温
で８０％酢酸水溶液（２５ｍｌ）で１５分間処理する。
溶媒を除去した後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアン
モニウム緩衝液（ｐＨ７．５、２５ｍｌ）に溶解し、ジ
エチルエーテル（３×２５ｍｌ）で洗浄する。水層を蒸
発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム
緩衝液（ｐＨ７．５、２ｍｌ）に溶解すると、溶液中に
粗ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＣｐＴｐＣｐＴＯＨが得られる。
ＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの合成：ＤＭＴｒ
ＯＣBzｐｏＴｐｏＧiBｐｏＣBzｐｏＧiBｐｏＴｐｏＡBz
ｐｏＧiBｐｏＡBzｐｏＴｐｏＣBzｐｏＣBzｐｏＴｐｏＣ
BzｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマー（６０ｍ
ｇ）を、封管中、３７℃で、１Ｍ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチレングアニジウム・ピリジン−２−アルド
キシメート［ジオキサン−水（１：１ｖ／ｖ、１ｍｌ）
中］で２０時間処理する。反応混合物に２８％（ｗ／
ｗ）アンモニア水（１２ｍｌ）を加え、混合物を６０℃
で５時間加熱する。固体ポリマーを濾別し、水（１０ｍ
ｌ）で洗浄する。濾液と洗液を蒸発乾固し、残渣を室温
で８０％酢酸水溶液（２５ｍｌ）で１５分間処理する。
溶媒を除去した後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアン
モニウム緩衝液（ｐＨ７．５、２５ｍｌ）に溶解し、ジ
エチルエーテル（３×２５ｍｌ）で洗浄する。水層を蒸
発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム
緩衝液（ｐＨ７．５、２ｍｌ）に溶解すると、溶液中に
粗ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＣｐＴｐＣｐＴＯＨが得られる。
【００２５】（７）ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの精製 ｉ）粗生成物の最初の精製はバイオゲルＰ２（バイオラ
ッド）（２４×２．６ｃｍＩＤ）カラムクロマトグラフ
ィにより行う。最初の溶出ピークに相当する画分（０．
１ｍＭＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸アンモニウム、
流速：１ｍｌ／分）を集め、凍結乾燥して最初の精製物
を得る。 ii）最初の精製物の２回目の精製はＣＤＲ−１０（三菱
化成）（２５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ）を用いた高速液体
クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により１Ｍ酢酸アンモニ
ウム−１０％（ｖ／ｖ）含水エタノールから４．５Ｍ酢
酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）含水エタノールまで
の直線勾配（８０分間、流速：１ｍｌ／分、６０℃）を
用いて行い、２回目の精製物を得る。 iii）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬＣ
［Ｒｐ−１８−５μ（×７７）（メルク）、１５ｃｍ×
４ｍｍＩＤ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから
０．１Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（ｖ／ｖ）アセトニ
トリル水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｌ／
分、室温）を用いて行い、最終精製物を得る。（ＨＯＣ
ｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＣｐＴＯＨ）
ＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの精製 ｉ）粗生成物の最初の精製はバイオゲルＰ２（バイオラ
ッド）（２４×２．６ｃｍＩＤ）カラムクロマトグラフ
ィにより行う。最初の溶出ピークに相当する画分（０．
１ｍＭＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ酢酸アンモニウム、
流速：１ｍｌ／分）を集め、凍結乾燥して最初の精製物
を得る。 ii）最初の精製物の２回目の精製はＣＤＲ−１０（三菱
化成）（２５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ）を用いた高速液体
クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により１Ｍ酢酸アンモニ
ウム−１０％（ｖ／ｖ）含水エタノールから４．５Ｍ酢
酸アンモニウム−１０％（ｖ／ｖ）含水エタノールまで
の直線勾配（８０分間、流速：１ｍｌ／分、６０℃）を
用いて行い、２回目の精製物を得る。 iii）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬＣ
［Ｒｐ−１８−５μ（×７７）（メルク）、１５ｃｍ×
４ｍｍＩＤ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから
０．１Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（ｖ／ｖ）アセトニ
トリル水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｌ／
分、室温）を用いて行い、最終精製物を得る。（ＨＯＣ
ｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＣｐＴＯＨ）
【００２６】（８）オリゴヌクレオチド（ＨＯＣｐＴｐ
ＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴ
ＯＨ）の分析 ｉ）ホスホジエステラーゼによる消化 ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（１０μｇ、５．１μｌ）、０．２Ｍ
ＭｇＣｌ2（２０μｌ）、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．５）（２０μｌ）および０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（１４４．９μｌ）の混合物をホスホジエステラー
ゼ（１０単位、１０μｌ）で３７℃で２０分間処理し、
次いで１００℃で２時間加熱する。 ii）ＨＰＬＣ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ［ＣＤＲ
−１０（三菱化成）、２５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ］によ
り水〜２．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）の直線
勾配（４０分間、流速：１．５ｍｌ／分、６０℃）を用
いて分析する。標準品の面積と比較することにより、各
ピーク面積からそのヌクレオチド組成を決定する。 計算値：pCOH 4.000, pAOH 2.000, pTOH 5.000,pGOH 3.
000 実測値：pCOH 3.770, pAOH 2.026, pTOH 5.237,pGOH 2.
968
ＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴ
ＯＨ）の分析 ｉ）ホスホジエステラーゼによる消化 ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（１０μｇ、５．１μｌ）、０．２Ｍ
ＭｇＣｌ2（２０μｌ）、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．５）（２０μｌ）および０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（１４４．９μｌ）の混合物をホスホジエステラー
ゼ（１０単位、１０μｌ）で３７℃で２０分間処理し、
次いで１００℃で２時間加熱する。 ii）ＨＰＬＣ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ［ＣＤＲ
−１０（三菱化成）、２５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ］によ
り水〜２．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）の直線
勾配（４０分間、流速：１．５ｍｌ／分、６０℃）を用
いて分析する。標準品の面積と比較することにより、各
ピーク面積からそのヌクレオチド組成を決定する。 計算値：pCOH 4.000, pAOH 2.000, pTOH 5.000,pGOH 3.
000 実測値：pCOH 3.770, pAOH 2.026, pTOH 5.237,pGOH 2.
968
【００２７】実施例２ オリゴヌクレオチドの合成：下記オリゴヌクレオチドを
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＡＨ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ＡＨ２） （３） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＧｐＧｐＧｐＣＯＨ（ＡＨ３） （４） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣ
ｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＧＯＨ（ＡＨ４） （５） ＨＯＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＡＨ５） （６） ＨＯＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＧｐＣＯＨ（ＡＨ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＴｐＡＯＨ（ＡＨ８） （８） ＨＯＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴＯＨ（ＡＨ９） （９） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（ＡＨ１０） （１０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴＯＨ（ＡＨ１１） （１１） ＨＯＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＧｐＧＯＨ（ＡＨ１２） （１２） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（ＡＨ１３） （１３） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＧｐＡｐＣＯＨ（ＡＨ１４） （１４） ＨＯＧｐＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＡＨ１５） （１５） ＨＯＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡＯＨ（ＡＨ１６） （１６） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（ＡＨ１７） （１７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＧＯＨ（ＡＨ１８）
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴ
ｐＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＡＨ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ＡＨ２） （３） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＧｐＧｐＧｐＣＯＨ（ＡＨ３） （４） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣ
ｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＧＯＨ（ＡＨ４） （５） ＨＯＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＡＨ５） （６） ＨＯＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＧｐＣＯＨ（ＡＨ６） （７） ＨＯＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＴｐＡＯＨ（ＡＨ８） （８） ＨＯＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧ
ｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴＯＨ（ＡＨ９） （９） ＨＯＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（ＡＨ１０） （１０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴＯＨ（ＡＨ１１） （１１） ＨＯＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＧｐＧＯＨ（ＡＨ１２） （１２） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（ＡＨ１３） （１３） ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＧｐＡｐＣＯＨ（ＡＨ１４） （１４） ＨＯＧｐＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＡＨ１５） （１５） ＨＯＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡＯＨ（ＡＨ１６） （１６） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（ＡＨ１７） （１７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＧＯＨ（ＡＨ１８）
【００２８】実施例３ オリゴヌクレオチドの合成：下記オリゴヌクレオチドを
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ（Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴＯＨ（Ｍ’） （１４） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ
（Ｎ’） （１５） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ） （１６） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｎ） （１７） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡ） （１８） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ） （１９） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ） （２０） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＳＤ） （２１） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ） （２２） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ） （２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧ） （２４） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ） （２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ） （３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ） （４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ） （５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｅ） （６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ） （７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ） （８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈ） （９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ） （１０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ（Ｊ） （１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋ） （１２） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ） （１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴＯＨ（Ｍ’） （１４） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ
（Ｎ’） （１５） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ） （１６） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｎ） （１７） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡ） （１８） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ） （１９） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ） （２０） ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＳＤ） （２１） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ） （２２） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ） （２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧ） （２４） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐ
ＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）
【００２９】実施例４ オリゴヌクレオチドの合成：下記オリゴヌクレオチドを
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧ
ｐＣＯＨ（Ｎｐ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（Ｎｐ４） （３） ＨＯＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｎｐ２） （４） ＨＯＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｎｐ５） （５） ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｎｐ３） （６） ＨＯＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｎｐ６） （７） ＨＯＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃｄ１） （８） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧ
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｃｄ２） （９） ＨＯＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ３） （１０） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２） （１１） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈ１） （１２） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｈ２） （１３） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（Ｉ１） （１４） ＨＯＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＣｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ４） （１５） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧＯＨ（Ｃｄ５） （１６） ＨＯＡｐＣｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＡｐＣＯＨ（Ｃｄ６） （１７） ＨＯＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＧｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ７） （１８） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｃｄ８）
実施例１に記載の方法と同様にして製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧ
ｐＣＯＨ（Ｎｐ１） （２） ＨＯＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（Ｎｐ４） （３） ＨＯＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｎｐ２） （４） ＨＯＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧＯＨ（Ｎｐ５） （５） ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｎｐ３） （６） ＨＯＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｎｐ６） （７） ＨＯＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡ
ｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃｄ１） （８） ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧ
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｃｄ２） （９） ＨＯＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ３） （１０） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２） （１１） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈ１） （１２） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｈ２） （１３） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（Ｉ１） （１４） ＨＯＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＣｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ４） （１５） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐ
ＡｐＣｐＧＯＨ（Ｃｄ５） （１６） ＨＯＡｐＣｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＡｐＣＯＨ（Ｃｄ６） （１７） ＨＯＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＧｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ７） （１８） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｃｄ８）
【００３０】実施例５ 合成ｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子の構築およびクローニ
ング（図６、図７に示す）：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺
伝子を実施例７に記載の方法と同様の方法（図６に示
す）で構築する。合成遺伝子はｐＢＲ３２２（宝酒造、
ＮＥＢ等より市販品として入手できる）のＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、続いてＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）をライゲーシヨン生
成物で形質転換する。RＡｍｐでかつSＴｅｔの形質転換
体から得たプラスミドをＨｐａＩで消化してポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でバンド（４．１ｋ
ｂｐ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
で９０ｂ．ｐ．のバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ消化による５６ｂ．ｐ．の断片はＰＡＧ
Ｅでサイズマーカーと比較することにより確認した。こ
のプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクター
の構築に使用した。
ング（図６、図７に示す）：ｔｒｐプロモーターＩＩ遺
伝子を実施例７に記載の方法と同様の方法（図６に示
す）で構築する。合成遺伝子はｐＢＲ３２２（宝酒造、
ＮＥＢ等より市販品として入手できる）のＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、続いてＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）をライゲーシヨン生
成物で形質転換する。RＡｍｐでかつSＴｅｔの形質転換
体から得たプラスミドをＨｐａＩで消化してポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でバンド（４．１ｋ
ｂｐ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
で９０ｂ．ｐ．のバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ消化による５６ｂ．ｐ．の断片はＰＡＧ
Ｅでサイズマーカーと比較することにより確認した。こ
のプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクター
の構築に使用した。
【００３１】実施例６ ｔｒｐプロモーターベクター（ｐＢＲ３２２ｔｒｐ）の
構築およびクローニング（図８に示す）：プラスミドｐ
ＢＲ３２２（９μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制
限エンドヌクレアーゼで消化する。６５℃で５分間加熱
して反応を停止させ、０．８％アガロースゲル電気泳動
により断片を分離し、３７５ｂ．ｐ．の小さい断片（５
００ｎｇ）を得る。一方、プラスミドｐＴｒｐＥＢ７
（１０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
続いて調製ゲル電気泳動を行い、４０９４ｂ．ｐ．の大
きな断片（５μｇ）を得る。ｐＴｒｐＥＢ７のＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（４０９４ｂ．ｐ．、２００μｇ）
を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（３７
５ｂ．ｐ．、１００ｎｇ）と、Ｔ４リガーゼ（宝酒造、
３６０単位）を含有するライゲーションバッファー［５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍ
Ｍスペルミジン、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ］（２０μｌ）
中、１５℃で、一晩、ライゲートする。このライゲーシ
ョン混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１をＫｕｓｈｉｎｅ
ｒの方法［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、モルキュラー・ク
ローニング、ｐ２５２（１９８２）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー］により形質転換し、テ
トラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するプレート
上にテトラサイクリンに耐性の形質転換体を得る。形質
転換体より単離されたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐを
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（３７５ｂ．ｐ．、４０９４
ｂ．ｐ．）およびＨｐａＩ（４４６９ｂ．ｐ．）で消化
し、７．５％ＰＡＧＥおよび０．８％アガロースゲル電
気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子を確認した。
構築およびクローニング（図８に示す）：プラスミドｐ
ＢＲ３２２（９μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制
限エンドヌクレアーゼで消化する。６５℃で５分間加熱
して反応を停止させ、０．８％アガロースゲル電気泳動
により断片を分離し、３７５ｂ．ｐ．の小さい断片（５
００ｎｇ）を得る。一方、プラスミドｐＴｒｐＥＢ７
（１０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
続いて調製ゲル電気泳動を行い、４０９４ｂ．ｐ．の大
きな断片（５μｇ）を得る。ｐＴｒｐＥＢ７のＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（４０９４ｂ．ｐ．、２００μｇ）
を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（３７
５ｂ．ｐ．、１００ｎｇ）と、Ｔ４リガーゼ（宝酒造、
３６０単位）を含有するライゲーションバッファー［５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍ
Ｍスペルミジン、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ］（２０μｌ）
中、１５℃で、一晩、ライゲートする。このライゲーシ
ョン混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１をＫｕｓｈｉｎｅ
ｒの方法［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、モルキュラー・ク
ローニング、ｐ２５２（１９８２）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー］により形質転換し、テ
トラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するプレート
上にテトラサイクリンに耐性の形質転換体を得る。形質
転換体より単離されたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐを
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（３７５ｂ．ｐ．、４０９４
ｂ．ｐ．）およびＨｐａＩ（４４６９ｂ．ｐ．）で消化
し、７．５％ＰＡＧＥおよび０．８％アガロースゲル電
気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子を確認した。
【００３２】実施例７ 合成trpプロモーターＩＩＩ遺伝子の構築（図９に示
す）：ブロックＩ’、ＩＩ’およびＩＩＩ’の各オリゴ
ヌクレオチド（Ｂ−Ｍ’）（各０．２ｎモル）を、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、２．５単位）を用
い、ライゲションバッファー（７０μｌ）中、３７℃
で、１時間ホスホリル化する。各ブロックの反応混合物
にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）および２０ｍＭ
ＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物を１５℃で３０分間イ
ンキュベートした後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止させる。これらの各ブロック（Ｉ’、ＩＩ’および
ＩＩＩ’）の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３６０単位）および２０ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）の存
在下にホスホリル化していないオリゴヌクロレオチド
（Ａ、Ｎ’）と混合する。混合物を１５℃で１時間イン
キュベートした後、最終ライゲーション生成物を２〜１
６％の勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）により精製し、１０６ｂ．ｐ．の合成ｔｒｐプロモ
ーターＩＩＩ遺伝子を得る。
す）：ブロックＩ’、ＩＩ’およびＩＩＩ’の各オリゴ
ヌクレオチド（Ｂ−Ｍ’）（各０．２ｎモル）を、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、２．５単位）を用
い、ライゲションバッファー（７０μｌ）中、３７℃
で、１時間ホスホリル化する。各ブロックの反応混合物
にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）および２０ｍＭ
ＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物を１５℃で３０分間イ
ンキュベートした後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止させる。これらの各ブロック（Ｉ’、ＩＩ’および
ＩＩＩ’）の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３６０単位）および２０ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）の存
在下にホスホリル化していないオリゴヌクロレオチド
（Ａ、Ｎ’）と混合する。混合物を１５℃で１時間イン
キュベートした後、最終ライゲーション生成物を２〜１
６％の勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）により精製し、１０６ｂ．ｐ．の合成ｔｒｐプロモ
ーターＩＩＩ遺伝子を得る。
【００３３】実施例８ ダブルｔｒｐプロモーターベクター（ｐ３２２ｄｔｒｐ
Ｓ）の構築およびクローニング（図１０に示す）：プラ
スミドｐＢＲ３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩ
で消化し、続いて調製アガロースゲル電気泳動を行い４
４４６ｂ．ｐ．の大きな断片を得る。この断片（４４４
６ｂ．ｐ．）を実施例７で得たｔｒｐプロモーターＩＩ
Ｉ遺伝子（１０６ｂ．ｐ．）とＴ４ＤＮＡの存在下にラ
イゲートする。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌ
ｉＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリンおよびテトラ
サイクリンに耐性の形質転換体を得る。この形質転換体
より得られたプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳを、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析によって確認した。Ｃ１ａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ（３２５ｂ．ｐ．）、ＨｐａＩ（１０７ｂ．
ｐ．）およびＡａｔＩＩ−ＣｌａＩ（２８７ｂ．
ｐ．）。
Ｓ）の構築およびクローニング（図１０に示す）：プラ
スミドｐＢＲ３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩ
で消化し、続いて調製アガロースゲル電気泳動を行い４
４４６ｂ．ｐ．の大きな断片を得る。この断片（４４４
６ｂ．ｐ．）を実施例７で得たｔｒｐプロモーターＩＩ
Ｉ遺伝子（１０６ｂ．ｐ．）とＴ４ＤＮＡの存在下にラ
イゲートする。このライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌ
ｉＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリンおよびテトラ
サイクリンに耐性の形質転換体を得る。この形質転換体
より得られたプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳを、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析によって確認した。Ｃ１ａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ（３２５ｂ．ｐ．）、ＨｐａＩ（１０７ｂ．
ｐ．）およびＡａｔＩＩ−ＣｌａＩ（２８７ｂ．
ｐ．）。
【００３４】実施例９ 合成ｔｒｐプロモーターＩＩＩのＤＮＡ断片の一部を持
つペプチドＣｄ遺伝子の構築（図１１および図１２に示
す）：ブロックＩ’’、ＩＩ’’およびＩＩＩ’’の各
オリゴヌクレオチド（０．２ｎモル）（Ｎｐ１−Ｃｄ
８、実施例４に示す）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（２．５単位）を用い、ライゲーションバッファー
（６０μｌ）中、３７℃で、１時間ホスホリル化する。
各ブロックの反応混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３６０
単位）および２０ｍＭＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物
を１５℃で１時間インキュベートする。この各ブロック
の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３６０単
位）および２０ｍＭＡＴＰ（２μｌ）と共に、１５℃
で、一晩、インキュベートし、続いて８０℃で１０分間
加熱する。混合物に５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液
（２０μｌ）およびＥｃｏＲＩ（２０単位）を加える。
３７℃で２時間インキュベートした後、最終ライゲーシ
ョン生成物を１５％のＰＡＧＥで精製し、合成ｔｒｐプ
ロモーターＩＩＩのＤＮＡ断片の一部を持つペプチドＣ
ｄ遺伝子を得る。このＤＮＡ配列を図１２に示す。
つペプチドＣｄ遺伝子の構築（図１１および図１２に示
す）：ブロックＩ’’、ＩＩ’’およびＩＩＩ’’の各
オリゴヌクレオチド（０．２ｎモル）（Ｎｐ１−Ｃｄ
８、実施例４に示す）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（２．５単位）を用い、ライゲーションバッファー
（６０μｌ）中、３７℃で、１時間ホスホリル化する。
各ブロックの反応混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３６０
単位）および２０ｍＭＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物
を１５℃で１時間インキュベートする。この各ブロック
の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３６０単
位）および２０ｍＭＡＴＰ（２μｌ）と共に、１５℃
で、一晩、インキュベートし、続いて８０℃で１０分間
加熱する。混合物に５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液
（２０μｌ）およびＥｃｏＲＩ（２０単位）を加える。
３７℃で２時間インキュベートした後、最終ライゲーシ
ョン生成物を１５％のＰＡＧＥで精製し、合成ｔｒｐプ
ロモーターＩＩＩのＤＮＡ断片の一部を持つペプチドＣ
ｄ遺伝子を得る。このＤＮＡ配列を図１２に示す。
【００３５】実施例１０ プラスミドｐＣｄγの構築およびクローニング（図１３
に示す）：プラスミドｐγｔｒｐ（４５４４ｂ．ｐ．）
（このプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−９がＦ
ＥＲＭ ＢＰ−９０５として微工研に寄託されている。
英国特許出願公開番号第２１６４６５０号参照）をＨｐ
ａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し大きな断片（４５１０
ｂ．ｐ．）を得る。これを実施例９で得た合成ｔｒｐプ
ロモーターＩＩＩのＤＮＡ断片の一部を持つペプチドＣ
ｄ遺伝子とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートす
る。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換させる。RＡｍｐの形質転換体より
得られるプラスミド（ｐＣｄγ）を制限エンドヌクレア
ーゼ分析により確認した。ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ（５４
３ｂ．ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（２７３ｂ．
ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ（９３ｂ．ｐ．）および
ＡａｔＩＩ−Ｃ１ａＩ（１８０ｂ．ｐ．）。
に示す）：プラスミドｐγｔｒｐ（４５４４ｂ．ｐ．）
（このプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−９がＦ
ＥＲＭ ＢＰ−９０５として微工研に寄託されている。
英国特許出願公開番号第２１６４６５０号参照）をＨｐ
ａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し大きな断片（４５１０
ｂ．ｐ．）を得る。これを実施例９で得た合成ｔｒｐプ
ロモーターＩＩＩのＤＮＡ断片の一部を持つペプチドＣ
ｄ遺伝子とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートす
る。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換させる。RＡｍｐの形質転換体より
得られるプラスミド（ｐＣｄγ）を制限エンドヌクレア
ーゼ分析により確認した。ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ（５４
３ｂ．ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（２７３ｂ．
ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ（９３ｂ．ｐ．）および
ＡａｔＩＩ−Ｃ１ａＩ（１８０ｂ．ｐ．）。
【００３６】実施例１１ プラスミドｐＣｄγｔｒｐＳｄの構築およびクローンニ
ング（図１４に示す）：プラスミドｐＣｄγをＣ１ａＩ
およびＢａｍＨＩで消化した小さな断片（５４３ｂ．
ｐ．）を得、これをｐ３２２ｄｔｒｐＳ（実施例７）の
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片（４２２３ｂ．ｐ．）とＴ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートする。このライゲ
ーション混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換す
る。RＡｍｐの形質転換体より得られるプラスミド（ｐ
ＣｄγｔｒｐＳｄ）を制限エンドヌクレアーゼ分析によ
り確認した。ＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７５、５７５
ｂ．ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ（５４３ｂ．
ｐ．）、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ（１０５７ｂ．ｐ．）、
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（４５０ｂ．ｐ．）、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（２７０ｂ．ｐ．）およびＣ１ａＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ（２７３ｂ．ｐ．）。
ング（図１４に示す）：プラスミドｐＣｄγをＣ１ａＩ
およびＢａｍＨＩで消化した小さな断片（５４３ｂ．
ｐ．）を得、これをｐ３２２ｄｔｒｐＳ（実施例７）の
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片（４２２３ｂ．ｐ．）とＴ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートする。このライゲ
ーション混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換す
る。RＡｍｐの形質転換体より得られるプラスミド（ｐ
ＣｄγｔｒｐＳｄ）を制限エンドヌクレアーゼ分析によ
り確認した。ＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７５、５７５
ｂ．ｐ．）、Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ（５４３ｂ．
ｐ．）、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ（１０５７ｂ．ｐ．）、
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（４５０ｂ．ｐ．）、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（２７０ｂ．ｐ．）およびＣ１ａＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ（２７３ｂ．ｐ．）。
【００３７】実施例１２ リンカーＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子の調製（図１
５に示す）：ブロックＩ’’’およびＩＩ’’’の各オ
リゴヌクレオチド（ＡＨ２−ＡＨ１７）（各０．２モ
ル）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２．５単位）
を用い、ライゲーションバッファー（７０μｌ）中、３
７℃で、１時間、ホスホリル化する。各ブロックの反応
混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）および２０
ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物を１５℃で３０
分間インキュベートする。６５℃で１０分間加熱して反
応を停止させる。二つのブロック（Ｉ’’’およびＩ
Ｉ’’’）の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３００単位）および２０ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）の存
在下に、ホスホリル化してないオリゴヌクレオチド（Ａ
Ｈ１，ＡＨ１８）と混合する。混合物を１５℃で１時間
インキュベートした後、最終ラインゲーション生成物を
２〜１６％の勾配のＰＡＧＥにより精製し、リンカーＤ
ＮＡを持つ１３４ｂ．ｐ．のα−ｈＡＮＰ遺伝子を得る
（図５に示す）。
５に示す）：ブロックＩ’’’およびＩＩ’’’の各オ
リゴヌクレオチド（ＡＨ２−ＡＨ１７）（各０．２モ
ル）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２．５単位）
を用い、ライゲーションバッファー（７０μｌ）中、３
７℃で、１時間、ホスホリル化する。各ブロックの反応
混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）および２０
ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）を加え、混合物を１５℃で３０
分間インキュベートする。６５℃で１０分間加熱して反
応を停止させる。二つのブロック（Ｉ’’’およびＩ
Ｉ’’’）の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３００単位）および２０ｍＭ ＡＴＰ（２μｌ）の存
在下に、ホスホリル化してないオリゴヌクレオチド（Ａ
Ｈ１，ＡＨ１８）と混合する。混合物を１５℃で１時間
インキュベートした後、最終ラインゲーション生成物を
２〜１６％の勾配のＰＡＧＥにより精製し、リンカーＤ
ＮＡを持つ１３４ｂ．ｐ．のα−ｈＡＮＰ遺伝子を得る
（図５に示す）。
【００３８】実施例１３ α−ｈＡＮＰ発現ベクターｐＣＬａＨｔｒｐＳｄの構築
およびクローニング（図１６に示す）：プラスミドｐＣ
ｄγｔｒｐＳｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消
化し大きな断片（４７４３ｂ．ｐ．）を得、これをリン
カーＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子（１３４ｂ．
ｐ．）とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートす
る。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換し、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＨ１を
得る。RＡｍｐ（Ｅ．ｃｏｌｉＨ１）の形質転換体より
得られるプラスミド（ｐＣＬａＨｔｒｐＳｄ）［ＣＬａ
Ｈ蛋白（ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ蛋白）遺伝子
を含有しており、そのＤＮＡ配列は図１７に示す］を制
限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した。ＡａｔＩ
Ｉ−Ｃ１ａＩ（２８７ｂ．ｐ．）、ＣｌａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ（４０７ｂ．ｐ．）、ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ（９３、
１９８ｂ．ｐ．）、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１１６、
１９８ｂ．ｐ．）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（１３
４ｂ．ｐ．）およびＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７、４
３９ｂ．ｐ．）。
およびクローニング（図１６に示す）：プラスミドｐＣ
ｄγｔｒｐＳｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消
化し大きな断片（４７４３ｂ．ｐ．）を得、これをリン
カーＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子（１３４ｂ．
ｐ．）とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートす
る。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換し、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＨ１を
得る。RＡｍｐ（Ｅ．ｃｏｌｉＨ１）の形質転換体より
得られるプラスミド（ｐＣＬａＨｔｒｐＳｄ）［ＣＬａ
Ｈ蛋白（ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ蛋白）遺伝子
を含有しており、そのＤＮＡ配列は図１７に示す］を制
限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した。ＡａｔＩ
Ｉ−Ｃ１ａＩ（２８７ｂ．ｐ．）、ＣｌａＩ−ＢａｍＨ
Ｉ（４０７ｂ．ｐ．）、ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ（９３、
１９８ｂ．ｐ．）、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１１６、
１９８ｂ．ｐ．）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（１３
４ｂ．ｐ．）およびＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７、４
３９ｂ．ｐ．）。
【００３９】実施例１４ ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ（ＣＬａＨ蛋白）をコ
ードする遺伝子の発現：アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含
有Ｌブロス（２０ｍｌ）中で一晩培養した、発現ベクタ
ー（プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐＳｄ）含有のＥ．ｃｏ
ｌｉＨ１の培養物を、０．２％グルコース、０．５％カ
ザミノ酸（カゼイン加水分解物）、５０μｇ／ｍｌビタ
ミンＢ１ および２５μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｍ−
９培地（４００ｍｌ）で希釈し、このＥ．ｃｏｌｉを３
７℃で培養する。培養液のＡ６００（６００ｎｍの吸光
度）が０．５となった時にβ−インドールアクリル酸
（２ｍｇ／ｍｌエタノール、２ｍｌ）を加え、細胞を３
時間インキュベートする（最終Ａ６００＝１．８５）。
次に菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃、５分間）
により集める。
ードする遺伝子の発現：アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含
有Ｌブロス（２０ｍｌ）中で一晩培養した、発現ベクタ
ー（プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐＳｄ）含有のＥ．ｃｏ
ｌｉＨ１の培養物を、０．２％グルコース、０．５％カ
ザミノ酸（カゼイン加水分解物）、５０μｇ／ｍｌビタ
ミンＢ１ および２５μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｍ−
９培地（４００ｍｌ）で希釈し、このＥ．ｃｏｌｉを３
７℃で培養する。培養液のＡ６００（６００ｎｍの吸光
度）が０．５となった時にβ−インドールアクリル酸
（２ｍｇ／ｍｌエタノール、２ｍｌ）を加え、細胞を３
時間インキュベートする（最終Ａ６００＝１．８５）。
次に菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃、５分間）
により集める。
【００４０】実施例１５ α−ｈＡＮＰの分離および精製： （１） ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ（ＣＬａＨ蛋
白）の分離および精製：実施例１４で調製した培養液
（６００ｍｌ）より得られる湿潤菌体ペーストを１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）［１リットル中Ｎ
ａＣｌ（８．０ｇ）、ＫＣｌ（０．２ｇ）、Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4 ・１２Ｈ2Ｏ（２．９ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（０．２
ｇ）、ＥＤＴＡ（３．７３ｇ）］８ｍｌに懸濁し、細胞
を０℃で超音波処理して破壊する。１５，０００ｒｐｍ
で２０分間（４℃）遠心分離してペレットを集め、これ
を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＰＢＳ−ＥＤＴ
Ａおよび２ｍＭβ−メルカプトエタノールの混合物８ｍ
ｌに懸濁し、懸濁液を０℃で超音波処理する。この懸濁
液を１５，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離
し、上清をフッ化ｐ−ニトロフェニルメチルスルホニル
（ＰＭＳＦ）含有１０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液に対し
４℃で一晩透析する。透析画分を遠心分離（１５，００
０ｒｐｍ、４℃，２０分間）した後、ペレットを６Ｍグ
アニジン−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍ
Ｍジチオスレイトール含有の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（８ｍｌ）に溶かし、溶液を
一晩放置する。この溶液を１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール含有１Ｍ酢酸（０．５リットル）を用い２回透析
し、トリスアミノメタンでｐＨ８．０に調整する。得ら
れる沈殿（融合蛋白；１５．２ｍｇ）を遠心分離（３，
０００ｒｐｍ、１０分間）により集め、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄する。
白）の分離および精製：実施例１４で調製した培養液
（６００ｍｌ）より得られる湿潤菌体ペーストを１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）［１リットル中Ｎ
ａＣｌ（８．０ｇ）、ＫＣｌ（０．２ｇ）、Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4 ・１２Ｈ2Ｏ（２．９ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（０．２
ｇ）、ＥＤＴＡ（３．７３ｇ）］８ｍｌに懸濁し、細胞
を０℃で超音波処理して破壊する。１５，０００ｒｐｍ
で２０分間（４℃）遠心分離してペレットを集め、これ
を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＰＢＳ−ＥＤＴ
Ａおよび２ｍＭβ−メルカプトエタノールの混合物８ｍ
ｌに懸濁し、懸濁液を０℃で超音波処理する。この懸濁
液を１５，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離
し、上清をフッ化ｐ−ニトロフェニルメチルスルホニル
（ＰＭＳＦ）含有１０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液に対し
４℃で一晩透析する。透析画分を遠心分離（１５，００
０ｒｐｍ、４℃，２０分間）した後、ペレットを６Ｍグ
アニジン−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍ
Ｍジチオスレイトール含有の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（８ｍｌ）に溶かし、溶液を
一晩放置する。この溶液を１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール含有１Ｍ酢酸（０．５リットル）を用い２回透析
し、トリスアミノメタンでｐＨ８．０に調整する。得ら
れる沈殿（融合蛋白；１５．２ｍｇ）を遠心分離（３，
０００ｒｐｍ、１０分間）により集め、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄する。
【００４１】（２） アクロモバクター・プロテアーゼ
Ｉ（ＡＰＩ）によるペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰか
らのペプチドＣＬａの脱離：前記で得た融合蛋白を８Ｍ
尿素を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）（３０ｍｌ）に懸濁し、懸濁液をアクロモバク
ター・プロテアーゼＩ（ＡＰＩ）（０．２５単位）（和
光純薬）と共に、３７℃で、２時間、インキュベートす
る。反応混合物を蒸留水（３０ｍｌ）で希釈し、トリス
アミノメタンでｐＨ９．０に調整し、次いでＡＰＩ
（０．２５単位）をさらに加え、３７℃で２時間インキ
ュベートする。反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）（１２０ｍｌ）で希釈し、酢酸でｐＨ
７に調整する。この溶液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｐ−セファデックス
Ｃ−２５カラム（１５ｍｌ）にかける。カラムは同じ緩
衝液で洗浄し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を含有す
る１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶
出し、部分精製されたα−ｈＡＮＰ（０．４ｍｇ）含有
画分を集める。 （３）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：前記
（２）と同様にして得られプールしておいた画分を減圧
濃縮し、水（３００ｍｌ）に対し透析し、逆相ＨＰＬＣ
で精製して、純粋なα−ｈＡＮＰ（０．３ｍｇ）を得
る。
Ｉ（ＡＰＩ）によるペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰか
らのペプチドＣＬａの脱離：前記で得た融合蛋白を８Ｍ
尿素を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）（３０ｍｌ）に懸濁し、懸濁液をアクロモバク
ター・プロテアーゼＩ（ＡＰＩ）（０．２５単位）（和
光純薬）と共に、３７℃で、２時間、インキュベートす
る。反応混合物を蒸留水（３０ｍｌ）で希釈し、トリス
アミノメタンでｐＨ９．０に調整し、次いでＡＰＩ
（０．２５単位）をさらに加え、３７℃で２時間インキ
ュベートする。反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）（１２０ｍｌ）で希釈し、酢酸でｐＨ
７に調整する。この溶液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｐ−セファデックス
Ｃ−２５カラム（１５ｍｌ）にかける。カラムは同じ緩
衝液で洗浄し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を含有す
る１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶
出し、部分精製されたα−ｈＡＮＰ（０．４ｍｇ）含有
画分を集める。 （３）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：前記
（２）と同様にして得られプールしておいた画分を減圧
濃縮し、水（３００ｍｌ）に対し透析し、逆相ＨＰＬＣ
で精製して、純粋なα−ｈＡＮＰ（０．３ｍｇ）を得
る。
【００４２】ＨＰＬＣ条件 （調製） カラム：半調製用ベックマンウルトラポア（φ１０×２
５０ｍｍ） 流 速：２．５ｍｌ／分 溶 出：０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中１０％から６０
％までのアセトニトリルの直線勾配；５０分間 検 出：２１４ｎｍにおける吸光度 （分析） カラム：ベックマンウルトラポアＲＰＳＣ（φ４．６×
７５ｍｍ） 流 速：１ｍｌ／分 溶 出：調製と同条件 保持時間：１１．９分 この実施例により得られたα−ｈＡＮＰのＨＰＬＣ上で
の保持時間はα−ｈＡＮＰ標準品（販売：船越）のそれ
と一致した。
５０ｍｍ） 流 速：２．５ｍｌ／分 溶 出：０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中１０％から６０
％までのアセトニトリルの直線勾配；５０分間 検 出：２１４ｎｍにおける吸光度 （分析） カラム：ベックマンウルトラポアＲＰＳＣ（φ４．６×
７５ｍｍ） 流 速：１ｍｌ／分 溶 出：調製と同条件 保持時間：１１．９分 この実施例により得られたα−ｈＡＮＰのＨＰＬＣ上で
の保持時間はα−ｈＡＮＰ標準品（販売：船越）のそれ
と一致した。
【００４３】（４）α−ｈＡＮＰのアミノ酸分析 試料を還元、カルボキシメチル化し、次いで６Ｎ塩酸
で、１１０℃で、２４時間加水分解する。α−ｈＡＮＰ
のアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ酸分析システ
ムを用いて求めた。α−ｈＡＮＰのアミノ酸組成（１モ
ル当りの残留物）は計算値と一致した。 （５）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列分析 α−ｈＡＮＰのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法（ＤＡ
ＢＩＴＣ法）［ＦＥＢＳレターズ、９３、２０５（１９
７８）に記載］により決定し、Ｎ−末端ＳｅｒおよびＬ
ｅｕ配列を確認した。Ｃ末端アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）はカルボキシペプチダーゼにより消
化しそれに続いてウォーターズ社製アミノ酸分析システ
ムを用いるアミノ酸分析を行って決定した。次いで、実
施例で得られたα−ｈＡＮＰの全アミノ酸配列は両方の
方法を用いて決定され、α−ｈＡＮＰが得られているこ
とが確認された。
で、１１０℃で、２４時間加水分解する。α−ｈＡＮＰ
のアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ酸分析システ
ムを用いて求めた。α−ｈＡＮＰのアミノ酸組成（１モ
ル当りの残留物）は計算値と一致した。 （５）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列分析 α−ｈＡＮＰのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法（ＤＡ
ＢＩＴＣ法）［ＦＥＢＳレターズ、９３、２０５（１９
７８）に記載］により決定し、Ｎ−末端ＳｅｒおよびＬ
ｅｕ配列を確認した。Ｃ末端アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）はカルボキシペプチダーゼにより消
化しそれに続いてウォーターズ社製アミノ酸分析システ
ムを用いるアミノ酸分析を行って決定した。次いで、実
施例で得られたα−ｈＡＮＰの全アミノ酸配列は両方の
方法を用いて決定され、α−ｈＡＮＰが得られているこ
とが確認された。
【００４４】実施例１６ プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐＳｓの構築およびクロー
ニング（図１８に示す）：プラスミドｐＢＲ３２２をＥ
ｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化する。大きな断片（４３
４０ｂ．ｐ．）を０．８％アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび１ｍＭ ＡＴＰの
存在下に合成ｔｒｐプロモーターＩＩＩ遺伝子とライゲ
ートする。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する。プラスミドＤＮＡ
（ｐＢＲ３２２ｔｒｐＳｓ）を形質転換したクローンよ
り分離し、制限エンドヌクレアーゼ分析により定性解析
する。 分析データ：Hpa I; 4445bp, ClaI-Pst I; 834bp
ニング（図１８に示す）：プラスミドｐＢＲ３２２をＥ
ｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化する。大きな断片（４３
４０ｂ．ｐ．）を０．８％アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび１ｍＭ ＡＴＰの
存在下に合成ｔｒｐプロモーターＩＩＩ遺伝子とライゲ
ートする。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する。プラスミドＤＮＡ
（ｐＢＲ３２２ｔｒｐＳｓ）を形質転換したクローンよ
り分離し、制限エンドヌクレアーゼ分析により定性解析
する。 分析データ：Hpa I; 4445bp, ClaI-Pst I; 834bp
【００４５】実施例１７ プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ−２の構築およびクローニ
ング（図１９に示す）：プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐＳ
ｄをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化する。小さい断片
（４０７ｂ．ｐ．）を単離する。一方、ｐＢＲ３２２ｔ
ｒｐＳｓをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化する。大き
い断片（４０９３ｂ．ｐ．）を分離し、前記ＤＮＡ（４
０７ｂ．ｐ．）とライゲートする。このライゲーション
混合物によりＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換させた
後、所望のプラスミド（ｐＣＬａＨｔｒｐ−２）を形質
転換したクローンより単離し、制限エンドヌクレアーゼ
分析により確認した。ＣｌａＩ−ＰｓｔＩ（８３４ｂ．
ｐ．）、ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ（４０７ｂ．ｐ．）。
ング（図１９に示す）：プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐＳ
ｄをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化する。小さい断片
（４０７ｂ．ｐ．）を単離する。一方、ｐＢＲ３２２ｔ
ｒｐＳｓをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化する。大き
い断片（４０９３ｂ．ｐ．）を分離し、前記ＤＮＡ（４
０７ｂ．ｐ．）とライゲートする。このライゲーション
混合物によりＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換させた
後、所望のプラスミド（ｐＣＬａＨｔｒｐ−２）を形質
転換したクローンより単離し、制限エンドヌクレアーゼ
分析により確認した。ＣｌａＩ−ＰｓｔＩ（８３４ｂ．
ｐ．）、ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ（４０７ｂ．ｐ．）。
【００４６】実施例１８ オリゴヌクレオチドの合成：実施例１の方法に準じて、
下記のオリゴヌクレオチドを調製する。 （１） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（Ｔ１） （２） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｔ２） （３） ＨＯＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｔ３） （４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｔ４） （５） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｔ５） （６） ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡ
ＯＨ（Ｔ６）
下記のオリゴヌクレオチドを調製する。 （１） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（Ｔ１） （２） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｔ２） （３） ＨＯＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｔ３） （４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｔ４） （５） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｔ５） （６） ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡ
ＯＨ（Ｔ６）
【００４７】実施例１９ 合成ｆｄファージ・ターミネーターの構築およびクロー
ニング（図２０および図２１に示す）：実施例７に記載
の方法と同様にして合成ｆｄファージ・ターミネーター
を構築する（図２０に示す）。即ち、ＤＮＡオリゴマー
Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５（各０．４ｎモル）を混合
し、１ｍＭ ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼでホスホリル化する。反応混合物を６５℃で１０
分間加熱して酵素を不活性化する。得られた混合物にＤ
ＮＡオリゴマーＴ１およびＴ６（各０．８ｎモル）とＴ
４ＤＮＡリガーゼを加える。混合物を１５℃で３０分間
インキュベートし、２〜１６％の勾配のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に付し、所望のＤＮＡ断片（４７ｂ．
ｐ．）を電気溶出により回収し、ＢａｍＨＩおよびＳａ
ｌＩで消化したｐＢＲ３２２の大きい断片（４０８８
ｂ．ｐ．）に挿入とライゲートする。このライゲーショ
ン混合物によりＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換させ
た後、所望のプラスミド（ｐｔｅｒ２１）形質転換した
クローンより単離した。制限酵素分析：ＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｌＩ（４７ｂ．ｐ．）、ＡｖａＩ（８１７ｂ．
ｐ．）。
ニング（図２０および図２１に示す）：実施例７に記載
の方法と同様にして合成ｆｄファージ・ターミネーター
を構築する（図２０に示す）。即ち、ＤＮＡオリゴマー
Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５（各０．４ｎモル）を混合
し、１ｍＭ ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼでホスホリル化する。反応混合物を６５℃で１０
分間加熱して酵素を不活性化する。得られた混合物にＤ
ＮＡオリゴマーＴ１およびＴ６（各０．８ｎモル）とＴ
４ＤＮＡリガーゼを加える。混合物を１５℃で３０分間
インキュベートし、２〜１６％の勾配のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に付し、所望のＤＮＡ断片（４７ｂ．
ｐ．）を電気溶出により回収し、ＢａｍＨＩおよびＳａ
ｌＩで消化したｐＢＲ３２２の大きい断片（４０８８
ｂ．ｐ．）に挿入とライゲートする。このライゲーショ
ン混合物によりＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換させ
た後、所望のプラスミド（ｐｔｅｒ２１）形質転換した
クローンより単離した。制限酵素分析：ＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｌＩ（４７ｂ．ｐ．）、ＡｖａＩ（８１７ｂ．
ｐ．）。
【００４８】実施例２０ α−ｈＡＮＰ発現ベクタープラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ
３ｔの構築およびクローニング（図２２に示す）：プラ
スミドｐＣＬａＨｔｒｐ−２をＰｓｔＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化する。この消化混合物より小さい断片（１２４
１ｂ．ｐ．）を単離し、ｐｔｅｒ２１をＰｓｔＩおよび
ＢａｍＨＩで消化して得られたｐｔｅｒ２１の大きな断
片（３００５ｂ．ｐ．）にライゲートする。このライゲ
ーション混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換し
て形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＨ２を得る。RＡｍｐの形質
転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ２）より得られたプラスミド
ＣＬａＨｔｒｐ３ｔ（ＣＬａＨ蛋白遺伝子を含有する）
を制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。Ｃｌａ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ（９３ｂ．ｐ．、１９８ｂ．ｐ．）、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（１３４ｂ．ｐ．）およびＰ
ｓｔＩ−Ｃ１ａＩ−ＸｈｏＩ（８３４ｂ．ｐ．、４１１
ｂ．ｐ．）。
３ｔの構築およびクローニング（図２２に示す）：プラ
スミドｐＣＬａＨｔｒｐ−２をＰｓｔＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化する。この消化混合物より小さい断片（１２４
１ｂ．ｐ．）を単離し、ｐｔｅｒ２１をＰｓｔＩおよび
ＢａｍＨＩで消化して得られたｐｔｅｒ２１の大きな断
片（３００５ｂ．ｐ．）にライゲートする。このライゲ
ーション混合物でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換し
て形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＨ２を得る。RＡｍｐの形質
転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ２）より得られたプラスミド
ＣＬａＨｔｒｐ３ｔ（ＣＬａＨ蛋白遺伝子を含有する）
を制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した。Ｃｌａ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ（９３ｂ．ｐ．、１９８ｂ．ｐ．）、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（１３４ｂ．ｐ．）およびＰ
ｓｔＩ−Ｃ１ａＩ−ＸｈｏＩ（８３４ｂ．ｐ．、４１１
ｂ．ｐ．）。
【００４９】実施例２１ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ２を用いたα−ｈＡＮＰの製造：Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｈ１の代りにＥ．ｃｏｌｉ Ｈ２を用いて実
施例１４および１５と同じ方法でα−ｈＡＮＰを得る。
このようにして得たα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列はアミ
ノ酸配列分析の結果既知のα−ｈＡＮＰのそれと一致し
ていることが確認された。
ｃｏｌｉ Ｈ１の代りにＥ．ｃｏｌｉ Ｈ２を用いて実
施例１４および１５と同じ方法でα−ｈＡＮＰを得る。
このようにして得たα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列はアミ
ノ酸配列分析の結果既知のα−ｈＡＮＰのそれと一致し
ていることが確認された。
【図１】合成ｔｒｐプロモータＩ遺伝子のＤＮＡ配列を
示した図である。
示した図である。
【図２】合成ｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列
を示した図である。
を示した図である。
【図３】合成ｔｒｐプロモータＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配
列を示した図である。
列を示した図である。
【図４】ペプチドＣＬａ遺伝子のＤＮＡ配列およびそれ
に対応するアミノ酸配列を示した図である。
に対応するアミノ酸配列を示した図である。
【図５】リンカーＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子のＤ
ＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示した図
である。
ＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示した図
である。
【図６】合成ｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子の構築の工程
を示した図である。
を示した図である。
【図７】合成ｔｒｐプロモータＩＩ遺伝子の分子クロー
ニングの工程を示した図である。
ニングの工程を示した図である。
【図８】ｔｒｐプロモータ・ベクター（ｐＢＲ３２２ｔ
ｒｐ）の構築とクロニーングの工程を示した図である。
ｒｐ）の構築とクロニーングの工程を示した図である。
【図９】合成ｔｒｐＩＩＩ遺伝子の構築の工程を示した
図である。
図である。
【図１０】ダブルｔｒｐプロモータ・ベクター（ｐ３２
２ｄｔｒｐｓ）の構築とクローニングの構程を示した図
である。
２ｄｔｒｐｓ）の構築とクローニングの構程を示した図
である。
【図１１】合成ｔｒｐプロモータＩＩＩのＤＮＡ断片の
一部を持つペプチドＣｄ遺伝子の構築の工程を示した図
である。
一部を持つペプチドＣｄ遺伝子の構築の工程を示した図
である。
【図１２】合成ｔｒｐプロモータＩＩＩのＤＮＡ断片の
一部を持つペプチドＣｄ遺伝子のＤＮＡ配列を示した図
である。
一部を持つペプチドＣｄ遺伝子のＤＮＡ配列を示した図
である。
【図１３】プラスミドｐＣｄγの構築およびクローニン
グの工程を示した図である。
グの工程を示した図である。
【図１４】プラスミドｐＣｄγｔｒｐＳｄの構築および
クローニングの工程を示した図である。
クローニングの工程を示した図である。
【図１５】リンカーＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子の
構築の工程を示した図である。
構築の工程を示した図である。
【図１６】α−ｈＡＮＰ発現ベクターｐＣＬａＨｔｒｐ
Ｓｄの構築とクローニングの工程を示した図である。
Ｓｄの構築とクローニングの工程を示した図である。
【図１７】ＣＬａＨ蛋白遺伝子のＤＮＡ配列を示した図
である。
である。
【図１８】プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐＳｓの構築と
クローニングを示した図である。
クローニングを示した図である。
【図１９】プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ−２の構築とク
ローニングの工程を示した図である。
ローニングの工程を示した図である。
【図２０】合成ｆｄファージ・ターミネーターの構築の
工程を示した図である。
工程を示した図である。
【図２１】合成ｆｄファージ・ターミネーターのクロー
ニングの工程を示した図である。
ニングの工程を示した図である。
【図２２】プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ３ｔの構築とク
ローニングの工程を示した図である。
ローニングの工程を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＵ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｃ末端がリジンである保護ペプチドと該
リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰ。 - 【請求項２】 Ｃ末端がリジンである保護ペプチドと該
リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰをコードする遺伝
子を含むプラスミドで形質転換した微生物を培地に培養
し、培養液からＣ末端がリジンである保護ペプチドと該
リジンを介して融合したα−ｈＡＮＰを採取することを
特徴とする保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰの製造法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858515686A GB8515686D0 (en) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | Production of-human atrial natriuretic polypeptide |
| GB8515686 | 1985-06-20 | ||
| GB8600754 | 1986-01-14 | ||
| GB868600754A GB8600754D0 (en) | 1986-01-14 | 1986-01-14 | Human atrial natriuretic polypeptide |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61141900A Division JPS626689A (ja) | 1985-06-20 | 1986-06-18 | 合成遺伝子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067187A true JPH067187A (ja) | 1994-01-18 |
| JPH0633316B2 JPH0633316B2 (ja) | 1994-05-02 |
Family
ID=26289399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4278583A Expired - Fee Related JPH0633316B2 (ja) | 1985-06-20 | 1992-10-16 | 保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6403336B1 (ja) |
| EP (2) | EP0206769B2 (ja) |
| JP (1) | JPH0633316B2 (ja) |
| AT (1) | ATE79409T1 (ja) |
| DE (1) | DE3686365T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3686365T3 (de) | 1985-06-20 | 2000-07-27 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Herstellungsverfahren für humanes atriales natriuretisches Polypeptid. |
| EP0264074B1 (en) * | 1986-10-09 | 1992-12-30 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Expression vector for insulin-like growth factor i |
| US5340725A (en) * | 1986-10-09 | 1994-08-23 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Expression vector for insulin-like growth factor I and method of production |
| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| AUPN283195A0 (en) * | 1995-05-05 | 1995-06-01 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for the detection of viable cryptosporidium parvum cells |
| DE19535445A1 (de) * | 1995-09-23 | 1997-03-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Herstellung von natriuretischen Peptiden über Streptavidin-Fusionsproteine |
| AU783954B2 (en) * | 2000-05-10 | 2006-01-05 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Method of inhibiting the formation of by-product in the production of genetically modified polypeptide |
| US7357124B2 (en) * | 2002-05-10 | 2008-04-15 | Philip Morris Usa Inc. | Multiple capillary fuel injector for an internal combustion engine |
| US7459290B1 (en) | 2004-03-30 | 2008-12-02 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Methods of using functional 30S subunits |
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| WO2007047504A2 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Natriuretic peptide modified transferrin fusion proteins |
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| JPS62135500A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-06-18 | モンサント コンパニ− | ポリペプチドからのペプチドの放出 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0001929B1 (en) * | 1977-11-08 | 1989-04-19 | Genentech, Inc. | Plasmid for transforming bacterial host to render it capable of polypeptide expression |
| EP0116784B1 (en) * | 1982-02-22 | 1992-06-10 | Queen's University At Kingston | Atrial natriuretic factor |
| GB8314362D0 (en) | 1983-05-24 | 1983-06-29 | Celltech Ltd | Polypeptide and protein products |
| US4617149A (en) * | 1983-09-21 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Growth hormone release factor analogs |
| US4703004A (en) * | 1984-01-24 | 1987-10-27 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide |
| US4952561A (en) * | 1984-02-07 | 1990-08-28 | Merck & Co., Inc. | Cardiac atrial peptides |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| US4745179A (en) * | 1984-04-02 | 1988-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof |
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| DE3588006T2 (de) * | 1984-04-19 | 1995-08-10 | Scios Nova Inc | Atrielle natriumuretische/gefässerweiterende polypeptide. |
| AU600652B2 (en) * | 1984-06-08 | 1990-08-23 | Hisayuki Matsuo | Human atrial natriuretic peptide and gene encoding same |
| CA1340625C (en) * | 1984-06-29 | 1999-07-06 | Peter L. Davies | Cloned cardionatrin cdna |
| WO1986005812A1 (en) * | 1985-03-29 | 1986-10-09 | Biotechnica International, Inc. | Secretion vector |
| WO1986006742A1 (en) * | 1985-05-07 | 1986-11-20 | California Biotechnology Inc. | Fused proteine for enzyme immunoassay system |
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| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
-
1986
- 1986-06-19 DE DE3686365T patent/DE3686365T3/de not_active Expired - Fee Related
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-
1995
- 1995-01-09 US US08/370,356 patent/US6403336B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-10-24 US US10/279,061 patent/US20030170811A1/en not_active Abandoned
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| EP0206769B2 (en) | 1999-11-10 |
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