JPS626689A - 合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星呈上二上月至ｌ この発明は新規な合成遺伝子に関するものである。さら
に詳細にはα−ヒト心房由来ナトリウム排泄性ポリペプ
チド（α−ｈｕｍａｎ　ａｔｒｉａｌｎａｔｒｉｕｒｅ
ｔｉｃ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、以下“α−ｈＡＮＰ
”と略称する）および保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰを
コードする合成遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター
および形質転換体ならびに該形質転換体によるα−ｈＡ
ＮＰの製造法に関するものである。

従来の技術およびこの発明が解決しようとする開腹Ａ α−ｈＡＮＰは、利尿作用、ナトリウム排泄増加作用、
および降圧作用を有する公知のポリペプチドであり、利
尿降圧剤として有用であり、Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−
５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒ　　　　　　　　　　　（ｒ　）
なる構造を有する（バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第１１８巻
、第１３１ページ（１９８４年）参照）。

そして、このα−ｈＡＮＰを収率よく製造する方法が望
まれていた。

、明の構成および効果 この発明者等はα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列（Ｉ）をコ
ードする合成遺伝子を含有する発現ベクターを用いる組
換えＤＮＡ技術によるα−ｈＡＮＰの製造法を新たに創
出した。この方法によると、α−ｈＡＮＰを高収率で得
ることができる。

この発明では、（１）保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰの
アミノ酸配列をコードする合成遺伝子を含有する発現ベ
クターにより形質転換きれた微生物を培地に培養し、（
２）得られる培養物より保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰ
を採取し、（３）該保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰの保
護ペプチド部分を除去することによりα−ｈＡＮＰが製
造される。

以下に、Ｅ記製造法における詳細をさらに詳しく説明す
る。

形質転換される微生物は宿主細胞のことであり、細菌、
真菌、ヒトおよび動物培養細胞および植物培養細胞を挙
げることができる。微生物の好ましい例としては、細菌
、特に例えば≧、蝦冊１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）
、旦、製置２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｅ−、ｃ
ｏｌｉ　Ｘ　１７７６　（ＡｌＣＣ３１５３７）等（７
）　工’／　エリヒア属に属する菌株を挙げることがで
きる。

発現ベクターは、通常少くともプロモーター・オペレー
ター領域、開始フド、ン、合成保護ペプチド遺伝子、合
成α−ｈＡＮＰ遺伝子、終止コドンおよび複製可能なユ
ニットを有するＤＮＡより成る。

プロモーター・オペレーター領域は、プロモーター、オ
ペレーターおよび例えばＡＡＧＧ等のシャインーダルガ
ーノ（ＳＤ）配列を含有する。　ＳＤ配列−開始コドン
間の距離は、好ましくは８〜１２塩基対（ｂ、ｐ、）で
あり、後記実施例に示されるような最も好ましい例にお
いては、　ＳＤ配列−開始コドン間の距離は１１ｂ、ｐ
、である。プロモーター・オペレーター領域の例として
は、合成プロモーター・オペレーター領域の他に、例え
ばラクトース・オペロン、ＰＬ−プロモーター、ｔｒｐ
−プロモーター等の通常用いられるプロモーター・オペ
レーター領域を挙げることができる。プロモーター・オ
ペレーター領域の好ましい例は、この発明者等が新らた
に合成した合成ａｒｐプロモーター！、■、および■が
あり、そのＤＮＡ配列を各々第１図、第２図および第３
図に示す、この発明の製造法においては、各発現ベクタ
ー毎に１〜３連のプロモーター・オペレーター領域を使
用してもよい。

好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン（ＡＴＧ
）を挙げることができる。

保護ペプチド遺伝子としては、α−ｈＡＮＰとノ融合蛋
白を形成することができるペプチドまたは蛋白のアミノ
酸配列をコードし且つ宿主細胞または培養物中の融合蛋
白の望ましくない分解を抑制するＤＮＡ配列を有する遺
伝子が挙げられる。

その好ましい例は’ＬＨ蛋白遺伝子」に連結された「ペ
プチドＣｄ遺伝子、（以下、’ＬＨ蛋白遺伝子を連結し
たペプチドＣｄ遺伝子、を「ペプチドＣＬａ遺伝子」と
呼ぶ）であり、そのＤＮＡ配列を第４図に示す。

α−ｈＡＮＰ遺伝子のＤＮＡ配列は、α−ｈＡＮＰのア
ミノ酸配列から、多数の項目の非自明な基準に従ってデ
ザインされる。α−ｈＡＮＰ遺伝子の好ましいＤＮＡ配
列の例を第５図に示す。後記実施例においては、α−ｈ
ＡＮＰ遺伝子と保護ペプチド遺伝子との間に、アミノ酸
リジンをコードするＤＮＡ配列を挿入した。

このようにすると、融合蛋白の接合部をアクロモバクタ
−・プロテアーゼ■で切断することができる。

終止コドンとしては、例えばＴＡＧ、　ＴＧＡ等の通常
に用いられる終止コドンを挙げることができる。

複製可能なユニットとは、宿主細胞中で、それに属する
ＤＮＡ配列全体を複製することができるＤＮＡ配列のこ
とであり、天然プラスミド、例えば天然プラスミドより
調製したＤＮＡ断片等の人工修飾プラスミドおよび合成
プラスミドを挙げることができる。さらにプラスミドの
好ましい例としては、プラスミドｐＢＲ３２２またはそ
の人工修飾体（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理し
て得られるＤＮＡ断片）を挙げることができる。複製可
能なユニットは天然または合成ターミネータ−（例えば
合成ｆｄファージ・ターミネータ−等）を包含してもよ
い。

プロモーター・オペレーター領域、開始コドン、保護ペ
プチド遺伝子、α−ｈＡＮＰ遺伝子、終止コドン、ター
ミネータ−等を合成する場合には、その合成法はポリヌ
クレオチドの製造に通常用いられる公知の方法で行うこ
とができる。

プロモーター・オペレーター遺伝子、開始コドン、保護
ペプチド遺伝子、α−ｈＡＮＰ遺伝子および終止コドン
は、所望であれば適当なりＮＡ断片（例えばリンカ−１
その他の制限酵素作用部位等）を用いて、常法（例えば
制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを
用いるホスホリル化、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼを用いる
ライゲーション等）により、適当な複製可能なユニット
（プラスミド）と連続且つ環状に連結して、発現ベクタ
ーを得ることができる。

発現ベクターは常法により微生物（宿主細胞）に挿入す
ることができる。挿入は、例えば形質転換、マイクロ・
インジェクション等の常法によって行えば、形質転換体
を得ることができる。

この発明の製法においてα−ｈＡＮＰを製造するには、
このようにして得た発現ベクターを含有する形質転換体
を培地に培養することにより行なわれる。

培地としては、形質転換体が増殖するものであればよく
例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルク
トース、ラクトース等の炭素源および例えば硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵
母エキス、ポリペプトン、バタトトリプトン、ビーフェ
キス等の窒素源を含有するのが通例であり、所望により
、例えばリン酸二水素ナトリウムまたはカリウム、リン
酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム等の無機塩、例えばビタミンＢ１等
のビタミン、例えばアンピシリン等の抗生物質等の他の
成分も培地に加えてよい。

形質転換体の培養は、通常、ｐｌ（５，５〜８．５（好
ましくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好ましくは
２５〜３８℃）で５〜５０時間行われる。

このように製造された保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰは
通常培養された形質転換体の細胞中に存在するので、細
胞を濾過あるいは遠心分離によって集め、その細胞壁お
よび／または細胞膜を常法（例えば超音波および／また
はリゾチームによる処理等）により破壊し、破壊細胞を
得る。この破壊物より、天然または合成蛋白の精製およ
び単離に通常用いられる常法（例えば８ＭＪＩＲ素水溶
液、６Ｍグアニジン等の適当な溶媒による蛋白の溶解、
透析、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー等）で保護ペプチド融合α−ｈＡＮ
Ｐを精製および単離することができる。

α−ｈＡＮＰは、保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰを、適
当なプロテアーゼ（例えばアクロモバクタ−・プロテア
ーゼＩ（ＡＰＩ）等）による処理または化学的方法（例
えば臭化シアンによる処理）により切断して調製するこ
とができる。保護ペプチドのＣ末端がリジンである場合
は、ＡＰＩによる処理を用いることが好ましい。ＡＰＩ
は既知の酵素である［ビオキミカ・エト・ビオフイジ力
・アクタ、６６０．５１（１９８１）　］が、組換えＤ
ＮＡ技術により調製された融合蛋白をＡＰＩ処理により
好ましく切断することができることは知られていない。

この方法は保護ペプチドとその分子内にリジンを有しな
い目的ペプチドとの間にリジンを有するペプチドよりな
る融合蛋白の切断に好適に用いることができる。

融合蛋白の切断は、ｐＨ５〜１０．２０〜４０℃（好ま
しくは３５〜４０℃）で、例えば緩衝液、尿素水溶液等
の水溶液中で２〜１５時間行えばよい。

後記実施例において、融合蛋白は、先ず８Ｍ尿素を含有
するｐＨ５の緩衝液中、次いで４Ｍ尿素を含有するｐＨ
９の緩衝液中でＡＰＩにより処理される。この条件下で
は融合蛋白はリジン部位において切断され、産生したα
−ｈＡＮＰは自然に再構成される。

このように産生されたα−ｈＡＮＰは、得られた培養物
より、上記の常法で精製、単離される。

以下に、この明細書に添付した図について説明する。

図中の若干のものにおいては、オリゴヌクレオチドは　
□　□または□　　の記号 （記号中、・はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりホ
スホリル化された５′−末端を意味する）で示され、ブ
ロックされたオリゴヌクレオチドは−、ｍ　、ｍ、−蟲
一、−一または一＾−の記号（記号中、Δはライゲート
された位置を意味する）で示される。

特に断わり書きのない限り、この明細書においてＤＮＡ
配列のＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔは各４式：を意味し、５′−末端
Ａ％Ｇ、Ｃ％Ｔは各４式：を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ
、Ｃ，Ｔは各４式：を意味する。

以下の実施例において、Ａｐ、　Ｇｐ、　Ｃｐ、　Ｔｐ
は各４式： を意味し、３′−末端ＡＯＨ，ＧＯＨ，ＣＯＨ％ＴＯＨ
は各４式： を意味し１，５′末端ＨＯＡｐ、　ＨＯＧｐ、　ＨＯＣ
ｐ、　ＨＯＴｐは各４式： ％式％ 式： を意味する。ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｃ
Ｅはシアンエチルである。

オリプ゛ヌクレオチドのモノ（またはジまたはトリ）マ
ーは、常法例えば広瀬らの方法［蛋白質・核酸・酵素２
５．２２５（１９８０）　］により調製することができ
、カップリングは、例えばセルロースまたはポリスチレ
ン・ポリマー上でホスホトリエステル法［ニュークレイ
ツク・アシッド・リサーチ、且、　１６９１　（１９８
１）、ニュークレイツク・アシノド・リサーチ、す、　
１７５５（１９８２）コにより行うことができる。

以下の実施例はこの発明を説明するためのものでありこ
れにより制限されるものではない。

実施例において、使用した酵素（例えば制限酵素）は市
販品で入手可能なものであり、酵素の使用条件は当業者
にとっては、例えば市販の酵素に添付の用法を参照すれ
ば、自明のことである。

さらに、実施例において１ボリスチレンボリマーヨとは
アミノメチル化ポリスチレン・ＨＣｌ、ジビニルベンゼ
ン含量１％、１００〜２００メツシユ（販売元ペプチド
・インスティテユート・インク）を意味する。

実施例Ｉ ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ａ）１７）の合成： （１）　ＤＭＴｒＯＴｐｏＣ”２ｐｏｌｏ−スクシニル
ポリスチレンポリマーの合成 １　）　ＨＯＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマーの
調製： 反応用シリンジ中のＤＭＴｒＯ−ＩＯ−スクシニルポリ
スチレンポリマ−（５１，８ｍｇ、　１０．３７μモル
）［ニュークレイツク・アシッド・リサーチ１０゜１７
５５　（１９８２）に記載の方法により調製］に、ジク
ロロメタン（２ｍ）中の５％ジクロロ酢＃（ＤＣＡ）溶
液を加える。１分間放置した後、混合物を窒素気流でガ
ラスフィルターを通し濾過する。ＤＣＡ処理を２回以上
繰り返す。ポリマーをジクロロメタ’７（２ｍＱＸ３）
、メタノール（２ｍｕｘ３）およびピリジン（２ｍＱｘ
３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥して、ポリマー付力
ロ物■を得る。

Ｎ　）　ＤＭＴｒＯＴｐｏＣＢ２ｐｏ−の調製：蛋白質
・核酸・酵素２５　、２５５（１９８０）に記載の方法
で調製したＤＭＴｒＯＴｐｏＣ”ｐｏ−ＣＥ　（３２，
４ｍｇ、　８．１２μモル）を、室温で３０分間トリエ
チルアミン−アセトニトリル混液（１：　ｌｖ／ｖ、　
５ｍＱ）で処理する。このようにして得たホスホジエス
テルダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣ””ｐｏ−）を乾燥
し、水はピリジンとの共沸混合物（２ｍＱＸ２）として
分離する。

ｉ）カップリング： ダイマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣ”ｐｏ−）とメシチレン
スルホニルニトロチアゾリド（ＭＳＮＴ　）　（８０ｍ
ｇ　）をピリジン（ｏ、ｓｍσ）に溶解する。溶液をポ
リマー付加物１とともに反応用シリンジｔこ加え混合物
を室温で１時間振盪する。反応混合物を窒素気流でガラ
スフィルターを通して濾過し、ピリジン（２ｍｎｘ３）
で洗浄し、ポリマー付加物■を得る。

ｉｖ　）反応していない５′−ヒドロキシ基のアセチル
化： 上記で得られたポリマー付加物■に、ピリジン（０，９
ｍＱ　）および無水酢酸（０，１ｍＡ）を加え、混合物
を１５分間振盪する。反応液をガラスフィルターを通し
て濾過し、得られたポリマーをピリジン（２ｍＱｘ３）
、メタノール（２１１１１１Ｘ　３　）およびジクロロ
メタン（２ｍｕｘ３）で順次洗浄し、窒素気流で乾燥す
る。このポリマー付加物（ＤＭＴｒＯＴｐｏＣ’ｐｏＴ
ｏ−スクシニルポリスチレンポリマー）は次の力７ブリ
ング工程に使用した。

（２）　ＤＭＴｒＯＴｐｏＣ””ｐｏＣ””ｐｏｒｐｏ
ｃ””ｐｏｒｏ−スクシニルポリスチレンポリマーの合
成： 上記＜１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＩｐｏＣ”ｐｏ
ＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマートＤＭＴｒＯＴ
ｐｏＣ”ｐｏＣ”ｐｏＣＥ　（４４，９ｍｇ　）よりＤ
ＭＩｒＯＴｐｏＣＢ”ｐｏｃ””ｐｏＴｐ。

ｃＢ　ｚｐｏτＯ−スクシニルポリスチレンポリマーを
合成する。

（３）　ＤＭＴｒＯＡ８７′ｐｏＧｉＢｐｏＡ８７′ｐ
ｏＴｐｏｃＢ２ｐｏＣＢ２ｐｏＴｐｏＣ”ｐｏｒｏ−ス
クシニルポリスチレンポリマーの合成： 上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯｒｐｏＣ””ｐ
ｏｃ”ｐｏＴｐｏＣＢ２ｐｏＴｏ−スクシニルポリスチ
レンポリマーとＢＺ　　　ｉＢ　　　Ｂ２ ＤＭＴｒＯＡ　　ｐｏＧ　　ｐｏＡ　　ｐｏＣＥ（４８
，５ｍｇンより、開τｒＯＡ’ｐｏＧｌＢｐｏＡ””ｐ
ｏＴｐｏｃＢ”ｐｏｃ”ｐｏＴｐｏｃＢ２ｐｏＴｏ−ス
クシニルポリスチレンポリマーを合成する。

（４）　ＤＭＴｒＯＣＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＡＢ２
ｐｏＧｉＢｐｏＡＢ”ｐｏ工ｐｏｃＢｚｐｏＣ”ｐｏＴ
ｐｏＣＢ”ｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポリマー
の合成： 上記（１）と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＡ　　ｐｏＧ　
　ｐｏＡｐｏｒｐｏｃ””ｐｏＣ””ｐｏＴｐｏＣ””
ｐｏＩｏ−スクシニルポリスチレンポリマーとＤＭＴｒ
ＯＣＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏｃＥ　（４５，１ｍｇ　
）より、ＤＭＴｒＯＣ”ｐｏＧ′ＬＢｐｏ？ｐｏＡ””
ｐｏＧｉＢｐｏＡ””ｐｏｆｆｐ。

ＣＢ２ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏｃＢ２′ｐｏＴｏ−スクシニ
ルポリスチレンポリマーを合成する。

（５）　ＤＭＴｒＯＣＢ２ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＣＢ２
ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＡ”２ｐｏＧｉＢｐｏＡ”ｐｏｒ
ｐｏｃ””ｐｏＣ””ｐｏＴｐｏｃＢ２ｐｏＴｏ−スク
シニルポリマーの合成： 上記（１〉と同様の条件で、ＤＭＴｒＯＣ”２ｐｏＧｉ
Ｂｐｏｒｐ。

ＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＡ”ｐｏ？ｐｏＣＢ２ｐｏＣ”２
ｐｏｌｐｏＣ””ｐｏＴＯ−スクシニルポリスチレンポ
リマーとＤＭＴｒＯＣ””ｐｏＴｐ。

ＧｌＢｐｏＣＥ（４５、１ｍｇ　）より、ＤＭＴｒＯＣ
Ｂ２ｐｏＴｐｏＧｉＢｐ。

Ｃ””ｐｏＧ　ｉＢｐ、ＪＴｐｏＡ”ｐｏＧ’”ｐｏＡ
””ｐｏＴｐｏＣＢ”ｐｏＣ””ｐｏＩｐ。

Ｃ”ｐｏＴｏ−スクシニルポリスチレンポリマー（６０
ｍｇ）を合成する。この最終工程で、反応していない５
′−ヒドロキシ基は、アセチル基で保護する必要はない
。

（６）　）ｌＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの合成： ＤＭＴｒＯＣＢ２ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＣＢ２ｐｏＧｉ
ＢｐｏＴｐｏＡＢ２ｐｏＧｉＢｐ。

Ａ”ｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＣＢ２ｐｏｒｐｏｃ””ｐｏｌ
ｏ−スクシニルポリスチレンポリマー（６０ｍｇ）を、
封管中、３７℃で１、ＩＭ　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−
テトラメチレングアニジウム・ピリジン−２−アルドキ
シメート［ジオキサン−水（１：１ｖ／ｖ、１ｍｃ）中
］で２０時間処理する。反応混合物に２８％Ｃｗ／ｗ　
）アンモニア水（１２ｆｆｌ１１　）を加え、混合物を
６０℃で５時間加熱する。固体ポリマーを濾別し、水（
１０ｍ１１　）で洗浄する。ａ液と洗液を蒸発乾固し、
残渣を室温で８０％酢酸水溶液（２５ｍＱ　）で１５分
間処理する。溶媒を除去した後、残渣を０．ＩＭＮ酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７，５，２５ｍＢに
溶解し、ジエチルエーテル（３Ｘ２５ｍＱ　）で洗浄す
る。水層を蒸発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，５，２ｍＱ　）に溶解す
ると、溶液中に粗ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧ
ｐＡｐｌｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨが得られる。

（７）　ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴ
ｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴＯＨの精製１）粗生成物の最初の
精製はバイオゲルＰ２（バイオラッド）　Ｇ２４ｘ２．
６ｃｍＩＤ）カラムクロマトグラフィにより行う。最初
の溶出ピークに相当する両分（０，１ｍＭＥＤＩＡを含
有する５０ｍＭ酢酸アンモニウム、流速：１ｒｎＱ／分
）を集め、凍結乾燥して最初の精製物を得る。

■）最初の精製物の２回目の精製はＣＤＲ−１０（三菱
化成）　（２５ｃｍ　ｘ　４．６ｍｍＩＤ　）を用いた
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により１Ｍ酢酸
アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）含水エタノールから４
．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）含水エタノ
ールまでの直線勾配（８０分間、流速：１ｍＱ／分、６
０°Ｃ）を用いて行い、２回目の精製物を得る。

１１）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬＣ
［Ｒｐ−１８−５ａ　（Ｘ　７７　）　（メルク）、１
５ｃｍＸ４ｍｍＩＤ　］により、０．１Ｍ酢０．１Ｍ酢
酸アンモニラ１Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）
アセトニトリル水溶液までの直線勾配（４０分間、１．
５ｍＱ／分、室温）を用いて行い、最終精製物を得る。

（ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＣｐＴｐＣｐＴＯＨ）（８）オリゴヌクレオチド（ＨＯ
ＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐｌｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴ
ｐＣｌ）ＴＯＨ）の分析１）ホスホジェステラーゼによ
る消化 ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＣｐｒＯＨ（１０に、５、国）、ｏ、　２Ｍ　　
ＭｇＣ１ｚ　（２０４）、０．２Ｍ　　Ｔｒｉｓ−）Ｉ
Ｃ１（ｐ）Ｉｓ、　５　’）　（２０縛）および０．１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ（１４４，９バ）の混合物をホスホジ
ェステラーゼ（１０単位、ｌＯＳ　）で３７℃で２０分
間処理し、次いで１００℃で２時間加熱する。

ｉ　）　ＨＰＬＣ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ［ＣＤＲ
−１０（三菱化成）、２５ｃｍ　Ｘ　４．６ｍｍＩＤコ
により水〜２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の
直線勾配（４０分間、流速：１．５ｍＡ／分、６０°Ｃ
）を用いて分析する。標準品の面積と比較することによ
り、各ピーク面積からそのヌクレオチド組成を決定する
。

計算値：　ｐｃＯＨ４，０００，ｐＡＯＨ２，０００，
ｐＴＯＨ５，０００゜ｐＧＯＨ３，０００ 実洪１値：　ｐｃＯＲ３，７７０，ｐＡＯＨ２，０２６
，ｐＴＯＨ５，２３７゜ｐＧＯＨ２，９６８ 害」■礼主 オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方法と同様
にして製造する。

（１）　　ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＩｐｒｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａｌｌ） （２）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＣｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐｌｐＴｐＣｐＡＯｌ（（Ａｌ１） （３）　　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＡ
ｐＴｐＧｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ａｌ１）（４）　　ＨＯＴ
ｐｌｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣｐＧＯＨ（Ａｌ１＞ （５）　　ＨＯＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ａｌ１）（６）　　ＨＯ
ＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴＩ）Ａｐ
ＧｐＣＯＨ（Ａｌ１）（７）　　）ＩＯＡｐＡｐＧｐＣ
ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＡＯＨ（
Ａｌ１）（８）　　ＨＯＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＧｐ
ＧｐＴｐＧｐＧｐＣｐＣｐＧｐＩＯＨ（Ａｌ１）３°ゝ
゛°“ｐＣｐＣｐＡｐ”′”ｐＣｐＧｐＧｐＣｐＣｐ”
ｐＣｐＣｐ””（ＡＨＩＯ）３”Ｏ）　ＨＯＡｐ”ｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐ”ｐＣｐＧｐＧｐＴ°
’（ＡＨＩＩ）（１１）　ＨＯＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＧｐＧＯＨ（Ａｌｌ２
） （１３）　ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＧｐＡｐＣＯＨ（Ａｌｌ４） ３”ゝ）ｌＯＧｐＧｐｃｐ”′°“ｐＡｐＡｐＣｐ“′
°“′”“ｐｃＯＨ，、、□１．＞（１６）　ＨＯＣｐ
ＧｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＩｐＡｐＧＯＨ（Ａ
ｌｌ７）（１７）　ＨＯＧｐＡｐＩｐＣｐＣｐＴｐＡｐ
ｌｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａｌｌ８）友】ｄ（’ＩＩユ オリゴヌクレオチドの合成−： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方法と同様
にして製造する。

（１）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２）　　ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｂ）（３）　　　ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＩｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４）
　　ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＩｐＴｐ’ｒｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５）　　ＨＯＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＡｐｒｐＴｐＣｐｒｐＧｐＡｐＡｐＡｐｒ
ｐＧｐＡＯＨ＜Ｅ）（６）　　　ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐｌｐＴｐＣｐＡＯＨ
（Ｆ）（７）　　ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡ
ｐＣｐＡｐＡｐＴｐＩｐＡｐＡｐｒＯＨ（Ｇ）（８）　
　ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈ）（９）　　）ＩＯＣｐＡ
ｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＩｐＡｐ
ＡｐＣＯＨ（Ｉ）（１０）　ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＩｐＡＯＨ（Ｊ
）（１１）　ＨＯＴｐＡｐＧｐｌｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋ）（１２）　Ｈ
ＯＣｐｌｐＴｐＩｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＣｐＴｐＩＯＨ（Ｌ）（１３）　　ＨＯＧｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴＯＨ（Ｍ’
　）（１４）　ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ（
Ｎ’）（１５）　ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ）（１６）　Ｈ
ＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ（
Ｎ）（１７）　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐｒｐＧｐ
ＧｐＣｐＴＯＨ（ＳＡ）（１９）　）ＩＯＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐｌｐＴｐＩＯＨ（ＳＣ）
（２１）　　ＨＯＴｐｒｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ）（２２）　ＨＯ
ＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣ
ＯＨ（ＳＦ）＜２３＞　）ｌＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯ）Ｉ　（ＳＧ
）（２４）　　ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＲ）去」ｄ礼↓ オリゴヌクレオチドの合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の方法と同様
にして製造する。

（１）　　ＨＯＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐ
ＧｐＣＯＨ（Ｎｐｌ）（５）　　ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐ’ｒｐＧＯＨ（
Ｎｐ３）（７）　　ＨＯＩｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡＯ）ｌ　（Ｃｄｌ）（
８）　　ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧ
ｐＴｐｌｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｃｄ２）（９）　　ＨＯＣ
ｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐｒｐＧＯ
Ｈ（Ｃｄ３）（１０）　ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）（１
１）　ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１２）　ＨＯＣｐＧ
ｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐ
ＡＯＨ（）＋２）（１３）　ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（Ｉｔ）
（１４）　ＨＯＧｐＡｐｒｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＣｐＴｐＧＯＨ（Ｃｄ４）（１５）　ＨＯＧｐＴｐＡｐ
ＴｐＣｐＧｐｒｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧＯＨ（Ｃｄ５）（
１６）　ＨＯＡｐＣｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴ
ｐＡｐＣＯＨ（Ｃｄ６）（１７）　ＨＯＡｐＧｐＧｐＧ
ｐｒｐＧｐＧｐＣｐＧｐＡｐ’ｒｐＧＯＨ（Ｃｄ７）（
１８）　ＨＯＡｐＡｐＴｐｒｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣ
ｐＣＯＨ（Ｃｄ８）Ｗ乱立 合成ｔｒｐプロモータ■遺伝子の構築およびクローニン
グ（第６．７図に示す）： ｔｒｐプロモーター■遺伝子を実施例７に記載のｊｊ法
と同様の方法（第６図に示す）で構築する。

合成遺伝子はｐＢＲ３２２（宝酒造、ＮＥＢ等より市販
品として入手できる）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と
ライゲートし、続いて旦、装置ＨＢＩＯ１（ＡｌＣＣ３
３６９４）をライゲーション生成物で形質転換する。Ｒ
Ａｍｐでかつ５Ｔｅｔの形質転換体から得たプラスミド
をＨｐａＩで消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）でハンド（４，１ｋｂｐ　）を確認し、続
いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥで９０ｂ、　ｐ、の
バンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ
消化による５６ｂ、　ｐ、の断片はＰＡＧＥでサイズマ
ーカーと比較することにより確認した。このプラスミド
をｐＴｒｐＥＢ　７と命名し、発現ベクターの構築に使
用した。

火」Ｃ礼且 ｔｒｐプロモーターベクター（ｐＢＲ３２２ｔｒｐ　）
の構築およびクローニング（第８図に示す）ニブラスミ
ドｐＢＲ３２２（９，４）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化する。６５℃で５分間
力ロ熱して反応を停止許せ、０．８％アガロースゲル電
気泳動により断片を分離し、３７５ｂ、　ｐ、の小さい
断片（５００ｎｇ　）を得る。一方、プラスミドｐＴｒ
ｐＥＢ７　（ｔｏ＜　）をＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩ
で消化し、続いて調製ゲル電気泳動を行い、４０９４ｂ
、　９．の大きな断片（５（）を得る。ｐＴｒｐＥＢ　
７のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（４０９４ｂ、　ｐ、
、２００＜　）を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（３７５ｂ、ｐ、、１０１００ｎと、Ｔ４リガ
ーゼ（宝酒造、３６０単位）を含有するライゲーション
バッファー［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２０ｍＭＤＴＴ、　　１
　ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン、５０　ｇ　／　
ｍ１ｌＢＳＡコ（２０縛）中、１５°Ｃで、−晩、ライ
ゲートする。このライゲーション混合物で旦、装置ＨＢ
ＩＯＩをＫｕｓｈｉｎｅｒの方法［Ｔ、　１（６ｎｉａ
ｔｉｓら、モルキュラー・クローニング、ｐ２５２（１
９８２）、コールド・　スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリーコにより形質転換し、テトラサイクリン（２５ｘ
　／　ｍＱ　）を含有するプレート上にテトラサイクリ
ンに耐性の形質転換体を得る。形質転換体より単離され
たブラスミ　ドｐＢＲ３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ　（３７５ｂ、ｐ、、４０９４ｂ、ｐ、）および
ＨｐａＩ　（４４６９ｂ、　ｐ、　）で消化し、７．５
％ＰＡＧＥおよび０，８％アガロースゲル電気泳動によ
りｔｒｐプロモーター遺伝子を確認した。

衷夏遭ユ 合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の構築（第９図に示す
）ニ ブロックＩ’　、ｎ′および■′の各オリフ゛ヌクレオ
チド（Ｂ−Ｍ’）（各０．２ｎモル）を、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（ＢＲＬ、２．５単位）を用い、ライ
ゲションバンファー（７０４）　中、３７℃で、１時間
ホスホリル化する。各ブロックの反応混合物にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（３００単位）および２０ｎｎＭＡＴＰ（２
４）を加え、混合物を１５℃で３０分間インキュベート
した後、６５℃で１０分間加熱して反応を停止させる。

これらの各ブロック（１’、Ｉ’　およびＩＩＩ’　　
）の反応混合物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３６０
単位）および２０ｍＭ　ＡｒＰ（２１１）の存在下にホ
スホリル化していないオリゴヌク口しオチド（Ａ、　Ｎ
’　　）件混合する。混合物を１５℃で１時間インキュ
ベートした後、最終ライゲーション生成物を２〜１６％
の勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動ＣＰＡＧＥ　
）により精製し、１０６ｂ、ｐ、の合成ｔｒＴ）プロモ
ーター■遺伝子を得る。

Ｘ臭贋１ ダブルｔｒｐプロモーターベクター（ｐ３２２ｄｔｒｐ
ｓ　）の構築およびクローニング（第１０図に示す）ニ
ブラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩおよびＣ１
ａＩで消化し、続いて調製アガロースゲル電気泳動を行
い４４４６ｂ、　ｐ、の大きな断片を得る。この断片（
４４４６ｂ、ｐ、）を実施例７で得たｔｒｐプロモータ
ー■遺伝了（１０６ｂ、ｐ、　）とＴ４ＤＮＡの存在下
にライゲートする。このライゲーション混合物でＥ、　
、　ｃｏｌｉＨＢｌｏｌを形質転換し、アンピシリンお
よびテトラサイクリンに耐性の形質転換体を得る。この
形質転換体より得られたプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐｓ
を、制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した。Ｃ
１ａＩ−ＢａｍＨＩ（３２５ｂ、ｐ、　）、ＨｐａＩ　
（１０７ｂ、　ｐ、）およびＡａｔ　ＩＩ　−Ｃ１ａＩ
（２８７ｂ、ｐ、　）。

実施例９ 合成ｔｒｐプロモーター■のＤＮＡ断片の一部を持つペ
プチドＣｄ遺伝子の構築（第１１図および第１２図に示
す）ニ ブロックＩ″、■″および■“の各オリゴヌクレオチド
（０，２ｎモル）（Ｎｐｌ−Ｃｄ８、実施例４に示す）
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２，５単位）を用
い、ライゲーションバッファー（６０ｓ１１　）中　３
７℃で、１時間ホスホリル化する。各ブロックの反応混
合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３６０単位）および２０ｍ
ＭＡＴＰ　（２Ａ　）を加え、混合物を１５℃で１時間
インキュベートする。この各ブロックの反応混か物を合
わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３６０単位）および２０ｍ
ＭＡＹＰ　（２Ｉｔ　）と共に、１５℃で、−晩、イン
キュベートし、続いて８０℃で１０分間加熱する。

混合物に５ＱＯｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｚｏｆｉ　
）およびＥｃｏＲＩ　（２０単位）を加える。３７°Ｃ
で２時間インキュベートした後、最終ライゲーション生
成物を１５％のＰＡＧＥで精製し、合成ｔｒｐプロモー
ター■のＤＮＡ断片の一部を持つペプチドＣｄ遺伝子を
得る。このＤＮＡ配列を第１２図に示す。

実施例１０ プラスミドｐＣｄ　７の構築およびクローニング（第１
３図に示す）ニ プラスミドｐ　７　ｔｒｐ　（４５４４ｂ、　ｐ、）（
このプラスミドを含有するＥ　、　ｃｏｌｉ　Ｆ−９が
ＦＥＲＭ　ＢＰ−９０５として微−［研に寄託されてい
る。英国特許出願公開番号第２１６４６５０号参照）を
ＨｐａｌおよびＥｃｏＲＩで消化し大きな断片（４５１
０ｂ、　９．　）を得る。これを実施例９で得た合成ｔ
ｒｐプロモーター■のＤＮＡ断片の一部を持つペプチド
Ｃｄ遺伝子とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲート
する。このライゲーション混合物を用いテＥ　、　ｃｏ
ｌｉＨＢｌｏｌを形質転換させる。”Ａｍｐの形質転換
体より得られるプラスミド（ｐＣｄｙ）を制限エンドヌ
クレアーゼ分析により確認した。（１ａＩ−ＢａｍＨＩ
（５４３ｂ、ｐ、）、Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩｌｌ　（２
７３ｂ、　ｐ、　）、Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ（９３ｂ、
　９．　）およびＡａｔ　Ｉｆ　−Ｃ１ａＩ（１８０ｂ
、　Ｉ）、）。

去】ｕｌｌｌ プラスミドｐＣｄ　７　ｔｒｐｓｄの構築およびクロー
ニング（第１４図に示す）ニ プラスミドｐｃｃｔ　７をＣ１ａＩおよびＢａｍＨＩで
消化した小さな断片（５４３ｂ、　ｐ、　）を得、これ
をｐ３２２ｄｔｒｐＳ　（実施例７）のＣ１ａＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（４２２３ｂ、　ｐ、）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼの存在下にライゲートする。このライゲーション混合
物でｉｉ、　、ｃｏｌｉＨＢｌｏｌを形質転換する。

ＲＡｍｐの形質転換体より得られるプラスミド（ｐｃｄ
７　ｅｒｐｓｄ）を制限エンドヌクレアーゼ分析により
確認した。ＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７５，５７５ｂ
、　ｐ、　）、Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ（５４３ｂ、ｐ、
　）、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ（１０５７ｂ、ｐ、　）、
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（４５０ｂ、　ｐ、　）、Ｈｉ
ｎｄｌ［［−ＢａｍＨＩ（２７０ｂ、　ｐ、　）および
Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩ［［（２７３ｂ、ｐ、　）。

実施例１２ リンカ−ＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子の調製（第１
５図に示す）ニ ブロックＩ″′および■″′の各オリゴヌクレオチド（
Ａｌ１−　ＡＨＩ７　）　（各０．２モル）を、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（２，５単位）を用い、ライゲ
ーンヨンハッファ−（７０４）中、３７℃で、１時間、
ホスホリル化する。各ブロックの反応混合物にτ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ（３００単位）および２０ｍＭ　ＡＹＰ（
２ｐ）を加え、混合物を１５℃で３０分間インキュベー
ト［る。６５°Ｃで１０分間加熱して反応を停止させる
。二つのブロックＣＩ”’およびＩ［’）の反応ｉ１合
物を合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）および
２０ｍＭ　ＡＹＰ　（２４）の存在下に、ホスホリル化
してないオリゴヌクレオチド（ＡＨＩ　、　ＡＨｌｇ）
と混合する。混合物を１５℃で１時間インキュベートし
た後、最終ライゲーション混合物を２〜１６％の勾配の
ＰＡＧＥにより精製し、リンカ−ＤＮＡを持つ１３４ｂ
、ｐのα−ｈＡＮＰ遺伝子を得る（第５図に示す）。

実施例１３ α−ｈＡＮＰ発現ベクターｐｃＬａＨｔｒｐｓｄの構築
およびクローニング（第１６図に示す）ニ ブラスミドｐ（ｄ　７　ｔｒｐｓｄを１ｉｎｄｎ［およ
びＢ、ａｍＨＩで消化し大きな断片（４７４３ｂ、ｐ、
’）を得、これをリンカ−ＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺
伝子（１３４ｂ、ｐ、　）とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在
下にライゲートする。このライゲーション混合物を用い
て旦、蛇旦ＨＢＩＯＩを形質転換し、形質転換体旦、凹
旧を得る。２Ａ叩（≧、　ｃｏｌｉＨｌ　）の形質転換
体より得られるプラスミド（ｐｃＬａＨｔｒｐｓｄ　）
　［ＣＬａＨ蛋白（ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ蛋
白）遺伝子を含有しており、そのＤＮＡ配列は第１７図
に示すコを制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認し
た。Ａａｔ　ｌｌ−Ｃ１ａＩ（２８７ｂ、ｐ、）、Ｃ１
ａＩ−ＢａｍＨＩ（４０７ｂ、　ｐ、　）、Ｃ１ａＩ−
ＥｃｏＲＩ（９３，１９８ｂ、　ｐ、　）、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ（１１６，１９８ｂ、　ｐ、　）、Ｈｉｎ
ｄｌｌ［−ＢａｍＨＩ（１３４ｂ、ｐ、　）およびＨｐ
ａＩ−ＢａｍＨＩ（１０７，４３９ｂ、ｐ、）。

尺五五旦 ペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰ　（ＣＬａＨ蛋白）を
フードする遺伝子の発現： アンピシリン５０＜／ｍｆＪ含有Ｌプロス（２９ｍＭ　
）中で一晩培養した、発現ベクター（プラスミドｐｃＬ
ａＨｔｒｐｓｄ　）含有のＥ　、　ｃｏｌｉＨｌの培養
物を、０．２％グルコース、０．５％カザミノ酸（カゼ
イン加水分解物）、５０ｔ４／ＩＱビタミンＢ１および
２５４／ｒｎＱア〉・ピシリン含有Ｍ−９培地（４ｏｏ
ｍｕ　）で希釈し、この旦、　ｃｏｌｉを３７℃で培養
する。培養液のＡ６００（６００ｎｍの吸光度）が０．
５となった時にβ−インドールアクリル酸（２ｍｇ／　
ｍｌｌ　ｚタノール、２　ｍＱ　）を加え、細胞を３時
間インキュベートする（最終Ａ　６００−１．８５）。

次に菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ。

４℃、５分間）により集める。

哀履五卦 α−ｈＡＮＰの分離および精製： （１）ペプチドＣＬａ融合ａ　−ｈＡＮＰ　（ＣＬａＨ
蛋白）の分離および精製： 実施例１４で調製した培養液（６００ｍＱ　）より得ら
れるｆａ潤菌体ペーストを１０ｍＭ　ＰＢＳ−ＥＤＴＡ
　（ｐＨ７，４）［１リツトル中ＮａＣ１（８，０ｇ、
　）、ＫＣＩ（ｏ、ｚｇ　）、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ
２０（２，９ｇ　’）、ＫＨ２ＰＯ４（０，２ｇ　）、
ＥＤＴＡ（３，７３ｇ　）　１８ａＩに懸濁し、細胞を
０″Ｃで超ｇ０１処理して破壊する。１５．００Ｏｒｐ
ｍで２０分間（４’Ｃ）遠心分離してペレットを集め、
これを６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＰＢＳ−Ｅ
ＤＴＡおよび２ｍＭβ−メルカプトエタノールの混合物
１３ｍ１ｌに懸濁し、懸濁液を０℃で超音波処理する。

この懸濁液を１５，０００ｒｐｍで２０分間（４°Ｃ）
遠心分離し、上清をフッ化ｐ−ニトロフェニルメチルス
ルホニル（ＰＭＳＦ　’）含有１０＋ｎＭ　ＰＢＳ−Ｅ
ＤＴＡ溶液に対し４℃で一晩透析する。透析画分を遠心
分離（１５，０００ｒｐｍ、　４℃。

２０分ｌ５ｆｌ）した後、ペレットを６Ｍグアニジン−
ＨＣｌ　、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００ｍＭジチ
オスレイトール含有の１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（１）Ｈ８，Ｏ）　（８ｍｍ　）に溶かし、溶液を
一晩放置する。この溶液を１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール含有１Ｍ酢酸（ｏ、５リツトル）を用い２回透析
し、トリスアミノメタンでｐＨ８，０に調整する。得ら
れる沈殿（融合蛋白；１５．２ｍｇ）を遠心分離（３，
００Ｏｒｐｍ、　１０分間）により集め、１０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄する。

（２）アクロモバクタ−・プロテアーゼＩ　（ＡＰ　Ｉ
　）によるペプチドＣＬａ融合α−ｈＡＮＰからのペプ
チドＣＬａの脱Ｗｔ： 前記で得た融合蛋白を８Ｍ尿素を含有する１０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）　（３０ｍＭ　）に懸
濁し、懸濁液をアクロモバクタ−・プロテアーゼＩ（Ａ
ＰＩ　）　（０，２５単位）（和光紬薬）と共に、３７
℃で、２時間、インキュベートする。反応混合物を蒸留
水（３ｏｍＱ）で希釈し、トリスアミノメタンでｐＨ９
，０に調整し、次いでＡＰＩ（０，２５単位）をさらに
加え、３７℃で２時間インキュベートする。反応液を１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　（１２
０ｍＱ　）で希釈し、酢酸でｐＨ７に調整する。この溶
液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したＳｐ−セファデックスＣ−２５カラム（１５
１１１Ｑ　）にかける。カラムは同じ緩衝液で洗浄し、
０．５Ｍ’塩化ナトリウム水溶液を含有する１０ｍＭリ
ン酸ナトリウｌ、緩衝液（ｐＨ８，０）で溶出し、部分
精製されたα−ｈＡＮＰ　（０，４ｍｇ　）含有画分を
集メル。

く３〉高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）：前記（
２）と同様にして得られプールしておいた画分を減圧濃
縮し、水（３ｏｏｍｕ　）に対し透析し、逆相ＨＰＬＣ
で精製して、純粋なα−ｂＡＮＰ（０，３ｍｇ）を得る
。

ＨＰＬＣ条件 （調製） カラム二手調製用ベックマンウルトラボア（φ１０１０
Ｘ２５０　） 流　速：２．５＋１１９／分 溶　出、　０．ＯＩＭ　トリフルオロ酢酸中１０％から
６０％までのアセトニトリルの直線勾 配；５０分間 検　出：　２１４ｎｍにおける吸光度 （分析） カラム：ベックマンウルトラボアＲＰＳＣ（φ４．６ｘ
７５ｍｍ　） 流　速：１ｍ１ｌ／分 溶　出：調製と同条件 保持時間：　１１．９分 この実施例により得られたα−ｈＡＮＰの）ＩＰＬｃ上
での保持時間はα−ｈＡＮＰ標準品（販売：船越）のそ
れと一致した。

（４）α−ｈＡＮＰのアミノ酸分析 試料を還元、カルボキシメチル化し、次いで６Ｎ塩酸で
、１１０℃で、２４時間加水分解する。α−ｈＡＮＰの
アミノ酸組成はウォーターズ社製アミン酸分析システム
を用いて求めた。

α−ｈＡＮＰｆ７）アミノ酸組成（１モル当りの残留物
）は計算値と一致した。

（５）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列分析α−ｈＡＮＰの
Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン法（ＤＡＢＩＴＣ法）　
［ＦＥＢＳレターズ、録、２０５　（１９７８）に記載
］により決定し、Ｎ−末端ＳｅｒおよびＬｅｕ配列を確
認した。Ｃ末端アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｐｈａ−Ａｒｇ−ｒ
ｙｒ　）はカルボキシペプチダーゼにより消化しそれに
続いてウォーターズ社製アミノ酸分析システムを用いる
アミノ酸分析を行って決定した０次いで、実施例で得ら
れたα−ｈＡＮＰの全アミノ酸配列は両方の方法を用い
て決定され、α−ｈＡＮＰが得られていることが確認さ
れた。

夫凰五旦 プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐｓｓの構築およびクロー
ニング（第１８図に示す）ニ プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩおよびＣ１ａＩで
消化する。大きな断片（４３４０ｂ、ｐ、　）を０．８
％アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼおよび１　ｍＭ　ＡＴＰの存在下に合成ｔｒｐプ
ロモーター■遺伝子とライゲートする。このライゲーシ
ョン混合物を用いてＴ、　、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを
形質転換する。プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２ｔｒ
ｐｓｓ　）を形質転換したクローンより分離し、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析により定性解析する。

分析データ：　Ｈｐａ　Ｉ；　４４４５ｂｐ、　Ｃ１ａ
Ｉ−Ｐｓｔ　Ｉ；３４ｂｐ Ｘ凰孤旦 プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ　−２の構築およびクロー
ニング（第１９図に示す）ニ プラスミドｐＣＬａ）ｌｔｒｐｓｄをＣ１ａｌおよびＢ
ａｍＨＩで消化する。小さい断片（４０７ｂ、ｐ、　）
を単離する。一方、ｐＢＲ３２２ｔｒｐｓｓをＣ１ａＩ
およびＢａｍＨＩで消化する。

大きい断片（４０９３ｂ、ｐ、　）を分離し、前記ＤＮ
Ａ（４０７ｂ、ｐ、）とライゲートする。このライゲー
ション混合物によりＥ、　、　ｃｏｌｉ）ＩＢＩＯＩを
形質転換させた後、所望のプラスミド（ｐｃＬａＨｔｒ
ｐ　−２）を形質転換したクローンより単離し、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析により確認した。Ｃ１ａＩ−Ｐｓ
ｔＩ　（８３４ｂ、　ｐ、　）、Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ
　（４０７ｂ、　ｐ、　）。

実施例１８ オリゴクレオドの合成： 実施例１の方法に準じて、下記のオリゴクレオチドを調
製する。

（１）　　）ｌＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐｒｐＣｐＧｐＡ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（Ｔｌ）（２）　　ＨＯ
ＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐｌｐＧｐＡｐＴ
ｐＣｐＩｐＣｐＧｐＡｐＧｏ）ｉ　（Ｔ２） （３）　　ＨＯＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＣｐＩｐＩｐＴｐ工ｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｔ３） （４）　　　ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯｌ（（Ｔ４） （５）　　　ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＩｐＴｐＴ
ｐＴｐｌｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｔ５）（６）　　ＨＯＴｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｔ６）実施
例１９ 合成ｆｄファージ・ターミネータ−の構築およびクロー
ニング（第２０図および第２１図に示す）：実施例７に
記載の方法と同様にして合成ｆｄファーブ・ターミネー
タ−を構築する（第２０図に示す）。

即ち、ＤＮＡオリゴマーＴ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５（
各０．４ｎモル）を混合し、１　ｍＭ　ＡＴＰの存在下
にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでホスホリル化する。

反応混合物を６５１０で１０分間加熱して酵素を不活性
化する。得られた混合物にＤＮＡオリゴマーＴ１および
Ｔ６（各０．８ｎモル）とＩ４ＤＮＡリガーゼを加える
。混合物を１５℃で３０分間インキュベートし、２〜１
６％の勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、
所望のＤＮＡ断片（４７ｂ、ｐ、　）を電気溶出により
回収し、ＢａｍＨＩおよび５ａｌ）で消化したｐＢＲ３
２２の大きい断片（４０８８ｂ、ｐ、　）に挿入とライ
ゲートする。このライゲーション混合物によりＥ　、　
ｃｏｌｉＨＢｌｏｌを形質転換させた後、所望のプラス
ミド（ｐｔｅｒ２１　）形質転換したクローンより単離
した。制限酵素分析：ＢａｍＨＩ−５ａｌＩ　（４７ｂ
、　ｐ、　）、ＡｖａＩ（８１７ｂ、ｐ、　）。

実施例２０ α−ｈＡＮＰ発現ベクタープラスミドｐｃＬａＨｔｒｐ
３ｔの構築およびクローニング（第２２図に示す）ニブ
ラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ　−２をＰｓｔＩおよび１３
ａｍＨＩで消化する。この消化混合物より小さい断片（
１２４１ｂ、ｐ、）を単離し、ｐｔｅｒ２１をＰｓｔＩ
およびＢａｍＨＩで消化して得られたｐｔｅｒ２１（７
）大きな断片（３００５ｂ、　ｐ、　）にライゲートす
る。

このライゲーション混合物でＥ−、ｃｏｌｉＨＢｌｏｌ
を形質転換して形質転換体Ｅ　、　ｃｏｌｉＨ２を得る
。ＲＡｍｐの形質転換体（互、装置Ｈ２）より得られた
プラスミドＣＬａＨｔｒｐ３ｔ　（ＣＬａＨ蛋白遺伝子
を含有する）を制限エンドヌクレアーゼ分析により確認
した。Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ　（９３ｂ、　ｐ、、１９
８ｂ、ｐ、　）、ＨｉｎｄｌｌＩ　−ＢａｍＨＩ　（１
３４ｂ、ｐ、）およびＰｓｔＩ−Ｃ１ａＩ−Ｘｈｏ　Ｉ
　（８３４ｂ、ｐ、、４１１ｂ、ｐ、）。

Ｘ厘里里 ≧１組１ｉ　Ｈ２を用いたα−ｈＡＮＰの製造：互、　
ｃｏｌｉ　Ｈｌの代りに≧、　ｃｏｌｉ　Ｈ２を用いて
実施例１４および１５と同じ方法でα−ｈＡＮＰを得る
。

このようにして得たα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列はアミ
ノ酸配列分析の結果既知のα−ｈＡＮＰのそれと一致し
ていることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は合成ｔｒｐプロモータＩ遺伝子、合成ｔｒ
ｐプロモータ■遺伝子および合成ｔｒｐプロモータ■遺
伝子のＤＮＡ配列をそれぞれ示す。 第４図および第５図はペプチドＣＬａ遺伝子およびリン
カ−ＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子のＤＮＡ配列およ
びそれに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示す。 第６図は合成ｔｒｐプロモータ■遺伝子の構築を、第７
図は合成ｔｒｐプロモータ■遺伝子の分子クローニング
をそれぞれ示す。 第８図はｔｒｐプロモータ・ベクター（ｐＢＲ３２２ｔ
ｒｐ）の構築とクローニングを示す。 第９図は合成ｔｒｐプロモータ■遺伝子の構築を示す。 第１０図はダブルｔｒｐプロモータ・ベクター（ｐ３２
２ｄｔｒｐｓ）の構築とクローニングを示す。 第１１図および第１２図は合成ｔｒｐプロモータ■のＤ
ＮＡ断片の一部を持つペプチドＣｄ遺伝子の構築および
そのＤＮＡ配列をそれぞれ示す。 第１３図はプラスミドｐｃｃｉ　７の構築およびクロー
ニングを示す。 第１４図はプラスミドｐＣｄ　７　ｔｒｐｓｄの構築お
よびクローニングを示す。 第１５図はリンカ−ＤＮＡを持つα−ｈＡＮＰ遺伝子の
構築を示す。 第１６図はａ−ｈＡＮＰ発現ベクターｐｃＬａＨｔｒｐ
ｓｄの構築とクローニングを示す。 第１７図はＣＬａＨ蛋白遺伝子のＤＮＡ配列を示す。 第１８図はプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐｓｓの構築と
クローニングを示す。 第１９図はプラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ−２の構築とク
ローニングを示す。 第２０図および第２１図は合成ｆｄファージ・ターミネ
ークーの構築とクローニングをそれぞれ示す。 第２２図はプラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ３ｔの構築とク
ローニングを示す。 第１図 ＥｃｏＲ工 ３’−ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡ［
二ＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴ’ｌ’ＡＣＴＣＧ−Ｅ
ｃｏＲ工 ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧ−３’ 丁ＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴへへ−５１ 第２図 ＥｃｏＲ工 ３’−ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣ
ＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧ−ＥｃｏＲ
よ りａｍ）Ｉ工 ＡＣＴＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧ−３’ＴＧＭＧＣＡＣ
ＭＣＴＡＴＣＣＴＡＧ−５’第１７図 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｅ
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Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 をコードする合成遺伝子。
2. （２）ＤＮＡ配列： コードする鎖：５′−ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＡ
   　ＴＣＣコードしない鎖：３′−ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＧＣ
   Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＧ【遺伝子配列があります】 で示される特許請求の範囲第１項記載の合成遺伝子。
3. （３）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 をコードする合成遺伝子を含有する組換えベクター。
4. （４）ＤＮＡ配列： コードする鎖：５′−ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＡ
   　ＴＣＣコードしない鎖：３′−ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＧＣ
   Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＧ【遺伝子配列があります】 で示される合成遺伝子含有する特許請求の範囲第３項記
   載の組換えベクター。
5. （５）α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 をコードする合成遺伝子を含有する形質転換体。
6. （６）ＤＮＡ配列： コードする鎖：５′−ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＡ
   　ＴＣＣコードしない鎖：３′−ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＧＣ
   Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＧ【遺伝子配列があります】 で示される合成遺伝子を含有する特許請求の範囲第５項
   記載の形質転換体。
7. （７）リジンをコードするＤＮＡ配列を保護ペプチドの
   Ｃ末端として有する合成保護ペプチド遺伝子。
8. （８）第４図のＤＮＡ配列で示される特許請求の範囲第
   ７項記載の合成保護ペプチド遺伝子。
9. （９）保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰのアミノ酸配列を
   コードする合成遺伝子を含有する発現ベクターにより形
   質転換された微生物を培地に培養し、得られる培養物よ
   り保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰを採取し、該保護ペプ
   チド融合α−ｈＡＮＰの保護ペプチド部分を除去するこ
   とを特徴とするα−ｈＡＮＰの製造法。
10. （１０）微生物が細菌である特許請求の範囲第９項記載
    のα−ｈＡＮＰの製造法。
11. （１１）細菌がエシェリヒア属に属する細菌である特許
    請求の範囲第１０項記載のα−ｈＡＮＰの製造法。
12. （１２）エシェリヒア属に属する細菌が大腸菌である特
    許請求の範囲第１１項記載のα−ｈＡＮＰの製造法。
13. （１３）合成遺伝子のα−ｈＡＮＰ遺伝子部分が、ＤＮ
    Ａ配列： コードする鎖：５′−ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＡ
    　ＴＣＣコードしない鎖：３′−ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＧＣ
    Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＧ【遺伝子配列があります】 で示される特許請求の範囲第９項記載のα−ｈＡＮＰの
    製造法。
14. （１４）保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰが第１７図に示
    されるアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第９項記載
    のα−ｈＡＮＰの製造法。
15. （１５）保護ペプチド融合α−ｈＡＮＰの保護ペプチド
    部分をＡＰＩの存在下に除去する特許請求の範囲第９項
    記載のα−ｈＡＮＰの製造法。
16. （１６）保護ペプチドと目的ペプチドとの間にリジンを
    有するペプチドよりなる融合蛋白をＡＰ I の存在下に
    切断する方法
17. （１７）第３図のＤＮＡ配列で示される合成ｔｒｐプロ
    モーターIII。