JPH0672152B2 - チモシンα１―フラグメント及び該化合物を含有する免疫調節剤 - Google Patents

チモシンα１―フラグメント及び該化合物を含有する免疫調節剤

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JPH0672152B2 JP57002917A JP291782A JPH0672152B2 JP H0672152 B2 JPH0672152 B2 JP H0672152B2 JP 57002917 A JP57002917 A JP 57002917A JP 291782 A JP291782 A JP 291782A JP H0672152 B2 JPH0672152 B2 JP H0672152B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫欠乏症、ヴイールス性感染、速い老化、腫
瘍形成の蓋然性及び特に癌の治療のために使用すること
のできる免疫調節作用を有する薬剤並びに作用物質とし
て該薬剤中に含まれるチモシンα１−フラグメントに関
する。
チモシンα１は配列 を有する胸腺の酸性ポリペプチドであり、ここで最初の
アミノ酸であるセリンはアセチル化されている。
チモシンα１−調剤は癌治療において及び免疫学的防御
装置の調節の範囲において臨床的に使用される（P.B.Ch
retienne等著、J.D.Cancertreatment Reports、第62
巻、第1787〜〜1790頁（1978年））。チモシンα１の胸
腺から単離することは非常に困難であるので、すでにそ
の全合成への方法が提示されている（J.A.C.S.第101
巻、第252〜254頁（1979年）、西ドイツ国特許出願P291
9592.4号明細書）。ヨーロロツパ特許公開公報第801079
97.1号明細書中に記載されているように、チモシンα１
のいくつかのフラグメントがより僅かな程度であるとし
てもチモシンα１と同様な免疫調節作用をすでに有して
いる。わずかに弱い作用にもかかわらず、免疫治療にお
いてチモシンα１のかわりにチモシンα１−フラグメン
トの使用は次のような利点を提供する。
1. チモシンα１は分子量3107でアミノ酸28個の比較的
大きなポリペプチドであり、その合成には困難が伴な
う。それに反し本発明によるチモシンα１−フラグメン
トは著しく小さいし、従つて極めて容易に、高収率でよ
り良好な純度で製造される。
2. チモシンα１−フラグメントの中には免疫刺激作用
を有するペプチドも免疫抑制作用を有するペプチドもあ
る。免疫刺激作用を有するフラグメントは主にＣ−末端
フラグメントであり、一方免疫抑制作用はＮ−末端フラ
グメントである。その異なる薬理学的特性に相応して、
これらフラグメントを個々に、又は組み合わせて目的の
免疫治療に使用することができる。
意外にも、すでに公知のフラグメントの特性をも有する
その他のチモシンα１のフラグメントも見い出された。
従つて、本発明の課題は免疫調節作用を有する薬剤であ
り、これは式R1−Val−Val−R2（R1はGlu−、Lys−Glu
−、Lys−Lys−Glu−、Glu−Lys−Lys−Glu−、Lys−Gl
u−Lys−Lys−Glu−又はThr−Lys−Asp−Leu−Lys−Glu
−Lys−Lys−Gluであり、R2は−Glu、−Glu−Glu、−Gl
u−Glu−Ala又は−Glu−Glu−Ala−Gluである）により
表わされるチモシンα１−フラグメント少なくとも１個
及び／又は該化合物の誘導体少なくとも１個を遊離の形
で又は薬理学的に認容性の塩の形で含有する。
更なる薬剤としてはチモシンα１−フラグメントとして
R3−Lys−Glu−R4（ここで、R3はＨ−、Lys−、Glu−Ly
s−、Lys−Glu−Lys−、Leu−Lys−Glu−Lys−、Leu
−、Asp−Len−又はLys−Asp−Leu−であり、R4は−
Ｈ、−Val、−Val−Val、−Val−Val−Glu−Glu、−Val
−Val−Glu−Glu−Ala又は−Val−Val−Glu−Glu−Ala
−Gluである）を含有する薬剤、チモシンα１−フラグ
メントとしてR5−Glu−Lys−R6（ここで、R5はＨ−、Le
u−Lys−、Asp−Leu−Lys−、Lys−Asp−Leu−Lys−、T
hr−Lys−Asp−Leu−Lys−であり、R6は−Ｈである）を
含有する薬剤、チモシンα１−フラグメントとしてR7−
Glu−Ala−R8（ここで、R7はＨ−、Glu−又はVal−Glu
−であり、R8は−Ｈ又は−Gluである）を含有する薬
剤、チモシンα１−フラグメントとしてR9−Glu−Ile−
Thr（ここで、R9はＨ−、Ser−又はSer−Ser−である）
を含有する薬剤、チモシンα１−フラグメントとしてR
10−Ala−Val−Asp（ここで、R10はＨ−、Ala−又はAsp
−Ala−である）を含有する薬剤、チモシンα１−フラ
グメントとしてThr−Ser−Ser−Glu−Ile−Thr−Thr−L
ys−Asp−Leu−Lys−Glu−Lysを含有する薬剤を挙げる
ことができる。
相応するチモシンα１−フラグメントも同様に本発明の
課題である。
本発明による薬剤は記載したチモシンα１−フラグメン
ト２個以上を含有していてもよい。本発明によるチモシ
ンα１−フラグメントの例は表１中に詳細に記載した。
これらのフラグメントは誘導体の形でも使用することが
できる。チモシンα１−フラグメントのＮ−末端基が付
加的なアミノ酸として、アセチルセリン、アセチルデヒ
ドロアラニン又はアセチルリジンを有している誘導体が
有利である。Ｎ−末端基にリジンが存在しないチモシン
α１−誘導体はＮ−末端基に付加的なアミノ酸としてリ
ジンを有することもできる。本発明によるチモシンα１
−フラグメントも常法で有利に薬理学的に認容性の酸又
は塩基を使用して相応する塩に変換することもできる。
チモシンα１−フラグメント及び／又はその誘導体の形
の作用物質の他に、本発明による薬剤は常用の、選択し
た投与法に好適な薬理学的に認容性の結合剤、担持剤及
びその他の助剤を含有していてよい。
本発明によるチモシンα１−フラグメントは常用のペプ
チド合成法を使用して製造することができる。例えば側
鎖の最大保護又は最少保護での従来の溶液合成法によ
り、又はポリマー担体上にペプチドを担持するメリーフ
イールドによる固相合成法又は鎖延長のためにペプチド
をポリマー結合活性アミノ酸を介して送達するポリマー
試薬法による固相合成法により製造される。
しかしながら、特に有利な方法は、本発明によるチモシ
ンα１−フラグメントを西ドイツ国特許出願公開第p291
9592.4号公報の方法により形成される。この方法によれ
ば、混合無水物法を用いてステツプ・バイ・ステツプ式
に配列延長により本発明のチモシンα１−フラグメント
を合成する。この際、特にウレタン基中に３級炭素原子
を有する保護基、例えば３級ブチロキカルボニル基、
α，α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシ−
カルボニル基及び２−（ｐ−ビフエニル）−プロピル−
２−オキシ−カルボニル基を使用し、副反応を立体妨害
により押さえ、混合無水物の大過剰を繰り返し使用する
ことを可能とする。
次の実施例は本発明によるチモシンα１−フラグメント
の製造及びその薬理学的効果を明らかにする。
使用した短縮形はIUPAC−IUP−提案に一致させた（J.Bi
ol.Chem.第247巻（1972年）第977〜983頁）。この際、
次の意味を表わす： Ddz:α，α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキ
シ−カルボニル、 Z:ベンジルオキシカルボニル、 Ac:アセチル、 OBuｔ:tert−ブチルエステル、 Mbh:4,4′−ジメチルオキシベンズヒドリル、 Me:メチル、 OBzl:ベンジルエステル、及び Buｔ:tert−ブチル。
次の実施例中に記載した製法は保護したチモシンα１−
フラグメントにおいて終わり、その保護基は次のように
脱離することができる： ａ） Ddz−保護基の脱離 Ddz−保護したペプチドエステルを塩化メチレン（無
水）中の５％溶液の形の無水のトリフルオル酢酸８〜10
倍過剰と混合し、室温で15〜30分間撹拌する。長いペプ
チドにおいては時間を長くする。酸に不安定な4,4′−
ジメトキシベンズヒドリル基を配列中に有する場合、Dd
z−保護基を30〜60分の間2.5％又は１％のトリフルオル
酢酸で脱離させる。反応の中断のためには溶液を−15℃
に冷却し、計算量のＮ−メチルモルホリン（＋10％）で
7.0〜7.5のpH値とする。
最初にアニソールの添加下に塩化メチレン中の50％溶液
の形のトリフルオル酢酸でtert−ブチルエステル基並び
にtert−ブチルエーテル基を脱離し、引き続き4,4′−
ジメトキシベンズヒドリル保護基を95％トリフルオル酢
酸／アニソールで脱離する。フラグメントがベンジルオ
キシカルボニル保護基及び／又はベンジルエステルを有
するならば、トリフルオル酢酸処理の前にアルコール溶
液中で炭素上のパラジウムの存在で水素添加することに
より常法で脱離する。
例１ 全面的に保護された（19−24）、Ddz−Lys（Ｚ）−Lys
（Ｚ）−Glu（OBUｔ）−Val−Val−Glu（OBuｔ）OMeの
製造 反応溶液A:先ずDdz−（20−24）−OMeを製造した。
ａ） Ddz−（24）−OMe、Ddz−Glu（OBuｔ）−OMe Ddz−Glu（OBuｔ）−OH 20ミリモルをアセトン中に溶
かし、当量のジアゾメタン（エーテル溶液）を加えた。
クロマトグラフイーにより単一な帯黄色油状物質の収率
100％。
ｂ） Ddz−（23−24）−OMe、Ddz−Val−Glu（OBuｔ）
−OMe Ddz−Val−OH7.5ミリモルをDdz−Glu（OBuｔ）−OMe5ミ
リモルと反応させ、ジペプチドとした。CHCl3/エタノー
ル93:7でシリカゲル上最終精製を行なう。このペプチド
はこの先の合成工程に影響を与えないDdz−脱離片を有
した。
ｃ） Ddz−（22−24）−OMe、Ddz−Val−Val−Glu（OB
uｔ）−OMe このトリペプチドを常法でセフアデツクスLH20上メタノ
ールを用いてクロマトグラフイーにかけることにより純
粋にした。メタノール及びCHCl3中に良好に溶けた。無
色油状物質：収率60％。
ｄ） Ddz−（21−24）−OMe、Ddz−Glu（OBuｔ）−Val
−Val−Glu（OBuｔ）−OMe Ddz−Glu（OBuｔ）−OH ６ミリモルをDdz−（22−24）
−OMe 2.98ミリモルと常法で反応させテトラペプチド
とした。セフアデツクスLH20/メタノールカラムに通す
と、無色ガラス状物質として生成物が94％の収率で得ら
れた。テトラペプチドはCHCl3、メタノール、ジメチル
ホルムアミド及びジオキサン中に良好に溶けた。薄層ク
ロマトグラフイーにおいて93:7、7:1及び85:10:5で単一
であり、ニンヒドリンで通常の紫色を示した。
ｅ） Ddz−（20−24）−OMe、Ddz−Lys（Ｚ）−Glu（O
Buｔ）−Val−Val−Glu（OBuｔ）−OMe Ddz−Lys（Ｚ）−OH ９ミリモルをDdz−（21−24）−O
Me 2.43ミリモルと常法で反応させてペンタペプチドと
した。振蘯工程の後、メタノール／セフアデツクスLH−
20カラムを介してクロマトグラフイーにより精製する
と、生成物が99％の収率で無色ガラス状物質として得ら
れた。
Ddz（20−24）−OMe 1.0gをジクロルメタン14ml中に溶
かし、トルフルオル酢酸0.7mlを添加し、Ddz−保護基を
脱離した。20℃で30分後、Ｎ−メチルモルホリン1.03ml
で中和した。この際、生じたゲルをジメチルホルムアミ
ド5mlを添加することにより再び溶かした。
反応溶液Ｂ Ddz−Lys（Ｚ）OH 693mgを無水の条件下にジクロルメ
タン15ml中に溶かし、−15℃に冷却し、Ｎ−メチルモル
ホリン152μ及びイソブチルオキシカルボニルクロリ
ド162μと強力な撹拌下に混合した。−15℃で８分間
反応させた後、上記溶液Ａを添加し、冷却することなし
に３時間撹拌した。
処理のために、反応混合物をクロロホルム100mlで希釈
し、０℃で0.5モルKHSO4−溶液、５％KHCO3−溶液及び
水で抽出し、真空中で30℃で濃縮した。
エチルアセテート／エーテルから結晶させた後、収率は
1.125g（理論値の91％）、融点216〜218℃（分解）であ
つた。
アミノ酸分析:Glu 2.20（２）、Val 1.92（２）、Lys 2.00（２）、 薄層クロマトグラフイー（シリカゲルメルクF254、0.25
0mm） 例２ 全面的に保護された〔18−24〕、Ddz−Glu（OBuｔ）−L
ys（Ｚ）−Lys（Ｚ）−Glu（OBuｔ）−Val−Val−Glu
（OBuｔ）OMeの製造 例１により得られたDdz〔19−24〕OMe 735mgから前記方法Ａに相応してDdz−保護基を取り除
き、Ddz−Glu（OBuｔ）−CHA（CHA＝シクロヘキシルア
ンモニウム塩）787mg及びイソブチルオキシ−カルボニ
ルクロリド97μからの反応溶液と方法Ｂに相応して５
時間反応させ、そこに記載されているように処理した。
酢酸エチルから結晶後、収率730mg（理論値の87％）、
アミノ酸分析:Glu 2.99（３）、 Val.2.00（２）、Lys1.91（２）。
例３ 全面的に保護された〔17−24〕、Ddz−Lys（Ｚ）−Glu
（OBuｔ）−Lys（Ｚ）−Glu（OBuｔ）−Val−Val−Glu
（OBuｔ）OMeの製造。
例２により得られたDdz〔18−24〕OMe 350mgから方法Ａに相応してDdz−保護基を取り去り、Dd
z−Lys（Ｚ）OH 186mgとイソブチルオキシカルボニル
クロリド43.2μと方法Ｂに相応して５時間反応させ、
そこに記載されているように処理する。
煮沸メタノールから二回再結晶した後、収率は245mg
（理論値の60％）である。アミノ酸分析:Glu3.38
（３）、Val 2.00（２）、Lys 2.80（３） 例４ 全面的に保護された〔25−27〕、Ddz−Glu（OBuｔ）−A
la−Glu（OBuｔ）OBuｔの製造。
Ddz−Ala−Glu（OBuｔ）OBuｔ1.5gから方法ＡによりDdz
−保護基を取り去り、方法Ｂに相応してDdz−Glu−（OB
uｔ）CHA 2.84g及びイソブチルオキシカルボニルクロ
リド0.62mlからの反応溶液と２時間反応させる。そこに
記載してあるように処理した後、セフアデツクスLH 20
上メタノール中でクロマトグラフイーにより精製し、エ
ーテル／ベンジン（40℃）から結晶化する。
収率 1.7g（理論値の85％）、融点88〜90℃ アミノ酸分析:Glu 1.70（２）、Ala1.00（１） 例５ 全面的に保護された〔20−25〕、Ddz−Lys（Ｚ）−Glu
（OBuｔ）−Val−Val−Glu（OBuｔ）−Glu（OBuｔ）OBu
ｔの製造。
例１により製造したDdz−〔20−24〕OH 250mg及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）7
3.5mgを無水テトラヒドロフラン20ml中に溶かし、０℃
でジシクロヘキシルカルボジイミド50mgと反応させ、次
いでHGlu（OBuｔ）OBuｔ65mgと反反応させるが、この
際、反応時間２時間は０℃で、４時間は20℃で行なう。
真空中30℃に濃縮し、酢酸エチル50ml中に取り込み、ジ
シクロヘキシル尿素を濾別し、この濾液を0.5M KHSO4
−溶液、５％KHCO3溶液及び水で抽出する。この有機相
を塩基性Al2O3（カラム３×10cm）を介して濾過し、こ
れを酢酸エチル250mlで後洗浄する。この溶離液を真空
中30℃で濃縮し、最終生成物が無色ガラス状物質として
純粋な形で残留する。収量160mg（理論値の52％） アミノ酸分析:Glu 2.90（３）、Val2.00（２）、Lys
0.99（１） 例６ 全面的に保護された〔25−26〕、Ddz−Glu（OBuｔ）−A
IaOBzlの製造。
方法Ｂに相応してDdz−Glu（OBuｔ）CHA 2.1gをイソブ
チルオキシカルボニルクロリド468μで活性化し、HCl
・AlaOBzl500mg及びＮ−メチルモルホリン443μと反
応させた。真空中30℃で濃縮した後、油状残分を酢酸エ
チル5ml中に取り込み、塩基性Al2O3のカラム（３×10cc
m）を介して濾過した。
酢酸エチル250mlで溶離し、真空中30℃で濃縮した後、
純粋な生成物が無色ガラス状物質として得られた。
収量:1.31g（理論値の96％） 例７ 全面的に保護された〔20−26〕、Ddz−Lys（Ｚ）−Glu
（OBuｔ）−Val−Val−Glu（OBuｔ）−Glu（OBuｔ）−A
laOBzlの製造 方法Ａに相応して、例６により製造したDdz〔25−26〕
−OBzl 176mgからDdz−保護基を脱離させ、330μで
中和し、20℃で真空中濃縮した。残分をジメチルホルム
アミド2ml中に溶かし、次に記載した配合物を加えた。
Ddz〔20−24〕OH250mg及びHOBT73.5mgをジメチルホルム
アミド3ml中に溶かし、０℃でジシクロヘキシルカルボ
ジイミド100mgで活性化し、前記のＨ〔25−26〕Bzlの溶
液と混合した。０℃で１時間、20℃で３日間反応させた
後、フラグメント〔20−25〕の合成に相応して後処理
し、精製した。
メタノールから再結晶させた後、収率は190mg（理論値
の58％）であつた。
アミノ酸分析:Glu 3.06（３）、Ala1.00（１）、Val
1.77（２）、Lys 1.05（１） いくつかの本発明によるチモシンα１−フラグメントに
ついて次の第２表中にRf−値を記載した。これらはシリ
カゲル薄層プレート、0.25mm、メルク60F254上で測定さ
れ、Rf×100値として表わした。
溶離剤1:n−ブタノール／ピリジン／氷酢酸／水 5:5:1:4（V/V） 溶離剤2:酢酸エステル／ピリジン／氷酢酸 ／水 15:20:6:11（V/V） 溶離剤3:n−ペンタノール／ピリジン/2−ブタノン ／蟻酸／水 40:28:11:5:15（V/V） フラグメントの記号は第１表のナンバリングによる。
例７ 本発明によるチモシンα１−フラグメントの薬理学的作
用を明らかにするために、薬理学的比較実験を実施した
が、ここで本発明によるフラグメントを一方では合成チ
モシンα１及び他方では公知のチモシンフラクシヨンN
O.５と対比させた。この薬理学的比較実験において一方
では混合リンパ細胞培養をそして他方ではＥ−ロゼツト
試験（Rosetten Test）を実施し、この際、α−アマニ
チンによる細胞のRNS−ポリメラーゼの付加的な抑制で
両方の試験法を実施した。この際、詳細には次の条件を
使用した： 1. 混合リンパ細胞培養（MLC）、α−アマニチン抑制 リンパ細胞培養倍地100μ中に二人の健康な供与者か
らの人末梢Ｔ−リンパ細胞（105T−細胞）を懸濁させ、
培地20μ中にα−アマニチン２μｇを添加してこれを
抑制する。引き続き、実験すべき試料0.004μｇを媒地2
0μ中に加える（応答細胞−調剤）。分離してマイト
マイシン−Ｃで遮断した105T−細胞を加え、媒地100μ
中の懸濁液とする（刺激細胞−調剤、これは常法でML
Cにおいて使用されると同様）。この培地（全容量240μ
）を37℃で120時間培養する。培養時間の最後の８時
間に3H−チミジン100μCiを培地を加える。細胞を単離
した後、液体シンチレーシヨン測定により3H−チミジン
取り込みを測定する。全測定を少なくとも３回二重盲検
で実施する。
評価：全MLC−培地において、α−アマニチン−抑制盲
検B1及びB2をあらかじめ又はあとから実施し、その後平
均値を出す:B＝（B1＋B2）/2、全MLC−測定を実施時間
により三つのグループに分ける。第１のグループの計算
は盲検B1に対し、中間のグループはＢに対し、最後のグ
ループは盲検B2に対し比較する。最も強い反応は合成チ
モシンα１で達せられ、この値を100％とした。他の全
結果をこれに対する相対百分率で記載した。
2. Ｅ−ロゼツト試験、α−アマニチン−抑制 ブロードナー（O.Brodner）により実施されるＥ−ロゼ
ツト試験においては、健康な供与者１人の人末梢Ｔ−リ
ンパ細胞群の20×106T−細胞をハンクス溶液（Hanks−
Ｌsumg）4ml中に懸濁させ、その後ハンクス溶液1ml中
のα−アマニチン10μｇを加える。このプールを各100
μで50個に分割する。各100ml配分に人間の（熱安定
化した）AB−血清を加える。この倍地を１夜（13.5時
間）20℃で培養し、その後試験試料を加え（ハンクス−
緩衝溶液２μg/100μ）、１時間20℃で培養する。次
いで、ハンクス緩衝溶液100μ中に羊赤血球５×107を
加え、37℃で５分間培養する。次いで氷中で４℃に冷却
し、４℃及び100gで５分間遠心分離する。更に30分間、
０℃で培養し、その後Ｅ−ロゼットを数える（集合体−
羊赤血球3/1T−細胞）。
評価：α−アマニチン−抑制盲検試料６個を実施し（全
容量は同様に210μ）、これからわずかな活性の平均
値を調べ、これを相対尺度において０％とする。相対尺
度においてα−アマニチンでの抑制なしで、かつ付加的
な試料なしでのＥ−ロゼツト試校の平均活性を100％と
する。全測定は二重盲検技術により実施した。
この薬理学的実験で判明した結果を次表にまとめる： この結果はＴ−リンパ細胞混入が、添加したポリペプチ
ド−フラグメントにより与えられる刺激に応答すること
を示す。すなわち、これらのフラグメントはＴ−細胞の
免疫活性を刺激する。
例８ アザチオプリンＥ−ロゼット−抑制テスト このテストは成長した胸腺摘除術を行ったマウスと正常
マウスの脾臓細胞のアザチオプリン（AZ）に対する異な
る感度に基づく、成長した胸腺摘除マウスの脾臓細胞は
アザチオプリンの添加により再び取得することのでき
る、AZに対する感度が失われている。このテストの詳細
はDardenne及びBachにより記載されている（Biological
Activity of Thymic Hormones、1975年、第235
頁、Kooyker Scientific Publication Insitute Ro
tterdam）。この親油性ペプチドを十分に滅菌した蒸留
水中に溶かし、濃度10-3Mとした、ハンクス（Hanks）−
溶液中に10-11Mまで10倍希釈剤を製造し、各ペプチドに
関してテストした。各テスト希釈物（60μ）をAZと混
合し（ハンクス溶液中20μg/ml溶液60μ）、成長した
胸腺摘除C57B1/6−マウスの脾臓細胞（50μ）の懸濁
液と共に、75分間37℃で恒温保持した。Ｅ−ロゼット形
成及び評価を前記のように実施した。各測定を２回実施
した。テストペプチド及び脾臓細胞懸濁液からなるが、
AZは含有しない対照を各希釈に関して実施した。結果を
次の表にまとめたが、明らかな活性を示す。
この活性は未熟なマウス−脾臓細胞中にアザチオプリン
−抑制に敏感である、Ｅ−ロゼット形性能を誘発するこ
とのできる、ペプチドの最低濃度として表わされる。
例９ 免疫システムの生体内回復に対するチモシン−α１−フ
ラグメントの作用の検査法 次の実験において、“回復活性”を測定した。“回復活
性”とは抑圧された免疫システムを有する試験中の免疫
学的機能の回復に関する。
このシステムを抑圧するために、雌のBDF1−マウス（c5
7BL/6×DBA/2）、生後12週間を使用した。マウス７〜８
匹のグループを０日目に体重1kgあたり５−フルオルウ
ラシル100mgで処理した。ペプチドフラグメントを１、
３及び６日目に投与した。対照は５−フルオルウラシル
（５−FU）又はペプチドフラグメントのかわりに塩溶液
を含有する。この処理に関する免疫応答はニワトリ−赤
血球（CRBC）注入に対する応答としてDTHの製造の測定
により測定される。細胞108個を３日目に動物に腹腔内
注射し、７日目に足パッドを介して皮下注射した。チモ
シン−α１を参照として使用した。
回復活性（RA）を次の式を使用して測定した： ここで“テスト”とは５−FU並びにペプチドを含有する
群の応答である。
次の第４〜11表は、フラグメント19〜24、20〜24、20〜
28及び18〜24すべてが免疫−回復活性を示すことを示
す。
表中には次の記号を使用した： ヘキサ−α１（19〜24）、ヘプタ−α１（18〜24）、ノ
ナーα１（20〜28）、ペンタ−α１（20〜24）。
例10 カンジタ・アルビカンス（Candida Albicans）での死
に到る感染に対するチモシン−α１のペプチドフラグメ
ントの作用 この実験においては雄のC5F7B1/6、CDF1（BALB/c×DBA/
2）F1及びDBA/2マウス及び雌のddy−マウス（生後６週
間）を使用した。カンジタ・アルビカンスATCC10231を
使用した。マウスの免疫応答を５−FU（25mg/kg体重、
腹腔内投与）で８〜10日間毎日処置することにより抑圧
した。最後の５−FU−注射の後C.アンビカンス0.2mlを
投与した。
前記の条件、すなわち５−FU−投与下には低い投与量で
の感染が一般に死に到らしめる。この実験の結果をまと
めた第12表から明らかなように、引き続くチモシン−α
１−フラグメントの投与が対照に対する生存率を改良し
ている。フラグメント19〜24、20〜24、20〜28及び21〜
24はすべてプラスの結果を示す。
例11 転移−増大の抑圧に対するフラグメントの作用 この実験においてはマウスに黒色腫細胞を接種し、黒色
腫細胞注入の前又は後にチモシン−α１−フラグメント
で処理した。B16F1−黒色腫細胞はNCI（Bethesda、Mary
land）から入手した。この腫瘍細胞を試験管中で５日間
培養した。投与前日にEDTA−トリプシンの使用下に個々
の細胞における層を崩壊することにより、細胞を同期化
し、全量を新しい培地の使用下に同じ容器中に広げる。
投与のためには、この層をEDTA−トリプシンの使用下に
開き、この細胞を数え、106/ml培地に調節する。細胞懸
濁液0.1ml（105細胞）を雌のB6D2F1マウスの尻尾に静脈
内注射した。腫瘍投与21日後、マウスを殺し、肺内の腫
瘍の数を数えた。
体重20gの雌のB6D2F1マウスをこの転移モデルに使用し
た。マウス10匹のグループを各薬剤濃度に使用し、腫瘍
−対照グループに20匹を使用した。
チモシン−α１−フラクションを溶かし、塩溶液中に希
釈した。10又は100μg/kgを−６、−４、−１日に腹腔
内注射した。この処置の適用において、チモシンフラク
ションは実験的に誘発された転移に対して免疫学的予防
に働くことができる。NK−細胞活性能を有する化合物
は、肺中のB16F1−黒色腫の数を減少することができ
る。
後処理は＋３、＋６、＋８、＋10、＋13及び＋15日（腫
瘍細胞接種０日目に関して）に行った。このようにして
生理学的応答変性体が微小転移の処理に関して評価され
た。結果は次の表に示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−137914（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−82354（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−77248（ＪＰ，Ａ) 「Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．］78（１），Ｐ．192− 195（1981) 「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｎ．Ｂｕｌｌ. ］28（11），Ｐ．3411−3415（1980) 「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｎ．Ｂｕｌｌ. ］27（12），Ｐ．3171−3175（1979)

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式Ｉ R1−Val−Val−R2 ［式中、R1はGlu−、Lys−Glu、Lys−Lys−Glu−、Glu
    −Lys−Lys−Glu−、Lys−Glu−Lys−Lys−Glu−又はTh
    r−Lys−Asp−Leu−Lys−Glu−Lys−Lys−Glu−であ
    り、R2は−Glu、−Glu−Glu、−Glu−Glu−Ala又は−Gl
    u−Glu−Ala−Gluである］でチモシンα１−フラグメン
    ト。
  2. 【請求項２】少なくとも１種のチモシンα１−フラグメ
    ントを遊離の形で、又は薬理学的に認容性の塩の形で含
    有する免疫調節作用を有する薬剤において、チモシンα
    １−フラグメントとして一般式Ｉ R1−Val−Val−R2 ［式中、R1はGlu−、Lys−Glu−、Lys−Lys−Glu−、Gl
    u−Lys−Lys−Glu−、Lys−Glu−Lys−Lys−Glu−又はT
    hr−Lys−Asp−Leu−Lys−Glu−Lys−Lys−Glu−であ
    り、R2は−Glu−、−Glu−Glu、−Glu−Glu−Ala又は−
    Glu−Glu−Ala−Gluである］のチモシンα１−フラグメ
    ントを含有する免疫調節剤。
JP57002917A 1981-01-14 1982-01-13 チモシンα１―フラグメント及び該化合物を含有する免疫調節剤 Expired - Lifetime JPH0672152B2 (ja)

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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0215805A1 (en) * 1985-01-18 1987-04-01 MERCK PATENT GmbH Immunoregulatory peptides
IT1256925B (it) * 1992-08-05 1995-12-27 Impiego di frammenti o/e di derivati della timosina alfa 1.
TW234692B (ja) * 1992-11-17 1994-11-21 Albert Enstein College Of Medicine
CN1058500C (zh) * 1993-02-03 2000-11-15 施塞克龙药品公司 胸腺素α－1衍生物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH641152A5 (en) * 1977-04-22 1984-02-15 Hoffmann La Roche Process for preparing thymosin alpha-1 and an analogue
DE2938420A1 (de) * 1979-09-22 1981-04-09 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Neue peptide und verfahren zu ihrer herstellung
US4426324A (en) * 1979-09-28 1984-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Immunopotentiating peptides
ZA805863B (en) * 1979-09-28 1981-09-30 Hoffmann La Roche Peptides and process for their manufacture
EP0033384B1 (de) * 1980-01-18 1984-02-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunstimulierender Wirkung, und Thymosin-alpha-1-Fragmente
JPS56138154A (en) * 1980-02-28 1981-10-28 Genentech Inc Desacetylthymosin-alpha-1 and manufacture
ZA816445B (en) * 1980-09-19 1983-04-27 American Home Prod Polypeptides
US4361673A (en) * 1980-09-19 1982-11-30 American Home Products Corporation Polypeptide compositions

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｎ．Ｂｕｌｌ．２７（１２），Ｐ．３１７１−３１７５（１９７９）
「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｎ．Ｂｕｌｌ．２８（１１），Ｐ．３４１１−３４１５（１９８０）
「Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８（１），Ｐ．１９２−１９５（１９８１）

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