JPH0672894A - 合成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 低分子で選択性のあるスカッシュ型合成プロ
テイナーゼインヒビターを提供する。 【構成】 式１： 【化１】 ［式中、Ｘ₁がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕまたは
Ｖａｌであるアミノ酸を示すときＸ₂はＡｒｇまたはＬ
ｙｓを、Ｘ₁がＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであるアミ
ノ酸を示すときＸ₂はＡｓｎまたはＧｌｎを示し、実線
はジスルフィド結合を示す］で示されるアミノ酸配列を
有する合成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はプロテイナーゼの活性を
阻害し、プロテイナーゼ活性に由来する様々な疾患の治
療薬となる合成プロテイナーゼインヒビターに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内には消化酵素の他、タンパク質の
限定分解過程においてタンパク質の活性化、不活化、修
飾等を行う、あるいは血栓溶解作用または血液凝固作用
を引き起こす様々なプロテイナーゼが存在する。このた
め、プロテイナーゼインヒビターを例えば治療薬として
生体に用いる場合には、目的とするプロテイナーゼのみ
を特異的に阻害しないと他の代謝系に悪影響を及ぼす。
現在プロテイナーゼインヒビターとしては、アミノ酸残
基およそ１８０個からなる大豆トリプシンインヒビター
に代表されるタンパク質性のプロテイナーゼインヒビタ
ーが主体である。しかし、高分子のタンパク質であるた
め免疫原性の問題がある。また天然物由来であるため、
抽出、精製に手間および経費がかかるばかりでなく、ロ
ット差が大きく安定供給性にも問題がある。

【０００３】スカッシュ型プロテイナーゼインヒビター
はウリ科植物種子中に存在し、３個のＳ−Ｓ結合を含む
２８〜３０残基のアミノ酸で構成されている。現在まで
に多くのウリ科植物種子から多数のプロテイナーゼイン
ヒビターが単離され、そのアミノ酸配列が決定されてい
る。これらのアミノ酸配列は相同性が高く、各インヒビ
ター間のアミノ酸配列の相違は数残基に過ぎないが、こ
の数残基のアミノ酸の違いによってインヒビターのプロ
テイナーゼに対する阻害機能は大きく変化する。一般
に、インヒビターの阻害特異性は、阻害反応部位Ｐ１位
のアミノ酸残基によって定まることが多い。すなわち、
インヒビターのＰ１位のアミノ酸残基と酵素の特異性が
一致すればインヒビターはその酵素を阻害する。例え
ば、Ｐ１位がアルギニンまたはリジンであればこのイン
ヒビターはトリプシン様酵素（トリプシンをはじめ血液
凝固系酵素や線溶系酵素など）と結合してその活性を押
える。ところがＰ１位以外の部分のアミノ酸配列が異な
っていると、各酵素に対する阻害の強さは全く異なった
ものになる。また逆に、Ｐ１位のアミノ酸配列が酵素の
基質特異性と一致していても、Ｐ１位以外のアミノ酸配
列によっては全く阻害しないこともある。このように、
インヒビターのアミノ酸配列によって阻害機序は様々に
変化する。

【０００４】スカッシュ型インヒビターの構成アミノ酸
残基数は高々３０残基であるので、天然のインヒビター
のアミノ酸配列を参考にしてさまざまなアミノ酸配列を
有するインヒビターを合成することができる。このよう
にして合成されたインヒビターは、様々な酵素に対して
様々な阻害活性を示すはずであるとの考えに立脚して、
本発明の酵素のデザインを行った。

【０００５】公知のスカッシュ型プロテイナーゼインヒ
ビターとしてＰ１位がＡｒｇであってトリプシン様酵素
を阻害する２つのインヒビター；Ｓ−ＭＣＴＩ−Ｉ（Ｘ
₁，Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ａｒｇ）および、Ｓ−ＭＣＴＩ−
III（Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ｇｌｎ）がある。この２
つのインヒビターのアミノ酸配列は配列表に示す通りで
あるが、両者の配列はほとんど同じであり、わずかに３
位と１３位のアミノ酸が異なっているのみである。この
ような配列のわずかな違いによって両者のいくつかのプ
ロテイナーゼに対する特異性が異なっていることから、
３位および１３位のアミノ酸がインヒビターの選択性に
大きく影響を及ぼすと考え本発明に至った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】すなわち本発明は、低
分子で選択性のあるスカッシュ型合成プロテイナーゼイ
ンヒビターを提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決する手段】

式Ｉ（配列番号１）

【化３】 ［式Ｉ中、Ｘ₁およびＸ₂は（Ｘ₁、Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ａ
ｒｇ）（Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ｇｌｎ）以外のアミノ
酸を示し、実線はジスルフィド結合を示す］で示される
アミノ酸配列を有する合成スカッシュ型プロテイナーゼ
インヒビターに関する。

【０００８】天然のスカッシュ型プロテイナーゼとして
は式Ｉ中（Ｘ₁、Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ａｒｇ）および（Ｘ
₁，Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ｇｌｎ）であるものが発見されて
いるが、この２つは活性部位と異なる箇所のアミノ酸の
みが違っているにもかかわらず各種プロテイナーゼに対
する反応性が異なる（表４参照）。本発明のプロテイナ
ーゼインヒビターはこの３位と１３位を他のアミノ酸で
変換したものであり、いくつかの同族のプロテイナーゼ
に対してそれぞれ異なった強さの阻害作用を示す。

【０００９】本発明のプロテイナーゼインヒビターの３
位のＸ₁としては疎水性のＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ
ｅｕ、Ｉｌｅ、塩基性のＬｙｓまたはＡｒｇ、あるいは
アミドのＧｌｎが好ましい。１３位のＸ₂としては塩基
性のＡｒｇまたはＬｙｓ、あるいはアミドのＧｌｎまた
はＡｓｎが好ましい。Ｘ₁とＸ₂の組合せは、Ｘ₁が疎水
性の残基である場合にはＸ₂は塩基性の残基である方が
好ましく、Ｘ₁が塩基性の場合にはＸ₂がアミドであるも
のがよい。好ましいＸ₁とＸ₂の組合せとは、Ｘ₁がＧｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌであるときＸ
₂がＡｒｇまたはＬｙｓ、Ｘ₁がＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨ
ｉｓであるときＸ₂がＡｓｎまたはＧｌｎである。

【００１０】本発明の合成スカッシュ型プロテイナーゼ
インヒビターは各構成アミノ酸より合成する。合成方法
はペプチド合成方法として従来用いられている固相法、
液相法のいずれを用いてもよい。ペプチド合成を行った
後、合成されたペプチドは高速液体クロマトグラフィー
やカラムクロマトグラフィーを用いる常套の精製方法で
精製する。

【００１１】本発明の合成スカッシュ型プロテイナーゼ
インヒビターは精製されたアミノ酸より合成することか
ら、従来の天然物由来のプロテイナーゼインヒビターの
抽出、精製にかかる経費を削減することができる。ま
た、天然物由来につきもののロット差のないプロテイナ
ーゼインヒビターを安定に供給することができる。本発
明の合成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビターはア
ミノ酸残基が３０個と、比較的低分子であるため免疫原
生発生の問題も非常に低い。なお本明細書においては、
簡略化のためアミノ酸は表１に示す略号を用いて表し
た。

【００１２】

【表１】

【００１３】その他の略号は以下の通りである： Boc：ｔ−ブチルオキシカルボニル MCA：４−メチル−クマリル−７−アミド Bzl：ベンジル Suc：スクシニル

【００１４】本発明の合成スカッシュ型プロテイナーゼ
インヒビターは、トリプシン様プロテイナーゼを１対１
のモル比で阻害する。その効力は、ウシトリプシン、ヒ
トＸIIa因子、ヒトＸa因子、プラスミン、カテプシンＧ
等、異なる種類のトリプシン様プロテイナーゼに対して
それぞれ異なった活性を有する。

【００１５】

【実施例】実施例１、２および比較例１、２ １． インヒビターの合成 比較例１：配列番号２（Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ａｒ
ｇ）（S-MCTI-I） 比較例２：配列番号５（Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ｇｌ
ｎ）（S-MCTI-III） 実施例１：配列番号３（Ｘ₁、Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ａｒ
ｇ）（S-MCTI-I(3G)） 実施例２：配列番号４（Ｘ₁、Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ｇｌ
ｎ）（S-MCTI-I(13Q)） のアミノ酸配列を有するインヒビター４種の合成は、ベ
ガ社製ペプチドシンセサイザー（PEPTICOUPLER 2200)を
用い、固相法により行った。得られたペプチド樹脂は無
水フッ化水素処理により樹脂からの切り出しおよび脱保
護を行い、引き続き空気酸化法によりＳ−Ｓ結合を形成
させ、高速液体クロマトグラフィーで精製して活性イン
ヒビターを得た。得られたインヒビターを以下の方法で
確認した。各インヒビターの配列を以下に示す。

【００１６】

【化４】 [式中、実線はジスルフィド結合を示す]

【００１７】アミノ酸組成 各インヒビターのアミノ酸組成は、合成したインヒビタ
ーを真空封管中０.２％の３−（２−アミノエチル）−
インドールを含有する４Ｍメタンスルホン酸で１０９
℃、２４時間加水分解し、アミノ酸分析した。各インヒ
ビターのアミノ酸組成を表２に示す。

【００１８】

【表２】

【００１９】アミノ酸配列 得られたインヒビターのアミノ酸配列をエドマン分解法
を用いて決定した結果、目的とするアミノ酸配列を有す
るインヒビターが得られていることを確認した。

【００２０】Ｓ−Ｓ結合の位置 各インヒビターを化学的および酵素的方法により切断
し、高速液体クロマトグラフィーによりシスチンを含む
ペプチドを精製した。これらのペプチドのアミノ酸配列
分析によりＣｙｓ（４）とＣｙｓ（２１）、Ｃｙｓ（１
１）とＣｙｓ（２３）、Ｃｙｓ（１７）とＣｙｓ（２
９）がそれぞれＳ−Ｓ結合を結んでいることを確認し
た。

【００２１】分子量 マススペクトル法により、各インヒビターの分子量を表
３に示す通り決定した。この値は上記により解析したア
ミノ酸配列と矛盾しないものであった。

【００２２】

【表３】

【００２３】紫外吸収スペクトル 各比較例および実施例のインヒビターの紫外吸収スペク
トルを図１および図２に示す。上記のごとく合成した各
インヒビターを用い、いくつかのプロテイナーゼ阻害作
用を調べた。

【００２４】２．内因系血液凝固時間（ＡＰＴＴ）の遅延 トロンビンの生成速度から調べた。ヒト血漿、合成イン
ヒビター、エラジン酸、セファリンをトリスー塩酸緩衝
液（pH8.0）に加え、３７℃で５分間加温した後、生成
したトロンビン量を基質Boc-Val-Pro-Arg-MCAを用いて
測定した。図３に示すように、S-MCTI-IおよびS-MCTI-I
(13Q)はトロンビンの生成、すなわち血液凝固時間を強く
遅延させ、S-MCTI-IIIにも若干の遅延が認められた。し
かしS-MCTI-I(3G)には血液凝固時間の遅延は認められな
かった。

【００２５】３．外因系血液凝固時間（ＰＴ） ヒト血漿、インヒビター、セファリンとトロンボレルを
トリス−塩酸緩衝液中で混合し、３７℃で５分間加温し
て反応させた。その後基質としてBoc-Val-Pro-Arg-MCA
を加え、生成したトロンビン量を測定した。いずれのイ
ンヒビターも血液凝固時間を遅延させず、抗外因系血液
凝固活性は認められなかった。

【００２６】４．酵素阻害 １）ウシ・トリプシン トリプシンは膵臓で分泌される消化酵素である。膵炎患
者においては過剰に分泌されるため、トリプシンインヒ
ビターは主に膵炎治療薬として有用である。適当量のイ
ンヒビターおよび一定量のウシ・トリプシンをトリス−
塩酸緩衝液中（pH8.0）で混合し、３７℃で５分間加温
して反応させた。その後、基質としてBoc-Phe-Ser-Arg-
MCAを加えて残存酵素量を測定した。各インヒビターは
ウシ・トリプシンとのモル比が１対１の時にウシ・トリ
プシンの活性を１００％阻害した。１分子のインヒビタ
ーが１分子のウシ・トリプシンを阻害することが明らか
となった。ウシ・トリプシンに対する各インヒビターの
阻害の強さをディクソン・プロット法によって求めた。
酵素−インヒビター複合体の解離定数（Ｋｉ（Ｍ））を
表４に示した。Ｋｉの小さいものほど阻害が強いことを
示す。

【００２７】２）ヒト血液凝固系ＸI Ia因子 ヒト血液凝固系ＸIIa因子は、内因系の血液凝固作用に
関与するプロテイナーゼである。適当量の合成インヒビ
ターおよび一定量のヒト血液凝固系XIIa因子をトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）中で混合し、３７℃で５分間
加温して反応させた。その後、基質としてBoc-Glu-Gly-
Arg-MCAを加えて残存酵素量を測定した。どのインヒビ
ターもヒト血液凝固系ＸIIa因子と１対１のモル比の時
に活性を１００％阻害し、１分子のインヒビターが１分
子のヒト血液凝固系ＸIIa因子を阻害することが明らか
となった。ヒト血液凝固系ＸIIa因子に対する各インヒ
ビターの阻害の強さをディクソン・プロット法によって
求めた。酵素−インヒビター複合体の解離定数（Ｋｉ
（Ｍ））を表４に示した。

【００２８】３）ヒト血液凝固系Ｘａ因子 ヒト血液凝固系Ｘａ因子は外因系の血液凝固作用に関与
するプロテイナーゼである。適当量のインヒビターおよ
び一定量のヒト血液凝固系Ｘａ因子をトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0）中で混合し、３７℃１５分間加温反応させ
た。その後、基質としてBoc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAを
加えて残存酵素量を測定した。どのインヒビターもヒト
血液凝固系Ｘa因子と１対１のモル比の時に活性を１０
０％阻害し、１分子のインヒビターが１分子のヒト血液
凝固系Ｘa因子を阻害することが明らかとなった。ヒト
血液凝固系Ｘa因子に対する各インヒビターの阻害の強
さをディクソン・プロット法によって求めた。酵素−イ
ンヒビター複合体の解離定数（Ｋｉ（Ｍ））を表４に示
した。

【００２９】４）ヒト・プラスミン ヒト・プラスミンは血栓溶解作用に関与するプロテイナ
ーゼである。適当量のインヒビターおよび一定量のヒト
・プラスミンをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中で混
合し、３７℃で１０分間加温して反応させた。その後、
基質としてBoc-Val-Leu-Lys-MCAを加えて残存酵素量を
測定した。どのインヒビターもヒト・プラスミンと１対
１のモル比の時に活性を１００％阻害し、１分子のイン
ヒビターが１分子のヒト・プラスミンを阻害することが
明らかとなった。ヒト・プラスミンに対する各インヒビ
ターの阻害の強さをディクソン・プロット法によって求
めた。酵素−インヒビター−複合体の解離定数（Ｋｉ
（Ｍ））を表４に示した。

【００３０】５）ヒト・カテプシンＧ ヒト・カテプシンＧは芳香族アミノ酸残基のＣ末端側の
ペプチド結合を特異的に切断するプロテイナーゼであ
る。適当量のインヒビターおよび一定量のヒト・カテプ
シンＧをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中で混合し、
３７℃で１０分間加温して反応させた。その後基質とし
てSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCAを加えて残存酵素量を測定
した。どのインヒビターもヒト・カテプシンＧと１対１
のモル比の時に活性を１００％阻害し、１分子のインヒ
ビターが１分子のヒト・プラスミンを阻害することが明
らかとなった。ヒト・カテプシンＧに対する各インヒビ
ターの阻害の強さをディクソン・プロット法によって求
めた。酵素−インヒビター複合体の解離定数（Ｋｉ
（Ｍ））を表４に示した。

【００３１】

【表４】

【００３２】

【発明の効果】本発明の合成スカッシュ型プロテイナー
ゼインヒビターはアミノ酸残基数３０個のスカッシュ型
プロテイナーゼインヒビターの天然由来のアミノ酸配列
中、１ないし２個のアミノ酸を交換することによって得
られた、選択性の異なるプロテイナーゼインヒビターで
ある。分子量が小さいため、免疫原性が生じず、抽出等
の作業も必要ないため安定に合成、安価に供給ができ
る。

【００３３】

【配列表】

【００３４】配列番号：１ 配列数：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Arg Xaa Cys Pro Arg Ile Leu Lys Gln Cys Lys Xaa Asp Ser Asp 1 5 10 15 Cys Pro Gly Glu Cys Ile Cys Met Ala His Gly Phe Cys Gly 20 25 30

【００３５】配列番号：２ 配列数：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Arg Arg Cys Pro Arg Ile Leu Lys Gln Cys Lys Arg Asp Ser Asp 1 5 10 15 Cys Pro Gly Glu Cys Ile Cys Met Ala His Gly Phe Cys Gly 20 25 30

【００３６】配列番号：３ 配列数：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Arg Gly Cys Pro Arg Ile Leu Lys Gln Cys Lys Arg Asp Ser Asp 1 5 10 15 Cys Pro Gly Glu Cys Ile Cys Met Ala His Gly Phe Cys Gly 20 25 30

【００３７】配列番号：４ 配列数：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Arg Arg Cys Pro Arg Ile Leu Lys Gln Cys Lys Gln Asp Ser Asp 1 5 10 15 Cys Pro Gly Glu Cys Ile Cys Met Ala His Gly Phe Cys Gly 20 25 30

【００３８】配列番号：５ 配列数：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Arg Gly Cys Pro Arg Ile Leu Lys Gln Cys Lys Gln Asp Ser Asp 1 5 10 15 Cys Pro Gly Glu Cys Ile Cys Met Ala His Gly Phe Cys Gly 20 25 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の比較例の合成スカッシュ型プロテイ
ナーゼインヒビターの紫外吸収スペクトルを示す。

【図２】 本発明の実施例の合成スカッシュ型プロテイ
ナーゼインヒビターの紫外吸収スペクトルを示す。

【図３】 実施例および比較例の合成スカッシュ型プロ
テイナーゼインヒビターによる内因系血液凝固時間（Ａ
ＰＴＴ）の遅延を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原 三郎 大阪府高槻市富田町４丁目３番20号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 ［式中、Ｘ₁がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕまたは
   Ｖａｌであるアミノ酸を示すときＸ₂はＡｒｇまたはＬ
   ｙｓを、Ｘ₁がＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓであるアミ
   ノ酸を示すときＸ₂はＡｓｎまたはＧｌｎを示し、実線
   はジスルフィド結合を示す］で示されるアミノ酸配列を
   有する合成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビター。
2. 【請求項２】 （Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ｇｌｙ，Ａｒｇ）また
   は（Ｘ₁，Ｘ₂）＝（Ａｒｇ，Ｇｌｎ）である請求項１記
   載の合成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビター。
3. 【請求項３】 式Ｉ 【化２】 で示されるアミノ酸配列を有する合成スカッシュ型プロ
   テイナーゼインヒビターにおいて、Ｘ₁およびＸ₂のアミ
   ノ酸を変換してプロテイナーゼに対する選択性を得る合
   成スカッシュ型プロテイナーゼインヒビターに選択性を
   付与する方法。