JPH0674936A - 核酸、またはタンパク質の分析方法及び分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】アガロースゲルとオンカラム検出法を用いたキ
ャピラリーゲル電気泳動法で、数千塩基以上のＤＮＡの
微量量、高速分離を行なうこと。 【構成】試料を電気泳動法で分離するアガロースゲルの
充填されたガラスキャピラリーからなる電気泳動部２、
電気泳動部２に高電圧を印加する高圧電源部１、電気泳
動部２のガラスキャピラリー先端を試料容器８に移動さ
せて、試料の注入を行なわせる駆動部３、駆動部３のｘ
ｙｚ方向の動作を制御するコントローラ部４、アガロー
スゲルの充填された電気泳動部用ガラスキャピラリーと
ポリアクリルアミドゲルの充填された光学検出部用ガラ
スキャピラリーを接続する接続部６、電気泳動部２で分
離された成分を検出する光学検出部５、光学検出部５で
検出されたデータを処理するデータ処理部７から構成さ
れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はキャピラリー電気泳動法
を用いた核酸、またはタンパク質の分析法、または分析
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】キャピラリー電気泳動法は、高速液体ク
ロマトグラフィーと比較して１／１０００以下の微量試
料量で分析できる点と、数十倍分離性能が高い点とで優
れている。

【０００３】さらに、従来のスラブ電気泳動等に比べ
て、高電圧を印加できることによって、分析時間が短縮
することができる。また、キャピラリーの一端をインジ
ェクターとして利用できるため、試料注入の自動化も容
易である。

【０００４】そのため、近年キャピラリー電気泳動法が
多くの分野で、さかんに用いられるようになってきてい
る。特に、バイオ関係の研究の発展に伴い、核酸及びタ
ンパク質の分析に適用されつつある。核酸やタンパク質
の検出法としては、ＵＶ検出法、または蛍光法が一般的
である。

【０００５】キャピラリー電気泳動法において、ＵＶ検
出法、または蛍光法を用いる場合には、キャピラリーと
検出器を一体化したオンカラム検出法が汎用されてい
る。

【０００６】また、核酸の分析、特に配列決定において
は、ポリアクリルアミドを用いたキャピラリーゲル電気
泳動が通常用いられており、約３００塩基の配列決定を
約４５分で行なっている。さらに、約１０，０００塩基
のＤＮＡ断片を２０分で分離した報告もあるが、数千塩
基以上では１，０００塩基単位の分離能であった。な
お、キャピラリー電気泳動法については、サイエンス、
２２２巻（１９８３年）第２６６貢から第２７２貢（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２２（１９８３）ｐｐ．２６
６−２７２）に、塩基配列決定については、アナリティ
カル ケミストリー、６２巻（１９９０年）第９００貢
から第９０３貢（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，Ｖｏｌ．６２（１９９０）ｐｐ．９００−９０
３）に、約１０，０００塩基のＤＮＡ断片の分析につい
ては、ジャーナル オブ クロマトグラフィー ５１６
巻（１９９０年）第３３貢から第４８貢（Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．５１
６（１９９０）ｐｐ．３３−４８）において論じられて
いる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従来の核酸やタンパク
質の検出法として用いられているキャピラリーと検出器
を一体化したオンカラム検出法は、キャピラリーの一部
に光路を設けて検出を行なっていた。一般に、スラブ電
気泳動法では、１０００塩基以上のＤＮＡ分離用にアガ
ロースゲルが用いられている。そのため、数千塩基以上
のＤＮＡの分離には、ポリアクリルアミドゲルではなく
アガロースゲルを用いる必要があった。

【０００８】しかし、アガロースゲルは、光透過率が悪
く、オンカラム検出法には適していない。そのため、キ
ャピラリー電気泳動法での数千塩基以上のＤＮＡの分離
は非常に困難であった。

【０００９】また、アガロースゲルは、耐熱性に問題が
あった。特に、キャピラリーゲル電気泳動法では、高電
圧を印加するため、キャピラリー内で発生するジュール
熱が大きな問題となり、アガロースゲルを用いることは
非常に困難であった。

【００１０】

【課題を解決するための手段】以上の問題を解決するた
めに、本発明では、キャピラリー電気泳動法を用いた数
千塩基以上のＤＮＡを分析する場合には、アガロースゲ
ルを用いて分離を行ない、光透過率の優れたポリアクリ
ルアミドゲルを充填した検出部でオンライン検出を行な
った。その際に、より具体的な工夫として （１）アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルとの接
続をガラス製のコネクターを用い、さらにポリアクリル
アミドゲルを用いて接続部の密閉を行ない、分離した試
料の通過性、及び導電性を維持させた。

【００１１】（２）キャピラリー内を流れる電流値を抑
え、キャピラリー内で発生するジュール熱の発熱を抑え
た。

【００１２】

【作用】キャピラリー電気泳動法にアガロースゲルを用
いることにより、数千塩基以上のＤＮＡの分離を容易に
行なうことができる。検出部には、光透過性の優れたポ
リアクリルアミドゲルを用いているため、アガロースゲ
ルで分離したＤＮＡを高分離能を維持したまま、オンカ
ラム検出法で光学的に検出することができる。また、バ
ッファー濃度を適切に選定することによりジュール熱の
発生を抑制できる。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の一実施例をブロック図で示す
図１により説明する。本発明によるキャピラリーゲル電
気泳動装置は、高圧電源部１、電気泳動部２、駆動部
３、駆動部３を制御するコントローラ部４、光学検出部
５、電気泳動部２と光学検出部５を接続する接続部６、
及び光学検出部５で検出されたデータを処理するデータ
処理部７から構成されている。高圧電源部１は、出力電
圧０−３０ｋＶで、極性切り替えが容易な高電圧電源を
使用し、試料容器８とバッファー槽９との間に電極１
０、１１を使用して、及び試料容器８に並設されたバッ
ファー槽１２とバッファー槽９との間に電極１３、１１
を使用して電圧を印加している。駆動部３は、パルスモ
ーターで駆動し、ｘｙｚ方向の動きをコントロールして
いる。コントローラー部４は、駆動部３によるｘｙｚ方
向の動作を制御するもので、試料吸引等の汎用の動作
は、ｘｙｚ方向の移動距離、及び停止時間をプログラム
化することでスイッチ一つで行なうことができる。

【００１４】キャピラリーゲル電気泳動装置への試料の
注入は、先ず、電気泳動部２のガラスキャピラリー先端
を試料容器８に移動させて、高圧電源部１により電極１
０、１１に所定の極性の電圧を印加することにより、試
料容器８内の試料を電気泳動部２のガラスキャピラリー
先端から電気泳動で一定試料量吸引した。なお、吸引す
る試料量は、ピコリットルオーダーでも印加電圧及び電
圧印加時間により、容易に決めることができる。

【００１５】その後、電気泳動部２のガラスキャピラリ
ー先端をバッファー槽１２に移動し、電極１３、１１に
所定の電圧を印加して電気泳動を行なった。

【００１６】本発明では、電気泳動部２には、内径５０
μｍ、外径３７５μｍ、長さ５０ｃｍのフューズドシリ
カキャピラリー、及び０．３％アガロースゲルを用い
た。なお、アガロースゲル濃度は、分離する成分の分子
量に応じて選択することができる。

【００１７】光学検出部５には、３％Ｔ（ポリアクリル
アミドモノマーの重量百分率）、０．５％Ｃ（ポリアク
リルアミド中のビスポリアクリルアミドの重量百分率）
ポリアクリルアミドゲルを充填したガラスキャピラリー
を用いた。

【００１８】ポリアクリルアミドゲルの作成には、重合
剤としたＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジ
アミン、及びペルオキソ二硫酸アンモニウムを用いた。
なお、数千塩基以上のＤＮＡの分離を行なう場合は、５
％Ｔ以下のポリアクリルアミドを使用することが望まし
い。

【００１９】光学検出器５は、オンカラム検出用に改良
したＨＰＬＣ用紫外吸収検出器を用い、ＤＮＡの測定波
長である波長２６０ｎｍの吸光度を測定した。測定した
光学検出器５からのデータは、データ処理部７に逐次送
信し、データ処理部７で記録、及びデータ処理を行なっ
た。

【００２０】本発明の実施例により得られたＤＮＡ断片
の分析の一例を図２に示す。測定条件を表１に示す。こ
こで使用されたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ分子量マーカーと
して市販されているＴ４ｄＣ※−ＤＮＡとＴ４ｄＣ−Ｄ
ＮＡの混合物を制限酵素Ｂｇｌ Ｉ で完全分解した混
合物であり、これを３０分以内に完全に分離できること
がわかる。

【００２１】

【表１】

【００２２】次に、本発明の実施例で必要になり、アガ
ロースゲルの充填されたガラスキャピラリーとポリアク
リルアミドゲルの充填された光学検出部を接続する場合
を図３により説明する。

【００２３】アガロースゲルを充填した電気泳動部用ガ
ラスキャピラリー１４とポリアクリルアミドゲルを充填
した光学検出部用ガラスキャピラリー１５を個々に用意
した。その後、接続用ジョイント１６内に固定されたガ
ラスキャピラリーコネクター１７に各々にゲルを充填し
たガラスキャピラリー１４、１５を差し込み固定する。
固定は、押さえ具１８、１９、及び押しネジ２０、２１
を用いることにより、各々のガラスキャピラリーの一端
を同一直線上に力をかけて行なった。なお、ガラスキャ
ピラリーコネクター１７内には、予めポリアクリルアミ
ドゲルを充填しておき、これを押し出す形で両キャピラ
リーを差し込み固定することがより一層望ましい。

【００２４】アガロースゲルの充填された電気泳動部用
ガラスキャピラリーとポリアクリルアミドゲルの充填さ
れた光学検出部用ガラスキャピラリーを接続する場合の
他の実施例を図４により説明する。

【００２５】石英ガラス板２２、２３上に、ガラスキャ
ピラリー用の溝２４、２５を設ける。溝の形成方法は、
機械加工または化学的なエッチングを用いることができ
る。アガロースゲルを充填した電気泳動部用ガラスキャ
ピラリー２６とポリアクリルアミドゲルを充填した光学
検出部用ガラスキャピラリー２７を個々に用意した。そ
の後、電気泳動部用ガラスキャピラリー２６、及び光学
検出部用ガラスキャピラリー２７を石英ガラス板２３上
の溝２５に装着し、その上から石英ガラス板２２を密着
設置した。石英ガラス板２２、２３は、バネ２８と外箱
２９とにより上下に押す力が作用させられている。な
お、二つの石英ガラス板間は、ポリテトラフルオロエチ
レンシールにより密着されており、ガラスキャピラリー
間での漏れはない。また、石英ガラス板の代わりにポリ
テトラフルオロエチレン板を用いることもできる。この
場合においても、予め石英ガラス板間、ポリテトラフル
オロエチレン板の間にポリアクリルアミドゲルをを塗布
しておき、これを排除する形で接続するのが良い。

【００２６】次に、発熱量とバッファーに関して説明す
る。

【００２７】一般に、溶液中を流れる電流は、溶液中に
存在するイオンに依存する。本願の発明者は、そのた
め、キャピラリーを流れる電流値は、使用するバッファ
ーにより影響されると考え、種々のバッファーにおける
印加電圧と発熱量の関係を調べた。この結果を図５に示
している。なお、測定に使用したバッファーは、各々濃
度８０ｍＭ、ｐＨ８．３である。また、測定は、内径７
５μｍ、長さ５０ｃｍのガラスキャピラリーに０．３％
アガロースゲルを充填したものを用いて行なった。

【００２８】その結果、発熱量の大きさは、Ｔｒｉｓ−
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＞Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＞Ｔｒｉｓ−ａ
ｃｅｔａｔｅ＞Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅの順番に小さく
なり、その中で一番発熱量の小さいＴｒｉｓ−ｂｏｒａ
ｔｅバッファーを用いた場合の発熱量は、Ｔｒｉｓ−ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅの場合の約１／５であった。

【００２９】さらに、内径５０μｍ、長さ５０ｃｍのガ
ラスキャピラリーを用いた場合の発熱量は、内径７５μ
ｍ、長さ５０ｃｍのガラスキャピラリーの場合の約１／
３であった。また、図２、図５に示した一連の実験結果
より、発熱量０．０６Ｗ／ｍ以下の場合に測定が可能で
あることがわかった。

【００３０】以上のことにより、キャピラリーを流れる
電流値を抑えるために、バッファーとしてトリスホウ酸
バッファーが有利と判断し、種々のホウ酸バッファー濃
度における印加電圧と発熱量の関係を調べ、その結果を
図５に示した。なお、測定は、内径５０μｍ、長さ５０
ｃｍのガラスキャピラリーに０．３％アガロースゲルを
充填したものを用いて行なった。

【００３１】その結果、発熱量はバッファー濃度に比例
し、バッファー濃度が半減すると発熱量は半分になっ
た。そのため、キャピラリー内に発生する発熱量を０．
０６Ｗ／ｍ以下に抑えるために、一般に用いられている
１５０Ｖ／ｃｍ程度の印加電圧の場合には、トリスホウ
酸バッファーの濃度を８０ｍＭ以下にすれば良いことが
分かった。なお、バッファーは試料のｐＨ維持の機能も
持つから、薄ければ良いというものでは無いのは当然で
あり、発明者の実験によれば、１０ｍＭ以上であること
が必要であった。

【００３２】なお、印加電圧が２００Ｖ／ｃｍ以上の場
合には、トリスホウ酸バッファーの濃度を４０ｍＭ以下
で使用すれば問題ない。

【００３３】また、内径５０μｍ以下のガラスキャピラ
リーを用いることにより、ジュール熱の発生するガラス
キャピラリー内の体積に対する放熱が起こる外表面積の
割合が大きくなり、放熱効率が良くなる。

【００３４】

【発明の効果】本発明例によれば、電気泳動部にアガロ
ースゲルを用い、さらに、検出部には、光透過性の優れ
たポリアクリルアミドゲルを用いているため、数千塩基
以上のＤＮＡ等の巨大分子の分析をオンカラム検出法で
容易に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例にかかる核酸、またはタンパク
質の分析装置の構成を示すブロック図

【図２】本発明の実施例により得られたＤＮＡ断片の分
析を示す図

【図３】本発明の実施例に使用しうる電気泳動部と光学
検出部の接続構成を示す断面図

【図４】石英ガラス板上に設けた電気泳動部と光学検出
部の接続構成を示す断面図

【図５】各種バッファーと印加電圧による発熱量の関係
を実験した結果を示す図

【図６】ホウ酸バッファーの濃度と印加電圧による発熱
量の関係を実験した結果を示す図

【符号の説明】

１…高圧電源部、２…電気泳動部、３…駆動部、４…コ
ントローラ部、５…光学検出部、６…接続部、７…デー
タ処理部、８…試料容器、９、１２…バッファー槽、１
０、１１、１３…電極。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キャピラリーに収納されたアガロースゲル
   での電気泳動で分離を行なった後、キャピラリーに収納
   されたポリアクリルアミドゲルの部分で光学的に検出を
   行なうことを特徴とする核酸、またはタンパク質の分析
   方法。
2. 【請求項２】キャピラリーに収納されたアガロースゲル
   とキャピラリーに収納されたポリアクリルアミドゲルが
   カスケードに配列された電気泳動部、前記ポリアクリル
   アミドゲルの部分に設けられた光学検出部よりなること
   を特徴とする核酸、またはタンパク質の分析装置。
3. 【請求項３】アガロースゲルによる電気泳動部を持つキ
   ャピラリー電気泳動装置において、アガロースゲルに試
   料供給後キャピラリーに供給するバッファーをホウ酸バ
   ッファーとしたことを特徴とする核酸、またはタンパク
   質の分析装置。
4. 【請求項４】上記キャピラリーを内径１００μｍ以下の
   ガラスキャピラリーを用いて行なうことを特徴とする請
   求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核
   酸、またはタンパク質の分析法、または分析装置。
5. 【請求項５】上記アガロースゲルの充填されたガラスキ
   ャピラリーの一端と上記ポリアクリルアミドゲルの充填
   された上記光学検出部の一端を同一直線上に配置して接
   続を行なうことを特徴とする請求項１または請求項２の
   いずれかに記載の核酸、またはタンパク質の分析法、ま
   たは分析装置。
6. 【請求項６】上記アガロースゲル電気泳動と上記光学検
   出を、同一平面上で行なうことを特徴とする請求項１ま
   たは請求項２のいずれかに記載の核酸、またはタンパク
   質の分析法、または分析装置。
7. 【請求項７】アガロースゲルとポリアクリルアミドゲル
   をそれぞれ充填したガラスキャピラリーの接続をガラス
   製のコネクターを用い、且つガラスキャピラリーの接続
   部の外周とガラス製のコネクター内面にポリアクリルア
   ミドゲルを入れたことを特徴とする請求項２に記載の核
   酸、またはタンパク質の分析装置。
8. 【請求項８】上記ホウ酸バッファー濃度が８０ｍＭ以下
   １０ｍＭ以上であることを特徴とする請求項３記載の核
   酸、またはタンパク質の分析装置。