JPH05223778A - 電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】分子量分離される試料を高感度に検出できる電
気泳動装置を提供する。 【構成】キャピラリー１及び３で構成される泳動路の一
部に、分子ふるい膜で構成した試料濃縮部２を設ける。
試料をキャピラリー１に注入し、電極槽５と電極槽４の
間に電圧を印加して、試料を試料濃縮部２に集めて濃縮
する。次いで電極槽６と電極槽５の間に電圧を印加して
試料を泳動し、分子量分離パターンを測定する。 【効果】泳動路に試料濃縮部を設けるので、実質的に泳
動路中の試料濃度が濃くなり、試料であるＤＮＡ、蛋
白、糖等を高感度に検出することが可能な電気泳動装置
が実現できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸、蛋白、糖等を分
離し分析する電気泳動装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】電気泳動は、ＤＮＡ、蛋白、糖等の生体
関連物質を分離・分析する手段として有効である。電気
泳動のための媒体としては、アガロース、ポリアクリル
アミドゲル等が主に利用されている。これらは、２枚の
ガラス板の間に作成した平板ゲル、キャピラリー内部に
作成したキャピラリーゲル等の形状で使用されている。
また、さらに電気泳動の媒体としてゲルを用いず、緩衝
液のみを使用する方法も検討され、現在内径１００μｍ
以下のキャピラリーを用いたキャピラリー電気泳動も注
目されている。

【０００３】キャピラリーゲル電気泳動やキャピラリー
ゾーン電気泳動等のキャピラリーを使用した電気泳動で
は、キャピラリーの径が小さいため、泳動媒体の体積当
たりの表面積が大きく、ジュール熱の放散が容易にな
る。そのため、高電圧を印加しても温度上昇が抑えら
れ、結果的に通常の電気泳動に比べて高電圧を印加する
ことができ、短時間に高分離能が得られる。また、キャ
ピラリーの径が小さいために、試料の絶対量は数十ｎＬ
（ナノリットル）程度と少なくて済み、微量分析に適し
ている。電気泳動により分離した試料の検出には、ＵＶ
検出器による吸光度、またはレーザ励起蛍光測定装置等
による蛍光強度等が使用される。これらのキャピラリー
電気泳動については、例えば、ぶんせき、第８号、５９
９頁〜６０６頁（１９９１年）（Ｂｕｎｓｅｋｉ、Ｎｏ
８、５９９〜６０６（１９９１））に記載されている。

【０００４】また、キャピラリーゲル電気泳動をＤＮＡ
断片の分離分析に応用する試みもある。例えば、ニュク
レイック アシッド リサーチ、第１８巻、１４１５頁
〜１４１９頁（１９９０年）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８、１４１５〜１４１９（１
９９０））に記載の方法では、７５μｍの内径のキャピ
ラリーを使用し、９ｋＶの高電圧を印加することで、Ｄ
ＮＡ断片等の高速及び高分離検出を図っている。本方法
の検出部は、キャピラリーの軸とレーザ光の照射軸と
を、垂直方向から２５度程度傾斜させ、レーザ光をキャ
ピラリーの中心部に約２０μｍ径に集光して照射し、生
じる蛍光をバンドパス干渉フィルタ等で分光して検出し
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】電気泳動装置では、試
料の微量化等に伴い、検出感度の高感度化が望まれてい
る。一般に、電気泳動状態での蛍光測定では、目的とす
る蛍光体自体からの蛍光の他に、背景光として、ゲルに
よる励起光の散乱光（レーリー散乱など）、ゲルの支持
体例えばキャピラリー内壁、外壁での散乱光、ゲル自体
の蛍光が生じる。特にキャピラリーはその断面が円であ
り、励起光が散乱しやすい形状である。また、キャピラ
リー径が小さいために散乱光の発生するキャピラリー内
壁や外壁と試料からの蛍光発光位置とが非常に近接し、
空間的に両者を分離することも困難である。そのため、
バックグラウンドが高くなり、検出感度の低下を招きや
すいという問題があった。

【０００６】なお上述したように、キャピラリー電気泳
動では、分析する試料の絶対量が少ないのが特徴であ
り、極微量の試料を検出することができる。しかし一般
にキャピラリーそのものを光学検出の光学セルとするた
め、光路長がキャピラリーの内径以下となり、濃度感度
は必ずしも良くない。濃度感度は光路長に比例し、通常
の光学セルの光路長が２ｍｍ〜１０ｍｍであるのに対
し、キャピラリーの場合は２５〜１００μｍ程度以下で
あるため、感度が低下することになる。そのため、キャ
ピラリー電気泳動に適した高感度な検出法が重要な課題
となっていた。

【０００７】一般に、吸光度による感度に比べて蛍光測
定での感度が高く、ニュクレイックアシッド リサー
チ、第１８巻、１４１５頁〜１４１９頁（１９９０年）
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
８、１４１５〜１４１９（１９９０））に記載の方法で
は、蛍光測定により試料を検出している。しかし、蛍光
測定でもその全蛍光強度は光路長に比例するため、通常
の光学セルと比べて感度が低下する。なおキャピラリー
ゲル電気泳動では、試料がゲル部に導入されるときに濃
縮され、ゲル中での試料濃度が実効的に増大し、感度の
向上が期待できるが、しかし逆にゲルによる散乱光・蛍
光も増大する。そのため、高感度な検出法が重要な課題
となっていた。本発明の目的は、上記の問題点を解決
し、電気泳動により分離される試料を高感度に検出・解
析するための電気泳動装置を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的は、試料を電気
泳動させて検出し解析する電気泳動装置において、泳動
路を試料が注入される第１の泳動路と、この試料が濃縮
される試料濃縮部と、この濃縮された試料が泳動分離さ
れる第２の泳動路とで分岐することなく構成し、さらに
第１の泳動路と試料濃縮部と第２の泳動路を順に連結、
つまり、第１の泳動路の一端と試料濃縮部の一端を連結
させ、試料濃縮部のもう一方の端と第２の泳動路の一端
を連結する構造を有する電気泳動装置によって達成でき
る。試料濃縮部は、少なくともその一部が分子ふるい効
果を有する筒状担体であり、第１及び第２の泳動路とほ
ぼ同軸状に連結する構造とすることで達成できる。また
試料濃縮部は、第１の泳動路の軸と第２の泳動路の軸の
交差位置近傍に配置した分子ふるい膜によって達成でき
る。

【０００９】さらに、第１の泳動路端と試料濃縮部の間
に電圧を印加して試料を注入する第１の工程と、試料濃
縮部と第２の泳動路端に電圧を印加して試料を泳動分離
する第２の工程を有する電気泳動装置によって達成でき
る。なお、第１の工程では、第２の泳動路端には、少な
くとも試料が第２の泳動路端に泳動するような方向の電
圧は印加せず、第２の工程では、第１の泳動路端には電
圧を印加しない。また、第１の泳動路の長さを第２の泳
動路の長さよりも短くすることにより、より目的は達成
される。

【００１０】

【作用】試料を電気泳動させて検出し解析する電気泳動
装置において、泳動路が第１の泳動路と第２の泳動路と
試料濃縮部とで構成され、第１の泳動路と試料濃縮部と
第２の泳動路が順に連結していることによって、実効的
に泳動路内に注入できる試料の量を増加させ、さらに試
料濃縮部で濃縮して泳動路内での試料濃度を高めること
ができ、検出できる試料の濃度感度を高めることができ
る。従来のキャピラリー等を使った電気泳動装置では、
キャピラリー内に注入できる試料液量はｎＬ（ナノリッ
トル）のオーダーである。これは、キャピラリーの径が
小さいこと、及び分離能を損なわないようにするために
試料注入領域の長さ（泳動路に注入された、試料を含む
領域の泳動方向での長さ）を制限する必要があるためで
ある。つまり試料注入領域の長さが大きくなると、それ
だけ泳動バンド幅が大きくなり、分離能が悪くなる。通
常は試料注入領域の長さが１ｍｍ程度であり、キャピラ
リーが内径５０μｍとすれば試料液の注入量は２ｎＬ程
度となる。しかし、注入操作時に用意する試料の全量は
少なくとも数μＬ（マイクロリットル）必要とする。こ
れは注入容器に分注するためのピペットの性能や操作性
等の要因によって決定される。つまり用意する試料液に
対してキャピラリー内に注入される試料液の量は１／１
０００程度と極僅かである。

【００１１】本発明では、第１の泳動路の一端から試料
が注入され、試料濃縮部により試料が濃縮され、第２の
泳動路の部分で試料が泳動分離され、検出され解析され
る。そこで、泳動分離する部分である第２の泳動路内で
の試料注入領域の長さを従来と同じとした場合、注入で
きる試料液の量が従来に比べて試料濃縮部で濃縮される
分だけ増大することになる。しかも、上記したように、
用意する試料量は元々大過剰にあるため、本発明の操作
によって用意する試料量を増加させる必要は生じない。
逆に、用意した試料全量を注入することも可能である。
このようにすると第２の泳動路内での試料の濃度が増加
し、実効的に試料の検出感度を高めることができる。ま
た、注入する試料量を従来と同じにした場合は、より濃
縮することによって第２の泳動路内の試料注入領域の長
さを小さくすることもでき、分離能をも高めることが可
能になる。

【００１２】試料濃縮部は、その全部または一部が分子
ふるい効果を有する筒状担体からなり、第１及び前記第
２の泳動路とほぼ同軸状に連結させることで、試料を効
率的に濃縮することができ、簡便に試料濃縮部を構成す
ることができる。分子ふるい効果を有する筒状担体とし
ては、例えば、分析したい試料、例えば蛋白やＤＮＡ等
の分子量より小さな分画分子量を有する分子ふるい膜を
筒状に成型したもの等を使用する。この分子ふるい膜
は、分画分子量より小さな分子量を有する物質、例え
ば、緩衝液等の電解液の成分（塩等）を通過させるが、
分析したい試料は通さない。そこで、試料液に第１の泳
動路の一端を挿入して試料濃縮部との間に電圧を印加す
ることにより、通常の電気泳動と同じく、試料を第１の
泳動路に注入させ、試料濃縮部の方向に泳動させること
ができる。泳動を続行することで、試料は分子ふるい膜
のところに留まり、その結果、試料濃縮部の分子ふるい
膜付近に試料が濃縮されることになる。なお、試料濃縮
部の形状としては、第１または第２の泳動路とほぼ同じ
断面とすればよい。例えば、第１または第２の泳動路が
５０μｍ径のキャピラリーの場合、内径を５０μｍ程度
とした筒状の分子ふるい膜が使用できる。なお、試料濃
縮部の泳動方向の長さ、より具体的には試料の泳動する
部分に面した分子ふるい膜部の泳動方向の長さ（第１の
泳動路の泳動終端と第２の泳動路の泳動開始端との間の
距離）は短い方がよく、１ないし３ｍｍ程度またはそれ
以下が望ましい。

【００１３】また試料濃縮部は平面状の分子ふるい膜と
し、この分子ふるい膜を第１の泳動路の軸と第２の泳動
路の軸の交差位置近傍に配置することで、簡便に試料濃
縮部を構成することができ、試料を効率的に濃縮するこ
とができる。例えば、第１の泳動路と第２の泳動路の試
料濃縮部側の端をその軸が９０度で交わるように密着さ
せ、軸の交差位置近傍に、第１と第２の泳動路の端面と
で微小空間をつくるように面状の分子ふるい膜を配置し
て固定する。このようにすることで、上記と同様に泳動
させることで、試料は分子ふるい膜のところに留まり、
その結果、第１と第２の泳動路の端面と分子ふるい膜面
とで構成される微小空間に試料が濃縮されることにな
る。なお分子ふるい膜は、分子をふるい分ける性質を有
する膜であり、例えば、限外濾過膜、セルロースエステ
ル膜等の透析膜、マイクロポーラス膜など、分画分子量
に応じて種々の担体が使用できる。本発明の電気泳動装
置の泳動手順は、まず第１の工程として、第１の泳動路
端を試料液に挿入し、試料濃縮部との間に電圧を印加し
て試料を注入する。この操作で試料を試料濃縮部に泳動
させて濃縮させることができる。とくに電圧の印加時間
を長くすることにより、より試料を多く濃縮でき、試料
濃縮部内の試料濃度を高めることができる。なお、第１
の工程では、第２の泳動路端に少なくとも試料が第２の
泳動路端に泳動するような方向の電圧は印加しないこと
で、試料濃縮部から第２の泳動路方向に試料が漏れ出る
ことが防ぐことができ、効率良く濃縮させることができ
る。また、電圧の印加時間も原理的に制限されないた
め、十分に試料を注入・濃縮でき、試料の試料濃縮部で
の実効的な濃度を高めることができる。

【００１４】次に、第２の工程として、第１の泳動路端
には電圧を印加せずに、試料濃縮部と第２の泳動路端に
電圧を印加することで、濃縮された試料を濃縮された状
態のまま、つまり濃度が高められた状態で効率良く泳動
分離することができる。そのため、第２の泳動路の一部
に設けられた通常の検知手段により、容易に精度良く泳
動する試料を検出することができ、はじめに用意された
試料を濃縮し、高感度に検出でき、試料を解析すること
が可能になる。試料の検知手段としては、試料による蛍
光強度や吸光度の光学的手段の他、電気化学的な検知手
段等、種々の装置が使用しうる。また、第１の泳動路の
長さを第２の泳動路の長さよりも短くし、第１の泳動路
端と試料濃縮部との間を高速に泳動させることができ、
注入・濃縮に要する時間を短縮し、効率良く試料を濃縮
することができる。なお、第１、第２の泳動路は、ゲル
を充填したキャピラリー、また電解液を満たしたキャピ
ラリーが好ましく、さらにガラス板の間に形成した平板
ゲル等でもよい。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の一実施例（第１の実施例）を
説明する。本実施例では、キャピラリーゲル電気泳動に
より、蛍光標識したＤＮＡ断片を分子量分離し、蛍光検
出する方法について説明する。標識用の蛍光体には、フ
ルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用
するまず、電気泳動装置の概要について説明する。図１
に本実施例の電気泳動装置の構成図を示す。装置は、第
１の泳動路としてキャピラリー１、第２の泳動路として
キャピラリー３、試料濃縮部２、電極槽４及び５及び
６、高電圧電源７、電極槽４及び５及び６内に配置した
電極８及び９及び１０、励起光照射部１１、蛍光検出部
１２、データ処理部１３、表示部１４、記録部１５で構
成する。図２は試料濃縮部２付近の拡大断面図である。
試料濃縮部２は分子ふるい効果を有する筒状担体２５に
よって形成され、その両端部を図のようにキャピラリー
１及び３と中心軸がほぼ一致するように連結し、連続し
た泳動路を形成する。またキャピラリー１とキャピラリ
ー３は、一定のギャップ３０を保持するように調整す
る。筒状担体２５には電解質などの低分子のみを透過さ
せ、試料を透過させないものを選び、また電極槽５内の
緩衝液に浸すことで、試料濃縮部２を泳動端とした電気
泳動を行うことができる。またキャピラリー１及び３の
他端は、それぞれ電極槽４及び６に浸しておく。

【００１６】試料は、通常の方法により、キャピラリー
１の端から注入する。つまり、電極槽４を試料液を含む
容器内に置き換え、キャピラリー１端及び電極８を試料
液に挿入し、この試料液と電極槽５との間に電圧を印加
する。泳動路がゲルの場合は、試料液を陰極側、電極槽
５を陽極側にして電圧を印加することになる。電源の極
性については、電気泳動媒体の種類等によって変える必
要がある。電圧印加により、試料がキャピラリー１内に
注入される。その後、キャピラリー１端及び電極８を元
の電極槽４に戻し、同じ極性で電極槽４と電極槽５間に
電圧を印加して、試料を試料濃縮部の２方向に泳動させ
る。時間を十分長くかけ泳動を行うことで、注入した試
料が第１の泳動路の泳動末端と第２の泳動路の泳動開始
端との間隔、ギャップ３０の部分に集まる。原理的に試
料濃縮部２に集まる試料を含む領域の長さは最大でもギ
ャップ３０の幅であるため、ギャップ３０の幅をキャピ
ラリー１に試料が注入された試料注入領域の長さに対し
て十分に短くすることで、試料液が濃縮されることにな
る。電圧印加の時間、つまり試料がキャピラリー１内に
注入される時間を長くとることにより注入される試料量
を多くすることができ、これを試料濃縮部２に集めるこ
とができる。このように、分子ふるい効果を利用すれば
簡便に試料濃縮部を構成することができる。

【００１７】次に、濃縮された試料に対して、キャピラ
リー３を分離部とした泳動を行う。この操作の時は、電
圧を電極槽５と電極槽６の間に印加して、濃縮した試料
を電極槽６の方向に泳動させる。試料は、分子量分離さ
れつつ泳動され、蛍光検出位置２４で蛍光検出され、分
析される。蛍光検出位置２４を通過する試料を、励起光
照射部１１により励起し、生じる蛍光を蛍光検出部１２
で検出する。励起光照射部１１は、励起用のレーザ光源
１６と集光用のレンズ１７で構成し、キャピラリーにレ
ーザ光を絞って照射する。蛍光検出部１２は、励起光の
照射軸と垂直方向に配置したレンズ１８、分光フィルタ
１９、レンズ２０、光電子増倍管２１、増幅器２２で構
成する。測定された蛍光強度は、コンピュータ等のデー
タ処理部１３で処理し、それらの結果を表示部１４、記
録部１５に出力する。上記構成の装置により、蛍光標識
されたＤＮＡ断片の計測例を説明する。蛍光標識ＤＮＡ
断片は、周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキ
シ（dideoxy）法により、蛍光標識したプライマーを使
い、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行ない調製する。フルオ
レセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が結合した
２１ｍｅｒのプライマー（標識プライマー）を使用す
る。鋳型となる一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを加えて
アニールし一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを結合させ
る。次に４種の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、
チミン）に対応する４種のデオキシヌクレオチド三りん
酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び、
末端がアデニンに相当するＤＮＡ断片を得るためにジデ
オキシアデノシン三りん酸（ｄｄＡＴＰ）を加え、ＤＮ
Ａポリメラーゼ反応を行わせる。以上の操作で、末端が
アデニンの種々の長さの蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。

【００１８】キャピラリー１及び３は、内径１００μ
ｍ、外径２００μｍの石英製チューブであり、長さがそ
れぞれ３ｃｍ及び４０ｃｍとする。筒状担体２５には、
分画分子量が２０００であるセルロース系の分子ふるい
膜を内径が２００μｍの筒状にしたものを使用する。ギ
ャップ３０の幅は０．１ｍｍになるようにする。試料の
蛍光標識ＤＮＡ断片の分子量は筒状担体２５の分画分子
量より大きく、泳動により試料の濃縮が可能になる。泳
動路となるキャピラリー１及び試料濃縮部２及びキャピ
ラリー３の内部には、変性剤の尿素を含む４％の濃度の
ポリアクリルアミドゲル２３を形成し、試料の泳動媒体
あるいは分子量分離用の媒体とする。なお、キャピラリ
ーはポリイミドで被覆されており、蛍光測定の妨げとな
るため、ゲル充填に先立って蛍光検出位置２４の部分に
相当するポリイミドの被覆をはがす必要があり、試料濃
縮部２から３０ｃｍ離れた位置を蛍光検出位置２４と設
定して、その前後１ｍｍの被覆をはがして使用する。電
極槽４及び５及び６には、緩衝液（トリス、ほう酸、Ｅ
ＤＴＡを含む緩衝液）を注入し、キャピラリー端、試料
濃縮部及び電極を浸す。試料である蛍光標識ＤＮＡ断片
のキャピラリーへの注入、濃縮、分子量分離の各動作を
説明する。

【００１９】まず、試料液として上記の操作によって得
られた蛍光標識ＤＮＡ断片溶液約５μＬをサンプリング
チューブ（試料容器）に用意する。電極槽４に浸したキ
ャピラリー１の端及び電極８をサンプリングチューブに
移し、試料液を陰極側、電極槽５を陽極側にし、２分間
１５０Ｖの電圧を印加し、キャピラリー内部に試料を注
入する。次に、キャピラリー１の端及び電極８を電極槽
４に戻し、電極槽４を陰極側、電極槽５を陽極側にし、
１５分間６００Ｖの電圧を印加して泳動させ、注入され
た試料を試料濃縮部２に集めて濃縮する。この泳動時間
及び泳動電圧は注入された試料のほぼ全部が試料濃縮部
に到達するように調整するのが望ましい。

【００２０】次いで、電極槽５を陰極側、電極槽６を陽
極側にし、６ｋＶの電圧を印加して試料を泳動させ、分
子量分離する。次に、分子量分離されつつ蛍光検出位置
２４を泳動通過する蛍光標識ＤＮＡ断片の蛍光強度を測
定する。レーザ光源１６にはＦＩＴＣ励起用に発振波長
４８８ｎｍのアルゴンレーザ光源を使用する。分光フィ
ルタ１９には、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの波長域を通過
するバンドパス干渉フィルタを使用することで、ＦＩＴ
Ｃの蛍光強度を検出することができ、ＤＮＡ断片の分子
量分離パターンを計測することができる。

【００２１】試料の注入時間が数秒間である従来装置と
比較すると、本実施例では、注入される試料量が多くな
り、しかも濃縮されることで、ゲル中の試料濃度が実質
的に濃くなるため蛍光強度が大きくなり、精度良く蛍光
検出ができるようになる。その結果として、試料の検出
感度が向上することになる。本例の場合は従来の装置の
約１０倍以上の蛍光強度増加が得られることになる。な
お濃縮によって試料の集まる領域を狭くするので、分離
能を損なうことなく分子量分離パターンを計測すること
ができる。さらに試料の注入時間を十分に長くすること
で、用意した試料全部をキャピラリー内に注入すること
もでき、試料の検出が容易にできるようになる。また、
試料の注入量を従来と同じにする場合でも、濃縮するこ
とで実質的にゲル中の試料濃度が濃くなり、試料の検出
が容易になり、検出感度の向上が図られる。さらに、ギ
ャップ３０の幅を狭く調整することで第２の泳動路のゲ
ル中での泳動バンド幅をより狭くすることもでき、分離
能を高めることが可能になる。なお、使用するレーザ装
置及び蛍光体は、実施例でのアルゴンレーザ及びＦＩＴ
Ｃに限るものではなく、任意の蛍光体及び適当なレーザ
装置が使用できる。また、１種の蛍光体だけでなく、同
時に２種以上の蛍光体からの蛍光を検出することも可能
である。そのためには、図１において蛍光体の数に相当
する光検出部を設け、それぞれが別々の波長域の蛍光を
検出すればよい。

【００２２】この装置を応用することで、ＤＮＡの塩基
配列も決定できる。つまり、末端塩基の種類毎に、異な
る蛍光体で標識したプライマーを使用し、それぞれＤＮ
Ａポリメラーゼ反応を行わせた後、反応液を混合し、電
気泳動させる。蛍光検出位置を泳動通過するＤＮＡ断片
の蛍光のピークを識別することで塩基種が同定でき、塩
基配列が決定できる。なお、蛍光のピークを識別するに
は、図１において４種の蛍光波長域を検出する４つの光
検出部を設ける等の手段で可能である。なお、本実施例
では、ＤＮＡ断片の測定を例にして説明したが、蛋白、
糖等の分析にも当然のことながら使用できる。本実施例
では、試料の検知を蛍光強度により行う例を示したが、
ＵＶモニター等を使用し、吸光度により検知する場合で
も同様の効果が得られる。さらに他の検知手段について
も同様である。分子ふるい膜も上記記載のセルロースの
他、限外濾過膜等種々のものを使用することが可能であ
る。また、キャピラリーの形状についても限定されるも
のではない。また、本実施例では、キャピラリーへの試
料の注入を電圧印加により行ったが、これ以外にも種々
の方法が可能である。例えば、試料を通常の加圧法や落
差法によりキャピラリーに注入することができる。注入
後の試料の濃縮は、本実施例と同様に行うことができ
る。

【００２３】さらに、本実施例では、ポリアクリルアミ
ドゲルを泳動用担体としたが、アガロース等の他のゲル
でも同様の操作が可能である。また、ゲルを用いずに緩
衝液等を泳動用担体とする場合でも可能である。この場
合は主に試料の泳動方向がゲルの場合と逆になるため、
電圧印加の極性を逆にする必要がある。また、全部の泳
動路がゲルではなく、泳動路の一部を緩衝液としこの部
分で泳動する試料を検出することも可能である。また、
本実施例のように、キャピラリー１の長さをキャピラリ
ー３の長さに比べて十分に短くすることで、試料の注入
及び濃縮に要する時間を短くすることができる。また、
試料の注入及び濃縮操作時に、電極槽６と電極槽５また
は４の間に電圧が印加されないため、試料が試料濃縮部
２を過ぎて分子量分離部であるキャピラリー３内に泳動
されることはなく、濃縮を有効に行うことができる。さ
らに、分子量分離操作時に電極槽４と電極槽５または６
の間に電圧が印加されないため、試料濃縮部２内の濃縮
された試料のみが分子量分離部であるキャピラリー３内
に泳動され、濃縮位置まで泳動されずにキャピラリー１
内に存在しうる試料は、キャピラリー３方向に泳動され
ることはなく、分離精度の高い測定が可能になる。

【００２４】なお、試料の注入及び濃縮操作時に、電極
槽６と電極槽５の間に逆方向の電圧を印加すれば、試料
のキャピラリー３内への泳動漏れ込みを強制的に防ぐこ
とができ、より高精度化することが可能になる。本実施
例によれば、試料濃縮部を設けたことで、試料をより高
感度に検出できるようになる。また試料濃縮部で濃縮さ
れ試料が集まる領域を狭めることができ、泳動での分離
性能を損なうことなく、高精度に試料を分析することが
できる。本発明の別の一実施例（第２の実施例）を説明
する。第１の実施例と同じく、末端がアデニンである、
種々の長さを有する蛍光標識されたＤＮＡ断片を試料と
して検出する場合について説明する。電気泳動装置の概
要については、図１と基本的に同様の構成とする。本実
施例では、試料濃縮部の構造、及び電圧印加方法が第１
の実施例と異なる。

【００２５】図３（ａ）に、本実施例での試料濃縮部２
ａ付近の拡大断面図を示す。分画分子量が３０００で内
径が５００μｍの限外濾過チューブを分子ふるい用チュ
ーブ２６として使用する。また試料の注入用の第１の泳
動路用には、内径約１００μｍ、外径約５００μｍ、長
さ３ｃｍのキャピラリー１ａを用いる。泳動分離用の第
２の泳動路用には、内径約１００μｍ、外径約５００μ
ｍ、長さ４０ｃｍのキャピラリー３ａを用いる。キャピ
ラリー１ａ及びキャピラリー３ａには、変性剤の尿素を
含む４％の濃度のポリアクリルアミドゲル２７及び２８
を充填しておく。分子ふるい用チューブ２６は、電極槽
５ａの１ｍｍの間隔で対向する壁に設けた１対の孔５ｂ
と５ｃに通される。この状態の分子ふるい用チューブ２
６に、両側よりそれぞれゲルの充填されたキャピラリー
１ａ及びキャピラリー３ａを押し込み、試料濃縮部２ａ
を構成する。対向するキャピラリー１ａの端とキャピラ
リー３ａの端との間隔、ギャップ２９は長さが１ｍｍで
あり、その内部はあらかじめ緩衝液で満たしておく。ギ
ャップ２９内の緩衝液と外部の電極槽５ａ内の緩衝液と
は、分子ふるい用チューブ２６を介して隔てられている
が、電解質などは透過するため電気的にはつながってお
り、ギャップ２９を泳動端とした通常の電気泳動を行う
ことができる。

【００２６】試料である蛍光標識ＤＮＡ断片のキャピラ
リーへの注入と濃縮、及び分子量分離の各操作を説明す
る。蛍光標識ＤＮＡ断片溶液約５μＬを試料液として、
サンプリングチューブに用意する。電極槽４に浸したキ
ャピラリー１ａの端及び電極８を、試料液を入れたサン
プリングチューブに移し、試料液部に−１５０Ｖ、電極
槽５ａに０Ｖ、電極槽６に−２０００Ｖの電位の電圧を
約１分間印加し続ける。この操作で、試料はサンプリン
グチューブからキャピラリー１ａに注入され、試料濃縮
部２ａの方向に泳動される。キャピラリー３ａ内のゲル
部では電界の向きがキャピラリー１ａと逆になるため、
泳動されてくる試料のキャピラリー３ａ内への漏れ入り
を防ぐことができる。次にキャピラリー１ａの端及び電
極８を電極槽４に戻し、電極槽４に−４５０Ｖ、電極槽
５ａに０Ｖ、電極槽６に−６０００Ｖの電位の電圧を約
２０分間印加し、注入された試料を試料濃縮部２ａのギ
ャップ２９に集め、濃縮させる。この泳動時間及び泳動
電圧は注入された試料のほぼ全部が試料濃縮部２ａに到
達するように調整するのが望ましい。なお、この場合
も、キャピラリー３ａ内のゲル部では電界の向きがキャ
ピラリー１ａと逆になるため、泳動されて来る試料のキ
ャピラリー３ａ内への漏れ入りを防ぐことができる。つ
まり、試料濃縮部２ａ部での試料の拡散が小さくなり、
試料濃縮部２ａのギャップ２９位置に試料を効率良く濃
縮することができる。

【００２７】次いで、電極槽５が−６ｋＶ、電極槽６が
０Ｖになるように電圧を印加することで、試料濃縮部２
ａに濃縮された試料をキャピラリー３ａに導くことがで
き、分子量分離することができる。試料濃縮部２ａのギ
ャップ２９内は緩衝液であるのに対し、キャピラリー３
ａ内はポリアクリルアミドゲル２８であるため、濃縮さ
れた試料がキャピラリー３ａに入るときに、再度濃縮さ
れることになり、ゲル内での試料の濃度がより増加し、
より精度良く検出できるようになる。本実施例によれ
ば、試料のキャピラリーへの注入及び濃縮操作におい
て、試料濃縮部を境にして互いに逆向きの電界を印加す
ることで、濃縮部での試料の拡散が抑えられ、より高精
度に試料からの蛍光強度を検出することができる。ま
た、試料を注入する第１の泳動路をゲル、試料濃縮部を
緩衝液、試料を分子量分離する第２の泳動路をゲルとす
ることで、試料濃縮部での試料の濃縮に加えて、分子量
分離される際にも濃縮されるため、ゲル内での試料の実
際的な濃度が増加し、より容易に試料を高感度で検出す
ることができるようになる。なお、本実施例では、試料
濃縮部２ａは電極槽５ａと一体化しているが、第１の実
施例と同様の配置にしてもよい。

【００２８】また、複数の濃縮部を同一の電極槽に配置
して、複数の試料を同時に濃縮して測定することが可能
になる。図３（ｂ）に、複数の試料を同時に濃縮するた
めの多連の試料濃縮部の斜視図を示す。電極槽１０５の
下部に複数（図では４個）の試料濃縮部が形成されてお
り、各試料濃縮部はそれぞれ図３（ａ）と同様の断面構
造を有している。つまり、分子ふるい用チューブ１２６
ａにキャピラリー１０１ａとキャピラリー１０３ａが接
続され、１個の試料濃縮部が形成されている。同様に、
分子ふるい用チューブ１２６ｂ〜ｄ、キャピラリー１０
１ｂ〜ｄ、キャピラリー１０３ｂ〜ｄにより３個の試料
濃縮部が形成される。これら複数の試料濃縮部が１つの
電極槽内に列状に配置し、電極槽内の緩衝液を介して全
てが電気的につながっている。試料の注入する場合に
は、キャピラリー１０１ａ〜ｄを試料注入側とすれば、
キャピラリー１０１ａ〜ｄのそれぞれを別々の試料液に
浸し、電極槽１０５との間に電界を印加して、試料をそ
れぞれ注入する。この際試料の注入に要する電極の数
は、同時に行うときは試料数だけ必要となる。電極槽１
０５に対する電極は１つで済む。濃縮手順については上
記の説明と同様である。泳動分離については、泳動分離
であるキャピラリー１０３ａ〜ｄの端を１つの電極槽
（図１に示す電極槽６）に挿入し、電極槽１０５の間に
電圧を印加し、泳動させ、一定の距離泳動した位置で検
出する。本例のように多連の試料濃縮部を使用すれば、
複数の試料に対して、少なくとも濃縮部と泳動分離側の
電極槽及び電極が１個で十分となる。また、キャピラリ
ーや分子ふるい用チューブは細いため、本例のように複
数本まとめても電極槽全体の大きさは大きくする必要は
なく、小型化が可能になる。

【００２９】本発明の別の一実施例（第３の実施例）を
説明する。測定試料、試料注入法、蛍光検出法など、第
１の実施例と同様に行う。電気泳動装置の全体構成は、
第１の実施例の場合と基本的に同様であり、本実施例で
は、試料濃縮部の構造について主に説明する。試料濃縮
部は、膜保持具と電極槽と分子ふるい膜で構成するが、
以下にそれぞれの部品について説明する。図４に、膜保
持具３９の部品図を示す。図４の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ上面図、正面図（断面図を図
示）、底面図、側面図であり、三角法を基に図示した。
膜保持具は約８ｍｍ×８ｍｍ×８ｍｍの立方体の四ふっ
化エチレン樹脂の底部を加工して、正面の断面が五角形
となるようにしたものである。また、膜保持具には、キ
ャピラリーを差し込んで固定するための内径が１５０μ
ｍのキャピラリー挿入孔３１、３２を設ける。また分子
ふるい膜を保持して押さえるためのネジ穴３３（ネジサ
イズＭ５、深さ４ｍｍ）を設ける。ネジ穴３３の底部に
分子ふるい膜を敷き、押しネジで固定する構造とする。
ネジ穴３３の底部とキャピラリー挿入孔３１、３２とは
互いに連結しており、ネジ穴３３の底部の中心に約１５
０μｍ〜２００μｍのほぼ円状の連結口３４を有する。

【００３０】図５に、電極槽４０の部品図を示す。図５
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれその上面図、正面図
（断面図を図示）、底面図である。電極槽は、外径が約
１０ｍｍの円筒状の四ふっ化エチレン樹脂であり、膜保
持具のネジ穴３３に対応する押しネジ部３５（ネジサイ
ズＭ５）と、緩衝液溜３６（内径８ｍｍ、深さ２０ｍ
ｍ）と、貫通孔３７（内径１ｍｍ）とを有している。ま
た、電極槽の底面は膜押え面３８として利用する。図６
に、膜保持具３９と電極槽４０と分子ふるい膜４１とに
より構築される試料濃縮部の組立図（断面図）である。
膜保持具３９のネジ穴３３の底部に分子ふるい膜４１
（外径４ｍｍ）を載せ、電極槽４０の押しネジ部３５の
膜押え面３８により分子ふるい膜４１を押しつけて保持
する形態となる。実際の泳動時には、内径１００μｍ、
外径２００μｍのキャピラリー４２、４３をキャピラリ
ー挿入孔３１、３２に挿入して固定する。キャピラリー
４２及び４３と分子ふるい膜４１で囲まれる空間に試料
が濃縮されることになる。さらに、電極槽４０の緩衝液
溜３６に緩衝液を満たして電極を挿入する。なお、キャ
ピラリー４２、４３及びキャピラリー挿入孔３１、３２
と連結口３４で囲まれる内部には、ゲルまたは緩衝液な
どの電気泳動用の担体を満たして使用する。この状態で
は、分子ふるい膜４１によりキャピラリー４２、４３と
電極槽４０内の緩衝液が電気的に接触することから、試
料濃縮部を泳動端とする電気泳動を行うことができる。

【００３１】また、キャピラリー４２及び４３の電気泳
動用の媒体と分子ふるい膜４１は連結口３４部で接触す
る。第１の実施例と同様の操作により、この連結口３４
に試料が泳動されて濃縮して集まることになるが、この
部分の大きさはキャピラリーを斜めに切断した断面の大
きさに等しく微小であるため、効率良く試料を濃縮する
ことができる。本実施例の試料濃縮部を使用し、キャピ
ラリーを含む泳動路の内部の担体、分子ふるい膜の種
類、試料注入法、試料濃縮法、泳動分離法等の諸操作
を、第１または第２の実施例と同様に行うことで、第１
または第２の実施例と同様に試料を高感度に検出するこ
とが可能になる。本実施例によれば、分子ふるい膜とし
てシート状の膜が使用できるため、種々の分子ふるい膜
を使用することができる。また、本実施例の構造の試料
濃縮部によれば、電極槽及び分子ふるい膜を一体化させ
た試料濃縮部を簡便に構成することができる。さらに、
キャピラリーの接続及び分子ふるい膜の固定が容易であ
り、しかも脱着可能であり、操作性が向上するとともに
繰返し使用によるコストの低減が図れる。また、第２の
実施例の図３（ｂ）と同様に、本実施例においても試料
濃縮部を複数個並べた多連濃縮部を構築することがで
き、小型化を図ることができる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、泳動路に試料濃縮部を
設けることで、実質的に泳動路中の試料濃度が濃くなる
ため、試料であるＤＮＡ、蛋白、糖等を分子量分離性能
を損なうことなく高感度に検出することが可能な電気泳
動装置が実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例の電気泳動装置の構成
図。

【図２】本発明の第１の実施例の試料濃縮部近傍の拡大
断面図。

【図３】本発明の第２の実施例の（ａ）試料濃縮部付近
の拡大断面図、（ｂ）多連の試料濃縮部の斜視図。

【図４】本発明の第３の実施例の膜保持具の部品図。

【図５】本発明の第３の実施例の電極槽の部品図。

【図６】本発明の第３の実施例の試料濃縮部の組立図。

【符号の説明】

１、１ａ、３、３ａ…キャピラリー、２、２ａ…試料濃
縮部、４、５、５ａ、６…電極槽、５ｂ、５ｃ…孔、７
…高電圧電源、８、９、１０…電極、１１…励起光照射
部、１２…蛍光検出部、１３…データ処理部、１４…表
示部、１５…記録部、１６…レーザ光源、１７、１８、
２０…レンズ、１９…分光フィルタ、２１…光電子増倍
管、２２…増幅器、２３…ポリアクリルアミドゲル、２
４…蛍光検出位置、２５…筒状担体、２６…分子ふるい
用チューブ、２７、２８…ポリアクリルアミドゲル、２
９、３０…ギャップ、３１、３２…キャピラリー挿入
孔、３３…ネジ穴、３４…連結口、３５…押しネジ部、
３６…緩衝液溜、３７…貫通孔、３８…膜押え面、３９
…膜保持具、４０…電極槽、４１…分子ふるい膜、４
２、４３、１０１ａ〜１０１ｄ、１０３ａ〜１０３ｄ…
キャピラリー、１０５…電極槽、１２６ａ〜１２６ｄ…
分子ふるい用チューブ。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料を電気泳動させて検出し解析する電気
   泳動装置において、泳動路は、試料が注入される第１の
   泳動路、この試料が濃縮される試料濃縮部、及びこの濃
   縮された試料が泳動分離される第２の泳動路とで分岐す
   ることなく構成され、前記第１の泳動路と前記試料濃縮
   部と前記第２の泳動路が順次連結していることを特徴と
   する電気泳動装置。
2. 【請求項２】前記試料濃縮部は、少なくともその一部が
   分子ふるい効果を有する筒状担体であり、前記第１及び
   前記第２の泳動路とほぼ同軸状に連結されていることを
   特徴とする請求項１記載の電気泳動装置。
3. 【請求項３】前記第１の泳動路の軸と第２の泳動路の軸
   が交差するように配置され、かつ、この交差位置に分子
   ふるい膜を配置することによって試料濃縮部を設けるこ
   とを特徴とする請求項１記載の電気泳動装置。
4. 【請求項４】前記第１の泳動路の端部と前記試料濃縮部
   の間に電圧を印加して試料を導入する第１の工程と、前
   記試料濃縮部と前記第２の泳動路の端部に電圧を印加し
   て試料を泳動分離する第２の工程を有することを特徴と
   する請求項１から請求項３のいずれかに記載の電気泳動
   装置。
5. 【請求項５】前記第１の工程において、前記試料濃縮部
   と前記第２の泳動路の端部の間に、前記第１の泳動路端
   と前記試料濃縮部の間の電圧と逆極性の電圧を印加する
   ことを特徴とする請求項５に記載の電気泳動装置。
6. 【請求項６】前記第１の泳動路の長さが前記第２の泳動
   路の長さよりも短いことを特徴とする請求項１から請求
   項５のいずれかに記載の電気泳動装置。