JPH0678356B2 - カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 - Google Patents
カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体Info
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- JPH0678356B2 JPH0678356B2 JP62298741A JP29874187A JPH0678356B2 JP H0678356 B2 JPH0678356 B2 JP H0678356B2 JP 62298741 A JP62298741 A JP 62298741A JP 29874187 A JP29874187 A JP 29874187A JP H0678356 B2 JPH0678356 B2 JP H0678356B2
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
産業上の利用分野 本発明は、カルシウム代謝異常、心臓病、潰瘍などの治
療薬または脳循環改善薬などの医薬として有用な新規ニ
ワトリカルシトニン遺伝子関連ペプチド（chicken Calc
itonin Gene Related Peptide;以下ｃ−CGRPという）誘
導体に関する。 従来の技術 最近、ニワトリのDNA構造解析により、ｃ−CGRPのアミ
ノ酸順序が推定されている〔FEBS Letters,Vol.203,No.
1,7−10,July 1986〕。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、ｃ−CGRPが単離もしくは合成された報告
はなく、どのような作用あるいは活性を有しているか否
か不明であり、このｃ−CGRP誘導体を合成し、その生物
活性を公知のCGRPと比較し、その有用性を探索すること
を医学上重要なことである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、このｃ−CGRP誘導体を合成し、その生物
活性について比較した結果、既知のヒトCGRP（ｈ−CGR
P）〔Nature,308（19）、746−748（1984）、Neuropept
ides,4,425−434（1984）、Nature,313（３）,54−56
（1984）〕より血清カルシウムおよびリン低下作用活性
が強く、しかもその活性発現の持続性の優れた新規ｃ−
CGRP誘導体を提供するものである。即ち、本発明は、式 （式中、Ｙは硫黄原子またはメチレン基を示し、ＡはAs
nまたはAspを示す）で表されるペプチドまたはその塩で
ある。 本発明において、Ｙが硫黄原子、ＡがAsnであるペプチ
ド〔１〕をデスアラニルーデアミノ−ｃ−CGRPと称し、
Ｙは硫黄原子、ＡがAspであるペプチド〔１〕をデスア
ラニルーデアミノ−〔Asp3〕−ｃ−CGRPと称し、Ｙがメ
チレン基、ＡがAsnであるペプチド〔１〕をデスアラニ
ルー〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPと称し、ＡがAspであるペプ
チド〔１〕をデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGR
Pと称することがある。 本発明のペプチド〔１〕は、公知のペプチド合成の常法
手段に従って合成できる。 （１）液相法によって製造する場合 例えば、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合
には、Ｃ末端のフェニルアラニル基のカルボキシル基を
アミド基に転化し、式〔１〕で示されるアミノ酸順序に
個々の保護されたアミノ酸および（または）保護された
低級ペプチドを縮合し、縮合反応の最終段階でＬ−シス
ティニル基およびβ−メルカプトプロピオン酸のメルカ
プト基の保護基およびその他の順鎖の官能基の保護基を
酸分解により脱離し、メルカプト基を酸化してジスルフ
ィド橋を形成することにより得られる。 また、Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合
には、Ｃ末端のフェニルアラニル基のカルボキシル基を
アミド基に転化し、式〔１〕で示されるアミノ酸順序に
個々の保護されたアミノ酸および（または）保護された
低級ペプチドを縮合し、生成された式 （式中、Ｒは活性エステル残基を示し、Ａは前記と同じ
意味を有する）を含む構成単位を上記縮合反応の任意の
過程で環化反応に付し、縮合反応の最終段階で活性基の
保護基を酸分解により脱離することにより得られる。 縮合反応自体はペプチド合成のための常法手段に従っ
て、保護基の脱着、縮合反応を繰り返すことにより行わ
れる。即ち、本ペプチド〔１〕の原料ならびにすべての
中間体の製造において使用される各種の保護基はペプチ
ド合成において既知なもの、例えば、加水分解、酸分
解、還元、アミノリシス、ヒドラジノリシスなどのよう
な既知手段によって容易に脱離することのできる保護基
が用いられる。このような保護基はペプチド合成化学の
分野の文献ならびに参考書に記載されている。 本発明においては、αーアミノ基の保護にｔ−ブチルオ
キシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−
メトキシベンジルオキシカルボニル基を用い、側鎖のア
ミノ基、即ちリジンのε−アミノ基の保護にベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニ
ル基を用い、α−カルボキシル基の保護にメチルエステ
ル基、ベンジルエステル基を用い、側鎖のカルボキシル
基、即ちアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護に
ベンジルエステル基を用い、α−アミノスベリン酸の側
鎖カルボキシル基の保護にｔ−ブチルエステル基を用
い、セリンおよびスレオニンの水酸基の保護にベンジル
基を用い、アルギニンのグアニジノ基中のアミノ基の保
護にメシチレン−２−スルホニル基またはトシル基を用
いるのが好ましい。 本ペプチド〔１〕の合成においては、個々のアミノ酸お
よび（または）低級ペプチドの縮合は、例えば、保護さ
れたα−アミノ基および活性化末端α−カルボキシル基
をもつアミノ酸または低級ペプチドと遊離のα−アミノ
基および保護された末端カルボキシル基をもつアミノ酸
または低級ペプチドとを反応させるか、あるいは活性化
α−アミノ基および保護された末端カルボキシル基をも
つアミノ酸または低級ペプチドと遊離の末端α−カルボ
キシル基をもつアミノ酸または低級ペプチドとを反応さ
せることにより実施することができる。 この場合、カルボキシル基は、例えば、酸アジド、酸無
水物、酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えば、シ
アノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステルなどに変換するこ
とによって活性化することができる。また、カルボジイ
ミド、例えばN,N′−ジシクロヘキシル−カルボジイミ
ド（DCC）、Ｎ−エチル−Ｎ′−３−ジメチルアミノプ
ロピル−カルボジイミド、N,N′−カルボニル−ジイミ
ダゾールなどの縮合剤を使用して反応させることによっ
て活性化することができる。 本発明において好ましい縮合方法は、アジド法、活性エ
ステル法、混合酸無水物法およびカルボジイミド法であ
る。縮合の各段階ではラセミ化が起こらない方法または
ラセミ化が最小になる方法を用いるのが望ましく、好ま
しくはアジド法、活性エステル法、Wunsch法〔Z.Naturf
orsch.,21b,426（1966）〕またはGeiger法（Chem.Ber.,
103,788（1970）〕などを用いる。 縮合順序は式〔１〕で示されるアミノ酸順序であれば、
如何なる順序からも合成し得るが、Ｃ末端側から順次ア
ミノ酸および（または）低級ペプチドを連結させるのが
好ましい。 かくして得られる鎖状保護ペプチドから目的のペプチド
〔１〕を得るには、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕
を得るか、またはＹがメチレン基であるペプチド〔１〕
を得るかにより、その後の製造工程が異なる。 Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合には、先
ず上記鎖状保護ペプチド、即ち保護されたω−アミノ
基、側鎖カルボキシル基、水酸基、グアニジノ基および
メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオン酸でア
シル化されたペンタトリアコンタペプチドアミドの保護
基が脱離される。これらの保護基は、好ましくは、酸分
解、例えばトリフルオロメタンスルホン酸、無水弗化水
素などによる方法によって一段階で脱離され、遊離メル
カプト基を有するβ−メルカプトプロピオニル−ペンタ
トリアコンタペプチドアミドが得られる。 次いで、このペプチドアミドは酸化により分子内ジスル
フィド橋が形成され、目的のペプチド〔１〕が得られる
のであるが、このジスルフィド橋の形成は通常、水中の
大気酸素、有機溶媒中のジヨードエタン、氷酢酸中の沃
素、水溶液中のフェリシアン化カリウムなどで酸化する
ことによって行われる。 Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合には、
上記鎖状保護ペプチド合成の段階で、式 （式中、ＲおよびＡは前記と同じ意味を有する）を含む
構成単位を縮合反応の任意の段階で環化反応に付すので
あるが、この環化は前述の方法で活性化されたα−アミ
ノスベリン酸のω位カルボキシル基とＮ−末端アミノ酸
の遊離アミノ基との縮合反応により行われる。その際ス
レオニンの水酸基およびアスパラギン酸の側鎖カルボキ
シル基は保護しておくことが好ましい。 このようにして得られたα−アミノスベリン酸を含む活
性基の保護されたまたは保護されていない環状ペプチド
とそれ以外の活性基の保護されたまたは保護されていな
い大きなペプチドを縮合させ、引続き保護基のある場合
は、保護基を脱離させることにより行われる。 こうして保護されたε−アミノ基、側鎖カルボキシル
基、グアニジノ基および水酸基を有するペンタトリアコ
ンタペプチドアミドが得られる。これらの保護基は好ま
しくは、酸分解、例えばトリフルオロメタンスルホン
酸、無水弗化水素などによる方法によって一段階で脱離
され、目的のペプチド〔１〕が得られる。 （２）固相法によって製造する場合 本発明においては、上記の液相法によるペプチド合成法
の他に、固相法によるペプチド合成法を一部または全部
利用してペプチド〔１〕を合成することができる。 例えば、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合
には、３番目から37番目までのペプチドフラグメントを
固相法により合成し、α−アミノ基をβ−メルカプトプ
ロピオン酸でアシル化することにより保護されたペンタ
トリアコンタペプチド結合樹脂が得られる。これらの保
護基および樹脂は、公知の方法、例えば、トリフルオロ
メタンスルホン酸、無水弗化水素などによる方法によっ
て一段階で脱離され、遊離メルカプト基を有するβ−メ
ルカプトプロピオニル−ペンタトリアコンタペプチドア
ミドが得られる。このペプチドアミドは前記の液相法で
述べたと同じ方法で分子内ジスルフィド橋を形成するこ
とにより目的のペプチド〔１〕が得られる。 また、Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合
には、例えば９番目から37番目までのペプチドフラグメ
ントを固相法により合成し、Ｎ−末端部のα−アミノス
ベリン酸を含む環状ペプチドフラグメントを液相法によ
り合成し、引続き上記２つのペプチドフラグメントを固
相法により縮合して保護されたペンタトリアコンタペプ
チド結合樹脂が得られる。これらの保護基および樹脂
は、公知の方法、例えば、トリフルオロメタンスルホン
酸、無水弗化水素などによる方法によって一段階で脱離
され、目的のペプチド〔１〕が得られる。 上記の固相法で用いられる樹脂としては、固相法で通常
用いられる樹脂、例えばベンズヒドリルアミン樹脂、ｐ
−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが挙げられる。
この樹脂は官能基当量や架橋度の違いによって所望の性
状を有する樹脂が入手可能であり、市販品を購入するこ
ともできる。 上記の固相法においては、樹脂に式〔１〕で示されるア
ミノ酸順序にＣ−末端のアミノ酸から３番目のアミノ酸
（Ｙが硫黄原子である場合）またはＣ−末端のアミノ酸
から９番目のアミノ酸（Ｙがメチレン基である場合）ま
でを順次一つずつ縮合させて行う。該アミノ酸の官能基
は公知の方法により保護基で保護される。上記の保護基
の例としては、上記で述べた通りである。 上記の固相反応に際しては、樹脂を反応器に入れ、ジク
ロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼンまたは樹脂を膨潤させる溶媒を樹脂1gに対し、溶
媒２〜20mlの割合で添加する。これに、予め別の反応器
で、樹脂中のアミノ基１当量に対し１〜６当量のBoc
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノ酸とDCCを反
応させ、得られた対称酸無水物を副生したジシクロヘキ
シル尿素（DCU）より分離して、上記樹脂の入った反応
器に加える。縮合剤（DCC）の使用量はBoc−アミノ酸１
当量に対し、0.5から３当量を用いる。反応は通常５〜6
0分行われる。 各工程で得られたBoc−アミノ酸−樹脂またはBoc−ペプ
チド−樹脂の一部を採取し、常法〔T.Fairwell.et al.,
Biochemistry,22,2691（1983）〕に従い反応したBoc−
アミノ酸量を測定してカップリング量を求めればよい。 次に、α−アミノ基の保護基であるBocをトリフルオロ
酢酸の如き酸で脱離して、順次縮合反応を遂行すればよ
い。上記の固相法によるペプチド合成は自動固相合成機
を用いるが、手動法で遂行してもよい。これらの操作は
全て窒素ガス気流下で行うのが望ましい。 このようにして３番目または９番目から37番目までのペ
プチドフラグメントが結合した樹脂が得られる。 ３番目から37番目までのペプチドフラグメント結合樹脂
は、最後にβ−メルカプトプロピオン酸でアシル化され
て、β−メルカプトプロピオニル−保護されたペンタト
リアコンタペプチドアミド結合樹脂が得られる。 このようにして得られた保護されたペンタトリアコンタ
ペプチドアミド結合樹脂は、上記で述べた通り、無水弗
化水素などにより一段階で保護基と樹脂が脱離され、遊
離メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオニペン
タトリアコンタペプチドアミドが得られる。 前記遊離メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオ
ニペンタトリアコンタペプチドアミドは前記の通り分子
内ジスルフィド橋を形成することにより目的のペプチド
〔１〕が得られる。 ９番目から37番目までのペプチドフラグメント結合樹脂
に前記のα−アミノスベリン酸を含む環状ペプチドフラ
グメントを縮合させればよい。 このようにして得られたα−アミノスベリン酸を含む保
護されたペンタトリアコンタペプチドアミド結合樹脂は
上記で述べた通り、無水弗化水素などにより一段階で保
護基と樹脂が脱離され、目的のペプチド〔１〕が得られ
る。 （３）分離精製、その他 このようにして得られたペプチド〔１〕は、ペプチドま
たは蛋白質を精製する公知の手段によって分離精製する
ことができる。例えば、セファデックスＧ−25、セファ
デックスＧ−50、セファデックスLH−20などのゲル濾過
剤を用いるゲル濾過法、カルボキシメチルセルロース、
その他のイオン交換樹脂などを用いるカラムクロマトク
ラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより行う
ことができる。 本発明の新規ペプチド〔１〕は、その方法の条件により
塩基またはその塩の形で得られる。例えば、酢酸などの
公知の有機酸との塩を形成することができる。 尚、本明細書および図面中に記載の略記号は、次の意味
を有する。 Asu;L−α−アミノスベリン酸 Asn;L−アスパラギン Asp;L−アスパラギン酸 Ala;L−アラニン Thr;L−スレオニン Val;L−バリン His;L−ヒスチジン Arg;L−アルギニン Leu;L−ロイシン Phe;L−フェニルアラニン Ser;L−セリン Gly;グリシン Lys;L−リジン Pro;L−プロリン Boc;t−ブチルオキシカルボニル Z;ベンジルオキシカルボニル Cl−Z;p−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl;ベンジル OSu;N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル ONp;p−ニトロフェニルエステル OMe;メチルエステル OBut;t−ブチルエステル OBzl;ベンジルエステル TFA;トリフルオロ酢酸 エーテル；ジエチルエーテル DMF;N,N′−ジメチルホルムアミド MeOH;メタノール DCM;ジクロロメタン DIEA;ジイソプロピルエチルアミン HOBt;1−ヒドロキシベンゾトリアゾール MBHA樹脂;p−メチルベンズヒドリルアミン樹脂 発明の効果 血清カルシウムおよびリン低下作用 ＜活性測定法＞ 本発明のデスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP、デスアラ
ニル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPおよびデスアラニル−〔As
p3,Asu2,7〕−ｃ−CGRP各々80μｇならびに対照として
ｃ−CGRP（特願昭61−273581（特開昭63−126894号公
報）および公知のｈ−CGRP各々80μｇを0.1％牛血清ア
ルブミン含有クエン酸緩衝液（pH6.5）〔以下単に溶解
液と称する〕1mlに溶かし、ウィスター系ラット（80−9
0g）１群５−６匹に80μg/kgになるよう尾静脈より投与
し、30分および60分後に腹部下行大動脈より採血し、血
清カルシウム濃度を原子吸光より測定し、また血清リン
濃度はゴールデンベルクらの方法〔Clin.Chem.,12,871
−882（1966）〕により測定した。 ＜結果＞ 本発明品であるデスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP20μ
g/kgを投与（―〇―）すると、第１図および第２図に示
す通り、コントロール群（溶解液投与群）（―×―）に
比べ血清カルシウムおよびリン濃度は30％以上も低下
し、２時間後もこの作用は持続し、この活性の強さは４
倍量のｈ−CGRPを投与した時の活性（―□―,80μg/k
g）より遥かに強くまた、同量のｃ−CGRPを投与した群
（―△―,20μg/kg）と比較しても、その活性は有意に
強く、その発現時間も有意に延長した。 一方、本発明品であるデスアラニル−デアミノ−ｃ−CG
RP80μg/kgを投与（―●―）とすると、第１図および第
２図に示す通り、コントロール群（溶解液投与群）（―
×―）に比べ血清カルシウムおよびリン濃度は30％以上
も低下し、２時間後もこの作用は持続し、血清カルシウ
ム低下作用活性はさらに増強された。この活性の強さは
同量のｈ−CGRPを投与した時の活性（―□―,80μg/k
g）および同量のｃ−CGRPを投与した時の活性（―▲―8
0μg/kg）より遥かに強く、その発現時間も遥かに延長
した。 また、本発明品であるデスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−
CGRP（―●―）80μg/kgおよびデスアラニル−〔Asp3,A
su2,7〕−ｃ−CGRP（―■―）80μg/kgを投与すると、
第３図および第４図に示す通り、コントロール群（溶解
液投与群）（―×―）に比べ血清カルシウムおよびリン
濃度は30％以上も低下し、２時間後もこの作用は持続し
た。この活性の強さは同量のｈ−CGRPを投与した時の活
性（―□―）より遥かに強く、同量のｃ−CGRPを投与し
た時の活性（―△―）より強く、その発現時間も延長し
た。 上記の通り、本発明のペプチド〔１〕は、既知物質のｈ
−CGRPよりも血清カルシウム、リン低下作用活性が極め
て強く、しかもその活性発現の持続性が優れているだけ
でなくｃ−CGRPと比較しても、生物活性が強く、活性発
現の持続性が長いという特徴を有しており、生体内では
アミノペプチダーゼの酵素作用に対してより安定である
ため、カルシウム代謝異常、心臓病、潰瘍などの治療薬
または脳循環改善薬などとして有用である。 実施例 次に実施例を挙げて本発明の製造例を具体的に説明す
る。 尚、実施例中のPF（ ）は（ ）内の数字のアミノ
酸順序を有するペプチドフラグメントを意味する。 また、実施例で使用した薄層クロマトグラフィー（TL
C）の担体および展開溶媒ならびにアミノ酸分析用の加
水分解の条件は特記しない限り次の通りである。 ＜TLC＞ 担体；シリカゲル（メルク社製Art5715）展開溶媒； 1;クロロホルムーメタノールー酢酸（95:5:3） 2;クロロホルム−メタノールー酢酸（85:15:5） ＜加水分解条件＞ 試料を6N塩酸で110℃、24〜48時間封管中で加水分解し
た。 実施例 １ デスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPの製造 デスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−37）
−MBHA樹脂、即ち 1.09gにアニソール1mlを加え、これに無水弗化水素25ml
を加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗化水素
を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに0.1M
酢酸20mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液をDowex
WGRのカラム（2.8×15cm）に通し、0.1M酢酸60mlで溶出
した。得られた溶出液を凍結乾燥し、370mgの白色粉末
を得た。この粉末をカルボキシメチルセルロースのカラ
ム（2.8×13cm）にチャージし、0.01M酢酸アンモニウム
水溶液（pH4.5）300ml〜0.5M酢酸アンモニウム水溶液
（pH5.3）300mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μｌを
使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750nm
で測定し、フラクション33〜37番目を集め、これをCHP
−20樹脂（三菱化成工業社製）のカラム（2.8×5.5cm）
にチャージし、25％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶
液150ml〜40％アセトナトリルを含む0.1M酢酸水溶液150
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を6.4mlづつ分画し、フラクション10〜12番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末30.5mgを得た。これを下記
の条件による逆相系高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）により精製し、デスアラニルー（Asu2,7〕−ｃ−CGR
Pの精製品3.4mgを得た。 カラム;Nucleosil 5C18 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを2
5分間に28〜38％に変化させるグラジエント溶出） 流速;2.5ml/分 分取;17.8分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕26.5 D▼−53.3（ｃ＝0.094,0.1M酢酸） アミノ酸分析値； Asp4.96（５）、Thr3.77（４）、 Ser2.83（３）、Pro1.12（１）、Gly4.15（４）、Ala3.
00（３）、Val3.89（４）、Leu2.00（２）、Phe3.10
（３）、Lys2.11（２）、His0.98（１）、Arg2.10
（２）、Asu1.12（１） 上記のデスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂は次の方法により得た。 固相合成装置としてApplied Blosystems社製430−Ａペ
プチドシンセサイザーを用いて固相合成を行った。 （１）PF（９−37）−MBHA樹脂、即ちＨ−Thr（Bzl）−
His−Arg（Tos）−Leu−Ala−Asp（OBzl）−Phe−Leu−
Ser（Bzl）−Arg（Toss）−Ser（Bzl）−Gly−Gly−Val
−Gly−Lys（Cl−Ｚ）−Asn−Asn−Phe−Val−Pro−Thr
（Bzl）−Asn−Val−Gly−Ser（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）
−Ala−Phe−MBHA樹脂の製造 MBHA樹脂（Applied Biosystems社製、アミノ基0.61mモ
ル/g）0.8gをペプチド固相合成用反応容器に入れ、DCM8
ml（４回、各１分）、60％TFA含有DCM溶液8ml（20
分）、DCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1ml含有DMF溶液3m
l（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各40秒）の順に窒
素ガス気流中撹拌下処理し、各々の処理後濾過した。 一方、アミノ酸順序37番目のBoc−Phe2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。反応液を濾過して濃縮
容器に移し、これにDMF3mlを加え、窒素ガス気流下DCM
を留去した。これにDMF3mlを加え、前記の反応容器に移
して25分間反応させた。次いで、DCM8ml（６回、各20
秒）で洗浄、濾過してBoc−Phe−MBHA樹脂を得た。 次に、前記のBoc−Phe−MBHA樹脂を反応容器中DCM8ml
（４回、各１分）で洗浄し、濾過した。これに60％TFA
含有40％DCM溶液8mlを加え、20分間撹拌し、Bocを脱離
した。得られた樹脂をDCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1m
l含有DMF溶液3ml（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各4
0秒）で順次洗浄し、濾過した。 さらに、アミノ酸順序36番目のBoc−Ala2mモルをDCM5ml
に溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶
液）2mlを加え、５分間反応させた。次いで、Boc−Phe
の場合と同様に処理し、DMFを加えて窒素ガス気流下で
濃縮した後、反応容器に移して20分間反応させた。次い
で、DCM8ml（６回、各20秒）で洗浄、濾過してBoc−Ala
−Phe−MBHA樹脂を得た。 以下、順次35番目から９番目までのアミノ酸をカップリ
ングしてPF（９−37）−MBHA樹脂を得た。用いた保護ア
ミノ酸は次の通りである。 上記固相合成において、Asn、Argを用いた場合は、2mモ
ルのアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml中、DCC溶
液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加え、１分間
反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、反応容器
に移してカップリング反応させ、DCM洗浄、濾過後、も
う一度2mモルアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml
中、DCC溶液2ml、HoBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加
え、25分間反応させたものを反応容器に移してカップリ
ング反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で行
った。 （２）デスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂の製造 環状PF（３−８）〔10〕即ち、 220mgをDMF10mlに溶かし、これに−40℃に冷却下ジオキ
サン中4N−塩化水素0.93mlを加え、−30℃で亜硝酸イソ
アミル60μを加えた。30分後にヒドラジン・テストが
陰性になったので、−70℃に冷却下トリエチルアミン52
0μを加え、中和した。これにPF（９−37）−MBHA樹
脂1.13gを加え、さらにトリエチルアミン90μを加
え、−20〜−10℃で５時間撹拌した後、４℃で１昼夜撹
拌した。反応終了後、吸引濾過し、DMF10ml、0.1M酢酸1
0ml、エタノール10mlの順で洗浄後、減圧乾燥してデス
アラニルー〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−37）−MB
HA樹脂1.09gを得た。 上記環状PF（３−８）〔10〕は次の方法により製造し
た。 （３）環状保護PF（３−８）； Boc−Asn−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu−Val−O
Me〔７〕3.4gをピリジン50mlに溶かし、これに5.7当量
のｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテートを加え、
45℃で４時間撹拌した。ピリジンを留去後、エーテルを
加え、生じた沈澱物を集めた。これにTFA30mlを加えて
脱Boc化した後、TFAを減圧留去し、エーテルを加え、生
じた沈澱物を集めた。沈澱物をDMF82mlに溶解し、これ
に45℃のピリジン2.3に滴下し、50℃で６時間、次い
で室温で一夜撹拌した。反応液を減圧下ピリジンを留去
し、残渣に0.5％重曹水100mlを加え、生じた沈澱物を充
分水洗した後、デシケータで乾燥して環状保護PF（３−
８）〔８〕を得た。収量3.26g （４）環状PF（３−８）； 環状保護PF（３−８）〔８〕1.48gにアニソール1.5mlを
加え、０℃に冷却下無水弗化水素15mlを加え、１時間撹
拌した。反応後、減圧下無水弗化水素を留去した。残渣
をエーテルで洗浄し、白色粉末1.15gを得た。これを酢
酸3mlに溶解し、これに0.1M酢酸9mlを加え、33％DMF含
有0.1M酢酸で充填したCHP−20のカラム（3.2×25cm）に
チャージし、33％酢酸700mlから70％DMF含有33％酢酸70
0mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行っ
た。溶出液を10mlづつ分画し、フラクション32−49番目
を集め、DMF留去後、凍結乾燥して白色粉末の環状PF
（３−８）
療薬または脳循環改善薬などの医薬として有用な新規ニ
ワトリカルシトニン遺伝子関連ペプチド（chicken Calc
itonin Gene Related Peptide;以下ｃ−CGRPという）誘
導体に関する。 従来の技術 最近、ニワトリのDNA構造解析により、ｃ−CGRPのアミ
ノ酸順序が推定されている〔FEBS Letters,Vol.203,No.
1,7−10,July 1986〕。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、ｃ−CGRPが単離もしくは合成された報告
はなく、どのような作用あるいは活性を有しているか否
か不明であり、このｃ−CGRP誘導体を合成し、その生物
活性を公知のCGRPと比較し、その有用性を探索すること
を医学上重要なことである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、このｃ−CGRP誘導体を合成し、その生物
活性について比較した結果、既知のヒトCGRP（ｈ−CGR
P）〔Nature,308（19）、746−748（1984）、Neuropept
ides,4,425−434（1984）、Nature,313（３）,54−56
（1984）〕より血清カルシウムおよびリン低下作用活性
が強く、しかもその活性発現の持続性の優れた新規ｃ−
CGRP誘導体を提供するものである。即ち、本発明は、式 （式中、Ｙは硫黄原子またはメチレン基を示し、ＡはAs
nまたはAspを示す）で表されるペプチドまたはその塩で
ある。 本発明において、Ｙが硫黄原子、ＡがAsnであるペプチ
ド〔１〕をデスアラニルーデアミノ−ｃ−CGRPと称し、
Ｙは硫黄原子、ＡがAspであるペプチド〔１〕をデスア
ラニルーデアミノ−〔Asp3〕−ｃ−CGRPと称し、Ｙがメ
チレン基、ＡがAsnであるペプチド〔１〕をデスアラニ
ルー〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPと称し、ＡがAspであるペプ
チド〔１〕をデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGR
Pと称することがある。 本発明のペプチド〔１〕は、公知のペプチド合成の常法
手段に従って合成できる。 （１）液相法によって製造する場合 例えば、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合
には、Ｃ末端のフェニルアラニル基のカルボキシル基を
アミド基に転化し、式〔１〕で示されるアミノ酸順序に
個々の保護されたアミノ酸および（または）保護された
低級ペプチドを縮合し、縮合反応の最終段階でＬ−シス
ティニル基およびβ−メルカプトプロピオン酸のメルカ
プト基の保護基およびその他の順鎖の官能基の保護基を
酸分解により脱離し、メルカプト基を酸化してジスルフ
ィド橋を形成することにより得られる。 また、Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合
には、Ｃ末端のフェニルアラニル基のカルボキシル基を
アミド基に転化し、式〔１〕で示されるアミノ酸順序に
個々の保護されたアミノ酸および（または）保護された
低級ペプチドを縮合し、生成された式 （式中、Ｒは活性エステル残基を示し、Ａは前記と同じ
意味を有する）を含む構成単位を上記縮合反応の任意の
過程で環化反応に付し、縮合反応の最終段階で活性基の
保護基を酸分解により脱離することにより得られる。 縮合反応自体はペプチド合成のための常法手段に従っ
て、保護基の脱着、縮合反応を繰り返すことにより行わ
れる。即ち、本ペプチド〔１〕の原料ならびにすべての
中間体の製造において使用される各種の保護基はペプチ
ド合成において既知なもの、例えば、加水分解、酸分
解、還元、アミノリシス、ヒドラジノリシスなどのよう
な既知手段によって容易に脱離することのできる保護基
が用いられる。このような保護基はペプチド合成化学の
分野の文献ならびに参考書に記載されている。 本発明においては、αーアミノ基の保護にｔ−ブチルオ
キシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−
メトキシベンジルオキシカルボニル基を用い、側鎖のア
ミノ基、即ちリジンのε−アミノ基の保護にベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニ
ル基を用い、α−カルボキシル基の保護にメチルエステ
ル基、ベンジルエステル基を用い、側鎖のカルボキシル
基、即ちアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護に
ベンジルエステル基を用い、α−アミノスベリン酸の側
鎖カルボキシル基の保護にｔ−ブチルエステル基を用
い、セリンおよびスレオニンの水酸基の保護にベンジル
基を用い、アルギニンのグアニジノ基中のアミノ基の保
護にメシチレン−２−スルホニル基またはトシル基を用
いるのが好ましい。 本ペプチド〔１〕の合成においては、個々のアミノ酸お
よび（または）低級ペプチドの縮合は、例えば、保護さ
れたα−アミノ基および活性化末端α−カルボキシル基
をもつアミノ酸または低級ペプチドと遊離のα−アミノ
基および保護された末端カルボキシル基をもつアミノ酸
または低級ペプチドとを反応させるか、あるいは活性化
α−アミノ基および保護された末端カルボキシル基をも
つアミノ酸または低級ペプチドと遊離の末端α−カルボ
キシル基をもつアミノ酸または低級ペプチドとを反応さ
せることにより実施することができる。 この場合、カルボキシル基は、例えば、酸アジド、酸無
水物、酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えば、シ
アノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステルなどに変換するこ
とによって活性化することができる。また、カルボジイ
ミド、例えばN,N′−ジシクロヘキシル−カルボジイミ
ド（DCC）、Ｎ−エチル−Ｎ′−３−ジメチルアミノプ
ロピル−カルボジイミド、N,N′−カルボニル−ジイミ
ダゾールなどの縮合剤を使用して反応させることによっ
て活性化することができる。 本発明において好ましい縮合方法は、アジド法、活性エ
ステル法、混合酸無水物法およびカルボジイミド法であ
る。縮合の各段階ではラセミ化が起こらない方法または
ラセミ化が最小になる方法を用いるのが望ましく、好ま
しくはアジド法、活性エステル法、Wunsch法〔Z.Naturf
orsch.,21b,426（1966）〕またはGeiger法（Chem.Ber.,
103,788（1970）〕などを用いる。 縮合順序は式〔１〕で示されるアミノ酸順序であれば、
如何なる順序からも合成し得るが、Ｃ末端側から順次ア
ミノ酸および（または）低級ペプチドを連結させるのが
好ましい。 かくして得られる鎖状保護ペプチドから目的のペプチド
〔１〕を得るには、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕
を得るか、またはＹがメチレン基であるペプチド〔１〕
を得るかにより、その後の製造工程が異なる。 Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合には、先
ず上記鎖状保護ペプチド、即ち保護されたω−アミノ
基、側鎖カルボキシル基、水酸基、グアニジノ基および
メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオン酸でア
シル化されたペンタトリアコンタペプチドアミドの保護
基が脱離される。これらの保護基は、好ましくは、酸分
解、例えばトリフルオロメタンスルホン酸、無水弗化水
素などによる方法によって一段階で脱離され、遊離メル
カプト基を有するβ−メルカプトプロピオニル−ペンタ
トリアコンタペプチドアミドが得られる。 次いで、このペプチドアミドは酸化により分子内ジスル
フィド橋が形成され、目的のペプチド〔１〕が得られる
のであるが、このジスルフィド橋の形成は通常、水中の
大気酸素、有機溶媒中のジヨードエタン、氷酢酸中の沃
素、水溶液中のフェリシアン化カリウムなどで酸化する
ことによって行われる。 Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合には、
上記鎖状保護ペプチド合成の段階で、式 （式中、ＲおよびＡは前記と同じ意味を有する）を含む
構成単位を縮合反応の任意の段階で環化反応に付すので
あるが、この環化は前述の方法で活性化されたα−アミ
ノスベリン酸のω位カルボキシル基とＮ−末端アミノ酸
の遊離アミノ基との縮合反応により行われる。その際ス
レオニンの水酸基およびアスパラギン酸の側鎖カルボキ
シル基は保護しておくことが好ましい。 このようにして得られたα−アミノスベリン酸を含む活
性基の保護されたまたは保護されていない環状ペプチド
とそれ以外の活性基の保護されたまたは保護されていな
い大きなペプチドを縮合させ、引続き保護基のある場合
は、保護基を脱離させることにより行われる。 こうして保護されたε−アミノ基、側鎖カルボキシル
基、グアニジノ基および水酸基を有するペンタトリアコ
ンタペプチドアミドが得られる。これらの保護基は好ま
しくは、酸分解、例えばトリフルオロメタンスルホン
酸、無水弗化水素などによる方法によって一段階で脱離
され、目的のペプチド〔１〕が得られる。 （２）固相法によって製造する場合 本発明においては、上記の液相法によるペプチド合成法
の他に、固相法によるペプチド合成法を一部または全部
利用してペプチド〔１〕を合成することができる。 例えば、Ｙが硫黄原子であるペプチド〔１〕を得る場合
には、３番目から37番目までのペプチドフラグメントを
固相法により合成し、α−アミノ基をβ−メルカプトプ
ロピオン酸でアシル化することにより保護されたペンタ
トリアコンタペプチド結合樹脂が得られる。これらの保
護基および樹脂は、公知の方法、例えば、トリフルオロ
メタンスルホン酸、無水弗化水素などによる方法によっ
て一段階で脱離され、遊離メルカプト基を有するβ−メ
ルカプトプロピオニル−ペンタトリアコンタペプチドア
ミドが得られる。このペプチドアミドは前記の液相法で
述べたと同じ方法で分子内ジスルフィド橋を形成するこ
とにより目的のペプチド〔１〕が得られる。 また、Ｙがメチレン基であるペプチド〔１〕を得る場合
には、例えば９番目から37番目までのペプチドフラグメ
ントを固相法により合成し、Ｎ−末端部のα−アミノス
ベリン酸を含む環状ペプチドフラグメントを液相法によ
り合成し、引続き上記２つのペプチドフラグメントを固
相法により縮合して保護されたペンタトリアコンタペプ
チド結合樹脂が得られる。これらの保護基および樹脂
は、公知の方法、例えば、トリフルオロメタンスルホン
酸、無水弗化水素などによる方法によって一段階で脱離
され、目的のペプチド〔１〕が得られる。 上記の固相法で用いられる樹脂としては、固相法で通常
用いられる樹脂、例えばベンズヒドリルアミン樹脂、ｐ
−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが挙げられる。
この樹脂は官能基当量や架橋度の違いによって所望の性
状を有する樹脂が入手可能であり、市販品を購入するこ
ともできる。 上記の固相法においては、樹脂に式〔１〕で示されるア
ミノ酸順序にＣ−末端のアミノ酸から３番目のアミノ酸
（Ｙが硫黄原子である場合）またはＣ−末端のアミノ酸
から９番目のアミノ酸（Ｙがメチレン基である場合）ま
でを順次一つずつ縮合させて行う。該アミノ酸の官能基
は公知の方法により保護基で保護される。上記の保護基
の例としては、上記で述べた通りである。 上記の固相反応に際しては、樹脂を反応器に入れ、ジク
ロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼンまたは樹脂を膨潤させる溶媒を樹脂1gに対し、溶
媒２〜20mlの割合で添加する。これに、予め別の反応器
で、樹脂中のアミノ基１当量に対し１〜６当量のBoc
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノ酸とDCCを反
応させ、得られた対称酸無水物を副生したジシクロヘキ
シル尿素（DCU）より分離して、上記樹脂の入った反応
器に加える。縮合剤（DCC）の使用量はBoc−アミノ酸１
当量に対し、0.5から３当量を用いる。反応は通常５〜6
0分行われる。 各工程で得られたBoc−アミノ酸−樹脂またはBoc−ペプ
チド−樹脂の一部を採取し、常法〔T.Fairwell.et al.,
Biochemistry,22,2691（1983）〕に従い反応したBoc−
アミノ酸量を測定してカップリング量を求めればよい。 次に、α−アミノ基の保護基であるBocをトリフルオロ
酢酸の如き酸で脱離して、順次縮合反応を遂行すればよ
い。上記の固相法によるペプチド合成は自動固相合成機
を用いるが、手動法で遂行してもよい。これらの操作は
全て窒素ガス気流下で行うのが望ましい。 このようにして３番目または９番目から37番目までのペ
プチドフラグメントが結合した樹脂が得られる。 ３番目から37番目までのペプチドフラグメント結合樹脂
は、最後にβ−メルカプトプロピオン酸でアシル化され
て、β−メルカプトプロピオニル−保護されたペンタト
リアコンタペプチドアミド結合樹脂が得られる。 このようにして得られた保護されたペンタトリアコンタ
ペプチドアミド結合樹脂は、上記で述べた通り、無水弗
化水素などにより一段階で保護基と樹脂が脱離され、遊
離メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオニペン
タトリアコンタペプチドアミドが得られる。 前記遊離メルカプト基を有するβ−メルカプトプロピオ
ニペンタトリアコンタペプチドアミドは前記の通り分子
内ジスルフィド橋を形成することにより目的のペプチド
〔１〕が得られる。 ９番目から37番目までのペプチドフラグメント結合樹脂
に前記のα−アミノスベリン酸を含む環状ペプチドフラ
グメントを縮合させればよい。 このようにして得られたα−アミノスベリン酸を含む保
護されたペンタトリアコンタペプチドアミド結合樹脂は
上記で述べた通り、無水弗化水素などにより一段階で保
護基と樹脂が脱離され、目的のペプチド〔１〕が得られ
る。 （３）分離精製、その他 このようにして得られたペプチド〔１〕は、ペプチドま
たは蛋白質を精製する公知の手段によって分離精製する
ことができる。例えば、セファデックスＧ−25、セファ
デックスＧ−50、セファデックスLH−20などのゲル濾過
剤を用いるゲル濾過法、カルボキシメチルセルロース、
その他のイオン交換樹脂などを用いるカラムクロマトク
ラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより行う
ことができる。 本発明の新規ペプチド〔１〕は、その方法の条件により
塩基またはその塩の形で得られる。例えば、酢酸などの
公知の有機酸との塩を形成することができる。 尚、本明細書および図面中に記載の略記号は、次の意味
を有する。 Asu;L−α−アミノスベリン酸 Asn;L−アスパラギン Asp;L−アスパラギン酸 Ala;L−アラニン Thr;L−スレオニン Val;L−バリン His;L−ヒスチジン Arg;L−アルギニン Leu;L−ロイシン Phe;L−フェニルアラニン Ser;L−セリン Gly;グリシン Lys;L−リジン Pro;L−プロリン Boc;t−ブチルオキシカルボニル Z;ベンジルオキシカルボニル Cl−Z;p−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl;ベンジル OSu;N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル ONp;p−ニトロフェニルエステル OMe;メチルエステル OBut;t−ブチルエステル OBzl;ベンジルエステル TFA;トリフルオロ酢酸 エーテル；ジエチルエーテル DMF;N,N′−ジメチルホルムアミド MeOH;メタノール DCM;ジクロロメタン DIEA;ジイソプロピルエチルアミン HOBt;1−ヒドロキシベンゾトリアゾール MBHA樹脂;p−メチルベンズヒドリルアミン樹脂 発明の効果 血清カルシウムおよびリン低下作用 ＜活性測定法＞ 本発明のデスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP、デスアラ
ニル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPおよびデスアラニル−〔As
p3,Asu2,7〕−ｃ−CGRP各々80μｇならびに対照として
ｃ−CGRP（特願昭61−273581（特開昭63−126894号公
報）および公知のｈ−CGRP各々80μｇを0.1％牛血清ア
ルブミン含有クエン酸緩衝液（pH6.5）〔以下単に溶解
液と称する〕1mlに溶かし、ウィスター系ラット（80−9
0g）１群５−６匹に80μg/kgになるよう尾静脈より投与
し、30分および60分後に腹部下行大動脈より採血し、血
清カルシウム濃度を原子吸光より測定し、また血清リン
濃度はゴールデンベルクらの方法〔Clin.Chem.,12,871
−882（1966）〕により測定した。 ＜結果＞ 本発明品であるデスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP20μ
g/kgを投与（―〇―）すると、第１図および第２図に示
す通り、コントロール群（溶解液投与群）（―×―）に
比べ血清カルシウムおよびリン濃度は30％以上も低下
し、２時間後もこの作用は持続し、この活性の強さは４
倍量のｈ−CGRPを投与した時の活性（―□―,80μg/k
g）より遥かに強くまた、同量のｃ−CGRPを投与した群
（―△―,20μg/kg）と比較しても、その活性は有意に
強く、その発現時間も有意に延長した。 一方、本発明品であるデスアラニル−デアミノ−ｃ−CG
RP80μg/kgを投与（―●―）とすると、第１図および第
２図に示す通り、コントロール群（溶解液投与群）（―
×―）に比べ血清カルシウムおよびリン濃度は30％以上
も低下し、２時間後もこの作用は持続し、血清カルシウ
ム低下作用活性はさらに増強された。この活性の強さは
同量のｈ−CGRPを投与した時の活性（―□―,80μg/k
g）および同量のｃ−CGRPを投与した時の活性（―▲―8
0μg/kg）より遥かに強く、その発現時間も遥かに延長
した。 また、本発明品であるデスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−
CGRP（―●―）80μg/kgおよびデスアラニル−〔Asp3,A
su2,7〕−ｃ−CGRP（―■―）80μg/kgを投与すると、
第３図および第４図に示す通り、コントロール群（溶解
液投与群）（―×―）に比べ血清カルシウムおよびリン
濃度は30％以上も低下し、２時間後もこの作用は持続し
た。この活性の強さは同量のｈ−CGRPを投与した時の活
性（―□―）より遥かに強く、同量のｃ−CGRPを投与し
た時の活性（―△―）より強く、その発現時間も延長し
た。 上記の通り、本発明のペプチド〔１〕は、既知物質のｈ
−CGRPよりも血清カルシウム、リン低下作用活性が極め
て強く、しかもその活性発現の持続性が優れているだけ
でなくｃ−CGRPと比較しても、生物活性が強く、活性発
現の持続性が長いという特徴を有しており、生体内では
アミノペプチダーゼの酵素作用に対してより安定である
ため、カルシウム代謝異常、心臓病、潰瘍などの治療薬
または脳循環改善薬などとして有用である。 実施例 次に実施例を挙げて本発明の製造例を具体的に説明す
る。 尚、実施例中のPF（ ）は（ ）内の数字のアミノ
酸順序を有するペプチドフラグメントを意味する。 また、実施例で使用した薄層クロマトグラフィー（TL
C）の担体および展開溶媒ならびにアミノ酸分析用の加
水分解の条件は特記しない限り次の通りである。 ＜TLC＞ 担体；シリカゲル（メルク社製Art5715）展開溶媒； 1;クロロホルムーメタノールー酢酸（95:5:3） 2;クロロホルム−メタノールー酢酸（85:15:5） ＜加水分解条件＞ 試料を6N塩酸で110℃、24〜48時間封管中で加水分解し
た。 実施例 １ デスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPの製造 デスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−37）
−MBHA樹脂、即ち 1.09gにアニソール1mlを加え、これに無水弗化水素25ml
を加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗化水素
を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに0.1M
酢酸20mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液をDowex
WGRのカラム（2.8×15cm）に通し、0.1M酢酸60mlで溶出
した。得られた溶出液を凍結乾燥し、370mgの白色粉末
を得た。この粉末をカルボキシメチルセルロースのカラ
ム（2.8×13cm）にチャージし、0.01M酢酸アンモニウム
水溶液（pH4.5）300ml〜0.5M酢酸アンモニウム水溶液
（pH5.3）300mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μｌを
使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750nm
で測定し、フラクション33〜37番目を集め、これをCHP
−20樹脂（三菱化成工業社製）のカラム（2.8×5.5cm）
にチャージし、25％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶
液150ml〜40％アセトナトリルを含む0.1M酢酸水溶液150
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を6.4mlづつ分画し、フラクション10〜12番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末30.5mgを得た。これを下記
の条件による逆相系高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）により精製し、デスアラニルー（Asu2,7〕−ｃ−CGR
Pの精製品3.4mgを得た。 カラム;Nucleosil 5C18 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを2
5分間に28〜38％に変化させるグラジエント溶出） 流速;2.5ml/分 分取;17.8分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕26.5 D▼−53.3（ｃ＝0.094,0.1M酢酸） アミノ酸分析値； Asp4.96（５）、Thr3.77（４）、 Ser2.83（３）、Pro1.12（１）、Gly4.15（４）、Ala3.
00（３）、Val3.89（４）、Leu2.00（２）、Phe3.10
（３）、Lys2.11（２）、His0.98（１）、Arg2.10
（２）、Asu1.12（１） 上記のデスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂は次の方法により得た。 固相合成装置としてApplied Blosystems社製430−Ａペ
プチドシンセサイザーを用いて固相合成を行った。 （１）PF（９−37）−MBHA樹脂、即ちＨ−Thr（Bzl）−
His−Arg（Tos）−Leu−Ala−Asp（OBzl）−Phe−Leu−
Ser（Bzl）−Arg（Toss）−Ser（Bzl）−Gly−Gly−Val
−Gly−Lys（Cl−Ｚ）−Asn−Asn−Phe−Val−Pro−Thr
（Bzl）−Asn−Val−Gly−Ser（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）
−Ala−Phe−MBHA樹脂の製造 MBHA樹脂（Applied Biosystems社製、アミノ基0.61mモ
ル/g）0.8gをペプチド固相合成用反応容器に入れ、DCM8
ml（４回、各１分）、60％TFA含有DCM溶液8ml（20
分）、DCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1ml含有DMF溶液3m
l（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各40秒）の順に窒
素ガス気流中撹拌下処理し、各々の処理後濾過した。 一方、アミノ酸順序37番目のBoc−Phe2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。反応液を濾過して濃縮
容器に移し、これにDMF3mlを加え、窒素ガス気流下DCM
を留去した。これにDMF3mlを加え、前記の反応容器に移
して25分間反応させた。次いで、DCM8ml（６回、各20
秒）で洗浄、濾過してBoc−Phe−MBHA樹脂を得た。 次に、前記のBoc−Phe−MBHA樹脂を反応容器中DCM8ml
（４回、各１分）で洗浄し、濾過した。これに60％TFA
含有40％DCM溶液8mlを加え、20分間撹拌し、Bocを脱離
した。得られた樹脂をDCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1m
l含有DMF溶液3ml（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各4
0秒）で順次洗浄し、濾過した。 さらに、アミノ酸順序36番目のBoc−Ala2mモルをDCM5ml
に溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶
液）2mlを加え、５分間反応させた。次いで、Boc−Phe
の場合と同様に処理し、DMFを加えて窒素ガス気流下で
濃縮した後、反応容器に移して20分間反応させた。次い
で、DCM8ml（６回、各20秒）で洗浄、濾過してBoc−Ala
−Phe−MBHA樹脂を得た。 以下、順次35番目から９番目までのアミノ酸をカップリ
ングしてPF（９−37）−MBHA樹脂を得た。用いた保護ア
ミノ酸は次の通りである。 上記固相合成において、Asn、Argを用いた場合は、2mモ
ルのアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml中、DCC溶
液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加え、１分間
反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、反応容器
に移してカップリング反応させ、DCM洗浄、濾過後、も
う一度2mモルアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml
中、DCC溶液2ml、HoBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加
え、25分間反応させたものを反応容器に移してカップリ
ング反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で行
った。 （２）デスアラニル−〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂の製造 環状PF（３−８）〔10〕即ち、 220mgをDMF10mlに溶かし、これに−40℃に冷却下ジオキ
サン中4N−塩化水素0.93mlを加え、−30℃で亜硝酸イソ
アミル60μを加えた。30分後にヒドラジン・テストが
陰性になったので、−70℃に冷却下トリエチルアミン52
0μを加え、中和した。これにPF（９−37）−MBHA樹
脂1.13gを加え、さらにトリエチルアミン90μを加
え、−20〜−10℃で５時間撹拌した後、４℃で１昼夜撹
拌した。反応終了後、吸引濾過し、DMF10ml、0.1M酢酸1
0ml、エタノール10mlの順で洗浄後、減圧乾燥してデス
アラニルー〔Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−37）−MB
HA樹脂1.09gを得た。 上記環状PF（３−８）〔10〕は次の方法により製造し
た。 （３）環状保護PF（３−８）； Boc−Asn−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu−Val−O
Me〔７〕3.4gをピリジン50mlに溶かし、これに5.7当量
のｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテートを加え、
45℃で４時間撹拌した。ピリジンを留去後、エーテルを
加え、生じた沈澱物を集めた。これにTFA30mlを加えて
脱Boc化した後、TFAを減圧留去し、エーテルを加え、生
じた沈澱物を集めた。沈澱物をDMF82mlに溶解し、これ
に45℃のピリジン2.3に滴下し、50℃で６時間、次い
で室温で一夜撹拌した。反応液を減圧下ピリジンを留去
し、残渣に0.5％重曹水100mlを加え、生じた沈澱物を充
分水洗した後、デシケータで乾燥して環状保護PF（３−
８）〔８〕を得た。収量3.26g （４）環状PF（３−８）； 環状保護PF（３−８）〔８〕1.48gにアニソール1.5mlを
加え、０℃に冷却下無水弗化水素15mlを加え、１時間撹
拌した。反応後、減圧下無水弗化水素を留去した。残渣
をエーテルで洗浄し、白色粉末1.15gを得た。これを酢
酸3mlに溶解し、これに0.1M酢酸9mlを加え、33％DMF含
有0.1M酢酸で充填したCHP−20のカラム（3.2×25cm）に
チャージし、33％酢酸700mlから70％DMF含有33％酢酸70
0mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行っ
た。溶出液を10mlづつ分画し、フラクション32−49番目
を集め、DMF留去後、凍結乾燥して白色粉末の環状PF
（３−８）
〔９〕を得た。収量600mg アミノ酸分析値； Asp0.99（１）、Thr1.95（２）、Ala1.00（１）、Val1.
01（１）、Asu1.07（１） （５）環状PF（３−８）〔10〕 環状PF（３−８）
01（１）、Asu1.07（１） （５）環状PF（３−８）〔10〕 環状PF（３−８）
〔９〕600mgをTHF20mlに溶解し、60℃
に加熱して溶解した後、30℃に保ち、これに2mlのNH2NH
2・H2Oを加え、６時間室温で撹拌した。次いで、THF20m
l、DMF10mlを追加し、一夜撹拌した。反応後、減圧下溶
媒を留去し、残渣を酢酸5mlに溶解し、これに水15mlを
加え、CHP−20のカラム（2.8×16.0cm）にチャージし、
0.1酢酸300mlから40％アセトニトリル含有0.1M酢酸300m
lの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を9.6mlづつ分画し、フラクション46−56番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末の環状PF（３−８）〔10〕
を得た。収量224mg 上記のBoc−Asn−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu−
Val−OMe〔７〕は、第５図のペプチドフラグメント（３
−８）の製造工程図に示される工程により製造された。
尚、製造中の中間ペプチドフラグメントの物理化学的性
質は次の通りである。 （１）PF（５−６）;Boc−Ala−Thr（Bzl）−OBzl TLC;Rf1;0.93 融点;89−95℃ アミノ酸分析値;Thr1.00（１）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 10.75（ｃ＝0.99,DMF） （２）PF（４−６）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−OBzl TLC;Rf1;0.73 融点;92−94℃ アミノ酸分析値;Thr1.97（２）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 5.42（ｃ＝1.00,DMF） （３）PF（４−６）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−OH TLC;Rf1;0.32 融点;54−58℃ アミノ酸分析値； Thr1.86（２）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 24.20（ｃ＝1.03,DMF （４）PF（７−８）;Z−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.90 融点；室温で油状 （５）PF（７−８）;H−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.25 融点；室温で油状 （６）PF（４−８）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.64 融点;107−113℃ アミノ酸分析値； Thr1.83（２）、Ala1.00（１）、Val1.05（１）、Asu1.
18（１） 〔α▲〕26.5 D▼ 5.46（ｃ＝1.03,DMF） （７）PF（３−８）〔７〕； TLC;Rf2;0.54 融点;216−218℃ アミノ酸分析値； Asp1.00（１）、Thr1.92（２）、 Ala1.00（１）、Val1.00（１）、 Asu1.06（１） 実施例 ２ デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGRPの製造 デスアラニル鵜〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂、 即ち、 1.09gにアニソール1mlを加え、これに無水弗化水素25ml
を加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗化水素
を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに0.1M
酢酸20mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液をDowex
WGRのカラム（2.8×16cm）に通し、0.1M酢酸60mlで溶出
した。得られた溶出液を凍結乾燥し、410mgの白色粉末
を得た。この粉末をカルボキシメチルセルロースのカラ
ム（2.8×14cm）にチャージし、0.01M酢酸アンモニウム
水溶液（pH4.5）300ml〜0.5M酢酸アンモニウム水溶液
（pH5.9）300mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μを
使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750nm
で測定し、フラクション29〜31番目を集め、これをCHP
−20樹脂（三菱化成工業社製）のカラム（2.8×6.5cm）
にチャージし、25％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶
液150ml〜40％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶液150
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を6.4mlづつ分画し、フラクション10〜12番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末18.2mgを得た。これを下記
の条件による逆相系高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）により精製し、デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ
−CGRPの精製品2.8mgを得た。 カラム;Nucleosil 5C18 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを2
5分間に28〜38％に変化させるグラジエント溶出） 流速;2.5ml/分 分取;17.7分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕26.5 D▼ −56.8（ｃ＝0.091,0.1M酢酸） アミノ酸分析値； Asp4.91（５）、Thr3.80（４）、Ser2.80（３）、Pro1.
03（１）、Gly4.05（４）、Ala3.00（３）、Val3.80
（４）、Leu1.99（２）、Phe3.08（３）、Lys2.08
（２）、His0.92（１）、Arg2.03（２）、Asu1.09
（１） 上記のデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGR
P（３−37）−MBHA樹脂は次の方法により製造した。 （１）PF（９−37）−MBHA樹脂は、実施例１に記載の通
りである。 （２）デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGR
P（３−37）−MBHA樹脂の製造 環状PF（３−８）〔14〕即ち、 250mgをDMF10mlに溶かし、これに−40℃に冷却下ジオキ
サン中4N−塩化水素0.93mlを加え、−30℃で亜硝酸イソ
アミル60μを加えた。30分後にヒドラジン・テストが
陰性になったので、−70℃に冷却下トリエチルアミン52
0μを加え、中和した。これにPF（９−37）−MBHA樹
脂1.13gを加え、さらにトリエチルアミン90μを加
え、−20〜−10℃で５時間撹拌した後、４℃で１昼夜撹
拌した。反応終了後、吸引濾過し、DMF10ml、0.1M酢酸1
0ml、エタノール10mlの順で洗浄後、減圧乾燥してデス
アラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−3
7）−MBHA樹脂1.09gを得た。 上記環状PF（３−８）〔14〕は次の方法により製造し
た。 （３）環状保護PF（３−８）； Boc−Asp（OBzl）−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu
−Val−OMe〔11〕3.2gをピリジン40mlに溶かし、これに
７当量のｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテートを
加え、45℃で３時間撹拌した。ピリジンを留去後、エー
テルを加え、生じた沈澱物を集めた。これにTFA30mlを
加えて脱Boc化した後、TFAを減圧留去し、エーテルを加
え、生じた沈澱物を集めた。沈澱物をDMF70mlに溶解
し、これを45℃のピリジン２に滴下、50℃で７時間、
次いで室温で一夜撹拌した。反応液を減圧下ピリジンを
留去し、残渣をクロロホルム400mlで抽出して環状保護P
F（３−８）〔12〕を得た。 収量2.62g （４）環状PF（３−８）； 環状保護PF（３−８）〔12〕2.67gにアニソール1mlを加
え、０℃に冷却下無水弗化水素15mlを加え、１時間撹拌
した。反応後、減圧下無水弗化水素を留去した。残渣を
エーテルで洗浄し、白色粉末1.75gを得た。これをDMF10
mlに溶解し、これに0.1M酢酸10mlを加え、20％DMF含有
0.1M酢酸で充填したCHP−20のカラム（3.2×32cm）にチ
ャージし、20％DMF含有0.1M酢酸500mlから66％DMF含有
0.1M酢酸500mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を14.8mlづつ分画し、フラクション
54−63番目を集め、濃縮乾固して白色粉末の環状PF（３
−８）〔13〕を得た。 収量670mg 融点;154−160℃ アミノ酸分析値； Asp0.98（１）、Thr1.90（２）、Ala1.00（１）、Val0.
96（１）、Asu1.07（１） マス・スペクトル;673（M+）（理論価672.71） （５）環状PF（３−８）〔14〕 環状PF（３−８）〔13〕800mgをTHF25mlに加熱して溶解
し、30℃に冷却後、これに2mlのNH2NH2・H2Oを加え、室
温で６時間撹拌後、DMF20mlを追加し、一夜撹拌した。
反応後、減圧下溶媒を留去し、残渣を0.1M酢酸15mlに溶
解し、CHP−20のカラム（2.6×13.0cm）にチャージし、
0.1M酢酸300mlから33％アセトニトリル含有0.1M酢酸300
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を7.9mlづつ分画し、フラクション26−40番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末の環状PF（３−８）〔14〕
を得た。収量502mg 上記のBoc−Asp（OBzl）−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−Asu−Val−OMe〔11〕は、第６図のペプチドフラグ
メント（３−８）の製造工程図に示される工程により製
造されるが、上記ペプチドフラグメント〔11〕の物理化
学的性質は次の通りである。 TLC;Rf2;0.58 アミノ酸分析値； Asp1.04（１）、Thr2.04（２）、Ala1.00（１）、Val1.
06（１）、Asu1.25（１） 実施例 ３ デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRPの製造 保護−デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP−MBHA樹脂、
即ちMBzl−Ｓ−（CH2）２−CO−Asn−Thr（Bzl）−Ala
−Thr（Bz1）−Cys（MBzl）−Va1−Thr（Bzl）−His−A
rg（Tos）−Leu−Ala−Asp（OBzl）−Phe−Len−Ser（B
zl）−Arg（Tos）−Ser（Bzl）−Gly−Gly−Val−Gly−
Lys（Cl−Ｚ）−AsnーAsn−Phe−Val−Pro−Thr（Bzl）
−Asn−Val−Gly−Se（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Ala−Ph
e−MBHA樹脂2.65gにアニソール4ml、ジメチルスルフィ
ド4ml、エタンジオール0.8mlを加え、これに無水弗化水
素40mlを加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗
化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これ
に20％酢酸50mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液を
Dowex WGRのカラム（2.5×15cm）に通し、1M酢酸160ml
で溶出した。得られた溶出液を凍結乾燥し、780mgの白
色粉末を得た。この粉末150mgを8M尿素、5mMジチオスラ
イトールを含む50mMNa2HPO4緩衝液（pH7.5）10mlに溶解
し、室温で１時間撹拌した。その後50mMNa2HPO4緩衝液
（pH7.5）1125mlで希釈し20mMK3Fe（CN）６水溶液8mlを
加えた。この溶液をCHP−20P（三菱化成工業社製）のカ
ラム（2.5×10cm）にチャージし、５％アセトニトリル
含有0.1Nギ酸水溶液500ml〜45％アセトニトリル含有0.1
Nギ酸水溶液500mlの直線型濃度勾配によるグラジエント
溶出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μ
を使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750n
mで測定し、フラクション46〜53番目を集め、凍結乾燥
して白色粉末35mgを得た。得られた白色粉末を0.1M酢酸
に溶解し、Sephadex G−25Fineのカラム（1.6×45cm）
にチャージし、0.1M酢酸で溶出した。溶出液を6mlづつ
分画し、フラクション５〜15番目を集め、凍結乾燥して
白色粉末31mgを得た。 これを下記の条件による逆相系高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）により精製し、デスアラニル−デアミノ−
ｃ−CGRPの精製品10.0mgを得た。 カラム;YMC−GEL ODS Ｓ−５ AMtype（20mmID×250m
m） 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを3
0分間に27〜40％に変化させるグラジエント溶出） 流速;7ml/分 分取；約17.3分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕24 D▼ −60.46゜（ｃ＝0.086,0.1M酢酸） アミノ酸分析値（6N塩酸加水分解）； Asp4.75（５）、Thr3.62（４）、Ser2.74（３）、Pro1.
01（１）、Gly3.85（４）、Ala3.00（３）、Val3.70
（４）、Leu1.94（２）、Phe2.83（３）、Lys2.04
（２）、His0.95（１）、Arg1.89（２）、上記の保護−
デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP−MBHA樹脂は次の方
法により得た。 固相合成装置としてApplied Bios ystems社製430−Ａペ
プチドシンセサイザーを用いて固相合成を行った。 MBHA樹脂（Applied Biosystems社製、アミノ基0.48mモ
ル/g）1.0gをペプチド固相合成用反応容器に入れ、DCM8
ml（４回、各１分）、60％TFA含有DCM溶液8ml（20
分）、DCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1ml含有DMF溶液3m
l（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各40秒）の順に窒
素ガス気流中撹拌下処理し、各々の処理後濾過した。 一方、アミノ酸順序37番目のBoc−Phe2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。反応液を濾過して濃縮
容器に移し、これにDMF3mlを加え、窒素ガス気流下DCM
を留去した。これにDMF3mlを加え、前記の反応容器に移
して25分間反応させた。次いで、DCM8ml（６回、各20
秒）で洗浄、濾過してBoc−Phe−MBHA樹脂を得た。 次に、前記のBoc−Phe−MBHA樹脂を反応容器中DCM8ml
（４回、各１分）で洗浄し、濾過した。これに60％TFA
含有40％DCM溶液8mlを加え、20分間撹拌し、Boc基を脱
離した。得られた樹脂をDCM4ml（３回、各15秒）、DIEA
1ml含有DMF溶液3ml（２回、各１分）、DMF8ml（６回、
各40秒）で順次洗浄し、濾過した。 一方、アミノ酸順序36番目のBoc−Ala2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。次いで、Boc−Pheの場
合と同様に処理し、DMFを加えて窒素ガス気流下で濃縮
した後、反応容器に移して20分間反応させた。次いで、
DCM8ml（６回、各20秒）で洗浄、濾過してBoc−Ala−Ph
e−樹脂を得た。 以下、順次35番目から３番目までのアミノ酸をカップリ
ングし、最後にMBzl−β−メルカプトプロピオン酸でア
シル化して、保護−デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP
−MBHA樹脂を得た。 用いた保護アミノ酸は次の通りである。 上記固相合成において、Asn、Argを用いた場合は、2mモ
ルのアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml中、DCC溶
液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加え、１分間
反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、反応容器
に移してカップリング反応をし、DCM洗浄、濾過後、も
う一度2mモルアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml
中、DCC溶液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加
え、25分間反応させたものを反応容器に移してカップリ
ング反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で行
った。
に加熱して溶解した後、30℃に保ち、これに2mlのNH2NH
2・H2Oを加え、６時間室温で撹拌した。次いで、THF20m
l、DMF10mlを追加し、一夜撹拌した。反応後、減圧下溶
媒を留去し、残渣を酢酸5mlに溶解し、これに水15mlを
加え、CHP−20のカラム（2.8×16.0cm）にチャージし、
0.1酢酸300mlから40％アセトニトリル含有0.1M酢酸300m
lの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を9.6mlづつ分画し、フラクション46−56番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末の環状PF（３−８）〔10〕
を得た。収量224mg 上記のBoc−Asn−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu−
Val−OMe〔７〕は、第５図のペプチドフラグメント（３
−８）の製造工程図に示される工程により製造された。
尚、製造中の中間ペプチドフラグメントの物理化学的性
質は次の通りである。 （１）PF（５−６）;Boc−Ala−Thr（Bzl）−OBzl TLC;Rf1;0.93 融点;89−95℃ アミノ酸分析値;Thr1.00（１）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 10.75（ｃ＝0.99,DMF） （２）PF（４−６）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−OBzl TLC;Rf1;0.73 融点;92−94℃ アミノ酸分析値;Thr1.97（２）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 5.42（ｃ＝1.00,DMF） （３）PF（４−６）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−OH TLC;Rf1;0.32 融点;54−58℃ アミノ酸分析値； Thr1.86（２）、Ala1 〔α▲〕26.5 D▼ 24.20（ｃ＝1.03,DMF （４）PF（７−８）;Z−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.90 融点；室温で油状 （５）PF（７−８）;H−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.25 融点；室温で油状 （６）PF（４−８）;Boc−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−Asu（OBut）−Val−OMe TLC;Rf1;0.64 融点;107−113℃ アミノ酸分析値； Thr1.83（２）、Ala1.00（１）、Val1.05（１）、Asu1.
18（１） 〔α▲〕26.5 D▼ 5.46（ｃ＝1.03,DMF） （７）PF（３−８）〔７〕； TLC;Rf2;0.54 融点;216−218℃ アミノ酸分析値； Asp1.00（１）、Thr1.92（２）、 Ala1.00（１）、Val1.00（１）、 Asu1.06（１） 実施例 ２ デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGRPの製造 デスアラニル鵜〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３
−37）−MBHA樹脂、 即ち、 1.09gにアニソール1mlを加え、これに無水弗化水素25ml
を加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗化水素
を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに0.1M
酢酸20mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液をDowex
WGRのカラム（2.8×16cm）に通し、0.1M酢酸60mlで溶出
した。得られた溶出液を凍結乾燥し、410mgの白色粉末
を得た。この粉末をカルボキシメチルセルロースのカラ
ム（2.8×14cm）にチャージし、0.01M酢酸アンモニウム
水溶液（pH4.5）300ml〜0.5M酢酸アンモニウム水溶液
（pH5.9）300mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μを
使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750nm
で測定し、フラクション29〜31番目を集め、これをCHP
−20樹脂（三菱化成工業社製）のカラム（2.8×6.5cm）
にチャージし、25％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶
液150ml〜40％アセトニトリルを含む0.1M酢酸水溶液150
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を6.4mlづつ分画し、フラクション10〜12番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末18.2mgを得た。これを下記
の条件による逆相系高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）により精製し、デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ
−CGRPの精製品2.8mgを得た。 カラム;Nucleosil 5C18 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを2
5分間に28〜38％に変化させるグラジエント溶出） 流速;2.5ml/分 分取;17.7分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕26.5 D▼ −56.8（ｃ＝0.091,0.1M酢酸） アミノ酸分析値； Asp4.91（５）、Thr3.80（４）、Ser2.80（３）、Pro1.
03（１）、Gly4.05（４）、Ala3.00（３）、Val3.80
（４）、Leu1.99（２）、Phe3.08（３）、Lys2.08
（２）、His0.92（１）、Arg2.03（２）、Asu1.09
（１） 上記のデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGR
P（３−37）−MBHA樹脂は次の方法により製造した。 （１）PF（９−37）−MBHA樹脂は、実施例１に記載の通
りである。 （２）デスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGR
P（３−37）−MBHA樹脂の製造 環状PF（３−８）〔14〕即ち、 250mgをDMF10mlに溶かし、これに−40℃に冷却下ジオキ
サン中4N−塩化水素0.93mlを加え、−30℃で亜硝酸イソ
アミル60μを加えた。30分後にヒドラジン・テストが
陰性になったので、−70℃に冷却下トリエチルアミン52
0μを加え、中和した。これにPF（９−37）−MBHA樹
脂1.13gを加え、さらにトリエチルアミン90μを加
え、−20〜−10℃で５時間撹拌した後、４℃で１昼夜撹
拌した。反応終了後、吸引濾過し、DMF10ml、0.1M酢酸1
0ml、エタノール10mlの順で洗浄後、減圧乾燥してデス
アラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−保護−ｃ−CGRP（３−3
7）−MBHA樹脂1.09gを得た。 上記環状PF（３−８）〔14〕は次の方法により製造し
た。 （３）環状保護PF（３−８）； Boc−Asp（OBzl）−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bzl）−Asu
−Val−OMe〔11〕3.2gをピリジン40mlに溶かし、これに
７当量のｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテートを
加え、45℃で３時間撹拌した。ピリジンを留去後、エー
テルを加え、生じた沈澱物を集めた。これにTFA30mlを
加えて脱Boc化した後、TFAを減圧留去し、エーテルを加
え、生じた沈澱物を集めた。沈澱物をDMF70mlに溶解
し、これを45℃のピリジン２に滴下、50℃で７時間、
次いで室温で一夜撹拌した。反応液を減圧下ピリジンを
留去し、残渣をクロロホルム400mlで抽出して環状保護P
F（３−８）〔12〕を得た。 収量2.62g （４）環状PF（３−８）； 環状保護PF（３−８）〔12〕2.67gにアニソール1mlを加
え、０℃に冷却下無水弗化水素15mlを加え、１時間撹拌
した。反応後、減圧下無水弗化水素を留去した。残渣を
エーテルで洗浄し、白色粉末1.75gを得た。これをDMF10
mlに溶解し、これに0.1M酢酸10mlを加え、20％DMF含有
0.1M酢酸で充填したCHP−20のカラム（3.2×32cm）にチ
ャージし、20％DMF含有0.1M酢酸500mlから66％DMF含有
0.1M酢酸500mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶
出を行った。溶出液を14.8mlづつ分画し、フラクション
54−63番目を集め、濃縮乾固して白色粉末の環状PF（３
−８）〔13〕を得た。 収量670mg 融点;154−160℃ アミノ酸分析値； Asp0.98（１）、Thr1.90（２）、Ala1.00（１）、Val0.
96（１）、Asu1.07（１） マス・スペクトル;673（M+）（理論価672.71） （５）環状PF（３−８）〔14〕 環状PF（３−８）〔13〕800mgをTHF25mlに加熱して溶解
し、30℃に冷却後、これに2mlのNH2NH2・H2Oを加え、室
温で６時間撹拌後、DMF20mlを追加し、一夜撹拌した。
反応後、減圧下溶媒を留去し、残渣を0.1M酢酸15mlに溶
解し、CHP−20のカラム（2.6×13.0cm）にチャージし、
0.1M酢酸300mlから33％アセトニトリル含有0.1M酢酸300
mlの直線型濃度勾配によるグラジエント溶出を行った。
溶出液を7.9mlづつ分画し、フラクション26−40番目を
集め、凍結乾燥して白色粉末の環状PF（３−８）〔14〕
を得た。収量502mg 上記のBoc−Asp（OBzl）−Thr（Bzl）−Ala−Thr（Bz
l）−Asu−Val−OMe〔11〕は、第６図のペプチドフラグ
メント（３−８）の製造工程図に示される工程により製
造されるが、上記ペプチドフラグメント〔11〕の物理化
学的性質は次の通りである。 TLC;Rf2;0.58 アミノ酸分析値； Asp1.04（１）、Thr2.04（２）、Ala1.00（１）、Val1.
06（１）、Asu1.25（１） 実施例 ３ デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRPの製造 保護−デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP−MBHA樹脂、
即ちMBzl−Ｓ−（CH2）２−CO−Asn−Thr（Bzl）−Ala
−Thr（Bz1）−Cys（MBzl）−Va1−Thr（Bzl）−His−A
rg（Tos）−Leu−Ala−Asp（OBzl）−Phe−Len−Ser（B
zl）−Arg（Tos）−Ser（Bzl）−Gly−Gly−Val−Gly−
Lys（Cl−Ｚ）−AsnーAsn−Phe−Val−Pro−Thr（Bzl）
−Asn−Val−Gly−Se（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Ala−Ph
e−MBHA樹脂2.65gにアニソール4ml、ジメチルスルフィ
ド4ml、エタンジオール0.8mlを加え、これに無水弗化水
素40mlを加え、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水弗
化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これ
に20％酢酸50mlを加え、ペプチドを抽出した。抽出液を
Dowex WGRのカラム（2.5×15cm）に通し、1M酢酸160ml
で溶出した。得られた溶出液を凍結乾燥し、780mgの白
色粉末を得た。この粉末150mgを8M尿素、5mMジチオスラ
イトールを含む50mMNa2HPO4緩衝液（pH7.5）10mlに溶解
し、室温で１時間撹拌した。その後50mMNa2HPO4緩衝液
（pH7.5）1125mlで希釈し20mMK3Fe（CN）６水溶液8mlを
加えた。この溶液をCHP−20P（三菱化成工業社製）のカ
ラム（2.5×10cm）にチャージし、５％アセトニトリル
含有0.1Nギ酸水溶液500ml〜45％アセトニトリル含有0.1
Nギ酸水溶液500mlの直線型濃度勾配によるグラジエント
溶出を行った。溶出液を10mlづつ分画し、その100μ
を使用してフォリン・ローリー法により発色させ、750n
mで測定し、フラクション46〜53番目を集め、凍結乾燥
して白色粉末35mgを得た。得られた白色粉末を0.1M酢酸
に溶解し、Sephadex G−25Fineのカラム（1.6×45cm）
にチャージし、0.1M酢酸で溶出した。溶出液を6mlづつ
分画し、フラクション５〜15番目を集め、凍結乾燥して
白色粉末31mgを得た。 これを下記の条件による逆相系高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）により精製し、デスアラニル−デアミノ−
ｃ−CGRPの精製品10.0mgを得た。 カラム;YMC−GEL ODS Ｓ−５ AMtype（20mmID×250m
m） 緩衝液;0.1％TFA−アセトニトリル（アセトニトリルを3
0分間に27〜40％に変化させるグラジエント溶出） 流速;7ml/分 分取；約17.3分に溶出されるピークを分取した。 本品の物性； pI;10.25以上 〔α▲〕24 D▼ −60.46゜（ｃ＝0.086,0.1M酢酸） アミノ酸分析値（6N塩酸加水分解）； Asp4.75（５）、Thr3.62（４）、Ser2.74（３）、Pro1.
01（１）、Gly3.85（４）、Ala3.00（３）、Val3.70
（４）、Leu1.94（２）、Phe2.83（３）、Lys2.04
（２）、His0.95（１）、Arg1.89（２）、上記の保護−
デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP−MBHA樹脂は次の方
法により得た。 固相合成装置としてApplied Bios ystems社製430−Ａペ
プチドシンセサイザーを用いて固相合成を行った。 MBHA樹脂（Applied Biosystems社製、アミノ基0.48mモ
ル/g）1.0gをペプチド固相合成用反応容器に入れ、DCM8
ml（４回、各１分）、60％TFA含有DCM溶液8ml（20
分）、DCM4ml（３回、各15秒）、DIEA1ml含有DMF溶液3m
l（２回、各１分）、DMF8ml（６回、各40秒）の順に窒
素ガス気流中撹拌下処理し、各々の処理後濾過した。 一方、アミノ酸順序37番目のBoc−Phe2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。反応液を濾過して濃縮
容器に移し、これにDMF3mlを加え、窒素ガス気流下DCM
を留去した。これにDMF3mlを加え、前記の反応容器に移
して25分間反応させた。次いで、DCM8ml（６回、各20
秒）で洗浄、濾過してBoc−Phe−MBHA樹脂を得た。 次に、前記のBoc−Phe−MBHA樹脂を反応容器中DCM8ml
（４回、各１分）で洗浄し、濾過した。これに60％TFA
含有40％DCM溶液8mlを加え、20分間撹拌し、Boc基を脱
離した。得られた樹脂をDCM4ml（３回、各15秒）、DIEA
1ml含有DMF溶液3ml（２回、各１分）、DMF8ml（６回、
各40秒）で順次洗浄し、濾過した。 一方、アミノ酸順序36番目のBoc−Ala2mモルをDCM5mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でDCC（0.5M−DCM溶液）
2mlを加え、５分間反応させた。次いで、Boc−Pheの場
合と同様に処理し、DMFを加えて窒素ガス気流下で濃縮
した後、反応容器に移して20分間反応させた。次いで、
DCM8ml（６回、各20秒）で洗浄、濾過してBoc−Ala−Ph
e−樹脂を得た。 以下、順次35番目から３番目までのアミノ酸をカップリ
ングし、最後にMBzl−β−メルカプトプロピオン酸でア
シル化して、保護−デスアラニル−デアミノ−ｃ−CGRP
−MBHA樹脂を得た。 用いた保護アミノ酸は次の通りである。 上記固相合成において、Asn、Argを用いた場合は、2mモ
ルのアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml中、DCC溶
液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加え、１分間
反応させた後、他のアミノ酸と同様に処理し、反応容器
に移してカップリング反応をし、DCM洗浄、濾過後、も
う一度2mモルアミノ酸をDMF−DCM（3:1）混合溶媒4ml
中、DCC溶液2ml、HOBt溶液（0.5M−DMF溶液）2mlを加
え、25分間反応させたものを反応容器に移してカップリ
ング反応させる、いわゆるダブル・カップリング法で行
った。
第１図はラットの血清カルシウムに対するｈ−CGRP、ｃ
−CGRPおよび本発明のデスアラニル−デアミノ−ｃ−CG
RPの効果を表す曲線を示し、第２図はラットの無機リン
値に対するｈ−CGRP、ｃ−CGRPおよび本発明のデスアラ
ニル−デアミノ−ｃ−CGRPの効果を表す曲線を示し、第
３図はラットの血清カルシウムに対するｈ−CGRP、ｃ−
CGRPならびに本発明のデスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−
CGRPおよびデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGRP
の効果を表す曲線を示し、第４図はラットの血清リンに
対するｈ−CGRP、ｃ−CGRPならびに本発明のデスアラニ
ル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPおよびデスアラニル−〔As
p3,Asu2,7〕−ｃ−CGRPの効果を表す曲線を示し、第５
図および第６図は本発明の中間ペプチドフラグメントで
あるペプチドフラグメント（３−８）の製造工程図を示
す。
−CGRPおよび本発明のデスアラニル−デアミノ−ｃ−CG
RPの効果を表す曲線を示し、第２図はラットの無機リン
値に対するｈ−CGRP、ｃ−CGRPおよび本発明のデスアラ
ニル−デアミノ−ｃ−CGRPの効果を表す曲線を示し、第
３図はラットの血清カルシウムに対するｈ−CGRP、ｃ−
CGRPならびに本発明のデスアラニル−〔Asu2,7〕−ｃ−
CGRPおよびデスアラニル−〔Asp3,Asu2,7〕−ｃ−CGRP
の効果を表す曲線を示し、第４図はラットの血清リンに
対するｈ−CGRP、ｃ−CGRPならびに本発明のデスアラニ
ル−〔Asu2,7〕−ｃ−CGRPおよびデスアラニル−〔As
p3,Asu2,7〕−ｃ−CGRPの効果を表す曲線を示し、第５
図および第６図は本発明の中間ペプチドフラグメントで
あるペプチドフラグメント（３−８）の製造工程図を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:00 99:46
Claims (4)
- 【請求項１】式 （式中、Ｙは硫黄原子またはメチレン基を示し、ＡはAs
nまたはAspを示す）で表されるペプチドまたはその塩。 - 【請求項２】式 で表されるペプチドである特許請求の範囲第１項記載の
ペプチドまたはその塩。 - 【請求項３】式 で表されるペプチドである特許請求の範囲第１項記載の
ペプチドまたはその塩。 - 【請求項４】式 で表されるペプチドである特許請求の範囲第１項記載の
ペプチドまたはその塩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62298741A JPH0678356B2 (ja) | 1986-12-04 | 1987-11-26 | カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28959786 | 1986-12-04 | ||
| JP61-310585 | 1986-12-25 | ||
| JP61-289597 | 1986-12-25 | ||
| JP31058586 | 1986-12-25 | ||
| JP62298741A JPH0678356B2 (ja) | 1986-12-04 | 1987-11-26 | カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63258490A JPS63258490A (ja) | 1988-10-25 |
| JPH0678356B2 true JPH0678356B2 (ja) | 1994-10-05 |
Family
ID=27337519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62298741A Expired - Lifetime JPH0678356B2 (ja) | 1986-12-04 | 1987-11-26 | カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0678356B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2055665B1 (es) * | 1993-02-03 | 1995-03-01 | Lipotec Sa | Procedimiento para la obtencion de carbocalcitonina. |
-
1987
- 1987-11-26 JP JP62298741A patent/JPH0678356B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63258490A (ja) | 1988-10-25 |
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