JPH0676436B2

JPH0676436B2 - 新規な生理活性ペプチド

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Publication number: JPH0676436B2
Application number: JP60111874A
Authority: JP
Inventors: 壽之松尾; 賢治寒川; 直人南野; 哲司須藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-05-24
Filing date: 1985-05-24
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: JPS61268700A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な生理活性ペプチドに関する。

〔従来の技術〕

1970年以降、精製技術、分析法の進歩に伴い、哺乳類の
脳および消化管から従来のアミン系神経伝達物質に類似
した作用を示すペプチドサブスタンスＰ、ニユーロテ
ンシン、バソアクテイブインテスデイナルポリペプ
チドやモルヒネ様作用を示す内在性のペプチド β−エ
ンドルフイン、メチオニンエンケフアリン、ロイシンエ
ンケフアリン、α−ネオ−エンドルフイン、ダイノルフ
イン等の生理活性を有する一群のペプチドが発見されて
以来、ペプチドの生理作用の研究が盛んに行われてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

然しながら、その一方では生理活性を有する新規なペプ
チドの開発が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者はブタ脊髄中から各種の
生理活性ペプチドを抽出し、その一次構造及び生物学的
活性を調べていたところ、その中に従来知られていない
下記の一般式で示される新規化合物が存在すること見出
すと共に、これを合成によつて製造することに成功し
た。

すなわち本発明は、一般式Ｘ−Tyr−Phe−Leu−Phe−Arg−Pro−Arg−Asn−NH₂ （式中、ＸはＨ又はＨ−Phe−Lys−Val−Asp−Glu−Glu
−Phe−Gln−Gly−Pro−Ile−Val−Ser−Gln−Asn−Arg
−Arg−を示す）で表わされる生理活性ペプチド〔以下、ＸがＨのものを
ペプチド(1)、ＸがＨ−Phe−…−Arg−のものをペプチ
ド(2)という〕及びその塩を提供するものである。

なお、本明細書において、本発明化合物中の略称は当該
分野において一般に使用されるもので次の意味を有す
る。

Tyr;L−チロシン,Phe;L−フエニルアラニン Leu;L−ロイシン,Arg;L−アルギニン Pro;L−プロリン,Asn;L−アスパラギン Lys;L−リジン,Val;L−バリン Asp;L−アスパラギン酸,Glu;L−グルタミン酸 Gln;L−グルタミン,Gly;グリシン Ile;L−イソロイシン,Sre;L−セリン本発明の新規な生理活性ペプチドは、ブタ脊髄から抽出
・単離する方法あるいは合成によつて得ることができ
る。

ブタ脊髄から本発明ペプチドを抽出・単離するには、例
えばブタ脊髄を適当な酸性溶媒、即ちギ酸水溶液、酢酸
水溶液等の中でホモジナイズ、不溶物を遠心分離するこ
とにより抽出液を得、次いでこの抽出液を有機溶媒によ
る分別沈殿、溶媒抽出、透析、限外過、ゲル過、イ
オン交換クロマトグラフイー、吸着クロマトグラフイ
ー、高速液体クロマトグラフイー等のペプチド精製に用
いられる自体公知の手段を使つて対応する分子量を有す
る物質を収得すればよい。

然し、工業的には合成で得る方が原料の入手、大量生
産、価格といつた面で有利である。

本発明ペプチドの合成は、ペプチド合成に常用される固
相法又は液相法によつて行うことができる。〔泉屋信夫
等著「ペプチド合成」1984年、丸善（株）発光；日本化
学会編「生化学実験講座（Ｉ）／タンパク質の化学」４
巻、208〜495頁、1977年、東京化学同人発行〕。

例えば固相法を本発明に適用する場合、ペプチドアミド
を得るための支持体としては、ベンズヒドリルアミン樹
脂（ポリスチレン）を用いるのが好ましい。また、使用
するアミノ酸のα−アミノ基はいずれの場合もtert−ブ
チルオキシカルボニル基（Boc基）で保護し、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸のβ，及びγカルボン酸はベンジ
ル基（Bzl基），アルギニンのグアジノ基はトシル基（T
os基），チロシンの水酸基は2,6−ジクロルベンジル基
（Cl₂−Bzl基），リジンのε−アミノ基はベンジルオキ
シカルボニル基（Ｚ基），セリンの水酸基はベンジル基
（Bzl基）でそれぞれ保護するのが好ましい。更にま
た、保護アミノ酸の縮合はジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCC）法又はDCCによる酸無水物法によるが、Boc
−Asn−OH,Boc−Gln−OHについては活性エステル法を用
いるのが好ましい。

例えば本発明ペプチドは、まずＣ末端アミノ酸であるア
スパラギンをその保護誘導体であるBoc−アスパラギン
−ｐ−ニトロフエニルエステルを用いてベンズヒドリル
アミン樹脂に導入し、以後順次アミノ酸を延長し保護ペ
プチド樹脂を合成した後、これをフツ化水素酸（HF）で
処理することにより粗合成ペプチドを得、必要であれば
更にこれを精製することにより製造することができる。

粗合成ペプチドの精製は常法に従つて、ゲル過、イオ
ン交換クロマトグラフイー、逆相高速液体クロマトグラ
フイー（RP−HPLC）等により行うことが出来る。また、
本発明ペプチドの塩は該ペプチドを酢酸，クエン酸，酒
石酸，フマル酸，マレイン酸等の当モル程度に溶解した
後、凍結乾燥することにより得ることができる。

斯くして抽出又は合成されたペプチドがペプチド(1)あ
るいはペプチド(2)の構造を有するものであることの確
認は、アミノ酸組成をアミノ酸分析計により、またアミ
ノ酸配列を気相ブロテインシーケンサーによりエドマン
分解して得られたフエニルチオヒダントイン（PTH）ア
ミノ酸を逆相高速液体クロマトグラフイーで分析するこ
とにより行なつた。Ｃ末端のアミドは、精製したペプチ
ドをトリプシン消化後ダンシルクロリドでダンシル化
し、ポリアミドシートによる二次元薄層クロマトグラフ
イーでの分析によりダンシルアスパラギンアミドの生成
を確認することにより証明した。

本発明のペプチド(1)及び(2)の物理化学的性質は次のと
おりである。

〔作用〕本発明ペプチドは平滑筋（ラツト子宮筋）を収縮させる
活性並びに血圧上昇作用を有する。

本発明ペプチドの生物学的性質を下記方法により試験し
た。その結果を第２図に示す。

（試験方法）ラツト〔ウイスター（wister）〕雌の子宮筋を摘出し、
３mlオルガンバスを用いてロツク−リンゲル液中に浸し
た。オルガンバス中のロツク−リンゲル液には95％O₂−
５％CO₂ガスを通じ32℃に保温した。筋標本には1gの静
圧をかけ１時間程静置し、筋の自動運動が安定したとこ
ろで本発明のペプチドを投与し、３〜４分間筋の収縮を
測定した〔等張性トランスデユーサー：モデル ME−40
12エム・イー・コマーシヤル（MEC）社製〕。測定後す
みやかにオルガンバスを洗い、20〜30分おきにこれを繰
返した。被験物質は所定量を生理食塩水に溶かし投与し
た。

（結果）第２図から明らかなように、アミノ酸残基数が８個のペ
プチド(1)は1.0nMで活性を示した。一方、アミノ酸残基
数が25個のペプチド(2)は(1)よりも活性が強く、0.35nM
で活性を示し、しかも0.7nMでは活性の持続時間が著し
く長いという特徴を示した。この特徴は生理作用の解明
に有効に利用しうるものである。

〔発明の効果〕

従来、消化管、子宮、輸精管、胆嚢、血筋等の平滑筋を
収縮又は弛緩させる活性がある生理活性ペプチドは数多
く知られている。例えばモルモツト回腸の収縮に強い作
用を示すものとしてサブスタンスP,ニューロテンシン，
コレチストキニン，ニユーロメジンK,ニユーロメジンL,
ニユーロメジンN,カツシニン等が、またラツト子宮筋の
収縮に強い作用を示すものとしてオキシトシン，ブラジ
キニン，ガストリン放出ペプチド，ニユーロメジンB,ニ
ユーロメジンC,ボンベシン等が知られている。またこれ
らの物質は平滑筋の収縮，弛緩だけでなく生体内で独自
の生理作用をもつことが知られており、本発明ペプチド
も生体内で新たな生理的役割をはたしていると考えられ
る。

さらに従来知られている生理活性ペプチドのアミノ酸配
列は、例えばサブスタンＰではＨ−Arg−Pro−Lys−Pro
−Gln−Gln−Phe−Phe−Gly−Leu−Met−NH₂、オキシト
シンではブラジキニンではＨ−Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser−
Pro−Phe−Arg−OHであつて本発明の生理活性ペプチド
のアミノ酸配列とは全く異なる。

従つて、本発明ペプチドは新規なものであり、かつ生理
学的活性を有し、また生理作用の解明にも有用なもので
ある。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１屠殺直後のブタから摘出した脊髄20kg（550頭分）を２
倍量の20mM塩酸を含有する1N−酢酸中で10分間煮沸する
ことにより内在するプロテアーゼを失活させた。これを
冷却した後、４℃においてポリトロンミキサーでホモジ
ナイズすることにより抽出をおこなつた。得られた抽出
液を12,000×Ｇで30分間遠心分離し、その上清を約40
得た。さらにGF/Bグラスフイルター（ワツトマン製）で
浮遊する脂肪を除き限外過（UM−2,アミコン社製）す
ることにより脱塩濃縮して最終液量を3.3とした。こ
の調整液にアセトンを４℃で滴下し、その最終濃度を75
％にすることによりアセトン沈殿をおこない、次にこれ
を遠心分離することにより約13の上清を得た。得られ
た上清を減圧下で濃縮乾固し、残渣を再度1N−酢酸に溶
かし凍結乾燥した。この乾燥物を1N−酢酸２に溶か
し、1N−酢酸で平衡化したSP−セフアデツクスＣ−25
400mlで処理し、1N−酢酸で溶出する酸性画分（SP−
Ｉ）,2M−ピリジン溶液で溶出する中性弱塩基画分（SP
−II）,2M−ピリジン−酢酸（pH5.0）で溶出する塩基性
画分（SP−III）を得た。

このSP−IIIの画分を凍結乾燥することにより乾燥物10.
5gを得、これを1N−酢酸に溶解しセフアデツクスＧ−
50によりゲル過（4.5×140cm;流速40ml／時；フラク
シヨンサイズ50ml／チユーブ）を５回にわけておこなつ
た。ここでラツト子宮筋のアツセイをおこない収縮活性
のある画分を凍結乾燥後1N−酢酸に溶解し、さらにセフ
アデツクスＧ−25によるゲル過（7.5×135cm;流速6
0ml／時；フラクシヨンサイズ100ml／チユーブ）をおこ
なつた。ここでもラツト子宮筋のアツセイをおこない第
１図のようにＡ〜Ｆの画分を得た。

(1)のペプチドはＦの画分を精製するとこにより得られ
る。

Ｆの画分をさらに陽イオン交換HPLCにかけた。条件〔カ
ラム:TSKゲルCM−2sw、4.0×250mm（東洋ソーダ製）；
流速1.0ml／分；溶媒系(A)10mM HCOONH₄（pH6.6）：ア
セトニトリル＝90:10、(B)1.0M HCOONH₄（pH6.6）：ア
セトニトリル:90:10、(A)：(B)＝100:0から(A)：(B)＝8
5:15まで48分の直線グラジエントさらに(A)：(B)＝85:1
5から(A)：(B)＝50:50まで48分の直線グラジエントをか
けた。〕このHPLCでリテンシヨンタイム103〜105分のと
ころに子宮筋の活性がある画分を得た。この画分をさら
に逆相HPLCにかけた。条件〔カラムケムコソルプ（Chem
cosorb）５ ODS−H,4.6×250mm（ケムコ製）；流速１m
l／分、溶媒系(A)水：アセトニトリル:10％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）＝90:10:1、(B)水：アセトニトリル:10％
TFA＝40:60:1、(A)：(B)＝100:0から(A)：(B)＝0:100へ
の80分の直線グラジエントをかけた。〕リテンシヨンタ
イム39分の主要ピークを分取し実質的に純粋なペプチド
(1)を約１μｇ得た。

(2)のペプチドはセフアデツクスＧ−25のＢの画分から
得られる。Ｂの画分2.6gを10mlの1N−酢酸に溶かし７回
に分けて逆相HPLCにかけた。条件〔カラム:TSKゲル OD
S−120A,20×250mm（東洋ソーダ製）；流速５ml／分；
溶媒系(A)水：アセトニトリル:10％TFA＝90:10:1,(B)
水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1,(A)：(B)＝90:1
0から(A)：(B)＝30:70への250分直線グラジエントをか
けた。〕このHPLCでリテンシヨンタイム128〜136分のと
ころに子宮筋の活性がある画分を得た。次にこの画分を
陽イオン交換HPLCにかけた。条件〔カラム;TSKゲルCM−
2sw、4.6×250mm（東洋ソーダ製）；流速１ml／分；溶
媒系(A)10mM HCOONH₄：アセトニトリル＝90:10、(B)1.
0M HCOONH₄：アセトニトリル＝90:10、(A)：(B)＝100:
0から(A)：(B)＝50:50への100分直線グラジエントをか
けた。〕リテンシヨンタイム68〜71分のところに子宮筋
の活性がある画分を得た。さらにこの画分を逆相HPLCに
かけた。条件〔カラム；ケムコソルブ７−ジフエニル,
4.6×250mm（ケムコ製）；流速1.5ml／分，溶媒(A)水：
アセトニトリル:10％TFA＝90:10:1(B)水：アセトニトリ
ル:10％TFA＝40:60:1、(A)：(B)＝80:20から(A)：(B)＝
0:100への128分の直線グラジエントをかけた。〕リテン
シヨンタイム27〜８分のところに子宮筋の活性がある画
分を得た。最終精製として活性画分を逆相HPLCにかけ
た。条件〔カラム；ケムコソルプ３ ODS−H,4.6×75mm
（ケムコ製）；流速１ml／分；溶媒系(A)水：アセトニ
トリル:10％TFA＝90:10:1(B)水：アセトニトリル:10％T
FA＝40:60:1,(A)：(B)＝80:20から(A)：(B)＝0:100へ19
2分直線グラジエントをかけた。〕リテンシヨンタイム3
4分の主要ピークを分取し実質的に純粋なペプチド(2)を
約3.5μｇ得た。

実施例２ベンズヒドリルアミン樹脂1g（0.4meq NH₂/g）をジメチ
ルホルムアミド（DMF）５mlによく膨潤させ、これにBoc
−アスパラギン−ｐ−ニトロフエニルエステル0.71g
（2.0mmol）のDMF溶液５mlを加え室温でゆるやかに撹拌
し６時間反応した。母液を去し、樹脂はDMFで３回洗
う。再度同じ反応を繰り返した。反応の進行および完結
はニンヒドリンによるカイザーテストでモニターした。
ついでDMF,塩化メチレン，イソプロピルアルコール，塩
化メチレンの順に樹脂を洗つて乾燥した。

保護ペプチド樹脂の合成においては、各構成アミノ酸の
α−アミノ基はすべてBoc基で保護し、活性な側鎖のう
ち、チロシンの水酸基はジクロルベンジル基（Cl₂−Bz
l）で、アルギニンのグアジノ基はトシル基（Tos）で、
リジンのε−アミノ基はベンジルオキシカルボニル基
(Z)で保護し、アスパラギン酸のβ−カルボン酸はベン
ジル基（Bzl）、グルタミン酸のγ−カルボン酸はBzl基
およびセリンの水酸基はBzl基で保護した。

保護アミノ酸の縮合にあたつては樹脂に結合している保
護ペプチドの末端アミノ基の保護基であるBoc基を塩化
メチレン中50％トリフルオロ酢酸で室温下20分処理する
ことを２回繰返しほぼ完全に除去した。ついで脱Boc化
で遊離したアミノ基を目的のペプチドのアミノ酸配列に
おける次に位置するアミノ酸のBoc保護誘導体のカルボ
キシル基と縮合した。この保護アノミ酸の縮合において
Boc−Asn,Boc−Glnはｐ−ニトロフエニルエステルとし
てこれを５当量用い10時間反応する操作を２回おこなつ
た。その他のBoc−アミノ酸は５当量用いジシクロカル
ボジイミドを縮合剤として用い縮合した。この操作によ
つて反応が完結していない場合は同じ操作を繰返した。
なお反応の進行及び完結はニンヒドリンによるカイザー
テストでモニターした。

このようにしてベンズヒドリルアミン1gよりBoc−Tyr
（Cl₂−Bzl）−Phe−Leu−Phe−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Asn−NH−ベンズヒドリル樹脂〔以下、保護ペ
プチド樹脂(A)という〕を合成した段階でこのものを一
部（500mg）取り出した。残りをさらにＮ端延長の反応
にかけBoc−Phe−Lys（Ｚ）−Val−Asp（OBzl）−Glu
（OBzl）−Glu（OBz）−Phe−Gln−Gly−Pro−Ile−Val
−Ser（Bzl）−Gln−Asn−Arg（Tos）−Arg（Tos）−）
Tyr（Cl₂−Bzl）−Phe−Leu−Phe−Arg（Tos）−Pro−A
rg（Tos）−Asn−NH−ベンズヒドリル樹脂〔以下、保護
ペプチド樹脂(B)という〕1460mgを得た。

(1)のペプチドの樹脂からの脱離・精製は次の方法によ
りおこなつた。保護ペプチド樹脂(A)300mgをアニソール
1.5mlと共にHFの反応器中に入れHFを８ml導入し、０℃
で60分反応させた。ついで過剰のHFを留去し、エーテル
25mlで洗いアニソールを除去し、1N−酢酸14.2mlを加え
生成物を抽出する。樹脂および不溶物を別し、さらに
水で10倍希釈後、90mlのODS樹脂〔LC−sorb（ケムコ社
製）〕を充填したカラム（2.0×40cm）に吸着させ、0.1
N酢酸でよく洗浄後0.1％トルフルオロ酢酸（TFA）を含
む60％アセトニトリル200mlで溶出する。溶出液はアセ
トニトリルを減圧下留去後凍結乾燥し約90mgの粗ペプチ
ド(1)を得た。このものを0.1％トリフルオロ酢酸６mlに
溶かし６回にわけて逆相HPLCにかけた。条件〔カラム:T
SKゲルODS120A,2.0×250cm;流速５ml／分；溶媒系(A)
水：アセトニトリル:10％TFA＝90:10:1,(B)水：アセト
ニトリル:10％TFA＝40:60:1,(A)：(B)＝75:25から(A)：
(B)＝25:75の100分間の直線グラジエントをかけた。〕
この操作を６回繰返してメインピークを分取した。この
分画を減圧下アセトニトリルを留去後凍結乾燥をおこな
い目的のペプチド(1)Ｈ−Tyr−Phe−Leu−Phe−Arg−Pr
o−Arg−Asn−NH₂を58.2mg得た。

(2)のペプチドの樹脂からの脱離・精製は次の方法によ
り行なつた。保護ペプチド樹脂(B)600mgをアニソール２
mlと共にHFの反応器中に入れ、HFを10ml導入し０℃で60
分反応させた。ついで過剰のHFを留去後、エーテル30ml
で洗いアニソールを除去し、1N−酢酸24.2mlを加え生成
物を抽出した。樹脂および不溶物を別し、さらに水で
10倍希釈後90mlのODS樹脂〔LC−sorb（ケムコ社製）〕
を充填したカラム（2.0×40cm）に吸着させ0.1N−酢酸
でよく洗浄後0.1％TFAを含む60％アセトニトリル200ml
で溶出する。溶出液はアセトニトリルを減圧下留去後凍
結乾燥し約228mgの粗ペプチド(2)を得た。この粗ペプチ
ド62.2mgを７mlのTFAに溶かし５回にわけて逆相HPLCに
かけた。条件〔カラム;TSKゲル、ODS120A、2.0×25cm;
流速５ml／分、溶媒系(A)水：アセトニトリル:10％TFA
＝90:10:1,(B)水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1、
(A)：(B)＝75:25から(A)：(B)＝25:75の100分間直線グ
ラジエントをかけた。〕この操作を５回くり返えしメイ
ンピークを分取した。この分画をアセトニトリルを減圧
下留去後凍結乾燥をして目的のペプチド(2)Ｈ−Phe−Ly
s−Val−Asp−Glu−Glu−Phe−Gln−Gly−Pro−Ile−Va
l−Ser−Gln−Asn−Arg−Arg−Tyr−Phe−Leu−Phe−Ar
g−Pro−Arg−Asn−NH₂を11.5mg得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における塩基性画分（SP−III）のセ
フアデツクスＧ−25によるゲル過の結果を示す図面で
あつて、280nmにおける吸収曲線及び相対活性を示す図
面である。第２図はラツト子宮筋の標本に本発明ペプチ
ドを投与したときの収縮長さの経時変化を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者須藤哲司東京都中央区日本橋３丁目13番５号第一化学薬品株式会社内 (56)参考文献［Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｆａｙｅｔｔｅｒｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）６（Ｓｕｐｐｌ. ３）245−248（1985) ［Ｐｅｐｔ．；Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，９ｔｈ 643−646（1985) ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ］130（３），1078− 1085（1985)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式Ｘ−Tyr−Phe−Leu−Phe−Arg−Pro−Arg−Asn−NH₂ （式中、ＸはＨ又はＨ−Phe−Lys−Val−Asp−Glu−Glu
−Phe−Gln−Gly−Pro−Ile−Val−Ser−Gln−Asn−Arg
−Arg−を示す）で表わされる生理活性ペプチド及びその塩。