JPH0678B2 - 光学活性３―フェニルグリシッド酸エステル類化合物の製法 - Google Patents
光学活性３―フェニルグリシッド酸エステル類化合物の製法Info
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- JPH0678B2 JPH0678B2 JP1226504A JP22650489A JPH0678B2 JP H0678 B2 JPH0678 B2 JP H0678B2 JP 1226504 A JP1226504 A JP 1226504A JP 22650489 A JP22650489 A JP 22650489A JP H0678 B2 JPH0678 B2 JP H0678B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、光学活性トランス−３−フェニルグリシッド
酸エステル類化合物の新規製法に関する。
酸エステル類化合物の新規製法に関する。
３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物には、２位
及び３位の２つの不斉炭素原子に基づき、（２Ｒ，３
Ｓ）体及び（２Ｓ，３Ｒ）体のトランス体のエナンチオ
マーが一対、（２Ｒ，３Ｒ）体及び（２Ｓ，３Ｓ）体の
シス体のエナンチオマーが一対、合計４種類の立体異性
体が存在する。このうち、光学活性トランス−３−フェ
ニルグリシッド酸エステル類化合物は、冠血管拡張剤と
して有用な塩酸ジルチアゼム及びその他各種医薬化合物
の合成中間体として重要な化合物であるが、従来、この
化合物の製法としては、トランス−３−（４−メトキシ
フェニル）グリシツド酸メチルエステルを加水分解して
対応するカルボン酸とし、このカルボン酸を光学活性ア
ミン類で光学分割した後、エステル化する方法（特開昭
60-13775、同60-13776）が知られている。
及び３位の２つの不斉炭素原子に基づき、（２Ｒ，３
Ｓ）体及び（２Ｓ，３Ｒ）体のトランス体のエナンチオ
マーが一対、（２Ｒ，３Ｒ）体及び（２Ｓ，３Ｓ）体の
シス体のエナンチオマーが一対、合計４種類の立体異性
体が存在する。このうち、光学活性トランス−３−フェ
ニルグリシッド酸エステル類化合物は、冠血管拡張剤と
して有用な塩酸ジルチアゼム及びその他各種医薬化合物
の合成中間体として重要な化合物であるが、従来、この
化合物の製法としては、トランス−３−（４−メトキシ
フェニル）グリシツド酸メチルエステルを加水分解して
対応するカルボン酸とし、このカルボン酸を光学活性ア
ミン類で光学分割した後、エステル化する方法（特開昭
60-13775、同60-13776）が知られている。
しかしながら、上記方法は工程数が多く、しかも目的と
する光学活性トランス−３−（４−メトキシフェニル）
グリシツド酸メチルエステルが純度の低い油状物として
しか得られないという難点があつた。
する光学活性トランス−３−（４−メトキシフェニル）
グリシツド酸メチルエステルが純度の低い油状物として
しか得られないという難点があつた。
本発明者らは、かかる難点を解決すべき鋭意研究を重ね
た結果、ラセミ型トランス−３−フェニルグリシツド酸
エステル類化合物から、目的とする光学活性トランス−
３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物を一挙にか
つ結晶として取得しうる方法を見出し、本発明を完成す
るに到つた。
た結果、ラセミ型トランス−３−フェニルグリシツド酸
エステル類化合物から、目的とする光学活性トランス−
３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物を一挙にか
つ結晶として取得しうる方法を見出し、本発明を完成す
るに到つた。
すなわち、本発明によれば、光学活性トランス−３−フ
ェニルグリシッド酸エステル類化合物は、一般式 （但し、環Ａは置換基を有することもあるフェニル基、
Ｒは低級アルキル基を表す。） で示されるラセミ型トランス−３−フェニルグリシッド
酸エステル類に、エステル結合を不斉加水分解する能力
を有するコリネバクテリウム属又はセラチア属に属する
微生物の培養液、菌体もしくは菌体処理物又は当該微生
物由来の酵素を作用させて一方の光学活性体を加水分解
した後、反応液より対掌体を分離・採取することにより
製造できる。
ェニルグリシッド酸エステル類化合物は、一般式 （但し、環Ａは置換基を有することもあるフェニル基、
Ｒは低級アルキル基を表す。） で示されるラセミ型トランス−３−フェニルグリシッド
酸エステル類に、エステル結合を不斉加水分解する能力
を有するコリネバクテリウム属又はセラチア属に属する
微生物の培養液、菌体もしくは菌体処理物又は当該微生
物由来の酵素を作用させて一方の光学活性体を加水分解
した後、反応液より対掌体を分離・採取することにより
製造できる。
本発明方法は、一般式〔Ｉ〕で示されるグリシッド酸エ
ステルが、環Ａに低級アルキル基、低級アルコキシ基及
びハロゲン原子から選ばれる置換基を有している場合で
も、置換基のない場合と同様に実施できる。そのような
置換基としては、例えば４位におけるメチル基、メトキ
シ基又はクロロ原子などがある。置換基Ｒは、低級アル
キル基であり、例えばメチル基、エチル基、イソプロピ
ル基又はｔ−ブチル基である。
ステルが、環Ａに低級アルキル基、低級アルコキシ基及
びハロゲン原子から選ばれる置換基を有している場合で
も、置換基のない場合と同様に実施できる。そのような
置換基としては、例えば４位におけるメチル基、メトキ
シ基又はクロロ原子などがある。置換基Ｒは、低級アル
キル基であり、例えばメチル基、エチル基、イソプロピ
ル基又はｔ−ブチル基である。
本発明において、原料化合物であるラセミ型トランス−
３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕とし
ては、（２Ｓ，３Ｒ）体及び（２Ｒ，３Ｓ）体を等量含
むものだけでなく、これらの光学活性体が適当な比率で
含まれているものであればいずれも用いることができ
る。
３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕とし
ては、（２Ｓ，３Ｒ）体及び（２Ｒ，３Ｓ）体を等量含
むものだけでなく、これらの光学活性体が適当な比率で
含まれているものであればいずれも用いることができ
る。
グリシツド酸エステル類化合物〔Ｉ〕のエステル結合を
不斉加水分解する酵素源は、コリネバクテリウム属もし
くはセラチア属に属する微生物の培養液、菌体もしくは
菌体処理物のほか、該菌体から公知方法により得られる
精製もしくは部分精製のリパーゼ或いはエステラーゼを
用いることができる。
不斉加水分解する酵素源は、コリネバクテリウム属もし
くはセラチア属に属する微生物の培養液、菌体もしくは
菌体処理物のほか、該菌体から公知方法により得られる
精製もしくは部分精製のリパーゼ或いはエステラーゼを
用いることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物の具体例として
は、コリネバクテリウム アルカノリテイカム（Coryne
bacterium alkanolyticum）ATCC 21511、コリネバクテ
リウム ハイドロカーボクラスタム（Corynebacterium
hydrocarboclastum）ATCC 15592、コリネバクテリウム
プリモリオキシダンス（Corynebacterium primorioxy
dans）ATCC 31015等をあげることができる。一方、セラ
チア属に属する微生物の具体例としては、セラチア リ
クエファシエンス（Serratia liquefaciens）ATCC 2759
2、セラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）
ATCC 13880、同ATCC 14764、同ATCC 19180、同ATCC 210
74、同ATCC 27117、同ATCC 21212等をあげることができ
る。これらは野性株、変異株であつてもよく、更にはこ
れらの微生物から、遺伝子組み換え、細胞融合などの生
物工学的手法により誘導されるものであつてもよい。
は、コリネバクテリウム アルカノリテイカム（Coryne
bacterium alkanolyticum）ATCC 21511、コリネバクテ
リウム ハイドロカーボクラスタム（Corynebacterium
hydrocarboclastum）ATCC 15592、コリネバクテリウム
プリモリオキシダンス（Corynebacterium primorioxy
dans）ATCC 31015等をあげることができる。一方、セラ
チア属に属する微生物の具体例としては、セラチア リ
クエファシエンス（Serratia liquefaciens）ATCC 2759
2、セラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）
ATCC 13880、同ATCC 14764、同ATCC 19180、同ATCC 210
74、同ATCC 27117、同ATCC 21212等をあげることができ
る。これらは野性株、変異株であつてもよく、更にはこ
れらの微生物から、遺伝子組み換え、細胞融合などの生
物工学的手法により誘導されるものであつてもよい。
また、上記微生物の培養液及び菌体は、例えば当該微生
物を、通常この分野において用いうる培地、例えば、慣
用の炭素源、窒素源及び無機塩類含有培地中、常温ない
し加温下（好ましくは約20〜40℃）、かつ好気的条件
下、pH約５〜８で培養し、必要とあれば常法により培養
液から菌体を分離・採取して得ることができる。
物を、通常この分野において用いうる培地、例えば、慣
用の炭素源、窒素源及び無機塩類含有培地中、常温ない
し加温下（好ましくは約20〜40℃）、かつ好気的条件
下、pH約５〜８で培養し、必要とあれば常法により培養
液から菌体を分離・採取して得ることができる。
なお、培養に際しては、培地にラセミ型トランス−３−
フェニルグリシツド酸エステル類化合物〔Ｉ〕を約0.00
1％以上、とりわけ約0.1〜１％程度、添加して酵素活性
をあげることもできる。
フェニルグリシツド酸エステル類化合物〔Ｉ〕を約0.00
1％以上、とりわけ約0.1〜１％程度、添加して酵素活性
をあげることもできる。
又、かかる微生物菌体の処理物としては、上記微生物の
凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌
体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物などがあげ
られる。更に、本発明の微生物菌体或いは菌体処理物
は、例えばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（カ
ラギーナンゲル法等）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法
等の公知方法により固定化して使用することもできる。
凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌
体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物などがあげ
られる。更に、本発明の微生物菌体或いは菌体処理物
は、例えばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（カ
ラギーナンゲル法等）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法
等の公知方法により固定化して使用することもできる。
本発明にかかる不斉加水分解反応は、適当な溶媒中、ラ
セミ型トランス−３−フェニルグリシッド酸エステル類
化合物〔Ｉ〕に酵素、微生物の培養液、該培養液から採
取した菌体又は菌体処理物を接触させることにより実施
することができる。
セミ型トランス−３−フェニルグリシッド酸エステル類
化合物〔Ｉ〕に酵素、微生物の培養液、該培養液から採
取した菌体又は菌体処理物を接触させることにより実施
することができる。
基質の濃度は概ね0.05〜20％、とりわけ0.5〜５％が好
ましく、反応は、常温ないし加温下、好ましくは10〜50
℃、とりわけ好ましくは25〜40℃で好適に進行する。ま
た反応に際しては、反応液のpHが５〜10、とりわけ６〜
９となるよう調整するのが好ましい。この際、基質は水
難溶姓のものが多いので、反応は水または水性溶媒と有
機溶媒との二相溶媒系で実施するのが好ましい。かかる
有機溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キシレ
ン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、トリ
クロロエチレン、クロロベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブ
チル、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、ジ
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルエチ
ルケトン、メチルイソブチルケトンなどがあげられ、と
りわけ酢酸エチル、四塩化炭素、トルエンが好ましい。
また、酵素源として微生物菌体またはその培養液を用い
る場合、上記反応を界面活性剤の存在下に実施すれば、
反応時間の短縮や光学活性トランス−３−フェニルグリ
シッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕の収量増加をはかるこ
とができる。かかる界面活性剤としては、臭化セチルピ
リジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポリエ
チレングリコール、ポリオキシエチレンオクチルフェニ
ルエーテル、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることが
でき、その添加量は反応液に対し、約0.0001〜0.1％程
度であるのが好ましい。
ましく、反応は、常温ないし加温下、好ましくは10〜50
℃、とりわけ好ましくは25〜40℃で好適に進行する。ま
た反応に際しては、反応液のpHが５〜10、とりわけ６〜
９となるよう調整するのが好ましい。この際、基質は水
難溶姓のものが多いので、反応は水または水性溶媒と有
機溶媒との二相溶媒系で実施するのが好ましい。かかる
有機溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キシレ
ン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、トリ
クロロエチレン、クロロベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブ
チル、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、ジ
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルエチ
ルケトン、メチルイソブチルケトンなどがあげられ、と
りわけ酢酸エチル、四塩化炭素、トルエンが好ましい。
また、酵素源として微生物菌体またはその培養液を用い
る場合、上記反応を界面活性剤の存在下に実施すれば、
反応時間の短縮や光学活性トランス−３−フェニルグリ
シッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕の収量増加をはかるこ
とができる。かかる界面活性剤としては、臭化セチルピ
リジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポリエ
チレングリコール、ポリオキシエチレンオクチルフェニ
ルエーテル、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることが
でき、その添加量は反応液に対し、約0.0001〜0.1％程
度であるのが好ましい。
かくして得られる加水分解反応液からの光学活性トラン
ス−３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕
の単離は常法にしたがつて容易に実施することができ
る。例えば加水分解反応を水−有機溶媒二相系で実施し
た場合には、３−フェニルグリシッド酸エステル類化合
物〔Ｉ〕の一方の光学活性体は加水分解されて水層に移
行し、反応を受けない他方の光学活性体は有機溶媒中に
残存するので、有機溶媒層を分取し、源圧濃縮すること
により光学活性トランス−３−フェニルグリシッド酸エ
ステル類化合物を結晶として採取することができる。
ス−３−フェニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕
の単離は常法にしたがつて容易に実施することができ
る。例えば加水分解反応を水−有機溶媒二相系で実施し
た場合には、３−フェニルグリシッド酸エステル類化合
物〔Ｉ〕の一方の光学活性体は加水分解されて水層に移
行し、反応を受けない他方の光学活性体は有機溶媒中に
残存するので、有機溶媒層を分取し、源圧濃縮すること
により光学活性トランス−３−フェニルグリシッド酸エ
ステル類化合物を結晶として採取することができる。
上記本発明方法によれば、光学活性トランス−３−フェ
ニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕を短工程で取
得できると共に、本発明に係る酵素の基質に対する立体
選択性がよく、しかも基質が安定なｐＨ領域と酵素の至
適ｐＨがほぼ一致しているため、高純度の目的物を高収
率に取得できるので、工業的有利な製法となりうるもの
である。
ニルグリシッド酸エステル類化合物〔Ｉ〕を短工程で取
得できると共に、本発明に係る酵素の基質に対する立体
選択性がよく、しかも基質が安定なｐＨ領域と酵素の至
適ｐＨがほぼ一致しているため、高純度の目的物を高収
率に取得できるので、工業的有利な製法となりうるもの
である。
実験例１ ＜目的＞ 本発明の酵素と対照の酵素につき、基質に対する立体選
択能を調べた。
択能を調べた。
＜使用酵素＞ 本発明の酵素：各微生物を培地（組成；デキストリン１
％、硫安0.2％、ミーストＳ ２％、KH2PO4 0.1％、Mg
SO4・7H2O 0.05％、CaCl2・2H2O 0.01％、FeSO4・7H2
O 0.001％、Tween80 0.5％、カラリン102 0.1％、pH
7.0）中、30℃で18時間培養した後、培養液を遠心分
離し、その上清をそのまま用いた（以下、同）。
％、硫安0.2％、ミーストＳ ２％、KH2PO4 0.1％、Mg
SO4・7H2O 0.05％、CaCl2・2H2O 0.01％、FeSO4・7H2
O 0.001％、Tween80 0.5％、カラリン102 0.1％、pH
7.0）中、30℃で18時間培養した後、培養液を遠心分
離し、その上清をそのまま用いた（以下、同）。
対照の酵素：市販の酵素を用いた（以下、同）。
＜実験方法＞ ２mM塩化カルシウムを含む0.4Mトリス塩酸緩衝液3.75ml
とラセミ体トランス−３−（４−メトキシフェニル）グ
リシッド酸メチルエステル1.5gを含むトルエン溶液7.5m
lを混合し、30℃で10分間プレインキユベートする。こ
れに酵素液3.75mlを添加し、反応液ｐＨを概酵素の至適
ｐＨに調製した後、30℃、毎分1400回転で３時間攪拌し
て加水分解反応を実施した。
とラセミ体トランス−３−（４−メトキシフェニル）グ
リシッド酸メチルエステル1.5gを含むトルエン溶液7.5m
lを混合し、30℃で10分間プレインキユベートする。こ
れに酵素液3.75mlを添加し、反応液ｐＨを概酵素の至適
ｐＨに調製した後、30℃、毎分1400回転で３時間攪拌し
て加水分解反応を実施した。
なお、酵素量は、３時間の反応で、基質の加水分解率が
４０〜５０％となる量を用いた。
４０〜５０％となる量を用いた。
反応後、回収したトランス−３−（４−メトキシフェニ
ル）グリシッド酸メチルエステルをダイセル化学工業
（株）製のキラルセルＯＪΦ4.6×250mmを用いた高速液
体クロマトグラフイーにより分析して、加水分解率及び
（2R,3S）−３−（４−メトキシフェニル）グリシツド
酸メチルエステルの光学純度を求め、これらからＥ値
〔ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ
テイー、第104巻、第7294〜7299頁（1982年）〕を式 により算出し、これを指標として各酵素の基質に対する
立体選択性を判断した。
ル）グリシッド酸メチルエステルをダイセル化学工業
（株）製のキラルセルＯＪΦ4.6×250mmを用いた高速液
体クロマトグラフイーにより分析して、加水分解率及び
（2R,3S）−３−（４−メトキシフェニル）グリシツド
酸メチルエステルの光学純度を求め、これらからＥ値
〔ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ
テイー、第104巻、第7294〜7299頁（1982年）〕を式 により算出し、これを指標として各酵素の基質に対する
立体選択性を判断した。
＜結果＞ 結果は下記第１表に示す通りである。
＜考察＞ 上記第１表より、本発明のセラチア属及びコリネバクテ
リウム属微生物に由来する酵素を使用した場合には、対
照の各酵素を使用した場合に較べて極めて高いＥ値を示
すことがわかる。
リウム属微生物に由来する酵素を使用した場合には、対
照の各酵素を使用した場合に較べて極めて高いＥ値を示
すことがわかる。
このことは、セラチア属及びコリネバクテリウム属微生
物に由来する酵素が、トランス−３−（４−メトキシフ
ェニル）グリシツド酸メチルエステルの加水分解反応に
おいて極めて優れた立体選択能を有していることを示す
ものである。
物に由来する酵素が、トランス−３−（４−メトキシフ
ェニル）グリシツド酸メチルエステルの加水分解反応に
おいて極めて優れた立体選択能を有していることを示す
ものである。
実験例２ ＜目的＞ 本発明の酵素および対照の酵素ならびに基質の各ｐＨ領
域における安定性（酵素は２４時間後、基質は６時間
後）を調べた。
域における安定性（酵素は２４時間後、基質は６時間
後）を調べた。
＜使用酵素＞ 本発明の酵素：セラチア マルセツセンスATCC 27117由
来の酵素 対照の酵素：リパーゼ OF-360〔キヤンデイダシリンド
ラシア由来、各糖産業製〕 ＜実験方法＞ (a)酵素のｐＨ安定性 600ユニツトの酵素溶液10mlを、第２表に記載のｐＨを
もつ0.2M水性緩衝液10mlに添加し、30℃で２４時間静置
し、酵素液とした。一方、２mM塩化カルシウムを含む0.
4M水性緩衝液3.75mlを、ラセミ型トランス−３−（４−
メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル1.5gを
含むトルエン溶液7.5mlと混合して30℃で10分間プレイ
ンキュベートし、これに上記酵素液２mlを含む水溶液3.
75mlを添加し、30℃、毎分1400回転で7.5分攪拌した。
反応液中の（2S，3R）−３−（４−メトキシフェニル）
グリシッド酸メチルエステルを高速液体クロマトグラフ
イーにて測定し、これから残存酵素活性を算出した。
来の酵素 対照の酵素：リパーゼ OF-360〔キヤンデイダシリンド
ラシア由来、各糖産業製〕 ＜実験方法＞ (a)酵素のｐＨ安定性 600ユニツトの酵素溶液10mlを、第２表に記載のｐＨを
もつ0.2M水性緩衝液10mlに添加し、30℃で２４時間静置
し、酵素液とした。一方、２mM塩化カルシウムを含む0.
4M水性緩衝液3.75mlを、ラセミ型トランス−３−（４−
メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル1.5gを
含むトルエン溶液7.5mlと混合して30℃で10分間プレイ
ンキュベートし、これに上記酵素液２mlを含む水溶液3.
75mlを添加し、30℃、毎分1400回転で7.5分攪拌した。
反応液中の（2S，3R）−３−（４−メトキシフェニル）
グリシッド酸メチルエステルを高速液体クロマトグラフ
イーにて測定し、これから残存酵素活性を算出した。
なお、上記において１ユニットは（2S,3R）−３−（４
−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル１μ
Ｍを１分間に分解するのに要する酵素量を表わす（以
下、同）。
−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル１μ
Ｍを１分間に分解するのに要する酵素量を表わす（以
下、同）。
(b)基質のｐＨ安定性 0.2M水性緩衝液7.5mlを、0.75gのラセミ型トランス−３
−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステ
ルを含むトルエン溶液7.5mlと混合した。この混合液
を、30℃で毎分1400回転で６時間攪拌した。次いで、高
速液体クロマトグラフイーにより、残存するトランス−
３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエス
テルの割合（％）を測定した。
−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステ
ルを含むトルエン溶液7.5mlと混合した。この混合液
を、30℃で毎分1400回転で６時間攪拌した。次いで、高
速液体クロマトグラフイーにより、残存するトランス−
３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエス
テルの割合（％）を測定した。
なお、水性緩衝液として、塩酸−グリココル（glycoco
l）緩衝液（pH２）、マックイルヴェイン（Mc Ilvain
e）緩衝液（pH３〜７）、トリス塩酸緩衝液（pH８〜
９）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10
〜11）を用いた。
l）緩衝液（pH２）、マックイルヴェイン（Mc Ilvain
e）緩衝液（pH３〜７）、トリス塩酸緩衝液（pH８〜
９）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10
〜11）を用いた。
＜結果＞ 結果は、下記第２表に示す通りである。
＜考察＞ 上記の結果から、本発明の酵素は、基質の残存率が最も
高いｐＨ（８）で酵素活性残存率が最も高く、基質の分
解を避けつつ不斉加水分解反応を実施する上で好都合で
あるが、対照の酵素は、基質がかなり分解するｐＨ
（６）で酵素活性がかなり低下しているため、効率よく
不斉加水分解反応を実施する上では望ましくないことが
わかる。
高いｐＨ（８）で酵素活性残存率が最も高く、基質の分
解を避けつつ不斉加水分解反応を実施する上で好都合で
あるが、対照の酵素は、基質がかなり分解するｐＨ
（６）で酵素活性がかなり低下しているため、効率よく
不斉加水分解反応を実施する上では望ましくないことが
わかる。
実験例３ ＜目的＞ 本発明の酵素と対照の酵素の至適ｐＨを調べた。
＜使用酵素＞ 本発明の酵素：セラチア マルセッセンスATCC 27117由
来の酵素 対照の酵素：リパーゼOF-360〔キャンディダシリンドラ
シア由来、名糖産業製〕 ＜実験方法＞ 2mM塩化カルシウムを含む0.4M水性緩衝液3.75mlを、ラ
セミ型トランス−３−（４−メトキシフェニル）グリシ
ッド酸メチルエステル1.5gを含むトルエン溶液7.5mlと
混合し、30℃で10分間プレインキュベートした。これに
50〜70ユニットの酵素を含む水溶液3.75mlを添加し、30
℃で毎分1400回転で7.5分攪拌した後、高速液体クロマ
トグラフイーによりトランス−３−（４−メトキシフェ
ニル）グリシッド酸メチルエステルを測定し、これに基
づき酵素活性を求めた。
来の酵素 対照の酵素：リパーゼOF-360〔キャンディダシリンドラ
シア由来、名糖産業製〕 ＜実験方法＞ 2mM塩化カルシウムを含む0.4M水性緩衝液3.75mlを、ラ
セミ型トランス−３−（４−メトキシフェニル）グリシ
ッド酸メチルエステル1.5gを含むトルエン溶液7.5mlと
混合し、30℃で10分間プレインキュベートした。これに
50〜70ユニットの酵素を含む水溶液3.75mlを添加し、30
℃で毎分1400回転で7.5分攪拌した後、高速液体クロマ
トグラフイーによりトランス−３−（４−メトキシフェ
ニル）グリシッド酸メチルエステルを測定し、これに基
づき酵素活性を求めた。
なお、水性緩衝液として実験例２で使用した各緩衝液を
使用した。
使用した。
＜結果＞ 結果は下記第３表に示す通りである。
（注）：表中の各酵素活性は、測定した最高値を１００
とした場合の％として表した。
とした場合の％として表した。
＜考察＞ 上記第３表から本発明の酵素は基質が最も安定なｐＨ９
付近に活性発現の至適ｐＨが存在し、効率的に不斉加水
分解を実施し得ることがわかる。
付近に活性発現の至適ｐＨが存在し、効率的に不斉加水
分解を実施し得ることがわかる。
実験例４〔酵素活性の半減期〕 ＜目的＞ 本発明の酵素と対照の酵素について、酵素活性の半減期
を調べた。
を調べた。
＜使用酵素＞ 本発明の酵素：セラチア マルセツセンスATCC 27117由
来の酵素 対照の酵素：リパーゼOF-360〔キヤンデイダシリンドラ
シア由来、名糖産業製〕 ＜実験方法＞ 1700ユニツトの酵素を含む0.2M水性緩衝液50mlとトルエ
ン溶液50mlを混合した。この混合物を30℃で毎分1400回
転で攪拌し、３日毎に酵素活性を実験例３と同様にして
測定することにより、酵素活性の半減期を算出した。
来の酵素 対照の酵素：リパーゼOF-360〔キヤンデイダシリンドラ
シア由来、名糖産業製〕 ＜実験方法＞ 1700ユニツトの酵素を含む0.2M水性緩衝液50mlとトルエ
ン溶液50mlを混合した。この混合物を30℃で毎分1400回
転で攪拌し、３日毎に酵素活性を実験例３と同様にして
測定することにより、酵素活性の半減期を算出した。
＜結果＞ 結果は下記第４表に示す通りである。
＜考察＞ 上記第４表から本発明の酵素は、対照の酵素に較べて半
減期が約３倍も長く、安定性が極めて良好であることが
わかる。
減期が約３倍も長く、安定性が極めて良好であることが
わかる。
実施例１ グルコース0.5%、ペプトン1%、肉エキス1%、酵母エキス
1.25%、塩化ナトリウム0.5%、からなる培地50ml（pH7.
0）を500ml容振盪フラスコに入れ、120℃で10分間減菌
した。この培地に、セラチア マルセッセンスATCC 271
17を１白金耳接種し、30℃で20時間振盪培養した。上記
培養液5.4から遠心分離により集めた菌体を、生理食
塩水に懸濁後さらに遠心分離により集菌した。菌体を臭
化セチルトリメチルアンモニウム0.01%を含む10mMリン
酸緩衝液1.8（pH7.5）に懸濁し、ラセミ型３−（４−
メトキシフエニル）グリシッド酸メチルエステル7.2gを
含む四塩化炭素1.8に添加した後、30℃で３日間不斉
加水分解反応させることにより、（２Ｓ，３Ｒ）−３−
（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル
が完全に分解した。四塩化炭素層を分取したのち、減圧
濃縮し、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニ
ル）グリシッド酸メチルエステル3.0gを粗結晶として得
た。この粗結晶3.0gにイソプロピルアルコール10mlを添
加した後、80℃にて攪拌しながら20分間加熱溶解した。
３時間かけて80℃から20℃へ徐冷した後、１時間氷冷
し、析出した結晶をろ取することにより、（２Ｒ，３
Ｓ）−３−（４−メトキシフエニル）グリシッド酸メチ
ルエステルのプリズム状結晶2.9gを得た。
1.25%、塩化ナトリウム0.5%、からなる培地50ml（pH7.
0）を500ml容振盪フラスコに入れ、120℃で10分間減菌
した。この培地に、セラチア マルセッセンスATCC 271
17を１白金耳接種し、30℃で20時間振盪培養した。上記
培養液5.4から遠心分離により集めた菌体を、生理食
塩水に懸濁後さらに遠心分離により集菌した。菌体を臭
化セチルトリメチルアンモニウム0.01%を含む10mMリン
酸緩衝液1.8（pH7.5）に懸濁し、ラセミ型３−（４−
メトキシフエニル）グリシッド酸メチルエステル7.2gを
含む四塩化炭素1.8に添加した後、30℃で３日間不斉
加水分解反応させることにより、（２Ｓ，３Ｒ）−３−
（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル
が完全に分解した。四塩化炭素層を分取したのち、減圧
濃縮し、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニ
ル）グリシッド酸メチルエステル3.0gを粗結晶として得
た。この粗結晶3.0gにイソプロピルアルコール10mlを添
加した後、80℃にて攪拌しながら20分間加熱溶解した。
３時間かけて80℃から20℃へ徐冷した後、１時間氷冷
し、析出した結晶をろ取することにより、（２Ｒ，３
Ｓ）−３−（４−メトキシフエニル）グリシッド酸メチ
ルエステルのプリズム状結晶2.9gを得た。
M.P. ：87-88℃ ▲〔α〕20 D▼：−207.08゜（C=1，メタノール） 純度 ：100％ 元素分析値：理論値 C:63.45，H:5.81，O:30.74 測定値 C:63.44，H:5.80，O:30.76 赤外吸収スペクトル ：第１図 核磁気共鳴スペクトル：第２図 質量分析スペクトル ：第３図 実施例２ 実施例１に示した培地に下記第５表に示す細菌を接種
し、30℃で20時間培養した。上記培養液45mlより遠心分
離により集めた菌体を、生理食塩水に懸濁後さらに遠心
分離により集菌した。該菌体を臭化セチルトリメチルア
ンモニウム0.01%を含む10mMリン酸緩衝液15ml（pH7.5）
に懸濁し、ラセミ型３−（４−メトキシフエニル）グリ
シッド酸メチルエステル60mgを含む四塩化炭素15mlに添
加し、30℃にて３日間不斉加水分解反応させた。反応
後、四塩化炭素層を分取して、（２Ｒ、３Ｓ）−３−
（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル
含有反応液を得た。この反応液の（２Ｒ、３Ｓ）体の含
量は下記第５表の通りであり、また、その対掌体である
（２Ｓ、３Ｒ）体は反応液中から殆ど検出されなかつ
た。
し、30℃で20時間培養した。上記培養液45mlより遠心分
離により集めた菌体を、生理食塩水に懸濁後さらに遠心
分離により集菌した。該菌体を臭化セチルトリメチルア
ンモニウム0.01%を含む10mMリン酸緩衝液15ml（pH7.5）
に懸濁し、ラセミ型３−（４−メトキシフエニル）グリ
シッド酸メチルエステル60mgを含む四塩化炭素15mlに添
加し、30℃にて３日間不斉加水分解反応させた。反応
後、四塩化炭素層を分取して、（２Ｒ、３Ｓ）−３−
（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエステル
含有反応液を得た。この反応液の（２Ｒ、３Ｓ）体の含
量は下記第５表の通りであり、また、その対掌体である
（２Ｓ、３Ｒ）体は反応液中から殆ど検出されなかつ
た。
尚、上記光学活性体の定量はダイセル化学工業（株）製
のキラルセルＯＩΦ4.6×250mmを用い、高速液体クロマ
トグラフイーにより行つた。
のキラルセルＯＩΦ4.6×250mmを用い、高速液体クロマ
トグラフイーにより行つた。
第１図は、(2R、3S)-3-(4-メトキシフェニル）グリシッ
ド酸メチルエステルの赤外吸収スペクトル、第２図は同
化合物の核磁気共鳴スペクトル、第３図は同化合物の質
量分析スペクトルである。
ド酸メチルエステルの赤外吸収スペクトル、第２図は同
化合物の核磁気共鳴スペクトル、第３図は同化合物の質
量分析スペクトルである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:425）
Claims (4)
- 【請求項１】一般式〔Ｉ〕 （但し、環Ａは置換基を有することもあるフェニル基、
Ｒは低級アルキル基を表わす。） で示されるラセミ型トランス−３−フェニルグリシッド
酸エステルに、エステル結合を不斉加水分解する能力を
有するコリネバクテリウム属もしくはセラチア属に属す
る微生物の培養液、菌体もしくは菌体処理物または当該
微生物由来の酵素を作用させて一方の光学活性体を加水
分解した後、反応液より対掌体を分離・採取することを
特徴とする光学活性トランス−３−フェニルグリシッド
酸エステル類化合物の製法。 - 【請求項２】分離・採取する対掌体の立体配置が（2R，
3S）である請求項１記載の製法。 - 【請求項３】酵素がエステラーゼ又はリバーゼである請
求項１記載の製法。 - 【請求項４】微生物がセラチア属に属する微生物である
請求項１記載の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226504A JPH0678B2 (ja) | 1988-09-02 | 1989-08-31 | 光学活性３―フェニルグリシッド酸エステル類化合物の製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-221016 | 1988-09-02 | ||
| JP22101688 | 1988-09-02 | ||
| JP1226504A JPH0678B2 (ja) | 1988-09-02 | 1989-08-31 | 光学活性３―フェニルグリシッド酸エステル類化合物の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0315398A JPH0315398A (ja) | 1991-01-23 |
| JPH0678B2 true JPH0678B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=26524038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1226504A Expired - Lifetime JPH0678B2 (ja) | 1988-09-02 | 1989-08-31 | 光学活性３―フェニルグリシッド酸エステル類化合物の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0678B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056762A3 (en) * | 1997-06-11 | 1999-03-25 | Tanabe Seiyaku Co | Process for preparing optically active phenyloxirane compounds |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8801311A (nl) * | 1988-05-20 | 1989-12-18 | Stamicarbon | Fenylglycidaatstereoisomeren, omzettingsprodukten daarvan met 2-nitrothiofenol en de bereiding van diltiazem. |
| US5677470A (en) | 1994-06-28 | 1997-10-14 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Baccatin derivatives and processes for preparing the same |
| CA2162759A1 (en) * | 1994-11-17 | 1996-05-18 | Kenji Tsujihara | Baccatin derivatives and processes for preparing the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6013776A (ja) * | 1983-07-05 | 1985-01-24 | Sawai Seiyaku Kk | 光学活性３−（ｐ−アルコキシフエニル）グリシツド酸誘導体の製造法 |
| JPS6013775A (ja) * | 1983-07-05 | 1985-01-24 | Sawai Seiyaku Kk | 光学活性３−（ｐ−アルコキシフエニル）グリシツド酸アルカリ金属塩の製造法 |
-
1989
- 1989-08-31 JP JP1226504A patent/JPH0678B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056762A3 (en) * | 1997-06-11 | 1999-03-25 | Tanabe Seiyaku Co | Process for preparing optically active phenyloxirane compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0315398A (ja) | 1991-01-23 |
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