JPH0680080B2

JPH0680080B2 - 免疫抑制因子

Info

Publication number: JPH0680080B2
Application number: JP60501675A
Authority: JP
Inventors: フオンタナ、アドリアーノ
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-16
Publication date: 1994-10-12
Anticipated expiration: 2009-10-12
Also published as: IE850732L; EP0159289A1; EP0159289B1; IE58821B1; DK171600B1; IL74680A0; WO1985004421A1; IL74680A; AU4157685A; DE3585968D1; NZ211525A; CA1341401C; ATE75778T1; DK539285A; AU587973B2; DK539285D0; ZA852194B; JPS61501514A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、免疫調節物質に関するものである。

より詳しくは、本発明はＴ細胞の機序、特にインターロ
イキン２（IL−２）依存性のＴ細胞の機序を阻害するこ
とのできる免疫抑制因子に関するものである。

細胞性免疫におけるＴ細胞の役割（例えばＢリンパ球と
の協同による）は、よく解明されている。抗体の産生ま
たは標的細胞の溶解に必要なＴ細胞の機序を阻害するこ
とのできる物質は、生体の免疫応答を抑制または低減す
るのに使用できる。したがつて、このような物質は、例
えば移植に関連して拒絶を防止するために、そしてさら
に生体の自己免疫応答を特徴とする疾病の処置に関連し
て使用することができる。

この度本発明者等は、ヒトの神経膠芽腫培養細胞がIL−
２依存性Ｔ細胞機序を阻害する因子を分泌することを見
出した。この因子は、レクチンの存在下での胸腺細胞に
対するIL−２の作用、およびリンパ球混合培養（MLC）
におけるアロ反応性細胞障害Ｔ細胞の誘導に対して阻害
効果を有する。IL−２は、MLCにおけるこの誘導に対す
る本抑制因子の阻害効果の代替となることはない。これ
は、さらに神経芽細胞の発育を阻害し、線維芽細胞の発
育を阻害しない。この神経膠芽腫細胞由来の抑制因子
は、さらに、供血者から分離したヒト末梢血単核細胞の
レクチン応答を阻害することがわかつた。しかしなが
ら、この因子の阻害効果は最適濃度より低いレクチン濃
度で最大となつた。

この因子は、神経膠芽腫腫瘍ののう胞液または培養した
ヒト神経膠芽腫セルラインの上清（SN）から得ることが
でき、見掛けのおよその分子量は97000であり、本明細
書中ではＧ−TsFとも称する。

培養したヒト神経膠芽腫細胞は、超微細構造、特に細線
維の存在、ならびにグリア原線維酸性蛋白質（GFA）お
よびＳ−100蛋白質のような生化学的マーカーによつて
特徴付けられる（７、14、15）。さらに、ヒト神経膠腫
細胞は、Ia様抗原および通常型の急性リンパ芽球性白血
病の患者からのリンパ球様細胞に発現される通常急性リ
ンパ芽球性白血病抗原（CALLA）、並びに、黒色腫およ
び神経芽腫と同様に、神経外胚葉性抗原を発現する
（８）。

２個の免疫制御伝達物質、１個の抑制因子および１個の
ヘルパー因子が神経膠芽腫細胞の上清中に検出された。
このヘルパー因子は、マクロフアージ由来IL1（インタ
ーロイキン１）の特徴を有する。この因子のIL1様伝達
物質としての性格付けは、この因子が、ａ）PHA（フイ
トヘムアグルチニン）誘導胸腺細胞増殖を促進し、ｂ）
IL2活性は示さないものの、ｃ）マイトージエンで刺激
した脾臓細胞によるIL2の産生を増大させ、そしてｄ）2
2000付近の分子量を有する、という発見に基づいてい
る。この内容中、リポ多糖体によつて刺激されたマウス
の星状膠細胞およびラツトのC₆神経膠腫細胞が、インビ
トロで同様なIL1様因子を分泌する（９、18、19）とい
う事は興味深い。さらに、ラツトの星状膠細胞は、Ｔ−
リンパ球に対する抗原を提示し、例えばミエリン塩基性
蛋白特異的Ｔリンパ球ラインを活性化することがわかつ
た（20）。これに加えて、培養したラツトの星状膠細胞
は、Ｔ細胞と相互作用して、Ia抗原を出現させる（2
0）。IL1様因子の産生および星状膠細胞による抗原の提
示は、脳内免疫応答の発生において中心的役割を担つて
いると思われる。また最近では、中枢神経系が、脳内に
入つた場合の腫瘍細胞および抗原に対する特異的免疫応
答を装備することが可能であるとの証拠もある（21）。

異型化（トランスフオーム）された星状膠細胞前駆細胞
に相当すると思われる神経膠芽腫細胞は、星状膠細胞と
同様に、インビトロでIL1様因子を産生する。しかし、I
L1様ヘルパー因子の効果は、やはりこの腫瘍細胞によつ
て創出される本明細書記載の阻害因子によつてくつがえ
される。この因子は、Con A（コンカナバリンＡ）また
はPHAおよびIL1/IL2標準の両者に対するＴ細胞の増殖的
応答を阻害する。この因子は、さらに、通常IL2および
ハプテン処理した照射脾臓細胞の存在下で発育するＨ−
２制限性ハプテン特異性Ｔ細胞ラインの増殖をも遮断す
る。神経膠芽腫由来の抑制因子は、Con Aにより刺激し
た脾臓細胞によるIL2の産生には影響せず、IL2に独立し
て増殖する胸腺腫セルライン（EL4細胞）の発育に影響
を及ぼさない。総合すると、これらの結果は、この因子
がＴ細胞活性化過程の最終工程を妨害することを示して
いる。この神経膠芽腫由来の抑制因子が必ずしもＴ細胞
に対するIL2の直接的作用を含まずに増殖段階に影響を
及ぼすという仮説は、この分子量97000の因子が、IL2と
は独立して発育する神経芽細胞の発育をも阻害するとい
う発見に基づいている。

最近、種々のヒト腫瘍細胞の調整培地中における免疫抑
制因子の存在が研究された（22）。12の異なる腫瘍（３
種の黒色腫、２種の肉腫、および７種の癌腫）のうち、
３種の腫瘍のSNのみが、PHAで誘導される芽球化を30％
以上阻害した。しかしながら希釈実験で示されるよう
に、この阻害効果はSNの1/4希釈まで観察されただけで
あり、より高希釈では効果がなかつた（22）。神経膠芽
腫SNを産生し試験する条件を用いた場合、２種類の神経
芽腫、黒色腫および横紋筋肉腫のSNは、Con Aに対する
胸腺細胞の応答性に影響を及ぼさなかつた。この事は、
非リンパ球様腫瘍のうちで、現時点では神経膠芽腫細胞
が、インビボおよびインビトロで免疫抑制因子を放出す
る能力という点で唯一のものであるという仮説を支持す
るものである。

免疫応答性の低下が神経膠芽腫の患者において証明され
ている（１〜６）。神経膠芽腫の患者の障害された細胞
性免疫は、ごく普通の抗原に対する皮膚の反応性の低
下、ジニトロクロロベンゼンに対し感作される能力の低
下、およびPHAまたは抗原に対するインビトロでのリン
パ球の応答性の低下という徴候を示す。この腫瘍細胞の
放出する因子が、既述したＴ細胞の免疫不全状態を良く
説明できる。この考えは、インビトロでは神経膠芽腫培
養SN中に、インビボでは神経膠芽腫腫瘍ののう胞液中に
存在するＴ細胞活性化阻害因子の検出により、支持され
る。さらに、神経膠芽腫の患者の血清は、MLCならびにP
HA−およびCon A−誘発リンパ球増殖をインビトロで阻
害する因子を含有する。神経膠芽腫を脳外科手術により
摘除した後には、血清中における抑制因子活性は消失す
る（１、４）。

殆んどの神経膠芽腫患者において、その腫瘍に対する液
性免疫応答が発達することは良く証明されている（23、
24）が、意味のある細胞性抗腫瘍免疫応答の証拠は殆ん
ど知られていない（25〜27）。一般的には、細胞障害Ｔ
細胞が細胞性抗腫瘍免疫反応の進展に連座して寄与する
結果となつている（28、29）。CTLの産生のIL2依存性
は、インビボで腫瘍細胞の注射と連係させて高度精製IL
2を投与すると、この結果マウスのCTLおよびナチユラル
キラー細胞の応答が増大することによつて証明された
（30）。本発明に係る神経膠芽腫細胞由来の分子量9700
0の因子によるCTLの産生の遮断の知見は、神経膠芽腫に
対する無能な免疫監視機構を少なくとも幾分かは説明で
きる。

宿主の免疫適格性の障害は、細胞性免疫応答を非特異的
に抑制する、神経膠芽腫細胞によるリンホカイン誘導ム
コ多糖体被覆の生成にも起因するかも知れない（31）。

Ｇ−TsFは、上記の活性スペクトルおよび下記の実施例
およびおよその分子量によつて特徴付けられる。さらに
本因子はトリプシンによる蛋白分解に対し感受性であ
り、後に述べるように等電点分離法でpI4.6のピークを
有した。精製は、細胞因子の精製のために普通に使用さ
れる種々の方法によつて行なうことができる。特に好都
合な方法は、まずブルーアフイゲル、次にヒドロキシリ
ン灰石を用いたSN（所望により予め脱塩する）の連続的
クロマトグラフイーを行ない、引き続き例えばウルトロ
ゲルAcA54、またはウルトロ・バツクTSK G3000SWGによ
るゲル過を行なうことを含む。使用可能なその他の吸
着剤には、フエニル−セフアロース、DEAE・セルロース
およびヘパリン・アフイゲルが含まれる。他の方法とし
ては、適当な抗体の使用がある。

Ｔ細胞活性化の調節に対する関連性に加えて、神経膠芽
腫の調節培地は、その神経芽細胞発育阻害因子（NGIF）
様活性の故に興味深い。NGIFはラツト胎児の膠芽細胞に
より放出され、神経芽細胞に対する抑制活性を発揮する
が、線維芽細胞に対しては発揮しない（32、33）。さら
に、この分子量75000の因子は、神経突起の形成により
証明されるようにニユーロ2A細胞の形態学的分化を促進
させる活性を有していた（32、33）。同様のアツセイに
おいて本発明者等は、IL2に対するＴ細胞の応答性およ
び神経芽細胞の発育を阻害するセフアクリルＳ−200の
神経膠芽腫分画が神経突起の生成を誘起するが、線維芽
細胞には影響を及ぼさないことを観察した。

本明細書中に引用した文献： 1.W.H.ブルツクス等，原発性頭蓋内腫瘍患者における細
胞性免疫の低下，ザ・ジヤーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メデイスン,136:1631。

2.W.H.ブルツクス等，神経膠腫患者における免疫応答，
サージカル・ニユーロロジー,2:419。

3.D.G.T.トーマス等，ヒト脳腫瘍における障害された細
胞性免疫，ザ・ランセツト,11:1389。

4.H.F.ヤング等，脳腫瘍患者における細胞性免疫の阻
害，サージカル・ニユーロロジー,5:19。

5.C.B.メンジーズ等，悪性脳腫瘍患者における障害され
た胸腺由来リンパ球機能，クリニカル・ニユーロロジー
・アンド・ニユーロサージエリー,82:157。

6.T.L.ロズマン等，原発性頭蓋内腫瘍の免疫生物学，大
脳腫瘍患者におけるサプレツサー細胞機能およびレクチ
ン結合リンパ球亜分画，キヤンサー,50:2173。

7.S.C.デイセレンス等，確立されたヒト悪性神経膠腫セ
ルラインLN−18の性格付け，アクタ・ニユーロパソロジ
カ,53:21。

8.S.N.カレル等，黒色腫、神経膠腫および神経芽腫に共
通する神経外胚葉性抗原の発現，モノクローン性抗黒色
腫および抗神経膠腫抗体による同定，アクタ・ニユーロ
パソロジカ,57:158。

9.A.フオンタナ等，培養した星上膠細胞およびC₆神経膠
腫細胞によるプロスタグランジンＥおよびインターロイ
キン１様因子の産生，ザ・ジヤーナル・オブ・イミユノ
ロジー,129:2413。

10.H.P.パーチヤー等，長命なハプテン特異性細胞障害
Ｔ細胞クローンの制限高度特異性:H−2K突然変異マウス
およびＨ−2K特異性モノクローン性抗体による分析，ヨ
ーロピアン・ジヤーナル・オブ・イミユノロジー。

11.J.C.セロツテイーニ等，細胞媒介性細胞障害、同種
移植拒絶、および腫瘍免疫，アドバンスイズ・イン・イ
ミユノロジー,18〜67。

12.J.T.カング等，誘導されたアルギネースに起因する
マクロフアージによるインビトロ細胞障害応答の抑制，
ザ・ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイス
ン,146:665。

13.B.M.スタツトラー等，ヒト単核球、ヒトおよびマウ
スのＴ細胞ラインからのIL−２活性の回復と細胞周期と
の関係，ザ・ジヤーナル・オブ・イミユノロジー,127〜
1936。

14.A.パクトー等，ヒト神経膠腫細胞におけるグリア原
線維酸性蛋白および中間径フイラメント，アクタ・ニユ
ーロパソロジカ,47:71。

15.A.エドストローム等，血清由来のヒト神経膠腫培養
細胞における形態学的変化およびＳ−100蛋白質の増
加，エクスペリメンタル・セル・リサーチ,83:426。

16.S.カレル等，神経膠腫細胞上の通常型急性リンホー
ル・リンパ芽球性白血病抗原およびHLA−DRの発現，ヨ
ーロピアン・ジヤーナル・オブ・イミユノロジー,12:35
4。

17.N.ド・トリボレツト等，実験的腫瘍研究の進歩中第2
7巻，脳腫瘍の生物学,M.I.ローゼンブラム等編，カーガ
ー，バーゼル。

18.A.フオンタナ等，ラツトC₆神経膠腫細胞から得たイ
ンターロイキン−１様因子の生物学的および生化学的性
格付け，ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・イミユノロ
ジー,13:685。

19.A.フオンタナ等，星状膠細胞に対するグリア成熟因
子の二重効果：インターロイキン−１様因子の分化およ
び放出，ジヤーナル・オブ・ニユーロイミユノロジー,
5:216。

20.A.フオンタナ等，星状膠細胞が脳炎惹起性Ｔ細胞ラ
インに対しミエリン塩基性蛋白を提示する，ネーチヤ
ー,307:273頁。

21.M.ハセツク等，脳内の腫瘍同種移植および免疫学的
寛容，ネーチヤー,186:68。

22.C.M.レンク等，培養中のヒト腫瘍細胞から放出され
る因子による正常同種リンパ球の阻害，キヤンサー・イ
ミユノロジー・アンド・イミユノセラピー,11:7。

23.M.プフロインドシユー等，ヒト悪性脳腫瘍の細胞表
面抗原の血清学的分析，プロシーデイング・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミー・サイエンスUSA,75:5122。

24.H.B.コーカム等，ヒト神経膠腫に対する自己液性応
答および或る種の細胞表面抗原の分析：内細胞障害性お
よび免疫粘着アツセイの使用によるインビトロの研究，
ジヤーナル・オブ・ザ・ナシヨナル・キヤンサー・イン
ステイテユート,64:223。

25.N.L.レビイ,1978,原発性頭蓋内腫瘍患者におけるリ
ンパ球媒介性細胞障害の特異性，ザ・ジヤーナル・オブ
・イミユノロジー,121:903。

26.K.M.A.シヤイク等，神経膠腫患者における特異的細
胞性免疫応答，キヤサー・リサーチ,39:1733。

27.M.K.ゲイトレイ等，ヒト脳腫瘍に対する細胞性免疫
応答に関するインビトロの研究、同種の培養神経膠腫に
おける細胞媒介性細胞障害応答の誘導に際しての第三者
刺激リンパ球の必要性，ジヤーナル・オブ・ザ・ナシヨ
ナル・キヤンサー・インステイテユート,69:1245。

28.G.B.ミリス等，協同刺激物質（インターロイキン
２）の使用による同系腫瘍における細胞障害リンパ球の
産生：インビボ活性，ザ・ジヤーナル・オブ・イミユノ
ロジー,125:1904。

29.M.A.チーバー等，インビボおよびインビトロで連続
的に免疫処置し、インターロイキン２との培養により非
特異的に増殖した同系リンパ球を用いた、確定化した白
血病の特異的養子療法，ザ・ジヤーナル・オブ・イミユ
ノロジー,126:1318。

30.S.H.ヘフエナイダー等，インビボでのインターロイ
キン２の投与は、細胞障害Ｔリンパ球および内在性ナチ
ユラル・キラー細胞のいずれかの産生を増大させる，ザ
・ジヤーナル・オブ・イミユノロジー,130:222。

31.S.J.デイツク等，リンパ球様細胞−神経膠腫細胞相
互作用がヒト神経膠腫による細胞被覆物の生成を促進す
る，サイエンス,220:739。

32.T.カトー等,1982,ラツトの神経膠芽細胞から誘導さ
れた蛋白因子による、マウス神経芽腫細胞の発育の阻
害，デイベロツプメンタル・ブレイン・リサーチ,3:64
5。

33.Y.サカザキ等,1983,神経膠芽細胞の培養基から得た
神経芽腫の発育阻害因子の性格付けおよび部分的精製，
ブレイン・リサーチ,262:125。

以下の実施例により本発明を説明する。以下の略語を使
用する： IL1:インターロイキン１、IL2:インターロイキン２、NG
IF:神経膠芽細胞発育阻害因子、SN:上清、GFA:グリア原
線維酸性蛋白質、DMEM:ダルベツコの改良イーグル培
地、Con A:コンカナバリンＡ、２−ME:2−メルカプトエ
タノール、³H−Tdr:〔³H〕チミジン、PHA:フイトヘムア
グルチニン、OVA細胞：卵白アルブミン特異性Ｔ細胞ラ
イン、CTL:細胞障害Ｔリンパ球、MLC:リンパ球混合培
養、LPS:リポ多糖体、AED:N−ヨードアセチル−Ｎ−
〔５−スルホン酸−１−ナフチル〕エチレンジアミン、
CH:シクロヘキシミド、FCS:牛胎児血清、Ｇ−TsF:神経
膠芽腫由来のＴ細胞抑制因子。

実施例１デイセレンス等，アクタ・ニユーロパソロジカ53:21に
記載の方法により、４個のヒト神経膠芽腫セルラインを
確立し、単層培養中に維持する。本実施例で使用する４
個のセルラインはCl−18、Cl−229、992および308と称
し、各々72、28、８および16か月間維持した。

神経膠芽腫セルラインの特性決定により、Cl−229、308
および992由来の細胞はその表面にIa様抗原を発現し、3
08および992由来の細胞はグリア原線維酸性蛋白質（GF
A）について陽性であり、Cl−18、308および992由来の
細胞は、最近の文献（アクタ・ニユーロパソロジカ57:1
58,カレルS.等）に記載のモノクローン性抗体により同
定された神経外胚葉性抗原を発現することが示された。

SNを生産するために、この神経膠芽腫細胞を、ダルベツ
コの改良イーグル培地（DMEM）、牛胎児血清（FCS）10
％、およびＬ−グルタミン300μg/mlから成る培地に、
１×10⁴〜１×10⁶細胞／孔（2.4×1.7cm、リンブロ・サ
イエンテイフイツク）蒔いた。神経膠芽腫細胞を蒔いて
から24時間後に、培地を0.5mlの培地で替えた。１〜５
日後にSNを集め、遠心分離（2000×Ｇ、10分間）し、YM
B膜（MPS.1、アミコン）による微量分配系を用いて限外
過した。遠心分離（1500×Ｇ、15分間）後、膜上に沈
着した物質（分子量＞10000）をRPMI1640に再懸濁して
当初の容量とし、0.45μｍ過材に通した。

実施例２吸着剤の選択以下の吸着剤を試験した：バイオーゲルHTP（ヒドロキ
シリン灰石）、ブルー−アフイゲル、ヘパリン、−アフ
イゲル（バイオーラド、リツチモンド、CA）；フエニル
−セフアロース、Con A−セフアロース、蛋白Ａ−セフ
アロース（フアルマシア、ウプサラ、スウエーデン）;D
EAE・セルロース、CM−セルロース（セルバ、ハイデル
ベルク、ドイツ）。各吸着剤を表Ｉに挙げた適当な吸着
緩衝液中で平衡化し、このスラリーを5mlの使い捨てプ
ラスチツクカラム（イソラブ、アクロン、OH）に移し、
所定の容量0.2mlとした。カラムの底を閉じた後、Ｇ−T
sF標準品（活性100単位）0.5mlを加え、スラリーを、回
転するターンテーブル上で４℃で一夜懸濁状態に保持し
た。次いでカラムを排水し、流出液を脱塩し、蛋白質含
量〔ローリー等，ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー,193:265,1951〕およびニユーロ2Aアツセ
イ（下記参照）を用いたＧ−TsF活性を測定した。吸着
剤を適当な脱着緩衝液（表IV）中に再懸濁し、４℃で２
時間懸濁状態に保ち、排水して、カラム流出液中のＧ−
TsFおよび蛋白含量を上記のごとく測定した。通算回収
率は少なくとも80％であつた。

実施例３Ｇ−TsFの精製（表Ｖ参照） 308SN（150ml）を、43mmYM10膜（アミコン、ダンバー
ズ、MA）を通過させる限外過により６倍に濃縮し、次
に10mMのトリス−HCl（pH7.5）を加えることにより容量
50mlを再希釈した。この濃縮液を、４℃で、流速40ml/
時でブルー−アフイゲルのカラム（1.6×35cm、支持体
容量70ml）に適用した。カラムはトリス−HCl（pH7.5）
10mM中の2MNaClの直線勾配（280ml）を用いて溶出し
た。Con A刺激胸腺細胞により測定したＧ−TsF活性を含
む分画（70ml、1.0〜1.5MNaCl）（第９図参照）をプー
ルし、10mMリン酸ナトリウム（pH7.5）70mlで希釈し、
室温下に流速12ml/時でヒドロキシリン灰石のカラム
（バイオーゲルHTP、0.8×28cm、14ml）に適用した。こ
の後は全分画をシリコーン処理したプラスチツク管に集
めた〔マニアテイス等，分子クローニング，コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー，ニユーヨーク,4
37頁〕。カラムを、10mMリン酸ナトリウム（pH7.5）、
0.15MNaCl（始発緩衝液）および0.5Mリン酸ナトリウム
（pH7.5）（最終緩衝液）より成る直線勾配（105ml）に
て溶出した。Ｇ−TsF活性を有する（第10図参照）各分
画（7.5ml）（0.25〜0.35リン酸ナトリウム）を、４℃
において10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.15MNaCl中で平
衡化すると共にブルー・デキストラン（ｖ）、牛血清ア
ルブミン（BSA）、卵白アルブミン、およびチトクロー
ムｃ（Cyc）で標定したウルトロゲルAcA54（LKB、ブロ
ンマ、スウエーデン）のカラム（1.6×88cm、176ml）に
個別に適用した。カラムを同じ緩衝液で20ml/時で溶出
し、Ｇ−TsF活性を有する分画をプールし、−20℃で保
存した。別法としては、Ｇ−TsF活性を有するHTPカラム
からの分画を、YM10膜を通した限外過により濃縮し、
さらに調製用HPLCゲル過カラム（TSK3000SWG LKB−
ブロンマ）で精製した。蛋白濃度はアミドブラツクアツ
セイ〔シヤフナー，ヴアイスマン・アナル・バイオケ
ム,56:514,1973〕または分光光度計により測定し、塩層
濃度は電導度によつた。IL−１活性はPHA刺激胸腺細胞
を用いて測定した。

実施例４等電点分離 pH勾配の形成を妨げる塩を一部除去するために、実施例
３（表Ｖ、第４工程）の後に得たＧ−TsF試料（60ml）
を、アミコンYM10膜を通過させる限外過によつて濃縮
した。次いでこのＧ−TsFを、ウルトロデクス（H₂O 100
ml中で4gを予め膨潤させる）85ml、アムフオリンズ（pH
3.5〜５）2.5ml、およびアムフオリンズ（pH5〜８）2.5
ml（全てLKBより取得）と共に10Wおよび１′2000Vで16
時間混合した。この後、ゲルを30の切片に薄切りし、こ
れらのpHを表面ガラス電極で測定した。各分画を5mlの
使い捨てプラスチツクカラムに移し、蛋白質を10mMトリ
ス−HCl（pH7.5）2ml、0.15MNaClにより溶出し、セフア
デツクスG50カラム中で脱塩してアムフオリンズを除去
し、Con A−胸腺細胞アツセイ（以下を参照されたい）
を用いてＧ−TsF活性を測定した。ピークはp^I4.6におい
て測定された（第11図参照）。

実施例５トリプシンによる蛋白分解実施例３（表Ｖ、工程３）の後に得られたＧ−TsF（0.2
ml）の試料を、インキユベーシヨン時間の開始時または
対照として終了時のいずれかに添加するトリプシン（ワ
ージントン;L−１−トシルアミド−フエニルエチルクロ
ロメチルケトンで処理）８μｇと共に370℃で１時間イ
ンキユベートした。さらに別量の試料をセフアロース結
合トリプシン（0.2mlの安定させたゲル；ワージント
ン）または当量の、アフイゲル10（バイオ・ラド）に係
合されたRNアーゼ（リボヌクレアーゼ）Ａと共にインキ
ユベートした。上に記載した脱塩方法を用いることによ
り反応を停止し、次いでCon A−胸腺細胞アツセイによ
りＧ−TsF活性を試験した。結果を表VIに示す。125−Ｉ
でラベルした因子と共に同時インキユベーシヨンするこ
とでアフイゲル10への非特異的吸着による蛋白の損失が
示され、したがつてRNAアーゼ（リボヌクレアーゼ）カ
ラムからのＧ−TsF活性の回収が低いことが説明でき
る。

実施例６胸腺細胞の増殖試験以下の方法により、コンカナバリンＡ（Con A）に対す
る胸腺細胞増殖応答についての神経膠芽腫SNの効果を試
験した。さまざまに希釈したSN50μｌの試料をC₃H/HeJ
マウスから得た６×10⁵の胸腺細胞に加えた。胸腺細胞
は、平底微量定量プレートに入れ、Ｌ−グルタミン300
μg/ml、２−メルカプトエタノール（２−ME）１×10^-5
M、および５％FCSを添加したRPMI1640培地150μｌに懸
濁し、Con A（１μg/孔）の存在下で72時間インキユベ
ートした。採取の16時間前に³H−Tdr.（5.0Ci/mmol）を
１孔当り0.5μCi加えた。

この結果を、培地対照で処理した胸腺細胞のCon A応答
と比較した抑制％として第1AおよびＢ図に示す。

標準化の目的のために、抑制％をプロツトし、ここから
Ｇ−TsF活性の単位数への変換ができるような標準曲線
を得ることができる。

第1A図では、使用した４種の神経膠芽腫セルラインのSN
を１、３および５日後に採取し、胸腺細胞に関して1/10
の最終希釈として試験した。第1B図では、相異なる播種
密度および最終希釈率で５日間培養した後に採取した30
8細胞のSNについて試験を実施した。神経膠芽腫SNの不
在下または培地対照において、バツクグラウンドの計数
値は483±229であり、Con A応答は76.797±6.631cpmで
あつた。

SNの阻害能の大きさは、培養時間および細胞密度に依存
することがわかる。

308細胞を使用する代謝阻害に関する選択的実験におい
ては、SNの生産を、照射（2000R）した又はマイトマイ
シンＣ処理（50μg/ml、30分間、37℃）した神経膠芽腫
細胞を用いて実施した。別法としては、72時間の培養の
開始時にシクロヘキシミド（10^-5M）を神経膠芽腫細胞
に加えた。シクロヘキシミドは72時間後に集めた対照SN
にも添加した。これらのSNは、試験の前に３回限外過
してCHを除去した。

これらの実験の結果を第２図に要約するが、ここでは５
日間以上培養した10⁶の細胞のSNを使用した。CH対照と
して、CH処理した308細胞のSNおよび採取の後にCHを添
加した308SNを限外過した。

この他の対照として、神経膠芽腫細胞に関連しない４種
の確立されたヒト腫瘍セルラインについて実験を行なつ
た。これらの結果を表Ｉに要約する。

Con Aの存在下で、胸腺細胞を、1/10希釈の腫瘍細胞SN
または該腫瘍細胞SN用の対照培地と共にインキユベート
した。培地対照の存在下では、胸腺細胞のバツクグラウ
ンド計数値は432±112であり、Con A応答は55441±4817
であつた。

免疫抑制因子の放出は、培養腫瘍細胞の一般的性質では
ないらしいことが注目されるであろう。

308SN中のＬ−アルギニン含量の分析は、阻害作用が、3
08細胞によるアルギネースの放出によつて培地中でアル
ギニンが分解されるためではないことを示した。さら
に、308SN中には抗ウイルス活性は検出されなかつたこ
とから、308−媒介性阻害作用はインターフエロンの産
生によつては説明することができなかつた。

実施例７Ｂリンパ球および非リンパ球様細胞に対する
神経膠芽腫SNの効果マウスの線維芽細胞（A9、3T3、LSセルライン）を、Ｌ
−グルタミン（300μg/ml）および10％FCSを添加したDM
EM中で培養した。マウスの神経芽細胞（ニユーロ2A、NB
4、1A3セルライン）を、10％FCS、Ｌ−グルタミン（300
μg/ml）、および１％非必須アミノ酸（100x）を含むア
ールの最少必須培地に蒔いた。線維芽細胞および神経芽
細胞（10⁴細胞／孔）を、培地0.2ml中で72時間インキユ
ベートした。最後の６時間に1.2μCiの³H−Tdrをこの細
胞に適用した。その後、培地を各々の孔から吸引し、ト
リプシン−EDTAに替えてインキユベート（37℃、10分
間）した。最後に、細胞を自動ハーベスターを用いて採
取した。

表IIのデータは、胸腺細胞に対する効果と比較した場
合、308SNはＢ細胞の増殖に対して阻害がより低かつた
ことを示している。脾臓のLPS−誘発刺激の阻害％は29
％であり、一方、骨髄腫セルラインX63−Ag8についての
対応値は21％であつた。

308SNを含有する線維芽細胞培養物および培地対照を補
つた当該培養物の間のチミジン取り込みに相違は無かつ
た。この事は、試験した３個の線維芽細胞セルライン全
てについて言える。これとは対照的に、³H−Tdrの取り
込み（第３図、表II）によつて、また72時間の培養終了
時に細胞数を計測することによつて測定されたように、
神経膠芽腫SNは、２種の神経芽細胞セルラインの発育を
著しく抑制した。ニユーロ2A細胞１×10⁴/孔を24、48お
よび72時間培養した後、308SNの存在下での、４倍化培
養の細胞数×10⁴/孔は、0.98±0.17（24時間）、1.80±
0.36（48時間）、および4.3±0.44（72時間）であり、
一方、培地対照についての対応値は、各々0.88±0.05、
2.55±0.06および6.08±0.40であつた。

第３図においては、５日間培養した10⁶の神経膠芽腫細
胞（308）のSNを、培養対照と共に使用した。

実施例８神経膠芽腫SNにより誘発される、Ｔ細胞活性
化阻害の機序 PHA（0.5μg/孔）および種々の希釈割合（1/10〜1/16
0）のIL1またはIL2の存在下で、胸腺細胞を308SN（最終
希釈率1/10）で処理した。インターロイキン不在下で
は、バツクグラウンド計数値は209±84、そしてPHA応答
は3074±425であつた。

結果を表IIIに要約する。

これらの結果は、胸腺細胞のCon A応答の阻害が、明ら
かにＴ細胞活性化経路の終わり頃の段階への影響に起因
することを示している。何故なら、308SNは、IL1または
IL2の存在下でPHAにより刺激された胸腺細胞の増殖応答
を阻害したからである。

308SNで誘発される増殖の抑制の程度は、使用したIL1ま
たはIL2の種々の濃度において類似していた。

実施例９クローンしたＴ細胞ラインに対するSN−308
の効果Ｈ−2bで制限されるハプテン（Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ
−（５−スルホン酸−１−ナフチル）エチレンジアミン
〔AEDE〕）−特異性のクローンした細胞障害Ｔ細胞（CT
L）（10）の増殖を、10％FCS、１×10⁵Mの２−ME、抗生
物質および10％（v/v）の24時間脾臓細胞のCon ASN（IL
2SN）を添加したイスコーブの改良DMEMから成る培地中
で評価した。

CTL（10⁴/孔）は、単独または刺激物質としての照射（2
000ラド）したハプテン処理した脾臓細胞（Ｈ−2b）10⁶
と共に培養した。

308神経膠芽腫細胞のSNまたは対照培地の種々の希釈液
を、培地で72時間培養したCTLおよび刺激物質の混合物
に添加した。採取の16時間前に、各々の孔に1.2μCiの³
H−Tdrを適用した。

結果を第４図に示す。ハプテン特異性のクローン化CTL
は、単独（Ｒ）で、または刺激物質としての照射は（20
00ラド）AED−ハプテン処理脾臓細胞10⁶（Ｓ）と共に
（黒い帯）培養した（10⁴細胞）。種々の希釈率（1/8〜
1/128）の308神経膠芽腫SNまたは1/8希釈の対照培地をCTLの混合物に加え、72時間培養した。データは³H−T
drの組み込みの１分間当たりの放射能計数値として与え
られる。第４図は、Ｈ−２制限されたハプテン特異的Ｔ
細胞ラインの細胞が、IL2および刺激物質としてのハプ
テン処理した照射脾臓細胞の存在下で増殖したことを示
している。この増殖は、神経膠芽腫により生成される因
子を加えることにより、完全に遮断された。

上に概説した実験から、神経膠芽腫細胞由来の因子によ
るＴ細胞発育の阻害は、Ｔ細胞増殖へとつながるIL2始
動反応を直接妨害することに起因すると言える。この可
能性は、308SNが、IL2とは独立して発育する胸腺腫セル
ラインの発育に影響を及ぼさないという発見（表II）に
より、さらに支持される。

実施例10 神経膠芽腫細胞による、インビボでの同様な阻害因子の
放出が、308細胞の起源となつた患者の限外過したの
う胞液を試験することにより、立証された。YMB膜上で
限外過したのう胞液（最終希釈率1/20）はIL2で誘発
されるOVAのＴ細胞の増殖を28％阻止したが、一方12の
対照血清は効果が無かつた。

実施例11 細胞障害Ｔ細胞の誘導に対する神経膠芽腫SN
の効果 10％FCS、１×10^-5Mの２−ME、および抗生物質を含有す
るイスコーブの改良DMEM（リンパ球混合培養（MLC）培
地）6ml中で、刺激物質用の照射（2000ラド）C57B1/6
（Ｈ−2b）脾臓細胞30×10⁶によりB10.D2（Ｈ−2d）脾
臓細胞12×10⁶を刺激することにより、抗Ｈ−2b特異的C
TLを誘導した。６日後に、このCTLの特異的細胞障害活
性を、11に記載のごとき異なる標的比率で⁵¹Crラベルし
た標的細胞（EL−４（Ｈ−2b）、P815（Ｈ−2d）、Yac
−１（Ｈ−2d））10⁴を含有する培地0.2ml中における３
時間の⁵¹Cr放出アツセイによつて試験した。MLC培地で
６日間にわたり培養した細胞の細胞障害効果を、培地対
照または308SNを添加したMLC培地で培養した細胞の効果
と比較した。

結果を第5A〜Ｄ図に要約する。第５図の説明。MLC培地
中で６日間にわたり培養した細胞の細胞障害効果を、ａ）培地対照（最終希釈率1/10）、ｂ）1/10（Ａ〜Ｄ）、1/100または1/1000（Ａ）に希
釈した308SN またはｃ）OVAT細胞のIL2依存性増殖を阻害するまたはこれに影響しないことがわかつている、セフアクリルＳ−200カラム分画
を添加したMLC培地で培養した細胞の効果と比較した。
アツセイすべき分画をYMB膜上で10倍に濃縮し、この濃
縮した分画を、最終希釈率が1/10となるようにMLC培地
に加えた。経過は、特異的⁵¹Cr放出の％として表わす
（文献11を参照されたい）。試験時間は３時間、３個の
試料の平均値をとつた。

この結果は、308SNがCTLの産生の阻害を誘起したことを
示している。この阻害効果は見掛けの分子量97,000を有
する因子を介するものである。

（セフアクリルＳ−200カラム分画の調製および試験方
法を下に述べる。）第６図に示すように、308SN因子と共にIL2を添加して
も、CTLの産生は復帰しなかつた。成熟CTLを308SNと共
に２時間予備インキユベーシヨンした場合、標的に対す
るCTLの機能への影響は無かつた。

第6A図では、６日間の全培養期間中、308SN（1/10希
釈）または培地対照で処理したMLC中に、IL2（最終濃度はCon ASNの10％）
を存在させた。６日後にCTL活性をEL−４細胞について
試験した。Ｂにおいては、EL−４細胞について試験する
前に、培地中で６日間にわたり産生されたCTLを、培地
対照または308SN（1/4希釈）の中で２時間予備インキユ
ベートした。

実施例12 神経膠芽腫SNの生化学的特徴付け。

血清を含まない条件下で96時間培養した308細胞から得
た308神経膠芽腫SNを、YM−10（アミコン）膜上で限外
過することにより30倍に濃縮し、濃縮したSN1.5ml
を、記載（９）された方法で４℃でセフアクリルＳ−20
0（カラムの大きさは2.5×85cm）に適用した。2.5mlず
つ採取した溶出液を280nmにおける吸収でモニターし、
上記のごとく線維芽細胞（L929）および神経芽細胞（ニ
ユーロ2A）について試験した。さらに、分画は、IL2存
在下のOVA細胞およびPHAで刺激した胸腺細胞について試
験した。このカラムは平行処理により、γ−グロブリン
（γ−Glob、分子量150,000）、牛血清アルブミン（BS
A、分子量67,000）、卵白アルブミン（OVA、分子量45,0
00）、α−キモトリプシノーゲン（CHY、分子量25,00
0）、およびチトクロームＣ（CYT Ｃ、分子量12,400）
を用いて標定した。

これらの結果を第７図に示すが、ここで上方の図表は検
定結果を示している。結果はカラム分画で処理した細胞
の増殖を、培地対照で処理した細胞と比較した刺激指標
（SI）として示す。セフアクリルＳ−200カラムで分画
した血清不含対照培地の結果は、IL2で処理したOVA細胞
について示してある神経芽細胞およびOVA細胞についての阻害活性のピーク
は、見掛けの分子量97000という同じ位置にカラムから
溶出した（第７図）。DMEMより成る培地対照（第７図）
および10％FCSを添加した培地対照（データは示してい
ない）のセフアクリルＳ−200分画は、IL2で刺激したOV
A細胞の発育に対する阻害効果がなかつた。さらに、308
SN分画を線維芽細胞について試験した場合、阻害効果は
観察されなかつた。事実、神経芽細胞またはIL2処理し
たOVA細胞ではなく、線維芽細胞の発育が、見掛けの分
子量22000近辺を示す分画によつて増大した。これらの
分画は、さらにマウスの胸腺細胞のPHA応答を刺激（第
７図）するが、IL2の不在下で培養したOVA細胞の発育に
は影響を及ぼさないものであると同定された。OVA細胞
による³H−Tdrの組み込みは284±72であり、IL2（最終
希釈率1/10）の存在下では62038±2981であつた。カラ
ムから溶出する分子量150000および10000の間の308分画
でOVA細胞を処理した場合には、OVA細胞の増殖は観察さ
れず、cpm値は決して500を超えなかつた。この事は、胸
腺細胞のPHA応答を増大させることが見出された分画を
も含めて308分画中にIL2が存在しないことを示してい
る。

実施例13 308SNのクロマトグラフイー分画を合したものを、最適
用量より低い用量のCon Aで処理した脾臓細胞によるIL2
の放出の促進能についてアツセイし、結果を第８図に要
約した。

第8A図では、分画を、胸腺細胞のPHA応答を増大させる
能力についてアツセイした。データは、カラム分画で処
理した胸腺細胞のPHA応答を非処理胸腺細胞と比較した
刺激指数（SI）として示してある。EFは溶出容量（ml）
である。Ｂにおいては、プールした分画（貯留分画Ｉ〜
Ｖ）をYMB膜上で10倍に濃縮し、脾臓細胞（５×10⁶/m
l）によるIL2の放出を促進する能力について試験した。
44時間後に脾臓細胞SNを採取し、IL2活性をOVA細胞につ
いてアツセイした。被験試料の活性は、文献13に記載の
ように単位に変換した。

308SNの貯留分画が存在しない場合、Con A（0.5μg/m
l）で処理した脾臓細胞により放出されるIL2の量は21U/
mlであり、最適用量のCon A（５μg/ml）で処理する
と、測定されたIL2含量は97U/mlであつた。

Con A単独と比較すると、プールＩ〜IIIはIL2の放出の
刺激も阻害も行なわなかつた（第８図）。しかしながら
分画プールIVおよびＶによつては、放出されたIL2の量
の増加は各々3.5倍および1.6倍であつた（第８図）。し
たがつて、脾臓細胞によるIL2の放出促進能力は、胸腺
細胞のPHA応答を増大させる分画に付随していると思わ
れる。

神経芽細胞の発育阻害に加えて、308分画は、ニユーロ2
A細胞の神経突起の生成を誘起することが見出された。
分画93（神経芽細胞の発育に関する最高阻害分画）で処
理したニユーロ2A細胞の66％が細胞突起を示し、一方、
対照分画（分画112）または対照培地で処理した培養に
おける対応値は、各々21および22％であつた。

これまでの実施例で証明されるように、本発明に係る免
疫抑制因子は、生体の免疫応答の抑制が望まれる疾病お
よび状態の処置における使用が適応となる。したがつ
て、拒絶を防止するための移植手術に関連した使用が適
応となる。生体の免疫系統の抑制が望まれる疾病の例に
は、いわゆる自己免疫疾患が包含される。

こうした使用のためには、患者当り約10〜2000μｇ、例
えば200〜1000μｇの日用量が典型的に適用される。

本発明に係る因子は、適当な神経膠芽腫セルラインから
得た精製上清としての混合形態で、または前記のような
分画化および精製した形態で使用することができる。

この因子は、この種の物質に常套の方法で、処置される
状態に合致した適切な投与形態に作り上げることができ
る。例えばこの因子は、適当な製薬用担体に担持させて
清脈内注射することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（イ）インターロイキン２（IL−２）依存
性Ｔ細胞機序を阻害し、（ロ）IL−２の存在下でコンカナバリンＡ（Con A）ま
たはフイトヘマグルチニン（PHA）により刺激されたマ
ウスの胸腺細胞への³H−デオキシチミジン（Tdr）のと
り込みを阻害する、ヒト神経膠芽腫細胞から誘導される
免疫抑制因子。
【請求項２】神経芽細胞の発育を阻害するが、線維芽細
胞の発育を阻害しない請求の範囲第１項記載の免疫抑制
因子。
【請求項３】（ａ）リンパ球混合培養（MLC）における
アロ反応性細胞障害Ｔ細胞の誘導に対して阻害効果を有
し、（ｂ）刺激細胞の存在下でＨ−２制限性ハプテン特異性
細胞障害Ｔ細胞の増殖を阻害する、請求の範囲第１または２項記載の免疫抑制因子。
【請求項４】コンカナバリンＡ（Con A）に対するＴ細
胞の増殖的応答を阻害する、請求の範囲第１−３項の何
れか１項記載の免疫抑制因子。
【請求項５】トリプシンによる蛋白分解に対し感受性で
ある、請求の範囲第１−４項の何れか１項記載の免疫抑
制因子。
【請求項６】限外濾過によりヒト神経膠芽腫セルライン
の上清を濃縮し、これをブルーアフイゲル、ヒドロキシ
リン灰石による連続的クロマトグラフィーおよびゲル濾
過に付すことからなる、（イ）インターロイキン２（IL−２）依存性Ｔ細胞機序
を阻害し、（ロ）IL−２の存在下でコンカナバリンＡ（Con A）ま
たはフイトヘマグルチニン（PHA）により刺激されたマ
ウスの胸腺細胞への³H−デオキシチミジン（Tdr）のと
り込みを阻害する、ヒト神経膠芽腫細胞から誘導される
免疫抑制因子を製造する方法。