JPH06800B2 - ヒトインターフェロン―βの精製方法 - Google Patents
ヒトインターフェロン―βの精製方法Info
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- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
- B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトインターフェロン−βの精製方法に係
り、特に特定吸着担体を用いてヒトインターフェロン−
βを精製する方法に関するものである。
り、特に特定吸着担体を用いてヒトインターフェロン−
βを精製する方法に関するものである。
（従来の技術） インターフェロンは長野ら（Compt.Rend.Soc.Biol.,148
巻，1700頁、1954年）およびIsaacsら（Proc.Roy.Soc.S
er.B,147巻，258頁，1957年）によって発見された抗ウ
ィルス物質であり、近年、抗腫瘍効果を含む多岐にわた
る生物学的作用を有することが報告され（Gressor,I.
ら，B.B.A.,516巻，231頁，1978年）、医薬としての可
能性が注目を集めている。
巻，1700頁、1954年）およびIsaacsら（Proc.Roy.Soc.S
er.B,147巻，258頁，1957年）によって発見された抗ウ
ィルス物質であり、近年、抗腫瘍効果を含む多岐にわた
る生物学的作用を有することが報告され（Gressor,I.
ら，B.B.A.,516巻，231頁，1978年）、医薬としての可
能性が注目を集めている。
インターフェロンの製造は一般に細胞培養あるいは遺伝
子組み換え法によって行なわれているが、通常、生産さ
れるインターフェロンの含有量は極めて少なく、そのた
め医薬として使用しうるインターフェロンを得るには、
粗インターフェロン液を出発材料として、高度に純化さ
れたインターフェロンを得ることのできる精製方法を確
立する必要がある。
子組み換え法によって行なわれているが、通常、生産さ
れるインターフェロンの含有量は極めて少なく、そのた
め医薬として使用しうるインターフェロンを得るには、
粗インターフェロン液を出発材料として、高度に純化さ
れたインターフェロンを得ることのできる精製方法を確
立する必要がある。
ところで、これまでに各種のヒトインターフェロンの精
製方法が報告されており、例えばインターフェロン−α
については、亜鉛キレートカラムクロマトグラフィー法
（Rubinstein,M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76
巻，640頁，1979年）や、ブルーセファロースカラムク
ロマトグラフィー法（Zoon,K.C.らProc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,76巻，5601頁，1979年）を使用した精製方法等
が報告されている。またヒトインターフェロン−βに関
しては、硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法お
よびＣＭセファデックスカラムクロマトグラフィー法を
使用した方法（Knight,E.Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,73巻，520頁，1976年）やＳＰセファデックスカラム
クロマトグラフィー法および亜鉛キレートカラムクロマ
トグラフィー法を使用した方法（細井和男ら、特開昭55
-64799号，1980年）等が報告されている。さらにインタ
ーフェロン−γの精製方法としては、多孔質ガラスクロ
マトグラフィー法、コンカナバリンＡアガロースカラム
クロマトグラフィー法あるいはそれらの方法を組み合わ
せた方法（Yip,Y.K.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78
巻，1601頁，1981年）等が報告されている。
製方法が報告されており、例えばインターフェロン−α
については、亜鉛キレートカラムクロマトグラフィー法
（Rubinstein,M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76
巻，640頁，1979年）や、ブルーセファロースカラムク
ロマトグラフィー法（Zoon,K.C.らProc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,76巻，5601頁，1979年）を使用した精製方法等
が報告されている。またヒトインターフェロン−βに関
しては、硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法お
よびＣＭセファデックスカラムクロマトグラフィー法を
使用した方法（Knight,E.Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,73巻，520頁，1976年）やＳＰセファデックスカラム
クロマトグラフィー法および亜鉛キレートカラムクロマ
トグラフィー法を使用した方法（細井和男ら、特開昭55
-64799号，1980年）等が報告されている。さらにインタ
ーフェロン−γの精製方法としては、多孔質ガラスクロ
マトグラフィー法、コンカナバリンＡアガロースカラム
クロマトグラフィー法あるいはそれらの方法を組み合わ
せた方法（Yip,Y.K.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78
巻，1601頁，1981年）等が報告されている。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、これらの従来報告されている各種の精製
方法は、それぞれ単独では精製度を十分上昇させること
ができず、したがって医薬として使用し得る純度のイン
ターフェロンを得るには種々の精製方法を複数個組み合
わせて使用せざるを得ず、そのため、最終的に得られた
インターフェロンは、高純度にまで精製された場合で
も、その収率は極めて小さくなることが避けられなかっ
たのである。
方法は、それぞれ単独では精製度を十分上昇させること
ができず、したがって医薬として使用し得る純度のイン
ターフェロンを得るには種々の精製方法を複数個組み合
わせて使用せざるを得ず、そのため、最終的に得られた
インターフェロンは、高純度にまで精製された場合で
も、その収率は極めて小さくなることが避けられなかっ
たのである。
本発明者らは、高純度のヒトインターフェロン−βを収
率良く得る方法について研究を重ねた結果、特定の吸着
担体を用いてその精製を行なえば１回の精製操作のみで
高純度のヒトインターフェロン−βが高収率で得られる
ことを見出して本発明を完成したのである。
率良く得る方法について研究を重ねた結果、特定の吸着
担体を用いてその精製を行なえば１回の精製操作のみで
高純度のヒトインターフェロン−βが高収率で得られる
ことを見出して本発明を完成したのである。
（問題点を解決するための手段） すなわち本発明は、粗ヒトインターフェロン液を吸着担
体に接触させ、該吸着担体にヒトインターフェロン−β
を吸着させ、次いで溶出液でヒトインターフェロン−β
を溶出することからなるヒトインターフェロン−βの精
製法において、 吸着担体として、有機高分子量物質からなる水不溶性の
担体に、リガンドとして芳香環を有するアミノ酸および
／または芳香環を有するアミノ酸誘導体の多量体を有
し、かつ、該担体に結合しているスペーサー分子に結合
し得るアミノ基またはカルボキシル基を有する化合物を
結合させた吸着担体を使用する、ヒトインターフェロン
−βの精製方法に関するものである。
体に接触させ、該吸着担体にヒトインターフェロン−β
を吸着させ、次いで溶出液でヒトインターフェロン−β
を溶出することからなるヒトインターフェロン−βの精
製法において、 吸着担体として、有機高分子量物質からなる水不溶性の
担体に、リガンドとして芳香環を有するアミノ酸および
／または芳香環を有するアミノ酸誘導体の多量体を有
し、かつ、該担体に結合しているスペーサー分子に結合
し得るアミノ基またはカルボキシル基を有する化合物を
結合させた吸着担体を使用する、ヒトインターフェロン
−βの精製方法に関するものである。
この場合の本発明の実施は、一般に次の様にして行なわ
れる。すなわち、ヒトインターフェロン−βを含有する
粗ヒトインターフェロン液を、それ自体公知のカラム法
あるいはバッチ法にて吸着担体に接触させてヒトインタ
ーフェロン−βを吸着担体に吸着させた後、適切な緩衝
液にて吸着担体を洗浄し、次いで適切な溶出液にてヒト
インターフェロン−βを溶出させることにより、ヒトイ
ンターフェロン−βを精製するのである。
れる。すなわち、ヒトインターフェロン−βを含有する
粗ヒトインターフェロン液を、それ自体公知のカラム法
あるいはバッチ法にて吸着担体に接触させてヒトインタ
ーフェロン−βを吸着担体に吸着させた後、適切な緩衝
液にて吸着担体を洗浄し、次いで適切な溶出液にてヒト
インターフェロン−βを溶出させることにより、ヒトイ
ンターフェロン−βを精製するのである。
したがって本発明は特にヒトインターフェロン−βの吸
着−溶出において、特定の吸着担体を使用する点に特徴
を有するものである。
着−溶出において、特定の吸着担体を使用する点に特徴
を有するものである。
（作用） 本発明において使用する吸着担体は、前述の如く、有機
高分子量物質からなる水不溶性の担体部分、スペーサー
部分、およびリガンド部分より構成される吸着担体であ
る。
高分子量物質からなる水不溶性の担体部分、スペーサー
部分、およびリガンド部分より構成される吸着担体であ
る。
この場合、吸着担体を構成する水不溶性の担体部分とし
ては、アガロース、セルロース、デキストランまたはポ
リアクリルアミド等の有機高分子量化合物が挙げられ、
そのいずれも使用可能であるが、特にアガロースを担体
部分として使用するのが好ましい。
ては、アガロース、セルロース、デキストランまたはポ
リアクリルアミド等の有機高分子量化合物が挙げられ、
そのいずれも使用可能であるが、特にアガロースを担体
部分として使用するのが好ましい。
一方、本発明で使用するリガンドは、芳香環を有するア
ミノ酸および／または芳香環を有するアミノ酸誘導体の
多量体を有し、かつ、保有するアミノ基あるいはカルボ
キシル基を介して水不溶性の担体に結合しているスペー
サー分子と結合可能な化合物である。
ミノ酸および／または芳香環を有するアミノ酸誘導体の
多量体を有し、かつ、保有するアミノ基あるいはカルボ
キシル基を介して水不溶性の担体に結合しているスペー
サー分子と結合可能な化合物である。
芳香環を有するアミノ酸としては、αアミノ酸に限ら
ず、それ以外のアミノ酸、例えば、βアミノ酸、γアミ
ノ酸、δアミノ酸などを使用することが可能であるが、
一般にαアミノ酸が入手しやすく、好ましい。芳香環を
有するαアミノ酸の中では、とりわけＬ−トリプトファ
ン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシ
ン、Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニルアラニン
が好ましい。これらのアミノ酸は、同一のアミノ酸のみ
から構成された多量体、または、少なくとも二種類以上
のアミノ酸より構成された多量体として使用することが
できる。多量体としては二量体または三量体が好まし
い。
ず、それ以外のアミノ酸、例えば、βアミノ酸、γアミ
ノ酸、δアミノ酸などを使用することが可能であるが、
一般にαアミノ酸が入手しやすく、好ましい。芳香環を
有するαアミノ酸の中では、とりわけＬ−トリプトファ
ン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシ
ン、Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニルアラニン
が好ましい。これらのアミノ酸は、同一のアミノ酸のみ
から構成された多量体、または、少なくとも二種類以上
のアミノ酸より構成された多量体として使用することが
できる。多量体としては二量体または三量体が好まし
い。
これらのアミノ酸の多量体において、含有する遊離のカ
ルボキシル基がアルキルエステル化、好ましくはメチル
エステル化、エチルエステル化またはプロピルエステル
化された該アミノ酸の多量体の誘導体をリガンドとして
使用することも可能である。
ルボキシル基がアルキルエステル化、好ましくはメチル
エステル化、エチルエステル化またはプロピルエステル
化された該アミノ酸の多量体の誘導体をリガンドとして
使用することも可能である。
リガンドとして使用する各化合物は、例えば和光純薬株
式会社、国産化学株式会社または半井化学薬品株式会社
から購入することが可能である。多量体は国産化学株式
会社から購入するか、またはカルボジイミドを使用した
縮合反応によって合成することも可能である。カルボジ
イミドとしてはＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（日本パイ
オラッドラボラトリーズ）などを使用することができ
る。
式会社、国産化学株式会社または半井化学薬品株式会社
から購入することが可能である。多量体は国産化学株式
会社から購入するか、またはカルボジイミドを使用した
縮合反応によって合成することも可能である。カルボジ
イミドとしてはＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（日本パイ
オラッドラボラトリーズ）などを使用することができ
る。
リガンドとして使用可能な化合物は、上記に示した化合
物にのみ限定されるものではなく、芳香環を有するアミ
ノ酸および芳香環を有するアミノ酸誘導体の多量体をそ
の化合物分子の構成成分として含み、かつ、その化合物
分子内のアミノ基またはカルボキシル基を介して水不溶
性担体にスペーサー分子を介して結合可能な化合物であ
れば本質的に使用することが可能である。
物にのみ限定されるものではなく、芳香環を有するアミ
ノ酸および芳香環を有するアミノ酸誘導体の多量体をそ
の化合物分子の構成成分として含み、かつ、その化合物
分子内のアミノ基またはカルボキシル基を介して水不溶
性担体にスペーサー分子を介して結合可能な化合物であ
れば本質的に使用することが可能である。
本発明において使用する吸着担体は、特に水不溶性の担
体部分にスペーサーを介してリガンドが結合したもので
ある。
体部分にスペーサーを介してリガンドが結合したもので
ある。
スペーサーを介してリガンドを水不溶性担体に結合させ
る方法としては、リガンドの有するアミノ基またはカル
ボキシル基と、スペーサー分子のアミノ官能基またはカ
ルボキシル官能基との間に縮合反応を生ぜしめることに
よって導入する手段が採用される。
る方法としては、リガンドの有するアミノ基またはカル
ボキシル基と、スペーサー分子のアミノ官能基またはカ
ルボキシル官能基との間に縮合反応を生ぜしめることに
よって導入する手段が採用される。
このスペーサー分子を介してリガンドを導入する場合の
スペーサーの長さとしては、炭素、窒素、酸素または硫
黄原紙より構成される直鎖部分の原子の数の総和が２な
いし15であることが好ましく、５ないし15の長さのスペ
ーサーが特に好ましい。
スペーサーの長さとしては、炭素、窒素、酸素または硫
黄原紙より構成される直鎖部分の原子の数の総和が２な
いし15であることが好ましく、５ないし15の長さのスペ
ーサーが特に好ましい。
なお、水不溶性担体への各種のスペーサー分子の導入
は、化学合成によって行なうことが可能であるが、一般
には以下のようなすでにスペーサーを有する水不溶性担
体の市販品を使用することも可能である。例えば、アガ
ロースのＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル
誘導体であるアフィ・ゲル10 アフィ・ゲル15 （いずれも日本バイオラッドラボラトリーズ）や活性化
ＣＨ−セファロース４Ｂ （ファルマシア・ジャパン株式会社）、また末端に遊離
のカルボキシル基あるいはアミノ基を有するアフィ・ゲ
ル202 アフィ・ゲル102 （いずれも日本バイオラッドラボラトリーズ）、ＡＨ−
セファロース４Ｂ ＣＨ−セファロース４Ｂ （いずれもファルマシア・ジャパン株式会社）などを使
用することが可能である。
は、化学合成によって行なうことが可能であるが、一般
には以下のようなすでにスペーサーを有する水不溶性担
体の市販品を使用することも可能である。例えば、アガ
ロースのＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性化エステル
誘導体であるアフィ・ゲル10 アフィ・ゲル15 （いずれも日本バイオラッドラボラトリーズ）や活性化
ＣＨ−セファロース４Ｂ （ファルマシア・ジャパン株式会社）、また末端に遊離
のカルボキシル基あるいはアミノ基を有するアフィ・ゲ
ル202 アフィ・ゲル102 （いずれも日本バイオラッドラボラトリーズ）、ＡＨ−
セファロース４Ｂ ＣＨ−セファロース４Ｂ （いずれもファルマシア・ジャパン株式会社）などを使
用することが可能である。
スペーサー分子を結合した水不溶性担体へのリガンドの
導入量は、例えばカルボジイミドを用いた縮合反応によ
り、リガンドを導入する場合には水不溶性およびスペー
サーの種類によっても異なるが、一般に水不溶性担体１
ml当り５ないし20μmoleが好ましい。Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミド活性化エステル誘導体にリガンドを導入す
る場合には水不溶性担体１ml当り５ないし15μmoleが好
ましい。スペーサー分子を介して水不溶性担体へリガン
ドを導入する具体的方法としては、通常以下のようにし
て行なわれる。例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド活
性化エステル誘導体にリガンドを導入する場合には、該
担体とリガンドを、pH５ないし10の条件下にて室温で１
ないし４時間、あるいは４℃にて一晩反応させることに
より実施する。
導入量は、例えばカルボジイミドを用いた縮合反応によ
り、リガンドを導入する場合には水不溶性およびスペー
サーの種類によっても異なるが、一般に水不溶性担体１
ml当り５ないし20μmoleが好ましい。Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミド活性化エステル誘導体にリガンドを導入す
る場合には水不溶性担体１ml当り５ないし15μmoleが好
ましい。スペーサー分子を介して水不溶性担体へリガン
ドを導入する具体的方法としては、通常以下のようにし
て行なわれる。例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド活
性化エステル誘導体にリガンドを導入する場合には、該
担体とリガンドを、pH５ないし10の条件下にて室温で１
ないし４時間、あるいは４℃にて一晩反応させることに
より実施する。
以上にように、本発明のヒトインターフェロン−βの精
製方法は、吸着担体として有機高分子量物質からなる水
不溶性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用して
行なうのであるが、特にスペーサー分子を介して水不溶
性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用するのが
好ましい。
製方法は、吸着担体として有機高分子量物質からなる水
不溶性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用して
行なうのであるが、特にスペーサー分子を介して水不溶
性担体にリガンドを結合させた吸着担体を使用するのが
好ましい。
（実施例） 本発明のヒトインターフェロン−βの精製方法は、上記
の如く作製された吸着担体に粗ヒトインターフェロン液
を接触させ、該吸着担体にヒトインターフェロン−βを
吸着させ、次いで溶出液にて吸着したヒトインターフェ
ロン−βを溶出させることからなる方法であるが、具体
的な各段階は例えば以下のようにして実施される。
の如く作製された吸着担体に粗ヒトインターフェロン液
を接触させ、該吸着担体にヒトインターフェロン−βを
吸着させ、次いで溶出液にて吸着したヒトインターフェ
ロン−βを溶出させることからなる方法であるが、具体
的な各段階は例えば以下のようにして実施される。
すなわち、吸着担体とヒトインターフェロン−βを含有
する溶液（粗ヒトインターフェロン液）を接触させる場
合にあっては、その接触させる際のpHは４ないし９が好
ましく、例えばpH７の0.01Ｍリン酸緩衝液を溶媒として
使用することが可能である。また、吸着担体と接触する
際のヒトインターフェロン−β含有液のイオン強度は特
に限定する必要はなく、例えば塩化ナトリウムにてイオ
ン強度を調整する場合には、その終濃度が0.14Ｍであっ
てもヒトインターフェロン−βは吸着担体に吸着可能で
ある。また、イオン強度を更に上昇させた場合、例え
ば、塩化ナトリウムを終濃度３Ｍに添加した場合でもヒ
トインターフェロン−βは吸着担体に十分吸着可能であ
る。吸着担体とヒトインターフェロン−β含有液との接
触は、バッチ法で行なってもカラム法で行なっても可能
であるが、カラム法で行なうのが精製効率が高く好まし
い。ヒトインターフェロン−βを吸着した吸着担体は、
非吸着の混在蛋白質などを除去する目的で、ヒトインタ
ーフェロン−βを溶出する操作の前に、十分量の緩衝
液、例えば0.14Ｍの塩化ナトリウムを含有するpH７の0.
01Ｍリン酸緩衝液にて洗浄することが好ましい。
する溶液（粗ヒトインターフェロン液）を接触させる場
合にあっては、その接触させる際のpHは４ないし９が好
ましく、例えばpH７の0.01Ｍリン酸緩衝液を溶媒として
使用することが可能である。また、吸着担体と接触する
際のヒトインターフェロン−β含有液のイオン強度は特
に限定する必要はなく、例えば塩化ナトリウムにてイオ
ン強度を調整する場合には、その終濃度が0.14Ｍであっ
てもヒトインターフェロン−βは吸着担体に吸着可能で
ある。また、イオン強度を更に上昇させた場合、例え
ば、塩化ナトリウムを終濃度３Ｍに添加した場合でもヒ
トインターフェロン−βは吸着担体に十分吸着可能であ
る。吸着担体とヒトインターフェロン−β含有液との接
触は、バッチ法で行なってもカラム法で行なっても可能
であるが、カラム法で行なうのが精製効率が高く好まし
い。ヒトインターフェロン−βを吸着した吸着担体は、
非吸着の混在蛋白質などを除去する目的で、ヒトインタ
ーフェロン−βを溶出する操作の前に、十分量の緩衝
液、例えば0.14Ｍの塩化ナトリウムを含有するpH７の0.
01Ｍリン酸緩衝液にて洗浄することが好ましい。
次いでヒトインターフェロン−βを吸着した吸着担体か
らヒトインターフェロン−βを溶出させる方法として
は、エチレングリコールあるいはプロピレングリコール
などの液状多価アルコールを30ないし80％（ｗ／ｖ）に
含有するpH４ないし８の緩衝液を使用して実施すること
ができる。
らヒトインターフェロン−βを溶出させる方法として
は、エチレングリコールあるいはプロピレングリコール
などの液状多価アルコールを30ないし80％（ｗ／ｖ）に
含有するpH４ないし８の緩衝液を使用して実施すること
ができる。
以上のようにして高度に純化されたヒトインターフェロ
ン−βが得られるが、本発明の上記方法にて精製し得る
ヒトインターフェロン−βは、細胞培養法によって製造
したヒトインターフェロン−βだけでなく、遺伝子組み
換えの手法を使用して生産したヒトインターフェロン−
β、例えば大腸菌、酵母あるいは哺乳類動物細胞にヒト
インターフェロン−β遺伝子を組み込んで生産したヒト
インターフェロン−βを精製することも可能である。
ン−βが得られるが、本発明の上記方法にて精製し得る
ヒトインターフェロン−βは、細胞培養法によって製造
したヒトインターフェロン−βだけでなく、遺伝子組み
換えの手法を使用して生産したヒトインターフェロン−
β、例えば大腸菌、酵母あるいは哺乳類動物細胞にヒト
インターフェロン−β遺伝子を組み込んで生産したヒト
インターフェロン−βを精製することも可能である。
本発明の精製方法で使用する吸着担体は、大腸菌が生産
した糖を含有しないヒトインターフェロン−βを吸着す
ることが可能なことから、ヒトインターフェロン−β分
子中の吸着担体との結合部位は、糖部分ではなくペプチ
ド部分であると推測される。したがって、本発明の吸着
担体は、天然のヒトインターフェロン−βの精製ばかり
でなく、アミノ酸配列が僅かに変化したヒトインターフ
ェロン−βあるいは糖部分が変化したヒトインターフェ
ロン−βの精製にも使用し得るものと期待される。
した糖を含有しないヒトインターフェロン−βを吸着す
ることが可能なことから、ヒトインターフェロン−β分
子中の吸着担体との結合部位は、糖部分ではなくペプチ
ド部分であると推測される。したがって、本発明の吸着
担体は、天然のヒトインターフェロン−βの精製ばかり
でなく、アミノ酸配列が僅かに変化したヒトインターフ
ェロン−βあるいは糖部分が変化したヒトインターフェ
ロン−βの精製にも使用し得るものと期待される。
このように本発明で使用する吸着担体は、粗ヒトインタ
ーフェロン液の精製だけでなく、他の公知の精製手段に
よって部分的に精製されたヒトインターフェロン−βの
精製度を、更に上昇させる目的にも使用することが可能
である。また本発明で使用する各種の吸着担体を組み合
せて使用することにより、ヒトインターフェロン−β以
外の混在蛋白質を完全に除去することも可能である。
ーフェロン液の精製だけでなく、他の公知の精製手段に
よって部分的に精製されたヒトインターフェロン−βの
精製度を、更に上昇させる目的にも使用することが可能
である。また本発明で使用する各種の吸着担体を組み合
せて使用することにより、ヒトインターフェロン−β以
外の混在蛋白質を完全に除去することも可能である。
以下に本発明を実験例および実施例により更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実験例および実施例に限
定されるものではない。なお、実施例および実施例中に
示したヒトインターフェロンの力価は、ＦＬ細胞および
シンドビスウィルスを使用したＣＰＥ（Cytopathic Eff
ect）法にて測定した。ヒトインターフェロン−αの力
価はヒトインターフェロン−αの国際標準品（ＧＯ２３
−９０１−５２７）を基準として表示し、ヒトインター
フェロン−βの力価はヒトインターフェロン−βの国際
標準品（ＧＯ２３−９０２−５２７）を基準として表示
した。
説明するが、本発明はこれらの実験例および実施例に限
定されるものではない。なお、実施例および実施例中に
示したヒトインターフェロンの力価は、ＦＬ細胞および
シンドビスウィルスを使用したＣＰＥ（Cytopathic Eff
ect）法にて測定した。ヒトインターフェロン−αの力
価はヒトインターフェロン−αの国際標準品（ＧＯ２３
−９０１−５２７）を基準として表示し、ヒトインター
フェロン−βの力価はヒトインターフェロン−βの国際
標準品（ＧＯ２３−９０２−５２７）を基準として表示
した。
実験例１ 40mlのアフィ・ゲル15を冷蒸留水４にて洗浄後、0.05
Ｍリン酸緩衝液（pH６）にて更に洗浄し、同緩衝液にて
40mlになるように懸濁した。この懸濁液を10mlづつに分
け、各々に、１mM、５mM、20mM又は40mMに調整したＤ−
フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニン水溶液10mlを
添加し、４℃にて18時間攪拌することにより、リガンド
としてのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニン
を接合させたそれぞれの導入量の異なる吸着担体を作製
した。担体に結合したリガンド量は、リガンド結合反応
終了後の液および洗浄液の吸光度を測定することにより
得られる未吸着リガンド量を、結合反応に使用した全リ
ガンド量から減じることにより計算した。上記のように
して作製した各吸着担体を0.14Ｍ塩化ナトリウム含有0.
01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて洗浄後、各々1.5cm径の
カラムに充填した。次いでVilcekら（Antimicrob.Ag.Ch
emother.,２巻，476頁，1972年）の方法に従って生産し
た正常ヒト線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞生産の粗インター
フェロン−β液500ml（比活性6.3×104単位／mg，総イ
ンターフェロン力価7.2×106単位）を通過させた。次い
で、インターフェロンを吸着したカラムを前記のpH７の
緩衝液にて洗浄後、50％（ｗ／ｖ）のエチレングリコー
ルを含有する上記のpH７の緩衝液を通過させることによ
り、吸着しているインターフェロンを溶出した。
Ｍリン酸緩衝液（pH６）にて更に洗浄し、同緩衝液にて
40mlになるように懸濁した。この懸濁液を10mlづつに分
け、各々に、１mM、５mM、20mM又は40mMに調整したＤ−
フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニン水溶液10mlを
添加し、４℃にて18時間攪拌することにより、リガンド
としてのＤ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルアラニン
を接合させたそれぞれの導入量の異なる吸着担体を作製
した。担体に結合したリガンド量は、リガンド結合反応
終了後の液および洗浄液の吸光度を測定することにより
得られる未吸着リガンド量を、結合反応に使用した全リ
ガンド量から減じることにより計算した。上記のように
して作製した各吸着担体を0.14Ｍ塩化ナトリウム含有0.
01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて洗浄後、各々1.5cm径の
カラムに充填した。次いでVilcekら（Antimicrob.Ag.Ch
emother.,２巻，476頁，1972年）の方法に従って生産し
た正常ヒト線維芽細胞ＭＲＣ−５細胞生産の粗インター
フェロン−β液500ml（比活性6.3×104単位／mg，総イ
ンターフェロン力価7.2×106単位）を通過させた。次い
で、インターフェロンを吸着したカラムを前記のpH７の
緩衝液にて洗浄後、50％（ｗ／ｖ）のエチレングリコー
ルを含有する上記のpH７の緩衝液を通過させることによ
り、吸着しているインターフェロンを溶出した。
リガンド結合量の異なる各吸着担体を使用して精製した
結果、得られた溶出液中の精製インターフェロンの回収
率および比活性を第１表に示した。
結果、得られた溶出液中の精製インターフェロンの回収
率および比活性を第１表に示した。
実験例２ インターフェロンの精製度および回収率に及ぼす吸着担
体中のスペーサー部分の長さを検討する目的で、Ｌ−ト
リプトフィル−Ｌ−トリプトファンメチルエステルをリ
ガンドとし、このリガンドを結合したスペーサーの長さ
の異なる吸着担体を作製した。
体中のスペーサー部分の長さを検討する目的で、Ｌ−ト
リプトフィル−Ｌ−トリプトファンメチルエステルをリ
ガンドとし、このリガンドを結合したスペーサーの長さ
の異なる吸着担体を作製した。
スペーサーを含まない吸着担体は次のようにして作製し
た。すなわち、市販のブロムシアン活性化セファロース
４Ｂ（ファルマシア・ジャパン株式会社）を１mM塩酸液
中で膨潤させ、同液にて洗浄後、0.5Ｍ塩化ナトリウム
含有0.1Ｍ炭酸緩衝液（pH8.3）よりなるカップリング緩
衝液に溶解したリガンドを、担体１ml当り10μmoleにな
るように添加した。４℃にて一晩攪拌後、グリシンにて
未反応基をブロッキング後、実験に供した。
た。すなわち、市販のブロムシアン活性化セファロース
４Ｂ（ファルマシア・ジャパン株式会社）を１mM塩酸液
中で膨潤させ、同液にて洗浄後、0.5Ｍ塩化ナトリウム
含有0.1Ｍ炭酸緩衝液（pH8.3）よりなるカップリング緩
衝液に溶解したリガンドを、担体１ml当り10μmoleにな
るように添加した。４℃にて一晩攪拌後、グリシンにて
未反応基をブロッキング後、実験に供した。
スペーサーとして炭素原子６個の長さを有する吸着担体
は、市販のＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジ
ャパン株式会社）にカルボジイミドを使用した縮合反応
によりリガンドを結合することにより作製した。すなわ
ち、ＣＨ−セファロース４Ｂの乾燥粉末を0.5Ｍ塩化ナ
トリウム液中にて膨潤し、更に同液にて洗浄した。蒸留
水にリガンドを溶解後、pHを4.5に調整し、リガンドの2
0mM液を調製した。このリガンド液20mlを、前記の洗浄
済のＣＨ−セファロース４Ｂの20mlと混合し、更に、pH
4.5に調整した0.2Ｍカルボジイミド水溶液５mlを直ちに
添加し、混合後室温にて一晩攪拌した。
は、市販のＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア・ジ
ャパン株式会社）にカルボジイミドを使用した縮合反応
によりリガンドを結合することにより作製した。すなわ
ち、ＣＨ−セファロース４Ｂの乾燥粉末を0.5Ｍ塩化ナ
トリウム液中にて膨潤し、更に同液にて洗浄した。蒸留
水にリガンドを溶解後、pHを4.5に調整し、リガンドの2
0mM液を調製した。このリガンド液20mlを、前記の洗浄
済のＣＨ−セファロース４Ｂの20mlと混合し、更に、pH
4.5に調整した0.2Ｍカルボジイミド水溶液５mlを直ちに
添加し、混合後室温にて一晩攪拌した。
原子数が10および15の長さのスペーサーを有する吸着担
体は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド誘導体を有するア
フィ・ゲル10およびアフィ・ゲル15（いずれも日本バイ
オラッドラボラトリーズ）にリガンドを導入することに
より作製した。すなわち、各々の樹脂30mlを冷蒸留水に
て洗浄し、その後、アフィ・ゲル10についてはpH７の0.
05Ｍリン酸緩衝液、また、アフィ・ゲル15についてはpH
６の0.05Ｍリン酸緩衝液よりなる冷カップリング緩衝液
にて洗浄した。洗浄後の各担体20mlを、各々の冷カップ
リング緩衝液にて別個に調製した20mMのリガンド液20ml
と各々混合し、４℃にて一晩攪拌した。
体は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド誘導体を有するア
フィ・ゲル10およびアフィ・ゲル15（いずれも日本バイ
オラッドラボラトリーズ）にリガンドを導入することに
より作製した。すなわち、各々の樹脂30mlを冷蒸留水に
て洗浄し、その後、アフィ・ゲル10についてはpH７の0.
05Ｍリン酸緩衝液、また、アフィ・ゲル15についてはpH
６の0.05Ｍリン酸緩衝液よりなる冷カップリング緩衝液
にて洗浄した。洗浄後の各担体20mlを、各々の冷カップ
リング緩衝液にて別個に調製した20mMのリガンド液20ml
と各々混合し、４℃にて一晩攪拌した。
上記のように作製した各吸着担体10mlを各々1.5cm径の
カラムに充填後、0.14Ｍ塩化ナトリウム含有0.01Ｍリン
酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化した。Zoonら（J.Clin.Mi
crobiol.,７巻，44頁，1979年）の方法に従ってNamalwa
細胞にて生産された粗ヒトインターフェロン−α液500m
l（比活性8.3×104単位／mg，総インターフェロン力価
2.4×106単位）を各カラムに通過させ、更に上記のpH7.
5の緩衝液にて洗浄した後、プロピレングリコールを60
％（ｗ／ｖ）に含有した上記のpH7.5の緩衝液にて吸着
しているインターフェロンを溶出した。
カラムに充填後、0.14Ｍ塩化ナトリウム含有0.01Ｍリン
酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化した。Zoonら（J.Clin.Mi
crobiol.,７巻，44頁，1979年）の方法に従ってNamalwa
細胞にて生産された粗ヒトインターフェロン−α液500m
l（比活性8.3×104単位／mg，総インターフェロン力価
2.4×106単位）を各カラムに通過させ、更に上記のpH7.
5の緩衝液にて洗浄した後、プロピレングリコールを60
％（ｗ／ｖ）に含有した上記のpH7.5の緩衝液にて吸着
しているインターフェロンを溶出した。
各吸着担体による粗インターフェロン−αの精製効果を
第２表に示した。
第２表に示した。
実験例３ アフィ・ゲル10を冷蒸留水および冷却した0.05Ｍリン酸
緩衝液（pH７）にて洗浄後、各10mlづつに分け、各種の
Ｌ型アミノ酸、Ｌ型アミノ酸の多量体あるいはそれらの
メチルエチルエステル体を各々リガンドとして導入した
吸着担体を、実験例２と同様の方法にて作製した。リガ
ンド結合反応系に添加したリガンド量は、担体１ml当り
20μmoleであった。このようにして作製した吸着担体各
10mlを、各々1.5cm径のカラムに充填し、１Ｍ塩化ナト
リウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて平衡化後、
塩化ナトリウムの終濃度を１Ｍに調整したＭＲＣ−５細
胞生産の粗ヒトインターフェロン−β液500ml（比活性
8.5×104単位／mg，総インターフェロン力価9.6×106単
位）を通過させた。上記の塩化ナトリウムを含有する緩
衝液にて洗浄後、同液に３％（ｗ／ｖ）のプロピレング
リコールを添加した液にて更に洗浄した後、80％（ｗ／
ｖ）のプロピレングリコールを含有する１Ｍ塩化ナトリ
ウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて吸着している
インターフェロンを溶出した。各吸着担体による粗イン
ターフェロン−βの精製効果を第３表に示した。
緩衝液（pH７）にて洗浄後、各10mlづつに分け、各種の
Ｌ型アミノ酸、Ｌ型アミノ酸の多量体あるいはそれらの
メチルエチルエステル体を各々リガンドとして導入した
吸着担体を、実験例２と同様の方法にて作製した。リガ
ンド結合反応系に添加したリガンド量は、担体１ml当り
20μmoleであった。このようにして作製した吸着担体各
10mlを、各々1.5cm径のカラムに充填し、１Ｍ塩化ナト
リウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて平衡化後、
塩化ナトリウムの終濃度を１Ｍに調整したＭＲＣ−５細
胞生産の粗ヒトインターフェロン−β液500ml（比活性
8.5×104単位／mg，総インターフェロン力価9.6×106単
位）を通過させた。上記の塩化ナトリウムを含有する緩
衝液にて洗浄後、同液に３％（ｗ／ｖ）のプロピレング
リコールを添加した液にて更に洗浄した後、80％（ｗ／
ｖ）のプロピレングリコールを含有する１Ｍ塩化ナトリ
ウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて吸着している
インターフェロンを溶出した。各吸着担体による粗イン
ターフェロン−βの精製効果を第３表に示した。
実施例１ 50mlのアフィ・ゲル10を冷蒸留水および冷却した0.05Ｍ
リン酸緩衝液（pH７）にて洗浄した後、上記緩衝液にて
20mMに調整したＤ−トリプトフィル−Ｄ−トリプトファ
ン液50mlと混合し、pH７の条件下、４℃にて一晩攪拌し
た。リガンドが結合した吸着担体を2.5cm径のカラムに
充填した後、１Ｍ塩化ナトリウム含有0.01Ｍリン酸緩衝
液（pH８）にて平衡化した。谷口ら（Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.,77巻，5320頁，1980年）の方法に従って大腸
菌にて生産した粗ヒトインターフェロン−β液２（比
活性4.8×104単位／mg，総インターフェロン力価3.3×1
07単位）に塩化ナトリウムを終濃度１Ｍに添加した後、
カラムを通過させた。上記pH８の緩衝液および10％（ｗ
／ｖ）のプロピレングリコールを含有する上記pH８の緩
衝液にてカラムを連続して洗浄した後、60％（ｗ／ｖ）
のプロピレングリコール及び１Ｍの塩化ナトリウムを含
有する0.01Ｍリン酸緩衝液（pH８）にて吸着しているヒ
トインターフェロン−βを溶出した。溶出されたヒトイ
ンターフェロン−βの回収率は70％であり、比活性は5.
1×107単位／mgであった。
リン酸緩衝液（pH７）にて洗浄した後、上記緩衝液にて
20mMに調整したＤ−トリプトフィル−Ｄ−トリプトファ
ン液50mlと混合し、pH７の条件下、４℃にて一晩攪拌し
た。リガンドが結合した吸着担体を2.5cm径のカラムに
充填した後、１Ｍ塩化ナトリウム含有0.01Ｍリン酸緩衝
液（pH８）にて平衡化した。谷口ら（Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.,77巻，5320頁，1980年）の方法に従って大腸
菌にて生産した粗ヒトインターフェロン−β液２（比
活性4.8×104単位／mg，総インターフェロン力価3.3×1
07単位）に塩化ナトリウムを終濃度１Ｍに添加した後、
カラムを通過させた。上記pH８の緩衝液および10％（ｗ
／ｖ）のプロピレングリコールを含有する上記pH８の緩
衝液にてカラムを連続して洗浄した後、60％（ｗ／ｖ）
のプロピレングリコール及び１Ｍの塩化ナトリウムを含
有する0.01Ｍリン酸緩衝液（pH８）にて吸着しているヒ
トインターフェロン−βを溶出した。溶出されたヒトイ
ンターフェロン−βの回収率は70％であり、比活性は5.
1×107単位／mgであった。
実施例２ 50mlのアフィ・ゲル10を冷蒸留水および冷却した0.05Ｍ
リン酸緩衝液（pH７）にて洗浄した後、上記緩衝液にて
20mMに調整したＬ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル液50mlと混合し、pH７の条件下、
４℃にて一晩攪拌した。反応終了後、リガンドが結合し
た吸着担体を2.5cm径のカラムに充填した後、１Ｍ塩化
ナトリウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて平衡化
した。ＭＲＣ−５細胞の生産した粗ヒトインターフェロ
ン−β液2.5（比活性8.0×104単位／mg，総インター
フェロン力価4.2×107単位）に塩化ナトリウムを終濃度
１Ｍに添加した後、カラムを通過させた。上記の塩化ナ
トリウムを含有する緩衝液にて洗浄後、同液に３％（ｗ
／ｖ）のプロピレングリコールを添加した液にて更に吸
着担体を洗浄した後、80％（ｗ／ｖ）のプロピレングリ
コールおよび１Ｍ塩化ナトリウムを含有する0.01Ｍリン
酸緩衝液（pH７）にて吸着しているヒトインターフェロ
ン−βを溶出した。溶出されたインターフェロンの回収
率は89％であり、その比活性は2.3×108単位／mgであっ
た。
リン酸緩衝液（pH７）にて洗浄した後、上記緩衝液にて
20mMに調整したＬ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル液50mlと混合し、pH７の条件下、
４℃にて一晩攪拌した。反応終了後、リガンドが結合し
た吸着担体を2.5cm径のカラムに充填した後、１Ｍ塩化
ナトリウム含有0.01Ｍリン酸緩衝液（pH７）にて平衡化
した。ＭＲＣ−５細胞の生産した粗ヒトインターフェロ
ン−β液2.5（比活性8.0×104単位／mg，総インター
フェロン力価4.2×107単位）に塩化ナトリウムを終濃度
１Ｍに添加した後、カラムを通過させた。上記の塩化ナ
トリウムを含有する緩衝液にて洗浄後、同液に３％（ｗ
／ｖ）のプロピレングリコールを添加した液にて更に吸
着担体を洗浄した後、80％（ｗ／ｖ）のプロピレングリ
コールおよび１Ｍ塩化ナトリウムを含有する0.01Ｍリン
酸緩衝液（pH７）にて吸着しているヒトインターフェロ
ン−βを溶出した。溶出されたインターフェロンの回収
率は89％であり、その比活性は2.3×108単位／mgであっ
た。
（効果） 以上記載した如く、本発明のヒトインターフェロン−β
の吸着−溶出による精製方法にあっては吸着担体として
有機高分子量物質からなる水不溶性の担体部、スペーサ
ー部分およびリガンド部分から構成される吸着担体を使
用し、特にリガンド部分として芳香環を有するアミノ酸
または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも１個
を有し、かつ保有するアミノ基またはカルボキシル基を
介して水不溶性の担体に結合しているスペーサー分子と
結合可能な化合物を選択したものであり、かかる吸着担
体を使用することにより１回の精製操作で高純度のヒト
インターフェロン−βを高収率で得ることができ、特に
従来方法に比し優れたものであるといえる。
の吸着−溶出による精製方法にあっては吸着担体として
有機高分子量物質からなる水不溶性の担体部、スペーサ
ー部分およびリガンド部分から構成される吸着担体を使
用し、特にリガンド部分として芳香環を有するアミノ酸
または芳香環を有するアミノ酸誘導体の少なくとも１個
を有し、かつ保有するアミノ基またはカルボキシル基を
介して水不溶性の担体に結合しているスペーサー分子と
結合可能な化合物を選択したものであり、かかる吸着担
体を使用することにより１回の精製操作で高純度のヒト
インターフェロン−βを高収率で得ることができ、特に
従来方法に比し優れたものであるといえる。
Claims (6)
- 【請求項１】粗ヒトインターフェロンを吸着担体に接触
させ、該吸着担体にヒトインターフェロン−βを吸着さ
せ、次いで溶出液でヒトインターフェロン−βを溶出す
ることからなるヒトインターフェロン−βの精製法にお
いて、 吸着担体として、有機高分子量物質からなる水不溶性の
担体に、リガンドとして芳香環を有するアミノ酸および
／または芳香環を有するアミノ酸誘導体の多量体を有
し、かつ、該担体に結合しているスペーサー分子に結合
し得るアミノ基またはカルボキシル基を有する化合物を
結合させた吸着担体を使用する、前記ヒトインターフェ
ロン−βの精製方法。 - 【請求項２】多量体が二量体または三量体である特許請
求の範囲第１項記載の精製方法。 - 【請求項３】芳香環を有するアミノ酸誘導体が、カルボ
キシル基がアルキルエステル化されたアミノ酸である特
許請求の範囲第１項記載の精製方法。 - 【請求項４】アルキルエステルが、メチルエステル、エ
チルエステルまたはプロピルエステルである特許請求の
範囲第３項記載の精製方法。 - 【請求項５】芳香環を有するアミノ酸が、Ｌ−トリプト
ファン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロ
シン、Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニルアラニ
ンである特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか
１項に記載の精製方法。 - 【請求項６】芳香環を有するアミノ酸誘導体が、Ｌ−ト
リプトファン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｄ
−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンまたはＤ−フェニル
アラニンの誘導体である特許請求の範囲第１項ないし第
３項のいずれか１項に記載の精製方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036110A JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60036110A JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH06800B2 true JPH06800B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=12460627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60036110A Expired - Lifetime JPH06800B2 (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | ヒトインターフェロン―βの精製方法 |
Country Status (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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