JPH0680695A

JPH0680695A - ペプチド

Info

Publication number: JPH0680695A
Application number: JP4233912A
Authority: JP
Inventors: Terumi Nakajima; 暉躬中嶋; Kenichi Hagiwara; 健一萩原; Noriyuki Morikawa; 記行森川
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-09-01
Filing date: 1992-09-01
Publication date: 1994-03-22

Abstract

(57)【要約】【構成】式【化１】及び【化２】で表されるペプチド。【効果】これまでにカエルの皮膚から単離された抗菌
性ペプチド、ボンビニンやマガイニンとは全く異なる一
次構造を持つものであり、ブレビニン−１については、
特にグラム陽性菌に対して、ブレビニン−２については
グラム陽性菌、グラム陰性菌両方に対し、比較的強い活
性を示した。また、ブレビニン−１及びブレビニン−２
はいづれも、かなり強いヒスタミン遊離活性を示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は新規なペプチドに関
し、例えば、この発明のペプチドは抗菌剤として有用で
ある。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
動物に対し生理活性を示す物質が天然物より単離されて
いるが、その中にペプチドがある。これらのペプチド類
は現在まで、そのアミノ酸配列等の構造解析や構造活性
相関等の検討が行われ、医学、薬学の分野で広く利用さ
れているものも多い。

【０００３】カエルの皮膚には多くの分泌腺が存在する
ことはよく知られており、これまでに、ボンベシン、ゼ
ノブシン、カエルレイン、ブラジキニン等の生理活性物
質が単離されている（Charles L. Bevins (1990) Annu.
Rev. Biochem. 59: 395) 。これらの物質は哺乳類の体
内にも一次構造の類似した物質が存在することが明らか
となってきたことから、生命科学の分野において生体系
の情報伝達機構を研究する際の有用なツールとして、現
在盛んに利用されている。

【０００４】これら生理活性物質の中で抗菌作用を有す
るペプチドとしては、これまでにミッチェルらにより、
ヨーロピアンボンビーナ類からボンビニンが単離されて
おり（A. Csordas H. Michel (1970) Monatshefte fur
Chemie 101: 182)、またザスロスらによりアフリカツメ
ガエルからマガイニンが単離されている（Michel Zaslo
ff (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5449)。

【０００５】一方、哺乳類の組織中からも抗菌活性を有
するペプチドの存在が確認されている。うさぎの肺のマ
クロファージからＭＣＰ−１及びＭＣＰ−２が、牛の好
中球からＢａｃ−１及びＢａｃ−２が単離されている
（Michel Zasloff (1983) J. Biol. Chem. 258, 23: 14
485 /Ming-Der Kuo (1988) J. Biol. Chem. 263, 20: 9
573 /Rainer W. Frank (1990) J. Biol. Chem. 265, 3
1: 18871)。これらのペプチドは活性酸素と共に外界の
バクテリアから生体を保護する役目を担っていると考え
られる。

【０００６】また、昆虫類においても、例えば、ウジの
体内にもこれらとかなり相同性のある構造を有するペプ
チドの存在が確認されており（Jean Lambert (1989) Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 262) 、やはり生体を保
護していると考えられている。カエルの皮膚由来の抗菌
性ペプチドの生物学的意義は明らかにされていないが、
これらのことからやはり生体保護の役割を担っていると
考えられる。よって、カエルの皮膚から新たな物質を探
索すれば、単に抗菌性だけでなく予期せぬ効果も期待で
きる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】発明者らは、日本に広く
棲息するトノサマガエル（ニグロマキュラタ；Nigromac
ulata)、ダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ；Rana bre
vipoda）等の皮膚からグラム陽性菌及びグラム陰性菌に
対する抗菌活性を指標に精製を進め、新しい構造を持つ
抗菌活性を有するペプチドを単離するに至った。そし
て、得られたペプチドは、それぞれ下記の式であること
を見出し、それぞれ、ブレビニン−１、ブレビニン−２
と命名した。さらに、このペプチドはマスト細胞からの
ヒスタミン放出活性を有することから、免疫細胞に作用
し、その作用を増強させることも考えられる。また、ブ
レビニン−１は、Ｎ末端側が走化性ペプチドと類似して
いることから、白血球等の走化性を促し、抗炎症作用を
持つ可能性もある。

【０００８】かくして、この発明によれば式、

【０００９】

【化３】及び

【００１０】

【化４】で表されるペプチドが提供される。この発明のペプチド
は、基本的にトノサマガエル（ニグロマキュラタ；Nigr
omaculata)、ダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ；Rana
brevipoda）等の皮膚からの抽出工程と精製工程とから
得ることができる。以下に、この発明のペプチドの抽
出、精製方法について説明する。

【００１１】抽出は弱酸性水溶液で行なう。この際、例
えば、１〜２Ｍ程度の酢酸水溶液等を用いることが望ま
しい。また、抽出は常温で皮膚を希酸水溶液中に長時間
静置しておいてもよいし、煮沸しながら短時間で行って
もよい。抽出物の精製は、複数の塩や低分子アミノ酸が
混在しているため、分子量１０００以下の物質を除去す
ることができるような透析膜を用いて、弱酸性水溶液、
例えば、抽出の際に用いた溶媒系で透析することが好ま
しい。また、その後さらに透析液をゲルろ過に付しても
よい。そして、得られた溶液を分離能に優れた逆相高速
液体クロマトグラフィに付す。逆相系カラムでの精製に
使用する溶媒としては、抽出の際に用いた溶媒系でよい
が、有機溶媒としてはアセトニトリルが最も望ましい。
溶離液中の成分は、紫外検出器による２１０ｎｍ〜２８
０ｎｍでの吸光度測定により、各ピークに相当する溶出
部分を分取することで得られる。

【００１２】精製された成分は、アミノ酸組成分析なら
びに自動シークエンサーによるアミノ酸配列分析により
化学構造を決定することができる。また、上記の方法で
得られるペプチドは、公知のペプチド合成装置により、
例えば、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、オルト−クロ
ロベンジルオキシカルボニル（ＣｌＺ）、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）、シクロヘキシルオキシ（ＯｃＨｅｘ）又はｔ−
ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）等の保護基を用いて、公
知のペプチド合成方法を利用して合成することができ
る。

【００１３】この発明におけるペプチドであるブレビニ
ン−１及びブレビニン−２は抗菌作用を有しており、感
染症の予防・治療に用いることができる。さらに、免疫
増強剤または抗炎症剤として有用であると思われる。ま
た、ブレビニン−１及びブレビニン−２における疎水性
アミノ酸（例えば、Leu 、Ile 、Val 又はPhe 等）はそ
れらの中で変換可能であり、そのようなペプチドも本発
明の範囲に含まれる。

【００１４】この発明におけるペプチドは、粉末、顆
粒、錠剤、カプセル剤、注射剤等の医薬組成物として、
ヒトに経口的又は非経口的に安全に投与することができ
る。この発明におけるペプチドは、担体もしくは賦形
剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビ
トール、トラガントゴム、ポリビニルピロリドン等、充
填剤、例えばラクトース、糖類、とうもろこし澱粉、燐
酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等、滑沢剤、例
えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、シリカ等、崩壊剤、例えば馬鈴薯澱粉等又
は湿潤剤、例えばナトリウムラウリルサルフェート等と
適宜混合したのち、経口投与用の粉末、顆粒、錠剤、カ
プセル剤とすることができる。錠剤、顆粒等は自体公知
の方法によってフィルムコーティングすることもでき
る。経口用製剤は、水性又は油性懸濁液、溶液、乳濁
液、シロップ、エリキシル等の液状製剤として用いても
よい。また、これらの製剤に、例えば公知の酸化防止
剤、防腐剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、粘稠剤又は風味
剤等の成分を混合してもよい。

【００１５】注射用製剤は、アンプル又は防腐剤を添加
した容器の使用形態で提供し得る。該製剤は、油性又は
水性溶媒中の懸濁液、溶液又は乳濁液であってもよく、
公知の懸濁剤、安定剤及び（又は）分散剤等の補助剤を
適宜含有していてもよい。また、この発明のペプチド
は、粉末剤、散剤として使用直前に適当な溶媒、例えば
殺菌した発熱性物質を含有していない水で溶解したのち
使用に供することができる。

【００１６】投与量は疾病の状態、投与ルートによって
も異なるが、例えば、成人（体重５０ｋｇ）患者に投与
する場合、約０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好まし
くは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。さらに、こ
の発明のペプチドは、外用殺菌剤としても用いることが
できる。例えばワセリン、ラノリンを基剤として、１ｇ
あたり通常約０．１〜１００ｍｇ含有する軟膏剤とし
て、皮膚あるいは粘膜等に塗布することができる。ま
た、この発明のペプチドを、必要に応じて液体の希釈剤
に溶解、あるいは懸濁させて用いることができる。この
際、この製剤に公知の溶解補助剤、吸収促進剤、懸濁
剤、安定剤及び（又は）分散剤等の補助剤を適宜含有し
ていてもよい。

【００１７】

【実施例】以下実施例によりこの発明を詳細に説明す
る。トウキョウダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ・ポル
サ；Rana brevipoda porsa）からのペプチドの抽出、精
製トウキョウダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ・ポル
サ；Rana brevipoda porsa）６匹の皮膚を１Ｍ酢酸溶液
８０ｍｌで煮沸下抽出し、ろ過後、抽出液を分子量１０
００カットの透析膜（スペクトラポア６：フナコシ社
製）を用い、１Ｍ酢酸溶液２リットルに対して１２時間
透析をかけて、塩及び低分子量アミンを除去した。透析
膜内液７０ｍｌを１Ｍ酢酸溶液で充填したＳＰ−セファ
デックスＣ−５０（ファルマシア製）２５ｍｌに付し、
１Ｍ酢酸溶液及び２Ｍピリジン溶液各７５ｍｌで洗浄
後、２ｍｌピリジン−酢酸溶液（ｐＨ５．０）７５ｍｌ
で溶出した。この溶出分画を減圧下濃縮乾固し、１．５
ｍｌの水に溶解後、以下の条件で逆相高速液体クロマト
グラフィを行った。カラム：ＴＳＫ−ゲル（東ソー社製）、ＯＤＳ−８０Ｔ
Ｍ(250×4.6 mm I.D.) 移動相：Ａ；H₂O/MeCN(95/5), 0.05%TFA、Ｂ；H₂O/MeCN
(40/60), 0.05%TFA 勾配：Ａ／Ｂ；１００／０→０／１００（６０分）→０
／１００（１０分）流速：０．７ｍｌ／分カラム温度：４０℃ 検出：２１５ｎｍ（ＵＶ）上記の条件下で行った逆相高速液体クロマトグラフィの
結果、図１に示すようなクロマトグラフィが得られた。
図中に示したピーク及びピークのない溶出液の抗菌活性
を調べたところ、図１中、No. ６（以下「Ｐ−６」と記
載）及びNo. ９（以下「Ｐ−９」と記載）に抗菌活性が
見られた。そこで、これらの画分を分取し、Ｐ−６を３
１ｎｍｏｌ（１０１．４μｇ）、Ｐ−９を２６ｎｍｏｌ
（６５．７μｇ）得た（アミノ酸分析の結果による）。
これらについて、アミノ酸組成分析、アミノ酸配列分
析、Ｃ末端構造分析を行った。

【００１８】ペプチドの構造解析１．Ｐ−９の構造解析まず、このペプチドの一部を取り、６ＮＨＣｌ／ＨＳＣ
Ｈ₂ＣＯＯＨ（１００／４）液中、１１０℃、２０時間
加水分解した後、ＩＥＸ−２１５（50×4.6 mmI.D. ；
東ソー社製）を用いたアミノ酸組成分析を行った。その
結果、Ｐ−９画分はシステイン残基を有することが判明
した。

【００１９】そこで、ペプチド３ｎｍｏｌの乾固物に、
０．３Ｍジチオスレイトールを３．５μｌ、５Ｍ塩酸グ
アニジンを３５μｌ加え、４５℃で１４時間反応させた
のち、１Ｍヨード酢酸（ｐＨ８．０）３５μｌ、２−メ
ルカプトエタノール２．５μｌを順次加え、Ｐ−９の還
元カルボキシメチル化を行った。そして、前述の高速液
体クロマトグラフィ条件により精製し、還元カルボキシ
メチル体約２．４ｎｍｏｌを得た。この還元カルボキシ
メチル体を約８００ｐｍｏｌずつ用いて、それぞれトリ
プシン、キモトリプシン等で酵素処理後、そのフラグメ
ントを高速液体クロマトグラフィで分取し、各フラグメ
ントについてアミノ酸組成分析、アミノ酸配列分析を行
った。アミノ酸配列分析には、ＡＢＩ４７７Ａプロテイ
ン・シークエンサーを用いた。アミノ酸組成分析、アミ
ノ酸配列分析については、表１及び図２に示した。

【００２０】

【表１】これらを組み合わせて、以下に示す一次構造を決定し
た。なお、ＦＡＢ−ＭＡＳＳによるこのペプチドの分子
量は２５２８であった。

【００２１】

【化５】Ｃ末端についてはトリプシン処理によりリジルシステイ
ンが生成されることが予備検討の結果判明したため、過
蟻酸酸化したＰ−９をトリプシン処理した。Ｃ末端のリ
ジルシステイン酸は、短いペプチドフラグメントである
こと、極性が高いこと等から、逆相高速液体クロマトグ
ラフィでの分取は不可能であると考え、酵素処理液フラ
グメントミクスチャーのままマニュアルエドマン分解を
行い、そのまま２０μｌの０．２５Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム溶液（ｐＨ８．０）中で、ダンシルクロリド（６ｍｇ
／ｍｌ）アセトン溶液２０μｌを加え、２０℃、２４時
間反応させてダンシル化を行った。以下の条件で逆相高
速液体クロマトグラフィ分析を行って、Ｃ末端を同定し
たところ、Ｃ末端はカルボン酸タイプであることが明ら
かとなった。カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ（東ソー社製）、ＯＤＳ−８０
ＴＭ(250×4.6 mm I.D.) 移動相：Ａ；10 mM NaOAc (pH 4.0)/MeCN(95/5) Ｂ；10 mM NaOAc (pH 4.0)/MeCN(30/70) 勾配：Ａ／Ｂ；１００／０→０／１００（７０分）流速：１．０ｍｌ／分カラム温度：４０℃ 検出器：励起波長；３５０ｎｍ、蛍光波長；５３０ｎｍまた、分取したＰ−９のペプチド画分を還元カルボキシ
メチル化をせず、そのままトリプシン処理し、その高速
液体クロマトグラフィ分取フラグメントをアミノ酸配列
分析した。その結果、２つのシステイン残基はジスルフ
ィド結合によりつながっていることが判明した。

【００２２】このペプチドを、以下に示した合成品と逆
相高速液体クロマトグラフィを用いて比較したところ、
溶出時間が一致した。２．Ｐ−６の構造解析まず、Ｐ−９と同様の方法でアミノ酸組成分析を行うこ
とによりＰ−６画分はシステイン残基を有することが判
明したので、ペプチド２．９ｎｍｏｌに、２−メルカプ
トエタノール１．５μｌ、５Ｍ塩酸グアニジンを２０μ
ｌ加え、３０℃で１４時間反応させたのち、０．０２％
ＨＣｌを５μｌ、１Ｍヨード酢酸（ｐＨ８．０）２０μ
ｌ、２−メルカプトエタノール１．５μｌを順次加え、
Ｐ−６の還元カルボキシメチル化を行った。この一部を
それぞれトリプシン、キモトリプシン等で酵素処理後、
そのフラグメントを高速液体クロマトグラフィで分取
し、各フラグメントについてアミノ酸組成分析、アミノ
酸配列分析を行った。アミノ酸配列分析には、ＡＢＩ４
７７Ａプロテイン・シークエンサーを用いた。アミノ酸
組成分析、アミノ酸配列分析については、表２及び図３
に示した。

【００２３】

【表２】これらを組み合わせて、以下に示す一次構造を決定し
た。

【００２４】

【化６】なお、分取したペプチド、画分をそのままトリプシンで
処理し、アミノ酸配列分析した結果、２つのシステイン
残基はジスルフィド結合によりつながっていることが判
明した。また、ＦＡＢ−ＭＡＳＳによるこのペプチドの
分子量は３２５０であった。

【００２５】Ｃ末端については、過蟻酸酸化したＰ−６
をトリプシン処理したところ、スレオニルシステイン酸
が生成したことが判明したので、この反応液を１Ｍ酢酸
で充填したダウエックス５０ＷＸ８約４００μｌに付し
た。１Ｍ酢酸溶出フラクションを自動シーケンサーにか
けたところ、スレオニルシステイン酸が溶出されていた
ため、この画分をマニュアルエドマン分解後、ダンシル
化を行った。そして、Ｐ−９と同様の条件下、逆相高速
液体クロマトグラフィ分析によりＣ末端分析（Ken'ichi
Hagiwara (1991) Biomedical Res. 12, 6:357参照）を
行ったところ、Ｃ末端はカルボン酸タイプであることが
明らかとなった。

【００２６】また、分取したＰ−６のペプチド画分を還
元カルボキシメチル化をせず、そのままトリプシン処理
し、その高速液体クロマトグラフィ分取フラグメントを
アミノ酸配列分析した。その結果、Ｐ−６もやはり、ジ
スルフィド結合により２つのシステイン残基はつながっ
ていることが判明した。このペプチドを以下に示す合成
品と逆相高速液体クロマトグラフィを用いて比較したと
ころ、溶出時間が一致した。

【００２７】ペプチドの合成１．Ｐ−９の合成自動合成装置（アプライド・バイオシステム・モデル４
３０Ａ）を用い、固相法によって合成した。Ｃｙｓ（Ａ
ｃｍ）、Ｌｙｓ（ＣｌＺ）及びＴｈｒ（Ｂｚｌ）のよう
な、側鎖が保護されたＢｏｃ−アミノ酸を用い、これら
Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体をＨＯＢｔ活性エステル法によ
り、４倍過剰でＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏレジン
（１．３９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）に反応させ、Ｂｏｃ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（Ｂ
ｚｌ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｃｙｓ
（Ａｃｍ）−Ｏレジン（２．９８ｇ、９８．９％）を得
た。

【００２８】次いで、保護ペプチドレジン（１．０ｇ、
０．１６６ｍｍｏｌ）を１時間、氷浴中でＨＦ（１８ｍ
ｌ）及びアニソール（２ｍｌ）で処理して、レジン及び
システイン（Ｃｙｓ）の保護基であるＡｃｍ以外の保護
基を除去する。ＨＦを留去した後、得られたペプチドを
酢酸溶液で抽出、ろ過する。そして、得られた溶液をセ
ファデックスＧ−１５（６００×３０ｍｍＩ．Ｄ．）
に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出し、逆相中圧カラムクロマ
トグラフィにより精製する。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤ
Ｓ−ＡＭ１２０−Ｓ５０（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）
を用い、流速１２ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢
酸を含む２０％アセトニトリルから、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリル水溶液への直線濃
度勾配法（３時間）により溶出、精製した。精製された
分画を集め、凍結乾燥してＰ−９〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂（７４ｍｇ、１６．７％）を得た。

【００２９】さらに、Ｐ−９〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂（５６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を８０％メタノー
ル１００ｍｌに溶解し、それに０．１Ｍ沃素のメタノー
ル溶液３．１ｍｌ（１５モル当量）を室温で加える。１
０時間攪拌した後、その溶液を１０ｍｌに濃縮し、セフ
ァデックスＧ−１５に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出する。
そして、逆相中圧カラムクロマトグラフィにより精製す
る。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０
（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、流速１２ｍｌ／
分で、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニ
トリルから、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６５％ア
セトニトリル水溶液への直線濃度勾配法（３時間）によ
り溶出、精製する。精製された分画を集め、凍結乾燥し
て、ペプチドを得た（２６ｍｇ、４８．９％）。

【００３０】そして、得られたペプチドの同一性を、逆
相高速液体クロマトグラフィで確認した。その際、カラ
ムはＹＭＣ−パックＯＤＳ−ＡＭ（２５０×４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）を用い、流速１．０ｍｌ／分で、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルから、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル水溶
液への直線濃度勾配法（３０分）により行った。検出は
２１５ｎｍで行った。ＦＡＢ−ＭＡＳＳ〔Ｍ＋Ｈ〕によ
る分子量は２５２９．９であった。また、その際の計算
値はＣ₁₂₁Ｈ₂₀₂Ｎ₂₈Ｏ₂₆Ｓ₂（２５２９．３）であっ
た。従って、上記により得られたペプチドは以下に示す
ブレビニン−１であることが確認された。

【００３１】

【化７】２．Ｐ−６の合成上記と同様の自動合成装置を用い、同様の方法によって
合成した。Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、
Ｌｙｓ（ＣｌＺ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）及びＴｈｒ（Ｂｚ
ｌ）のような、側鎖が保護されたＢｏｃ−アミノ酸を用
い、これらＢｏｃ−アミノ酸誘導体を上記と同様の方法
によりＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏレジン（０．７３
ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に反応させ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｓｅｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ（ＣｌＺ）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓ
ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−
Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ
（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ（ＣｌＺ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−
Ｏレジン（１．６９ｇ、９０．１％）を得た。

【００３２】次いで、保護ペプチドレジン（１．０ｇ、
０．１３３ｍｍｏｌ）を１時間、氷浴中でＨＦ（１８ｍ
ｌ）及びアニソール（２ｍｌ）で処理して、レジン及び
システイン（Ｃｙｓ）の保護基であるＡｃｍ以外の保護
基を除去する。ＨＦを留去した後、得られたペプチドを
酢酸溶液で抽出、ろ過する。そして、得られた溶液をセ
ファデックスＧ−１５（６００×３０ｍｍＩ．Ｄ．）
に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出し、逆相中圧カラムクロマ
トグラフィにより精製する。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤ
Ｓ−ＡＭ１２０−Ｓ５０（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）
を用い、流速１２ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢
酸を含む３０％アセトニトリルから、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリル水溶液への直線濃
度勾配法（３時間）により溶出、精製した。精製された
分画を集め、凍結乾燥してＰ−６〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂（９８ｍｇ、２１．７％）を得た。

【００３３】さらに、Ｐ−６〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂（９８ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ）を８０％メタノ
ール１５０ｍｌに溶解し、それに０．１Ｍ沃素のメタノ
ール溶液４．３ｍｌ（１５モル当量）を室温で加える。
３時間攪拌した後、その溶液を１０ｍｌに濃縮し、セフ
ァデックスＧ−１５に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出する。
そして、逆相中圧カラムクロマトグラフィにより精製す
る。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０
（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、流速１２ｍｌ／
分で、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニ
トリルから、０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％ア
セトニトリル水溶液への直線濃度勾配法（３時間）によ
り溶出、精製する。さらに、上記と同様の条件で、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルか
ら、０．１％トリフルオロ酢酸を含む４５％アセトニト
リルへの直線濃度勾配法（３時間）により再精製する。
精製された分画を集め、凍結乾燥して、ペプチドを得た
（１３．５ｍｇ、１４．４％）。

【００３４】そして、得られたＰ−６の同一性を、逆相
高速液体クロマトグラフィで確認した。その際、カラム
はＹＭＣ−パックＯＤＳ−ＡＭ（２５０×４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）を用い、流速１．０ｍｌ／分で、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルから、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリルへの
直線濃度勾配法（３０分）により行った。検出は２１５
ｎｍで行った。ＦＡＢ−ＭＡＳＳ〔Ｍ＋Ｈ〕による分子
量は３２５１．８であった。また、その際の計算値はＣ
₁₄₂Ｈ₂₄₄Ｎ₃₈Ｏ₄₄Ｓ₂（３２５１．８）であった。従
って、上記により得られたペプチドは以下に示すブレビ
ニン−２であることが確認された。

【００３５】

【化８】生物活性１．抗菌活性Ｐ−６、Ｐ−９の抗菌活性を寒天培地を用いたパルプア
ッセイ法により検討した。抗菌プレートの培地にはＬＢ
（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％寒天）を用い、バクテリア
は、グラム陽性菌としてスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus 209P JC-1 ）及びバチルス
・サブチリス（Bacillus subtilis ATCC 6633 ）、グラ
ム陰性菌としてエスチェリチア・コリ（Escherichia co
li NIHJ JC-2）を用いた。その結果を表３に示す。

【００３６】

【表３】Ｐ−９については、グラム陰性菌に対してあまり強い活
性を示さないのに対し、グラム陽性菌に対しては１０μ
ｇ／ｍｌ以下という強い活性を示した。一方、Ｐ−６に
ついてはグラム陽性菌、グラム陰性菌両方に対し、比較
的強い活性を示した。２．マスト細胞からヒスタミンの放出活性１０週齢ウィスター系ラット（３００〜３５０ｇ）の腹
腔内マスト細胞を用いて、ヒスタミンの放出活性を調べ
た。対照薬剤として、ハチ毒から単離されたマストパラ
ン（Y. Hirai, T. Yasuhara, H. Yoshida, T. Nakajim
a, M. Fujino and C. Katada (1979) Chem. Pharm. Bul
l. 27: 1942）を用いた。

【００３７】（１）ＭＣＭ (Mast Cell Medium) の調製 150mM NaCl 、3.7mM KCl、3.0mM Na₂HPO₄、3.5mM K
H₂PO₄、0.9mM CaCl₂にグルコース0.1%及びBSA 0.2%
を加え、調製した。（２）ヒスタミン定量用緩衝液（ＨＰＬＣ）（Ｂ、Ｃは
ポストカラムの溶媒）の調製Ａ： 0.4M クエン酸ナトリウム 0.06M ホウ酸ＮａＯＨでｐＨ１０．２３とするＢ： 0.2M ホウ酸緩衝液（ホウ酸11.2g KOH11.2g/L)
中、 0.1% ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド） 0.2% エタンチオール 0.25% Ｂｒｉｇ３５Ｃ： 0.75M Ｎａ₂ＣＯ₃ 0.25M ＮａＨＣＯ₃ （３）ラット腹腔内マスト細胞の調製１２週齢ウィスター系ラット（約３２０ｇ）をデカピテ
ートし、脱血した後、腹腔内に上記マストセルメデイウ
ム（ＭＣＭ）２０ｍｌを注入する。約３分間マッサージ
した後、腹部を開き、駒込ピペットで腹腔内のマスト細
胞のＭＣＭ懸濁液約１７ｍｌを吸い出し、４℃で１００
０ｒｐｍ、５分間遠心分離する。沈査をさらに、２、３
回、４ｍｌのＭＣＭで洗浄し、活性測定に用いる。血球
計算板〔萱垣製作所：Neubauer型〕を用いて細胞数を数
え、ＭＣＭで５×１０⁵個／ｍｌに調製する。

【００３８】（４）検定マスト細胞調製液２０μｌに、ＭＣＭに溶解したサンプ
ル２０μｌを加え、３７℃で静置する。５分後すぐ水冷
し、室温にて３０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清３０μ
Ｌをエッペンドルフチューブにとる。これに５５％トリ
クロル酢酸５μｌを加え、１００００ｒｐｍで５分間遠
心した後、上清中のヒスタミン量を定量する。ヒスタミ
ン定量は、ＯＰＡポストカラム検出法を用いて高速液体
クロマトグラフィにより行う。高速液体クロマトグラフ
ィの条件は以下の通りである。カラム：ＩＥＸ−２１５（東ソー社製）50×4.6 mm I.
D. 流速：Ａ液：０．７ｍｌ／分、Ｂ・Ｃ液：０．２ｍｌ／
分カラム温度：８０℃ 検出器：励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４５５ｎｍ各検体の活性は、マスト細胞を２０μｌの０．１％トリ
トンＸ−１００と、上記のように処理した際のヒスタミ
ン量を１００とし、百分率で表す。また、陽性コントロ
ールとしてコンパウンド４８／８０（シグマ製）１０μ
ｇ／ｍｌ及びマストパラン１０μＭを用いた。その結果
を図４に示す。

【００３９】図４より明らかなように、Ｐ−６、Ｐ−９
両ペプチドともマストパランと同程度か、やや劣る程度
のヒスタミン放出活性を持つことがわかった。

【００４０】

【発明の効果】この発明のペプチドは、これまでにカエ
ルの皮膚から単離された抗菌性ペプチド、ボンビニンや
マガイニンとは全く異なる一次構造を持つものであり、
ブレビニン−１については、特にグラム陽性菌に対し
て、ブレビニン−２についてはグラム陽性菌、グラム陰
性菌両方に対し、比較的強い活性を示した。

【００４１】また、ブレビニン−１及びブレビニン−２
はいづれも、かなり強いヒスタミン放出活性を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わるペプチドを抽出した際のＳＰ−
セファデックスＣ−５０溶出分画の逆相高速液体クロマ
トグラムである。

【図２】本発明に係わるペプチドであるブレビニン−１
のアミノ酸配列を示す図である。

【図３】本発明に係わるペプチドであるブレビニン−２
のアミノ酸配列を示す図である。

【図４】本発明に係わるペプチドのマスト細胞からのヒ
スタミン放出活性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式【化１】及び【化２】で表されるペプチド。