JPH0683669B2 - 高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子 - Google Patents

高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子

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JPH0683669B2 JP60186518A JP18651885A JPH0683669B2 JP H0683669 B2 JPH0683669 B2 JP H0683669B2 JP 60186518 A JP60186518 A JP 60186518A JP 18651885 A JP18651885 A JP 18651885A JP H0683669 B2 JPH0683669 B2 JP H0683669B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、高等真核生物細胞における非bGHポリペプチ
ドの発現におけるbGHgDNAポリアデニレーシヨン・シグ
ナルの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は新規組
換型DNA（rDNA）化合物および、これらの新規化合物を
細胞および細胞系の発現遺伝物質に取り込ませる方法を
提供するもので、これにより、新規細胞および細胞系が
生産され、さらに、本発明のもう１つの要素を構成す
る。特に、本発明は、予め選択したポリペプチド発現の
ための、高等真核生物細胞の発現遺伝物質への組換型DN
A化合物の取り込みに関する。
発明の背景 組換型DNA化合物の合成方法はよく知られている。さら
に、これらの技術は広範囲にわたつて報告されている。
例えば、米国、ニユーヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー、コールド・スプリング・ラボラトリーの、テ
イ・マニアチスら、「モレキユラー・クローニング：ラ
ボラトリー・マニユアル」（T.Maniatis et al.,“Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,"Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York）（198
2）参照。また、組換型DNA化合物、その合成およびその
分子生物学における使用についての一般的検討に関して
は、米国ニユーヨーク州、ニユーヨーク、サイエンテイ
フイツク・アメリカン・ブツクスの、ジエイ・デイ・ワ
トソンら、「レコンビナントDNA:シヨート・コース」
（J.D.Watson et al.,“Recombinant DNA:A Short Cour
se,"Scientific American Books, New York,New York）
（1983）およびそこに開示されている種々の参考文献目
録参照。
本発明によるDNA化合物は、糖（デオキシリボース）と
ホスフエート基の間の５′−３′ホスホジエステルで相
互に結合したデオキシリボ核酸の生物学的に有用なポリ
マー化合物である。該DNAポリマーはヌクレオチド単位
のくり返しからなり、本明細書に記載のごとく、二重ら
せん配置で存在することができ、この配置では対をなす
グアニン／シトシン（G/C）およびアデニン／チミン（A
/T）塩基が水素結合を形成し、二重らせんを安定化して
いる。
DNA化合物は全ての、あるいは実質的に全ての生細胞中
に存在していることが知られている。これらのDNA化合
物は、細胞の発現遺伝物質に取り込まれた場合、例え
ば、遺伝子、プラスミドおよび染色体の要素として適性
に取り込まれた場合、該DNAの定められた塩基対配列を
伝令リボ核酸（mRNA）上に転写することができる。この
RNA上への転写工程が生細胞内におけるポリペプチドお
よび／または蛋白合成を達成させる工程である。分子生
物学的技術は、現在、取り込み前に細胞が合成できるも
の、あるいは、より高次の発現レベルで細胞にそれが本
来産生するポリペプチドの合成を可能にするもの以外の
予め選択したポリペプチドをコードする伝令塩基対RNA
上に転写する目的で、組換型DNA化合物の生細胞の発現
遺伝物質への取り込みを可能にしている。
分子生物学の研究は、しばしば、天然源からのDNA化合
物の単離、特徴づけから開始される。例えば、DNA化合
物が成熟ウシ脳下垂体から単離され、これはウシ生長ホ
ルモンもしくはbGHの合成を指令する塩基対コーデイン
グを伝令RNA上に転写する。このDNA化合物の単離および
特徴づけはヨーロツパ特許公開出願0112012号（1984年
６月27日公開）に記載されている。このDNA化合物は、b
GH分泌を司るウシ脳下垂体遺伝子から由来するので、一
般に、ゲノムDNAもしくはgDNAと称される。
一般に、このgDNAから転写により誘導される伝令RNAは
逆転写酵素を用いてDNA中にコピーできる。このRNA塩基
配列のDNA上へのコピーは通常、コピーDNAまたはcDNAと
称されるDNA化合物を生じる。哺乳動物の遺伝子につい
て、cDNAの配列は、しばしば、同じポリペプチドまたは
蛋白をコードするgDNAの配列と異なつており、とりわ
け、gDNAは、しばしば、コドンに加えてイントロンもし
くは非ポリペプチド・コーデイング配列を含む。たとえ
ば、公知のbGHgDNAは５′および３′−末端間に４つの
かかるイントロンを含む。それから転写されたmRNAに対
応する定められた部分を有する定められたgDNA配列は、
しばしば、エクソンと称される。
発現能力のある遺伝子は、伝令RNAをコードしない、エ
クソン（伝令RNA上に転写されるDNA部分）を越えるフラ
ンキング配列を含むが、これは転写工程に必須である。
伝令RNA転写が開始されるサイトから上流（５′−端の
上）は、通常、プロモーターと称される転写の促進もし
くは開始を司るDNA配列である。大部分の真核細胞にお
いては、最後のエクソンから下流（３′−端の下）のDN
A領域は、転写完了後に加えられるアデニン含有ヌクレ
オチドの長配列の伝令RNAへの付加を司る。この領域、
すなわち、「DNAポリアデニン尾部」の付加のシグナル
は伝令RNAのポリアデニレーシヨンとしても知られてい
る。
いくつかの蛋白について、このポリアデニレーシヨン・
シグナルについての要件が知られている。例えば、アー
ル・ピイ・ウオイチクら、プロシーデイングス・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・ザ・サイエンス・
オブ・ユー・エス・エイ（R.P.Woychik et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci. U S A）81:3944〜3948（1984年７月）
「ウシ生長ホルモン遺伝子の３′フランキング領域の正
確なポリアデニレーシヨンのための要件」参照。また、
ヌクレオチド配列AATAAAが該遺伝子の３′−末端から11
〜30ヌクレオチド上流（５′末端の方へ）の位置でポリ
アデニレーシヨン・シグナルを特徴づける。デイ・アー
ル・ヒツグスら、ネイチヤー（D.R.Higgs et al.,Natur
e）306:398〜400（1983年11月24日）およびその参考文
献参照。
本明細書は、高等真核生物細胞における予め選択したポ
リペプチドの発現を得る手段としてbGH以外の予め選択
したポリペプチドをコードするDNA、ことにcDNAと連結
したbGHポリアデニレーシヨン・シグナルを利用する方
法を開示する。
先行文献 bGHの同定および特徴づけは公知である。ヨーロツバ特
許公開出願0112012（1984年６月27日公開）参照。同様
に、ウシ生長ホルモンの正確なアデニレーシヨンのため
のある種の要件も公知である。アール・ピイ・ウオイチ
クら、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・ア
カデミイ・オブ・ザ・サイエンス・オブ・ユー・エス・
エイ（R.P.Woychik et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S
A）81:3944〜3948（1984年７月）参照。
発明の要約 本発明は、ことに、 (a)式 で示される環状組換型DNA化合物 〔式中、 「Ｂ」領域は、その配列がbGHポリアデニレーシヨン・
シグナルを含むヌクレオチドからなる。「Ｆ」領域は、
その定められたコドンが、bGH以外の予め選択したポリ
ペプチドの合成のための遺伝子（そのゲノムまたは他の
イントロン含有形を含む）を含むヌクレオチドからな
る。
「Ｐ」領域は、その配列が該遺伝子の転写を開始できる
プロモーターを含有するヌクレオチドからなる。
「Ｍ」領域は、その配列が、選択可能なマーカーを含有
する任意のヌクレオチドからなり、該マーカーは、該DN
A化合物が生細胞の発現遺伝物質に取り込まれることに
より、取り込みが起つた細胞を選択するために利用でき
る。〕 およびその非環状型化合物、 (b)予め選択したポリペプチド発現のための該組換型DNA
の使用方法、 (c)その発現遺伝物質が該組換型DNA化合物からなる高等
真核生物細胞または細胞系、および、 (d)その発現遺伝物質中に含まれる組換型DNA化合物がtP
AcDNAからなる「Ｆ」領域を有するそのような細胞系を
培養することからなるtPAの製造法を提供するものであ
る。
発明の詳説 本発明によれば、該新規化合物、生細胞および／または
細胞系ならびにその使用は全て、組換型DNA化合物にウ
シ生長ホルモン（bGH）ポリアデニレーシヨン・シグナ
ルを取り込ませる。ウシ生長ホルモン（bGH）は、はじ
めに、26個のアミノ酸のシグナル・ペプチドを含む前生
長ホルモンとして合成される191個のアミノ酸のポリペ
プチドである〔エル・テイ・ハントおよびエム・オー・
ダイホフ、アトラス・オブ・プロテン・シーケンス・ア
ンド・ストラクチヤー、エム・オー・ダイホフ編、ナシ
ヨナル・バイオメデイカル・リサーチ・フアンデーシヨ
ン、ワシントン・デイ・シイ（L.T.Hunt and M.O.Dayho
ff,Atlas of Protein Sequence and Structure,ed.M.O.
Dayhoff,National Biomedical Research Foundation,Wa
shington D.G.）Vol.5、補遺２、113〜139頁（197
6）；ブイ・アール・リンガツパ、エイ・デビラース・
シエリーおよびジイ・ブロベル、プロシーデイングス・
オブ・ナシヨナル・アカデミ・オブ・サイエンス（V.R.
Lingappa,A.Devillers−Thiery and G,Blobel,Proc.Nat
l.Acad.Sci.）74:2432〜2436（1977）参照〕。組換DNA
法を用いたbGHゲノム・クローンが公知であり、pgGH2R2
と称されるゲノム・クローンが米国イリノイ州、ペオリ
ア（Peoria,Illinois,U.S.A）の米国農務省、ノーザン
・レジヨナル・リサーチ・ラボラトリース（NRRL）に永
久寄託されている。これは、イー・コリ（E.coli）HB10
1宿主中に入れて寄託されており、この寄託機関におけ
る寄託番号はNRRL B−15154である。また、イー・コリH
B101宿主中に入れた、クローンpgGH2R3を含有するbGHgD
NAも寄託番号NRRL B−15155で寄託されている。
bGHgDNAヌクレオチド配列は実質的につぎのとおりであ
ることが知られている（ヌクレオチドは塩基Ａ、Ｔ、Ｇ
またはＣで示す）， 小文字はイントロン配列に相当する。mRNA転写開始およ
び終止位置を５′および３′として示してある。制限エ
ンドヌクレアーゼPst IおよびPvu IIのための認識部位
を下線で示してあり、また、実際の開裂部位も示してあ
る（開裂は二重矢印の間で起る）。PstIはヌクレオチド
を非対称的に開裂し、その末端がbGHgDNAのTGCA配列に
対応する４つの対をなさない塩基を含むDNA化合物を生
じる。これらの配列がT4DNAポリメラーゼによつて除去
されると（すなわち、対をなさない、もしくは粘着末端
残基の除去）、平滑末端DNA化合物が生じる。生じた有
効もしくはPstI（平滑）開裂部位は下方の矢印で示して
ある。ポリアデニレーシヨンにともなうヌクレオチド配
列に下線を付してある。
本発明によれば、bGHポリアデニレーシヨン・シグナル
は、その官能中心がゲノムbGH遺伝子のほぼ３′−末端
付近に位置し、このbGH遺伝子の伝令RNA上への転写に際
し、ポリアデニレーシヨン（アデニン含有ヌクレオチド
の長鎖または「尾」の付加）を伝令RNA（mRNA）にシグ
ナルできるヌクレオチド配列のDNAである。したがつ
て、bGHポリアデニレーシヨン・シグナルは、該ゲノム
配列におけると同様に、３′−末端と、そこから約50〜
500ヌクレオチド下流（すなわち、５′−末端から離れ
る）までの配列のヌクレオチドを含む。しかし、より好
ましくは、該ポリアデニレーシヨン・シグナルは、bGH
ゲノムDNA（gDNA）の３′−末端から下流、約70ヌクレ
オチド以下を含む。ポリアデニレーシヨン・シグナルの
上流（すなわち、５′−末端に向う方向）は３′−末端
と、そこから約50ヌクレオチド上流までの間のゲノム配
列を含むが、また、それよりも実質的に多数のかかる上
流ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。たとえば、制
限エンドヌクレアーゼに対する都合よい開裂部位の位置
は実質的により多数の上流ヌクレオチドの容易な使用を
可能にする。したがつて、ポリアデニレーシヨン・シグ
ナルは式： 〔式中、「Ｕ」領域は３′−末端から上流のbGHDNAのヌ
クレオチド配列および「Ｄ」領域は３′−末端から下流
のヌクレオチド配列を表わす〕 で示されるDNA化合物として表わすことができる。
前記のbGHポリアデニレーシヨン・シグナルの選択につ
いてのパラメータの中で、該シグナルからなる実際のDN
A化合物は、公知の制限エンドヌクレアーゼでの開裂に
より、bGHgDNAから調製できる。ついで、得られたDNA化
合物は、実際に制限エンドヌクレオチドによりbGHgDNA
から開裂されるヌクレオチドを越えて、さらにいくつか
のbGHポリアデニレーシヨン・ヌクレオチドの「刈込み
（pruning）」または開裂後、シグナルとして用いるこ
とができる。該DNA化合物の刈込みを行なうエクソヌク
レアーゼを用いる技術は公知である。前記文献参照。
別法として、bGHgDNAから切り取られたポリアデニレー
シヨン・シグナルにさらにヌクレオチドを付加して、非
ゲノム配列を含むより大きなポリアデニレーシヨン・シ
グナルを作ることができる。例えば、得られたゲノムbG
HgDNA配列が３′−末端から上流50個のヌクレオチドお
よび下流50個のヌクレオチドからなる場合、本発明のbG
Hポリアデニレーシヨン・シグナルからなる実質的によ
り大きなDNA化合物を得るために、非ゲノムDNA化合物を
その上流または下流（もしくは両方）で結紮することが
できる。
所望により、総合または部分化学合成を用いて前記のい
ずれのbGHポリアデニレーシヨン・シグナルを調製でき
る。
合成および単離の都合上、本発明のbGHポリアデニレー
シヨン・シグナルの好ましい具体例はｐλGH2R2のPvuII
制限エンドヌクレアーゼによつてbGHgDNAを開裂して得
られる生成物である。別法として、いく分長いbGHポリ
アデニレーシヨン・シグナルがPstIを用いる消化によ
り、都合よく得られる。
式（Ｉ）のDNA化合物の「Ｆ」領域は、遺伝子、好まし
くは、cDNA遺伝子のアミノ酸コーデイング・ヌクレオチ
ドを示している。さらに詳しくは、「Ｆ」領域は、bGH
以外の予め選択されたポリペプチド合成用に定められた
コドンであるヌクレオチドからなる。別法として、ゲノ
ムDNAは「Ｆ」領域のcDNAならびに、イントロンおよび
アミノ酸をコードしないヌクレオチドを含む他の遺伝子
の代わりに用いることができる。選択するポリペプチド
には、遺伝子コーデイングが公知であるか、公知の技
術、すなわち、部分または全化学合成によつて構成でき
るいずれのポリペプチドも包含される。したがつて、か
かるポリペプチドには、ヒト血清アルブミン、インター
フエロン類およびその種々の類似体、ウシ生長ホルモン
以外の生長ホルモン、ワクチンに有用な免疫原性蛋白、
インターロイキン２およびインシユリンが包含される。
本発明による好ましい具体例は、「Ｆ」領域において組
織プラスミノーゲン活性化物質（tPA）cDNA遺伝子を用
いて高等真核生物細胞中でtPA発現をすることのできる
組換型DNA分子を作ることである。イー・コリにおける
ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質cDNAのクローニン
グおよび発現は公知であり、ネーチヤー（Nature）301:
214〜221（1983年１月20日）に記載されている。この公
知の方法はtPAcDNAを得るための有用な手段である。
式（Ｉ）の「Ｐ」領域は、「Ｆ」領域を構成する遺伝子
のRNAポリメラーゼによる転写を開始させることのでき
るプロモーターからなる。ゲノム源から「Ｆ」領域が形
成される場合「Ｐ」領域は、すでにそこに含まれている
プロモーターからなることができる。別法として、ま
た、特に、「Ｆ」領域がcDNAからなる場合、公知の、す
でに遺伝子工学分野で入手可能な多くの有用なプロモー
ターから別の「Ｐ」領域を選択し、取り込ませる。これ
らには、SV40プロモータ〔ジヤーナル・オブ・モレキユ
ラー・アンド・アプライド・ジエネテイツクス（Journa
l of Molecular and Applied Genetics）1:327〜341お
よびその参考文献参照〕およびLTRプロモーター（米国
特許第4405712号参照）が包含される。本発明による好
ましいプロモーターはGMV I.E.プロモーター、もつとも
好ましくは、Sau3A制限エンドヌクレアーゼから由来す
るそのフラグメントである。主即時初期遺伝子（CMV I.
E.）を含有するヒト・サイトメガロウイルス（CMV）ゲ
ノムの領域の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図は詳細に
記載されている〔ステインスキイら、ジヤーナル・オブ
・バイロロジイ（Stinski,et al.,J.Virol.）46:1〜14
（1983）；ステンベルグら、ジヤーナル・オブ・バイロ
ロジイ（Stenberg,et al.,J.Virol.）49:190〜199（19
84）；トムセンら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エ
ス・エイ（Thomsen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S
A）81:659〜663（1984）〕。これらの文献は該主即時初
期遺伝子用のプロモーターを含有する2.0キロベース（k
b）のPstIフラグメントを記載している。この2.0kb Pst
Iフラグメントを単離し、Sau3A Iで消化すると、種々の
生成物のうち、760塩基対フラグメントが得られる。こ
の760塩基対フラグメントは、その大きさおよび、フラ
グメントの中にSac I開裂部位およびBal I開裂部位が存
在することにより他の生成物と区別できる。その都合よ
い同定のため、このSau3A Iフラグメントの利用が本発
明のおける該CMV I.E.プロモーターの使用の好ましい方
法である。
「Ｍ」領域は、所望により、該組換型DNA化合物が生細
胞の発現遺伝物中に取り込まれたか否かを判定するため
に用いることのできる選択可能なマーカーを提供する。
このようなマーカーの使用およびその選択の原理はよく
知られている。選択可能なマーカーには抗生物質耐性遺
伝子が包含され、これは、取り込まれないと該抗生物質
が致死性である生細胞への取り込み判定に有用である。
例えば、哺乳動物細胞において、アミノグリコシド抗生
物質G418は蛋白合成を阻害し、細胞を致死させる。した
がつて、該G418耐性遺伝子は適当な選択可能マーカーと
なる。同様に、ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ（dhfr）遺
伝子は、dhfr欠損を生じる細胞（例えば、チヤイニーズ
・ハムスター卵巣細胞）の有用なマーカーを提供する。
式（Ｉ）のDNA化合物上のマーカーの利用を必要としな
い選択のもう１つの技術は共転移（cotransference）技
術の使用で、これにより、マーカーのない式（Ｉ）の化
合物と、マーカーを含む別のDNA分子の両方を１つの細
胞に共転移させる（米国特許第4399216号（コロンビア
大学）参照）。高等真核生物細胞の発現遺伝子物質への
取り込みは公知方法で行なわれる。典型的には、取り込
みは細胞中の染色体構造にDNA化合物の存在をもたらす
が、例えば、組換型ウシ乳頭腫ウイルスの利用のよう
な、染色体外取り込みによつても行なうことができる
〔このような取り込み方法については、エヌ・ヒジウン
グら、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・アンド・アプ
ライド・ジエネテイクス（N.Hsiung,et al.,J.Molecula
r and Applied Genetics）2:497〜506（1984）参照〕。
式（Ｉ）の化合物は環状組換型DNA分子として表わして
いるが、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる特定の
部位で、また、他のヌクレアーゼ等によるより任意の開
裂の結果としての、その非環状形も存在する。本発明は
これらの環状および非環状組換型DNA化合物の両方を提
供するものである。
また、本発明は、予め選択したポリペプチドの発現のた
めの式（Ｉ）の組換型DNA化合物の使用も提供するもの
である。この使用は該組換型DNA化合物を高等真核生物
細胞また細胞形の発現遺伝物質中に挿入することにより
行なわれる。本発明による高等真核生物細胞および細胞
系には複細胞生物から由来する細胞および細胞系、こと
に、哺乳動物細胞および細胞系が包含される。これらの
細胞または細胞系を公知の方法で培養すると、予め選択
したポリペプチド、例えば、組織プラスミノーゲン活性
化物質（tPA）が得られる。
したがつて、本発明は、得られる組換型構造物における
bGHポリアデニレーシヨン・シグナルの新規な使用も提
供する。
後に示すチヤートに本発明の構造および操作をさらに詳
しく示してある。
プラスミドが環状DNAであるので、便宜上、それらは、
しばしば、円で表わされる。しかし、本明細書において
は、チヤートおよび式を含め、プラスミドの別の表現法
を用いている。すなわち、基本的に、その水平辺がプラ
スミドのDNAヌクレオチドを表わし、２つの垂直辺の各
々が、水平辺の各々の上に表わされている架橋ヌクレオ
チドを結合する通常のホスホジエステル結合を表わす長
方形として示している。さらに、垂直辺は、該プラスミ
ドについての転写方向を示す方向矢印で表わしてある。
プラスミドのこの長方形表示を円形表示に翻訳するに際
しては、もつとも都合よくは、長方形の左側辺を円の最
上点に対応させる。すなわち、長方形の右側辺は円の最
下点に対応する。長方形表示の水平辺の上の垂直線は制
限エンドヌクレアーゼの開裂部位または特定のヌクレオ
チド配列の開始または終止位置に対応する。この特定の
ヌクレオチド配列は、さらに、水平線上に示すアルフア
ベツト文字によつて特徴づけることができる。同様に、
制限エンドヌクレアーゼについての開裂部位の位置は矢
印およびそれらの酵素の標準的略号で示してある。ここ
で用いるプラスミドの表示法の１つの利点は、長方形の
垂直辺の一方または両方を除いて、DNAの線形フラグメ
ントが環状プラスミドと同じに正確に示されることであ
る。両方の垂直を除くと、DNAは、その複製方向が別々
に、適宜水平方向の矢印で示される一本の水平線で表わ
される。
かくして、本明細書において、DNA化合物、すなわち、
その配列ヌクレオチドがアデニン（Ａ）、チミン
（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選ば
れる重合デオキシリボ核酸を水平線で部分的に示す場
合、該線は通常のホスホジエステル結合または分離した
いくつかのDNA残基を示す。これらの残基は、例えば、
遺伝子、プロモーター、マーカーまたはエンドヌクレア
ーゼ制限酵素部位を引用してさらに特徴化または特定化
しない限り、それらの非特徴化介在配列の大きさ、位置
および、機能化および／または特徴化配列に対する近接
についての公知の制限を受ける以外、任意に構成するこ
とができる。換言すると、これらの介在配列は、得られ
たDNA化合物の意図する目的に対する適合性を無効にし
てはならない。しかし、さらに好ましくは、該介在配列
は、意図する目的をさらに高める（例えば、予め選択し
たポリペプチドの発現レベルを高める）、あるいは、広
範囲の宿主の選択を可能にする（例えば、抗生物質耐性
遺伝子の包含）、予め選択した有用なヌクレオチド配列
を含有する。したがつて、本明細書の式で示すごとく、
該DNA化合物は、所望により、発現的に指定される配列
に加えて、構造的および／または機能的特徴を有するヌ
クレオチドの配列を含む。
チヤートについて、チヤートＡは該DNA化合物調製の一
般的方法を示す。チヤートＡに従い、予め選択したポリ
ペプチドをコードするヌクレオチドを含有するプラスミ
ドpXを制限エンドヌクレアーゼで消化し（チヤート中の
Res IおよびRes IIのように任意に消化）、該ポリペプ
チド用に実質的に定められた所望のコドンを含む式（I
I）のDNA化合物を得る。式（II）は、例えば、好ましく
は、該ポリペプチドをコードするcDNA化合物である。pX
のようなプラスミドの入手が都合よくない場合、式（I
I）の化合物の調製に全または部分化学合成を採用して
もよい。同様に、都合のよい制限エンドヌクラアーゼ部
位を欠く式（II）の化合物について、公知方法による化
学的修飾を用いて式（II）の化合物を得ることもでき
る。
チヤートＡによるつぎの工程は適当なマーカーを含む式
（III）のDNA化合物の調製である。すなわち、Res IIお
よびRes IIIのように任意に指定して制限エンドヌクレ
アーゼ部位でプラスミドpMを消化して、選択可能なマー
カーを含有する式（III）の化合物を得る。
式（II）及び式（III）のDNA化合物の組換えにより、式
（Ｖ）のDNA化合物を得る。
bGHポリアデニレーシヨン・シグナルを式（Ｖ）の化合
物に取り込ませるため、bGHgDNAを含むプラスミドpbGH
を、Res IIIおよびRes IVとして任意に示す制限エンド
ヌクレアーゼで消化する。これにより、bGHポリアデニ
レーシヨン・シグナルを含有する式（IV）のDNA化合物
を得る。選択する実際のRes IVに応じて、式（IV）のDN
A化合物はbGHgDNAからのイントロンを含む。所望によ
り、プラスミドpbGHの制限エンドヌクレアーゼによる消
化生成物は、さらに、他のヌクレアーゼで消化して修飾
でき、式（IV）のポリアデニレーシヨン・シグナルを得
る。別法として、もちろん、式（IV）の生成物は公知の
方法による全または部分化学合成により、簡単に誘導で
きる。
ついで、式（IV）および式（Ｖ）の化合物を結紮して、
式（VI）のプラスミドを得、これは、適当な制限エンド
ヌクレアーゼ、ここではRes IIで消化し、プロモーター
に結紮すると、式（Ｉ）のDNA化合物が得られる。式
（Ｉ）の化合物の成分を示す該DNA化合物の組立の順序
は一般に臨界的ではなく、入手しうる出発物質により、
もつとも都合よい順序とすることができる。したがつ
て、チヤートＡおよびそれ以降のチヤートは組立順序の
変動に応じて修飾してよい。
チヤートＢは、式（Ｉ）のDNA化合物調製に用いるbGHポ
リアデニレーシヨン・シグナルを得るのに有用なプラス
ミド調製用の都合よい方法を示す。
チヤートＢに従つて、プラスミドpSV2dHRをチヤートＢ
に示すような適当なエンドヌクレアーゼで消化し、アン
ピシリン耐性遺伝子（チヤートＢでAmpで示す）、SV40
複製開始点および付随するプロモーター、ならびに、マ
ウス・ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ（dhfr）遺伝子を含
む式（VI）のDNA化合物を得る。このプラスミドの調製
および使用は、エス・スブラマニら、モレキユラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジイ（S.Subramani,et al.,M
olecular and Cellular Biology）2:854〜864（1981年
９月）、「シミアン・ウイルス40におけるマウス・ジヒ
ドロ葉酸塩レダクターゼ補助デオキシリボ核酸の発現」
に記載されている。同様に、チヤートＢに関し、プラス
ミドｐλGH2R2を同じ制限エンドヌクレアーゼで消化
し、bGHgDNAを含有する式（VII）のDNA化合物を得る。
プラスミドｐλGH2R2はイー・コリHB101宿主、NRRL B−
15154から由来する。このプラスミドは公知であり、公
知の方法により容易に製造される（ヨーロツパ公開出願
83306655.8（1984年６月27日発酵）参照〕。
ついで、式（VI）および式（VII）のDNA化合物を結紮し
て式（XI）のpSVCOW7が得られる。
チヤートＣはDNA化合物、すなわち、式（XII）〜式（XI
V）の化合物調製におけるプラスミドpSVCOW7の使用を記
載しており、これらの化合物はチヤートＥの式（Ｘ）お
よび式（XII）の合成に有用である。すなわち、チヤー
トＣはそこに示す制限エンドヌクレアーゼを用いる消化
による種々の式（XII）、式（XIII）および式（XIV）の
化合物の調製を示している。
式（XIV）の化合物について、EcoRIおよびPstI エンド
ヌクレアーゼの消化の後、Pst I部位においてDNAポリメ
ラーゼを作用させ、平滑末端もしくは塩基が完全に対合
した式（XIV）の化合物を得る。
また、チヤートＣには、プラスミドpPSA18からtPAcDNA
の調製も示されている。この式（XV）プラスミドの調製
は、好ましい具体例で、BamHI部位における末端アミノ
酸をコードする領域におけるBamHIおよびBal I 制限ヌ
クレアーゼによる修飾の詳細を含んでいる。
本発明により、式（XIII）および式（XIV）の化合物は
有用なbGHポリアデニレーシヨン・シグナルを表わす。
これらの式（XIII）および式（XIV）の化合物のヌクレ
オチド配列は、各々、Pvu II開裂部位またはPst I（平
滑末端）開裂部位から、bGHgDNAについて前記した塩基
の末端まで、前記のbGHgDNAについて定められた配列か
らなる。
チヤートＤは、pTPA−IPA−dhfr およびpTPA−PA−dhf
rの２つのプラスミドを調製する方法を示す。これらの
プラスミドは、各々、式（XIV）または式（XIII）のポ
リアデニレーシヨン・シグナルのいずれかを含む。チヤ
ートＤの方法により、チヤートＣで得られた式（XII）
の化合物がチヤートＣの式（XVI）の化合物に結紮され
てDNA化合物を生じ、これは、ついで、式（XIV）のポリ
アデニレーシヨン・シグナルか、式（XIII）のポリアデ
ニレーシヨン・シグナルと結紮される。得られた生成物
は式（XVII）のイントロン含有bGHポリアデニレーシヨ
ン・シグナルおよび、そのbGHポリアデニレーシヨン・
シグナルがこのイントロンを含まない式（XVIII）の化
合物で表わされる。
チヤートＥは、有用なプロモーターを含有する式（Ｘ）
および式（XII）の化合物の製法を示す。チヤートＥに
従い、CMV I.E. プロモーター（エンドヌクレアーゼSa
u3A Iの消化で得られた760塩基対フラグメント）を式
（XVII）の化合物を制限エンドヌクレアーゼBamHIで消
化して得られるDNA化合物と結紮し、ついで、細菌性ア
ルカリ・ホスフアターゼで処理する。得られた式（Ｘ）
の化合物は本発明の式（Ｉ）のDNA化合物の１つであ
る。同様に、チヤートＥは、出発物質として式（XVII）
の化合物の代りに式（XVIII）の化合物を用いる場合の
式（XII）の化合物の製法も示している。
前記した一般的および特定の方法に従い、分子生物学に
おいて公知の標準的技術により、種々の式（Ｉ）の環状
組換型DNA化合物が製造される。これらの式（Ｉ）の化
合物の全てが、公知のヌクレアーゼの１つを用いて行な
うことのできるホスホジエステル結合の開裂で非環状形
に調製できる。
これらの式（Ｉ）の組換型DNA化合物は、高等真核生物
細胞又は細胞系の発現遺伝物質に取り込ませることによ
り、予め選択したポリペプチドの合成に有効に用いるこ
とができる。前記のごとく、この高等真核生物細胞また
は細胞系の発現遺伝物質への取り込みは、例えば、式
（Ｉ）の化合物のトランスフエクシヨンを含む公知の方
法で行なうことができる。一旦、高等真核生物細胞また
は細胞系の発現遺伝子物質が式（Ｉ）の化合物を取り込
めば、そのような細胞系を培養する公知の技術を用いて
予め選択したポリペプチドの発現を生じさせることがで
きる。
発現された予め選択したポリペプチドを、ついで、常法
により細胞培養から回収する。予め選択した各ポリペプ
チドは、ついで、公知の方法により、公知の医薬用途に
使用することができる。あるいは、ポリペプチドは栄養
的にも有用である。
好ましい具体例 つぎに調製例および実施例を挙げて、本発明をさらに詳
しく説明する。プラスミドの調製を含め、本発明で用い
るDNA化合物合成の全ての方法は分子生物学の研究分野
でよく知られた標準的技術である。これらの技術は、例
えば、前記テイ・マニアチスらの「モレキユラー・クロ
ーニング：ラボラトリー・マニユアル」に収集されてい
る。
調製例１ プラスミドpSVCOW7の合成 チヤートＢ参照 プラミドpSV2dhfr〔エス・スブラマニ、モレキユラー・
アンド・セルラー・バイオロジイ（S.Subramani,Molecu
lar and Cllular Biology）2:854〜864（1981年９月）
の方法に従つて調製〕をBamHIおよびEcoRIで消化し、ア
ンピシリン耐性遺伝子、SV40複製開始点およびdhfr遺伝
子を含むフラグメントを得る。プラスミド ｐλGH2R2
からのもう１つのフラグメントを同じ制限エンドヌクレ
アーゼで消化してゲノム・ウシ生長ホルモン遺伝子を含
有するDNA、すなわち、bGHgDNAを得る。ｐλGH2R2はイ
ー・コリHB101宿主、NRRL Ｂ−15154から得られる。得
られた式（VII）のbGHgDNAフラグメントを式（VI）の化
合物と結紮して式（XI）のプラスミドpSVCOW7を得る。
調製例２ プラスミドpPSA18の合成 チヤートＣ参照 ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（tPA）の完全長c
DNAクローンを入手または調製する。tPAcDNA調製には公
知の方法、例えば、ペニカら、ネーチヤー（Pennica,et
al.,Nature）301:214〜221（1983年１月20日）が利用
できる。ついで、tPAcDNAを制限エンドヌクレアーゼHga
Iで切断し、末端をDNAポリメラーゼＩクレノー・フラグ
メントで処理する。ついで、BamHI リンカーをHga I末
端に結紮する。得られたcDNAを制限エンドヌクレアーゼ
Nar で開裂し、490塩基対フラグメントを単離する。こ
れはtPAのＮ−末端アミノ酸に関するコーデイング配列
を含む。このDNA化合物は１つのNar I末端および、予め
BamHIリンカーと結合させた１つのHga I末端を有する。
別の反応で、tPAcDNAをNar IおよびBgl IIの両方で消化
する。1650塩基対Nar I/Bgl IIフラグメントを単離す
る。これはtPAのＣ−末端アミノ酸に関するコーデイン
グ配列を含む。前記で得られたＮ−末端およびＣ−末端
フラグメントを、ついで、プラスミドpKC7〔ラオら、ジ
ーン（Rao,et al.,Gene）7:70〜82（1982）の方法によ
り調製〕に結紮して表記のプラスミドpPSA18を得る。こ
のプラスミドはtPAについての全コーデイング領域を示
し、また、コーデイング領域の５′−非翻訳領域中に特
有のBamHI開裂部位を有する。
実施例１ プラスミドpTPA−PA−dhfr、pTPA−IPA−dhfr、pIE−TP
A−PA−dhfrおよびpIE−TPA−IPA−dhfrの製造 tPA発現プラスミドの組立を以下のごとく２工程で行な
う。
Ａ工程１（チヤートＣおよびＤ参照） つぎのDNA片を一体に結紮する。
(1)pSVCOW7（式XI）からのEcoRI/BamHIフラグメント
（式II）。これは、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリー
ス（Bethesda Research Laboratories）から入手できる
親プラスミドpSV2dhfrからのEcoRI/BamHIフラグメント
としても誘導される。この式（XII）のフラグメントはp
BR322からの複製開始点およびイー・コリで発現するア
ンピシリン耐性遺伝子を含有し、イー・コリ中でのプラ
スミドの複製を可能にする。該フラグメントはその構造
中にマウス・ジヒドロ葉酸塩レダクターゼcDNAも含み、
哺乳動物細胞における発現を可能にする（スブラマニ
ら、モレキユラー・アンド・バイオロジイ（Subramani,
et al.,Mol.Cell.Biol.）1:854−864（1981）参照）。
(2)プラスミドpPSA18（式Ｖ）からのBamHI/BalIフラグ
メント（式VI）。これはtPAcDNAからの完全コーデイン
グ領域を含有する。BamHI切断はmRNAの５′−非翻訳配
列をコードするcDNA中にあり、Bal I切断はcDNAの３′
−非翻訳配列をコードするcDNA中にある。
(3)各々bGHポリアデニレーシヨン部位を含む２つのフラ
グメントをつぎのようにして得る。
(a)pSVCOW7からのPvu II/EcoRIフラグメント（式II
I）。これは、bGH遺伝子の３′最大エクソン中のPvu II
部位から、３′−末端から下流のEcoR I部位まで伸長す
る全ウシDNAである。
(b)pSVCOW7からのPst I/EcoRIフラグメント（式IV）。
これは、bGH遺伝子の第４エクソン中のPst I部位から、
３′−末端から下流のEcoR I部位まで伸長する全ウシDN
Aである。
前記フラグメント(1)−(2)−(3)(a)およびび(1)−(2)−
(3)(b)の結紮結果は、各々、つぎの２つのプラスミドで
ある。
(a)pTPA−PA−dhfr（式XVII）。これは、その３′末端
に結紮したbGHポリアデニレーシヨン領域を有するtPAcD
NAを含有する。
(b)pTPA−IPA−dhfr（式XVIII）。これは、その３′末
端に結紮した、イントロンを含む、bGH遺伝子の３′−
末端からのより長いセグメントを有するtPAcDNAを含
む。
式（XVII）および式（XVIII）両方のプラスミド共にtPA
cDNA の５′−末端に特有のBamHI開裂部位を含む。
B.工程２（チヤートＥ参照） 工程１で調製した両方のプラスミドをBamHIで開裂し、C
MV即者初期プロモーターを含有するSau 3AI フラグメ
ントをBamHI部位に結紮する。プロモーターからの転写
がtPAに対するmRNAを合成するような方向で挿入フラグ
メントを含有するプラスミドをSac I による開裂で同
定する。得られるプラスミドはつぎのとおりである。
(a)CMVプロモーターを５′−末端に、bGHポリアデニレ
ーシヨン・シグナルをその３′−末端に有するtPAcDNA
を含有するpIETPA−PA−dhfr（式XII）。
(b)bGH遺伝子の３′−末端からのより長い片を含み、イ
ントロンを含む以外は(a)と同じpIETPA−IPA−dhfr（式
XI）。
実施例２ 細胞へのトランスフエクシヨン 前記実施例１、工程２から誘導された両方のプラスミド
を、通常のトランスフエクシヨン技術を用いてジヒドロ
葉酸塩レダクターゼ（dhfr）欠損チヤイニーズ・ハムス
ター卵巣（CHO）細胞にDNA感染させる。この細胞系はエ
ル・カシン、コロンビア大学（L.Chasin,Columbia Uni
v.）プロシーデイング・オブ・ナシヨナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エイ（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA）77:4216〜4220（1980）からの変異D
XB−11である。
このトランスフエクシヨン法は、グラハムら、イントロ
ダクシヨン・オブ・マクロモレキユール・インツウ・バ
イアブル・マンマリアン・セルズ、アラン・アール・リ
ス・インコーポレーテツド、ニユーヨーク（Graham et
al.,Introduction of Macromolecules into Viable Mam
malian Cells,Alan R.Liss.Inc.,N.Y.）1980,pp3〜25に
詳細に記載されている、DNAの細胞中の、リン酸カルシ
ウム・トランスフエクシヨンを用いる。DNA感染プラス
ミドを取り込んだ細胞を、プロリン加ダルベツコ修飾イ
ーグル培地中での増殖によりdhfr欠損に基いて選択す
る。
チヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞は前記で得られた式
（Ｘ）および式（XII）の化合物のようなプラスミドに
用いるのに特に適しているが、該tPA遺伝子発現中のCMV
I.E.プロモーターおよびbGHポリアデニレーシヨン部位
の使用はこれらのプラスミド上のdhfrマーカーの使用に
依存するものではない。cDNA遺伝子の発現は、抗生物質
G418に対する耐性を与える遺伝子〔ジヤーナル・オブ・
モレキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイツクス
（J.Mol.Appl.Genet.）1:327〜341（1982）〕のような
別の選択可能マーカーを用い、dhfrマーカーの代りに他
のマーカーを有する他の細胞系でも得られる。したがつ
て、そのような置換は該プラスミドに対する宿主として
多くの別の細胞系の使用を可能にする。
実施例３ tPA発現 pIETPA−PAdhfrでのDNA感染させた細胞からクローンを
単離し、単層で２日間増殖させ、少なくとも100ng tPA/
100万細胞を合成する。pIETAPA−IPA−dhfrを用いた細
胞から、クローンを単離し、少なくとも10ng tPA/100万
細胞を合成する。
したがつて、本発明は伝令RNAの必要なポリアデニレー
シヨンを得る方法、ことに、予め選択したポリペプチド
をコードするcDNA遺伝子からの転写方法を提供する。こ
れにより、高等真核生物細胞における発現にそのような
cDNAの使用が可能となり、ことに、驚くべきことに、ま
た、以外にも、高収率が得られることが判明した。
前記の好ましい具体例に加え、もつとも好ましくは、bG
Hポリアデニレーシヨン・シグナルはつぎのヌクレオチ
ド配列： およびその機能的均等物からなる。「機能的均等物」な
る語は該ヌクレオチド配列によつて示される化合物と実
質的に同じ生物学的役割を果すが、その１つ以上のヌク
レオチドが、例えば、１つのヌクレオチドが他のもので
置換されることによつて修飾されているヌクレオチド配
列を意味する。
このもつとも好ましい具体例は前記した一般的な方法、
すなわち、bGHgDNAの消化および／または化学的合成に
より調製できる。
式（Ｌ）のbGHポリアデニレーシヨン・シグナルはつぎ
のようにして得られる。その３′−フランキング配列の
400bPと共に、全ウシ生長ホルモン遺伝子を含む2.2Kb B
amHI/EcoRI制限フラグメントを含有するプラスミドpSVB
3/Baをピー・エヌ・エイ・エス（PNAS）81,3944〜3948
（1984年７月）の記載に従つて調製する。周囲の配列の
一連の欠失を作り、野生型bGH3′−末端の正確な、効率
よい生産を可能とする最少の充分なポリアデニレーシヨ
ン配列を得る。この欠失は２工程で生じさせる。一連の
Bal−31欠失が、bGHをコードするヌクレオチドとpBR322
配列の接合点におけるEcoRI部位からポリアデニレーシ
ヨン部位の３′−末端方向の上流に向つて伸長してい
る。該ポリアデニレーシヨン・シグナルの５′−境界は
pSVB3/Baクローン中のSma I部位を利用して同様に規定
できる。野生型３′−末端を生じる欠失は３′−bGH−
特定配列の52ヌクレオチドを含有し、ヘキサヌクレオチ
ドAATAAAから10ヌクレオチド上流まで伸長している。チ
ヤートＦはこれらの欠失の実験的詳細を示す。一般的操
作は公知の方法で行なわれる。前記、マニアチスらの
「モレキユラー・クローニング：ラボラトリー・マニユ
アル」参照。
欠失の大きさはサンガー（Sanger）ジデオキシ塩基配列
決定で行なわれる。各欠失変異体のポリアデニレーシヨ
ンの正確さは、リン酸カルシウム沈澱によるCos−１細
胞のトランスフエクシヨン、ついで、一時的に発現され
たＡ＋RNAのS1地図作成により決定される。各欠失の野
生型（pSVB3/Ba）と比較したポリアデニレーシヨン効率
を同じＡ＋RNAのノーザン・ブロツト分析で概略決定す
る。式（Ｌ）で示すように、ポリアデニレーシヨン・シ
グナルは52ヌクレオチドからなるポリアデニレーシヨン
を正確に、効率よく指令し、ヘキサヌクレオチドAATAAA
の10ヌクレオチド上流から、ポリアデニレーシヨン部位
の18ヌクレオチド下流までを含む。式（Ｌ）において、
ヘキサヌクレオチドおよびポリアデニレーシヨン部位に
下線を付している。
実施例４ 実施例1Aの操作において、フラグメント(1)および(2)を
式（Ｌ）のヌクレオチド配列で結紮すると、tPAcDNAを
含有するpTPA−52PA−dhfr（式XL）と定義されるプラス
ミドが得られ、これは、その３′末端に結紮された式
（Ｌ）の52ヌクレオチド塩基対ポリアデニレーシヨン領
域を有する。
実施例1Bの操作において、前記で得られたプラスミドを
式（XVII）および（XVIII）のプラスミドの代りに用い
て、プラスミドpIETPA−52PA−dhfr（式XLI）が得られ
る。これは、５′−末端にCMVプロモーターおよび３′
−末端に式（Ｌ）の52塩基ヌクレオチドbGHポリアデニ
レーシヨン・シグナルを有するtPAcDNAを含有する。
実施例２および３の操作において、式（XI）および（XI
I）のプラスミドの代りに式（XLI）のプラスミドを用
い、一般的方法を行なうと、tPAの発現が達成される。
用いた記号 BBBBB＝bGHポリアデニレート・シグナル、関連ヌクレオ
チド含有可。
FFFFF＝予め選択したポリペプチドをコードするヌクレ
オチド。
MMMMM＝所望により選択できるマーカー。
GGGGG＝ゲノムbGHヌクレオチド、ただし、もしあれば、
bGHポリアデニレーシヨン・シグナルおよび「Ｂ」領域
のような関連ヌクレオチドを除く。
注〕:pλCH2R2はイー・コリHB101宿主、NRRLB−15154か
ら由来するプラスミド。
pSV2dHRは、エス・サブラマニら、モレキユラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（S.Subramani,et al.,Mol
ecular and Cellular Biology）2:854−864（1981年９
月）の方法で調製したプラスミド。
用いた記号 BBBBB＝bGHポリアデニレート・シグナル、関連ヌクレオ
チド含有可。
FFFFF＝予め選択したポリペプチドをコードするヌクレ
オチド。
MMMMM＝所望により選択できるマーカー。
GGGGG＝ゲノムbGHヌクレオチド、ただし、もしあれば、
bGHポリアデニレーシヨン・シグナルおよび「Ｂ」領域
のような関連ヌクレオチドを除く。
OOOOO＝dhfr遺伝子 用いる記号 GGGIIIGGGG＝イントロン（III）含有ゲノムbGH遺伝子 GGGGGGG＝ゲノムbGH遺伝子（イントロンなし） TTTTTTT＝tPA遺伝子 PPPPPPP＝CMV I.E.プロモーター OOOOOOO＝dhrf遺伝子 用いる記号 GGGIIIGGGG＝イントロン（III）含有ゲノムbGH遺伝子 GGGGGGG＝ゲノムbGH遺伝子（イントロンなし） TTTTTTT＝tPA 遺伝子 PPPPPPP＝CMV I.E.プロモーター OOOOOOO＝dhrf遺伝子 用いる記号 GGGIIIGGGG＝イントロン（III）含有ゲノムbGH遺伝子 GGGGGGG＝ゲノムbGH遺伝子（イントロンなし） TTTTTTT＝tPA 遺伝子 PPPPPPP＝CMV I.E.プロモーター OOOOOOO＝dhrf遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダニエル・ピー・パレルモ アメリカ合衆国ミシガン州、カラマズー、 パー４サークル1124番 (72)発明者 レオナルド・イー・ポスト アメリカ合衆国ミシガン州、カラマズー、 ドリフトウツド・アベニユー5193番 (72)発明者 フリツツ・マツクス・ロツトマン アメリカ合衆国オハイオ州、ペツパー・パ イク、ゲイツ・ミルズ・ブールバード 28500番 (72)発明者 ダレル・アール・トムセン アメリカ合衆国ミシガン州、カラマズー、 ウイルソン・ドライブ6916番 (72)発明者 リチヤード・ピー・ウオイチク アメリカ合衆国マサチユセツツ州ボスト ン、アパートメント1903、ハンチントン 835番 (56)参考文献 欧州特許112012 ＭＯｌ．ＣＥＬＬ，ＢＩＯＬ．，1982 〔２〕Ｐ．1304−1319

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）ウシ成長ホルモン以外のポリペプチ
    ドをコードするDNA配列；および （ｂ）ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニレーション
    ・シグナルよりなり、 該ポリアデニレーション・シグナルがヌクレオチド配
    列： ５′GTCCTTTCCTAATAAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGT
    AGGTGTC3′よりなり； ウシ成長ホルモン以外のポリペプチドをコードする該DN
    A配列が該ポリアデニレーション・シグナルより上流に
    あり、かつそれに作動可能に連結していることを特徴と
    する組換えDNA分子。
  2. 【請求項２】さらにプロモーターよりなり、該プロモー
    ターが、ウシ成長ホルモン以外のポリペプチドをコード
    する該DNA配列より上流にあり、かつそれに作動可能に
    連結している請求の範囲第１項記載の組換えDNA分子。
  3. 【請求項３】該ポリアデニレーション・シグナルが、ア
    ミノ酸190〜192についてのコドンの暗号におけるPvuII
    切断部位から、それより下流の次の引き続いてのEcoRI
    切断部位までのウシ成長ホルモンのゲノムDNAヌクレオ
    チド配列よりなる請求の範囲第１項記載の組換えDNA分
    子。
  4. 【請求項４】該ポリアデニレーション・シグナルが、そ
    の中のイントロンも含めて、アミノ酸90〜91についての
    コドンの暗号におけるPstI切断部位から、それより下流
    の次の引き続いてのEcoRI切断部位までのウシ成長ホル
    モンのゲノムDNAヌクレオチド配列よりなる請求の範囲
    第３項記載の組換えDNA分子。
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