JPH0687059B2 - 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 - Google Patents
免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬Info
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- JPH0687059B2 JPH0687059B2 JP5922389A JP5922389A JPH0687059B2 JP H0687059 B2 JPH0687059 B2 JP H0687059B2 JP 5922389 A JP5922389 A JP 5922389A JP 5922389 A JP5922389 A JP 5922389A JP H0687059 B2 JPH0687059 B2 JP H0687059B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高感度で非特異反応が少ない免疫反応測定方法
および測定用試薬に関する。
および測定用試薬に関する。
（従来の技術） 各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば，抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテツクスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては，上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法，
酵素免疫測定法（EIA），放射免疫測定法（RIA）など各
種方法が知られている。
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば，抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテツクスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては，上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法，
酵素免疫測定法（EIA），放射免疫測定法（RIA）など各
種方法が知られている。
これらの免疫反応の測定法において，抗原抗体反応を促
進させ，あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば，反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり，これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば，これらの化合物を加えることによりラテツクス試薬
の凝集反応が促進される。しかし，これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため，バ
ッググラウンド値が上がる。そのため，バックグラウン
ド値を越える量の測定値でないと検出することができな
い。つまり多量の試料を必要とする。従って，この方法
は，短時間で反応を進行させることは可能であるが，非
特異反応を抑制するには充分な方法とはいえない。さら
に，使用されるポリエチレングリコールの市販品は,290
nm付近に吸収を有する不純物を含有することが多い。そ
のため，使用前に精製する必要があり，取扱いが煩雑と
なる。
進させ，あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば，反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり，これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば，これらの化合物を加えることによりラテツクス試薬
の凝集反応が促進される。しかし，これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため，バ
ッググラウンド値が上がる。そのため，バックグラウン
ド値を越える量の測定値でないと検出することができな
い。つまり多量の試料を必要とする。従って，この方法
は，短時間で反応を進行させることは可能であるが，非
特異反応を抑制するには充分な方法とはいえない。さら
に，使用されるポリエチレングリコールの市販品は,290
nm付近に吸収を有する不純物を含有することが多い。そ
のため，使用前に精製する必要があり，取扱いが煩雑と
なる。
非特異反応を抑制する方法として，特開昭57-182169号
公報には測定すべき試料にポリアニオンを添加する方法
が開示されている。ポリアニリンとしては，デキストラ
ン硫酸，ヘパリン，ポリスチレンスルホン酸，コンドロ
イチン硫酸などが挙げられる。これらを添加することに
より非特異反応が抑制される。上記公報の方法において
は、ポリアニオンは,0.001〜0.5重量％の割合で反応系
に含有される。しかし、上限の0.5重量％付近の濃度に
おいては，反応液の粘度が高いため反応性が高くなりす
ぎ，バックグラウンド値が上がる。下限の0.001重量％
付近では、非特異反応の抑制が充分に行なわれ得ない。
さらにこの方法においては，測定の感度自体がいまだ充
分であるとはいえない。
公報には測定すべき試料にポリアニオンを添加する方法
が開示されている。ポリアニリンとしては，デキストラ
ン硫酸，ヘパリン，ポリスチレンスルホン酸，コンドロ
イチン硫酸などが挙げられる。これらを添加することに
より非特異反応が抑制される。上記公報の方法において
は、ポリアニオンは,0.001〜0.5重量％の割合で反応系
に含有される。しかし、上限の0.5重量％付近の濃度に
おいては，反応液の粘度が高いため反応性が高くなりす
ぎ，バックグラウンド値が上がる。下限の0.001重量％
付近では、非特異反応の抑制が充分に行なわれ得ない。
さらにこの方法においては，測定の感度自体がいまだ充
分であるとはいえない。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法，および免疫反応測定用試
薬を提供することにある。
の目的とするところは、非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法，および免疫反応測定用試
薬を提供することにある。
（課題を解決するための手段） 本発明の免疫反応測定法は，抗原または抗体でなる被測
定物質を該抗原または抗体に対する抗体または抗原を用
いて測定する方法であって，該免疫反応の反応系にはカ
ルボキシメチルセルロースおよび／またはその塩が存在
し，そのことにより上記目的が達成される。
定物質を該抗原または抗体に対する抗体または抗原を用
いて測定する方法であって，該免疫反応の反応系にはカ
ルボキシメチルセルロースおよび／またはその塩が存在
し，そのことにより上記目的が達成される。
本発明の免疫反応測定用試薬は，被測定物質である抗原
または抗体に対する抗体または抗原，およびカルボキシ
メチルセルロースおよび／またはその塩を含有し，その
ことにより上記目的が達成される。
または抗体に対する抗体または抗原，およびカルボキシ
メチルセルロースおよび／またはその塩を含有し，その
ことにより上記目的が達成される。
本発明に用いられるカルボキシメチルセルロースおよび
／またはその塩（以下，カルボキシメチルセルロースお
よび／またはその塩をカルボキシメチルセルロースとし
て示す）の分子量は1,000〜500,000が適当である。分子
量が小さすぎると，抗原および抗体との相互作用が小さ
くなるため所期の効果が得られない。分子量が大きすぎ
ると水に溶解させたときの粘度が高くなるため，取り扱
いが困難となる。
／またはその塩（以下，カルボキシメチルセルロースお
よび／またはその塩をカルボキシメチルセルロースとし
て示す）の分子量は1,000〜500,000が適当である。分子
量が小さすぎると，抗原および抗体との相互作用が小さ
くなるため所期の効果が得られない。分子量が大きすぎ
ると水に溶解させたときの粘度が高くなるため，取り扱
いが困難となる。
本発明による測定されるべき物質は特に限定されず，一
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては，タン
パク，脂質などがあり，それには例えば，各種抗原，レ
セプター，酵素などが挙げられる。具体的には，HBs抗
体，HBc抗体，梅毒抗体（トレポネーマ抗原および脂質
抗原に対する抗体），抗HIV（ヒト免疫不全ウィルス）
抗体，抗ATLA（成人Ｔ細胞白血病関連抗原）抗体など
の，感染症に関係する抗体が挙げられる。
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては，タン
パク，脂質などがあり，それには例えば，各種抗原，レ
セプター，酵素などが挙げられる。具体的には，HBs抗
体，HBc抗体，梅毒抗体（トレポネーマ抗原および脂質
抗原に対する抗体），抗HIV（ヒト免疫不全ウィルス）
抗体，抗ATLA（成人Ｔ細胞白血病関連抗原）抗体など
の，感染症に関係する抗体が挙げられる。
本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は特に
限定されず，通常の免疫比濁法,EIA,RIA,螢光免疫測定
法，血球凝集法などが利用され得る。凝集反応，特にラ
テツクス凝集反応のような逆受身凝集反応が好適に用い
られる。例えば，ラテツクス試薬を用いた免疫反応によ
り被測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗
原または抗体に対する抗体または抗原を含有するラテツ
クス試薬にあらかじめカルボキシメチルセルロースを添
加しておく。このような試薬を用いて免疫凝集反応を行
ない，生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観
察することにより被測定物質が測定され得る。あるい
は，カルボキシメチルセルロースを含まないラテツクス
を使用することも可能で，この場合には免疫反応時にカ
ルボキシメチルセルロースが該反応系に存在するように
すればよい。例えば，検体にあらかじめカルボキシメチ
ルセルロースを添加しておく方法；使用する緩衝液にカ
ルボキシメチルセルロースを加えておく方法などがあ
り，特に限定されない。言いかえれば，本発明の測定用
試薬は，例えば，抗体または抗原，およびカルボキシメ
チルセルロースを含む,1液系の試薬；抗体または抗原を
含む第１試薬と，カルボキシメチルセルロースを含む緩
衝液でなる，第２試薬とで構成される２液系の試薬；な
ど種々の形態であり得る。上記免疫反応においては、カ
ルボキシメチルセルロースは，該反応系に0.1〜0.3％
（W/W），好ましくは0.2〜0.3％（W/W）の割合で含有さ
れるように調整される。カルボキシメチルセルロースの
濃度が0.1％（W/W）を下まわると，該カルボキシメチル
セルロースの抗原および抗体との相互作用が小さくなる
結果，増感効果が得られない。逆に0.3％（W/W）を上ま
わると反応液の粘度が高くなるため反応性が必要以上に
高くなり，非特異反応が促進される。その結果，バック
グラウンド値が上昇する。
限定されず，通常の免疫比濁法,EIA,RIA,螢光免疫測定
法，血球凝集法などが利用され得る。凝集反応，特にラ
テツクス凝集反応のような逆受身凝集反応が好適に用い
られる。例えば，ラテツクス試薬を用いた免疫反応によ
り被測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗
原または抗体に対する抗体または抗原を含有するラテツ
クス試薬にあらかじめカルボキシメチルセルロースを添
加しておく。このような試薬を用いて免疫凝集反応を行
ない，生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観
察することにより被測定物質が測定され得る。あるい
は，カルボキシメチルセルロースを含まないラテツクス
を使用することも可能で，この場合には免疫反応時にカ
ルボキシメチルセルロースが該反応系に存在するように
すればよい。例えば，検体にあらかじめカルボキシメチ
ルセルロースを添加しておく方法；使用する緩衝液にカ
ルボキシメチルセルロースを加えておく方法などがあ
り，特に限定されない。言いかえれば，本発明の測定用
試薬は，例えば，抗体または抗原，およびカルボキシメ
チルセルロースを含む,1液系の試薬；抗体または抗原を
含む第１試薬と，カルボキシメチルセルロースを含む緩
衝液でなる，第２試薬とで構成される２液系の試薬；な
ど種々の形態であり得る。上記免疫反応においては、カ
ルボキシメチルセルロースは，該反応系に0.1〜0.3％
（W/W），好ましくは0.2〜0.3％（W/W）の割合で含有さ
れるように調整される。カルボキシメチルセルロースの
濃度が0.1％（W/W）を下まわると，該カルボキシメチル
セルロースの抗原および抗体との相互作用が小さくなる
結果，増感効果が得られない。逆に0.3％（W/W）を上ま
わると反応液の粘度が高くなるため反応性が必要以上に
高くなり，非特異反応が促進される。その結果，バック
グラウンド値が上昇する。
上記免疫反応の条件は通常の場合と同様であり，反応媒
体としては，被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は，被測定物質を失活させること
がなく，かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強
度やpHを有するものであればよい。反応時には，さらに
測定系の特異性を高めるために，塩化コリン,EDTAなど
を添加することも可能である。
体としては，被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は，被測定物質を失活させること
がなく，かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強
度やpHを有するものであればよい。反応時には，さらに
測定系の特異性を高めるために，塩化コリン,EDTAなど
を添加することも可能である。
本発明によれば，カルボキシメチルセルロースの働きに
より，免疫反応における非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。以下に，本発明の実
施例を述べ，その効果を具体的に説明する。
より，免疫反応における非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。以下に，本発明の実
施例を述べ，その効果を具体的に説明する。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ （凝集板を用いたマニュアル法による梅毒抗体の測定） 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。
本実施例においては，次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例２〜６および比較例１〜６に
おいても，特に指示されない限り，同名の試薬および検
体については，同様のものを使用した。
本実施例においては，次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例２〜６および比較例１〜６に
おいても，特に指示されない限り，同名の試薬および検
体については，同様のものを使用した。
PBS（リン酸緩衝液）：リン酸−ナトリウム（２水和
物），リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナト
リウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそれ
ぞれ0.02Mおよび0.15M,pHが7.4となるように精製水に加
えて，調製を行なった。
物），リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナト
リウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそれ
ぞれ0.02Mおよび0.15M,pHが7.4となるように精製水に加
えて，調製を行なった。
１％ BSA・PBS:PBSに試薬特級BSA（ウシ血清アルブミ
ン）を１％（W/W）となるように溶解させて調製した。
ン）を１％（W/W）となるように溶解させて調製した。
１％トリトンＸ−100:リン酸緩衝液にトリトンＸ−100
を１％（W/W）となるように溶解させた。
を１％（W/W）となるように溶解させた。
カルボキシメチルセルロース溶液:1％BSA・PBSにカルボ
キシメチルセルロース（和光純薬社製；化学用）を，そ
れぞれ0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8
および1.0％（W/W）となるように溶解させた。
キシメチルセルロース（和光純薬社製；化学用）を，そ
れぞれ0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8
および1.0％（W/W）となるように溶解させた。
３％ポリエチレングリコール:1％BSA・PBSにポリエチレ
ングリコール（半井化学社製；平均分子量6000）を３％
（W/W）となるように溶解させた。
ングリコール（半井化学社製；平均分子量6000）を３％
（W/W）となるように溶解させた。
３％デキストラン:1％BSA・PBSにデキストラン（和光純
薬社製）を３％（W/W）となるように溶解させた。
薬社製）を３％（W/W）となるように溶解させた。
テトラトラン硫酸溶液:1％BSA・PBSにデキストラン硫酸
ナトリウム（Sigma社製；特級試薬）を，それぞれ0.00
5,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8および1.0％
（W/W）となるように溶解させた。
ナトリウム（Sigma社製；特級試薬）を，それぞれ0.00
5,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8および1.0％
（W/W）となるように溶解させた。
梅毒抗原液：家兎睾丸中で10〜14日間培養したトレポネ
ーマ パリダム［Treponema Pallidum;CDC（Center fo
r Disease Control,Public Health Service,U.S.Depart
ment of Health,Education and Welfare,Atlanta,Georg
ia）より入手したものを家兎睾丸に接種し，継代培養し
たものを用いた］を生理食塩水中に109個菌体/mlとなる
ように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り，リン酸緩衝液中
で遠心分離（6,000rpm×５分,3回）することにより洗浄
した。次いで，得られた沈澱に１％トリトンＸ−100を1
ml添加し,37℃にて30分間インキュベートした。その
後，これを超遠心分離機にかけて（50,000rpm×１時
間）上清を採取し,1％トリトンＸ−100で1,000倍希釈し
て使用した。
ーマ パリダム［Treponema Pallidum;CDC（Center fo
r Disease Control,Public Health Service,U.S.Depart
ment of Health,Education and Welfare,Atlanta,Georg
ia）より入手したものを家兎睾丸に接種し，継代培養し
たものを用いた］を生理食塩水中に109個菌体/mlとなる
ように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り，リン酸緩衝液中
で遠心分離（6,000rpm×５分,3回）することにより洗浄
した。次いで，得られた沈澱に１％トリトンＸ−100を1
ml添加し,37℃にて30分間インキュベートした。その
後，これを超遠心分離機にかけて（50,000rpm×１時
間）上清を採取し,1％トリトンＸ−100で1,000倍希釈し
て使用した。
梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ パリダムを睾丸に接
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血清
を１％BSA-PBSで100倍,200倍および400倍に希釈して使
用した。
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血清
を１％BSA-PBSで100倍,200倍および400倍に希釈して使
用した。
正常家兎結晶：トレポネーマ パリダムを接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキット
（セロディアTP;富士レビオ製）およびセロクリットTP
（化血研）を用いてタイター（力価）を測定したとこ
ろ，結果は陰性を示した。この血清を１％BSA・PASで10
0倍から400倍に希釈して用いた。
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキット
（セロディアTP;富士レビオ製）およびセロクリットTP
（化血研）を用いてタイター（力価）を測定したとこ
ろ，結果は陰性を示した。この血清を１％BSA・PASで10
0倍から400倍に希釈して用いた。
ラテツクス：積水化学工業（株）製の粒径0.23μｍのポ
リスチレンラテツクス（固形分10％）を用いた。
リスチレンラテツクス（固形分10％）を用いた。
（Ａ）ラテツクスへの梅毒抗原の感作：ラテツクス100
μｌと，梅毒抗原400μｌとを速やかに混合し，室温で
攪拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え，室温で
１時間攪拌した後,15000rpmで１時間遠心した。これを
２回繰り返してラテツクスを洗浄した。洗浄後のペレッ
トを2mlのカルボキシメチルセルロース溶液〔0.01,0.1,
0.2,0.4,0.6,0.8または1.0％（W/W）〕に懸濁させ，よ
く分散して固形分0.5％のラテツクス試薬を得た。これ
を４℃にて保存した。
μｌと，梅毒抗原400μｌとを速やかに混合し，室温で
攪拌した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え，室温で
１時間攪拌した後,15000rpmで１時間遠心した。これを
２回繰り返してラテツクスを洗浄した。洗浄後のペレッ
トを2mlのカルボキシメチルセルロース溶液〔0.01,0.1,
0.2,0.4,0.6,0.8または1.0％（W/W）〕に懸濁させ，よ
く分散して固形分0.5％のラテツクス試薬を得た。これ
を４℃にて保存した。
（Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（Ａ）項で
得られたラテツクス試薬とを50μｌずつ凝集観察板上に
採り，混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照とし
て、正常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラ
テツクス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を陽
性，凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結
果を表１に示す。表１における判定の基準は，次のとお
りである。
得られたラテツクス試薬とを50μｌずつ凝集観察板上に
採り，混合・攪拌したのち３分間反応させた。対照とし
て、正常家兎血清についても同様に反応を行なった。ラ
テツクス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を陽
性，凝集の認められなかった検体を陰性とした。その結
果を表１に示す。表１における判定の基準は，次のとお
りである。
＋＋：陽性（強い凝集） ＋：陽性（凝集） +W：陽性（弱い凝集） −：陰性（凝集しない） ±：偽陽性 比較例１ カルボキシメチルセルロース溶液の代わりに１％BSA・P
BS,3％ポリエチレングリコール,3％デキストランまたは
デキストラン硫酸溶液〔0.01,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8また
は1.0％（W/W）〕を用いて実施例１と同様に反応を行な
った。その結果を表１に示す。
BS,3％ポリエチレングリコール,3％デキストランまたは
デキストラン硫酸溶液〔0.01,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8また
は1.0％（W/W）〕を用いて実施例１と同様に反応を行な
った。その結果を表１に示す。
表１から，本発明のラテツクス試薬を用いると，従来の
試薬では偽陽性が生じる検体でも，非特異反応を起こす
ことなく正確に測定し得ることが明確である。さらに，
高希釈率の検体も高感度で測定し得ることがわかる。
試薬では偽陽性が生じる検体でも，非特異反応を起こす
ことなく正確に測定し得ることが明確である。さらに，
高希釈率の検体も高感度で測定し得ることがわかる。
実施例２ （全自動分析装置を用いた梅毒抗体の測定） 実施例１と同様の検体および試薬を用い，日立7050型全
自動分析装置により測定を行なった。但し，ラテツクス
試薬にはカルボキシメチルセルロースは加えず,1％BSA
・PBSで希釈して固形分0.25％に調整した。後述の希釈
液としてはカルボキシメチルセルロース溶液（0.005,0.
05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を使用した。
測定条件は次のとおりである。
自動分析装置により測定を行なった。但し，ラテツクス
試薬にはカルボキシメチルセルロースは加えず,1％BSA
・PBSで希釈して固形分0.25％に調整した。後述の希釈
液としてはカルボキシメチルセルロース溶液（0.005,0.
05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を使用した。
測定条件は次のとおりである。
検体容量 20μｌ ラテツクス試薬（R2） 50μｌ 希釈液（R1） 350μｌ 測定波長 570nm 測定温度 37℃ 検体20μｌをとり、これに希釈液（R1）350μｌを加え
た。これにラテツクス試薬50μｌを添加後、この溶液を
攪拌・混合した。そして該ラテツクス試薬の添加から80
秒後と320秒後の波長570nmにおける吸光度の差（ΔOD
570）を分光光度計で読み取り、この吸光度の変化量を
表２に示した（ｎ＝４の平均値）。各希釈倍率の陽性血
清試料を用いて試験したときの，使用したカルボキシメ
チルセルロースの濃度とΔOD570との関係を，第１図
（ａ）に示す。
た。これにラテツクス試薬50μｌを添加後、この溶液を
攪拌・混合した。そして該ラテツクス試薬の添加から80
秒後と320秒後の波長570nmにおける吸光度の差（ΔOD
570）を分光光度計で読み取り、この吸光度の変化量を
表２に示した（ｎ＝４の平均値）。各希釈倍率の陽性血
清試料を用いて試験したときの，使用したカルボキシメ
チルセルロースの濃度とΔOD570との関係を，第１図
（ａ）に示す。
比較例２ 希釈液として、１％BSA・PBS,3％ポリエチレングリコー
ル,3％デキストランまたはデキストラン硫酸溶液〔0.00
5,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を用いた
こと以外は実施例２と同様である。その結果を表２に示
す。
ル,3％デキストランまたはデキストラン硫酸溶液〔0.00
5,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を用いた
こと以外は実施例２と同様である。その結果を表２に示
す。
各希釈倍率の陽性血清試料を用いて試験したときの，使
用したデキストラン硫酸の濃度とΔOD570との関係を第
１図（ｂ）に示す。
用したデキストラン硫酸の濃度とΔOD570との関係を第
１図（ｂ）に示す。
表２および第１図（ａ）および（ｂ）の結果から明らか
なように，本発明によれば従来方法では凝集が認められ
なかった高希釈率の陽性血清においても，陽性と判定し
得る程度の高い感度が得られた。さらに，非特異反応に
より凝集が認められない。特開昭57-182169号公報に記
載のデキストラン硫酸を用いても比較的良好な結果が得
られるが，例えば,0.3％の濃度の場合を比較すると，本
発明のカルボキシメチルセルロースを用いた方法のほう
が，その効果がはるかに大きいことがわかる。このよう
に，本発明により，特異性が高く，高感度の測定が達成
された。
なように，本発明によれば従来方法では凝集が認められ
なかった高希釈率の陽性血清においても，陽性と判定し
得る程度の高い感度が得られた。さらに，非特異反応に
より凝集が認められない。特開昭57-182169号公報に記
載のデキストラン硫酸を用いても比較的良好な結果が得
られるが，例えば,0.3％の濃度の場合を比較すると，本
発明のカルボキシメチルセルロースを用いた方法のほう
が，その効果がはるかに大きいことがわかる。このよう
に，本発明により，特異性が高く，高感度の測定が達成
された。
実施例３ （ELISAによる梅毒抗体の測定） 実施例１に挙げられた試薬および検体に加えて，本実施
例では，さらに次の試薬およびプレートを用いた。
例では，さらに次の試薬およびプレートを用いた。
ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG:ペルオキシダーゼ標
識抗ウサギIgG（マイルズ・ラボラトリーズ社）を１％B
SA・PBSで1,000倍に希釈して用いた。
識抗ウサギIgG（マイルズ・ラボラトリーズ社）を１％B
SA・PBSで1,000倍に希釈して用いた。
マイクロタイタープレート:96穴マイクロタイタープレ
ート（ヌンク社製）を用いた。
ート（ヌンク社製）を用いた。
ペルオキシダーゼ基質：リン酸−クエン酸緩衝液にｏ−
フェニレンジアミン（２塩酸塩）2mg/ml,そして過酸化
水素水を0.03％（H2O2）となるように加えた。基質の調
製は使用直前に行った。
フェニレンジアミン（２塩酸塩）2mg/ml,そして過酸化
水素水を0.03％（H2O2）となるように加えた。基質の調
製は使用直前に行った。
IN硫酸：濃硫酸を精製水で希釈してIN硫酸水溶液とし
た。
た。
（Ａ）抗原の固定化：梅毒抗原液をマイクロタイタープ
レートの各ウェルに,50μｌずつ分注し，室温で１時間
インキュベートした。ウェルを１％BSA・PBS200μｌで
１回洗浄した後,1％BSA・PBS200μｌを加えて室温で１
時間インキュベートし，グロッキングを行った。その
後,1％BSA・PBSを吸引除去し，直ちにELISA分析に使用
した。
レートの各ウェルに,50μｌずつ分注し，室温で１時間
インキュベートした。ウェルを１％BSA・PBS200μｌで
１回洗浄した後,1％BSA・PBS200μｌを加えて室温で１
時間インキュベートし，グロッキングを行った。その
後,1％BSA・PBSを吸引除去し，直ちにELISA分析に使用
した。
（Ｂ）梅毒抗体の測定:1％BSA・PBSの代わりに、カルボ
キシメチルセルロース溶液〔0.005.0.05,0.1,0.2,0.3,
0.4または0.5％（W/W）〕を用いて100,200および400倍
に希釈した梅毒陽性家兎血清を第１抗体溶液とした。こ
れを各ウェルに50μｌずつ分注し，室温で１時間インキ
ュベートした。対照として，正常家兎血清を同様に希釈
した溶液を調製し，これを用いて同様に分注・インキュ
ベートした。
キシメチルセルロース溶液〔0.005.0.05,0.1,0.2,0.3,
0.4または0.5％（W/W）〕を用いて100,200および400倍
に希釈した梅毒陽性家兎血清を第１抗体溶液とした。こ
れを各ウェルに50μｌずつ分注し，室温で１時間インキ
ュベートした。対照として，正常家兎血清を同様に希釈
した溶液を調製し，これを用いて同様に分注・インキュ
ベートした。
１時間後に，反応液を吸引除去し,1％RSA・PBS200μｌ
で３回洗浄したのち，ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg
G（第２抗体溶液）をウェルに50μｌずつ分注した。室
温で１時間インキュベートした後，反応液を吸引除去
し,1％BSA・PBS200μｌで３回洗浄した。
で３回洗浄したのち，ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg
G（第２抗体溶液）をウェルに50μｌずつ分注した。室
温で１時間インキュベートした後，反応液を吸引除去
し,1％BSA・PBS200μｌで３回洗浄した。
各ウェルに直ちにペルオキシダーゼ基質100μｌずつを
分注し，室温で15分間インキュベートした。基質ブラン
クとして，第１抗体および第２抗体のいずれも添加して
いないウェルを用意し，同様に基質液を添加してインキ
ュベートした。インキュベート後,IN硫酸を100μｌずつ
分注し、酸素反応を停止させた。各ウェルの酵素反応時
間が一定となるように操作を行った。反応停止後，マイ
クロタイタープレートリーダー（MTP-100,コロナ社製）
により，基質ブランクを対照として,492nmの吸光度を測
定した。その結果を表３に示す（ｎ＝４の平均値）。各
希釈倍率の陽性血清試料を用いて試験したときの，使用
したカルボキシメチルセルロースの濃度とOD492との関
係を第２図（ａ）に示す。
分注し，室温で15分間インキュベートした。基質ブラン
クとして，第１抗体および第２抗体のいずれも添加して
いないウェルを用意し，同様に基質液を添加してインキ
ュベートした。インキュベート後,IN硫酸を100μｌずつ
分注し、酸素反応を停止させた。各ウェルの酵素反応時
間が一定となるように操作を行った。反応停止後，マイ
クロタイタープレートリーダー（MTP-100,コロナ社製）
により，基質ブランクを対照として,492nmの吸光度を測
定した。その結果を表３に示す（ｎ＝４の平均値）。各
希釈倍率の陽性血清試料を用いて試験したときの，使用
したカルボキシメチルセルロースの濃度とOD492との関
係を第２図（ａ）に示す。
実施例３ 梅毒性血清の希釈液として１％BSA・PBS,3％ポリエチレ
ングリコール,3％デキストランまたはデキストラン硫酸
溶液〔0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/
W）〕用いたこと以外は実施例３と同様である。その結
果を表３に示す。各希釈倍率の陽性血清試料を用いて試
験したときの，使用したデキストラン硫酸の濃度とOD
492との関係を第２図（ｂ）に示す。
ングリコール,3％デキストランまたはデキストラン硫酸
溶液〔0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/
W）〕用いたこと以外は実施例３と同様である。その結
果を表３に示す。各希釈倍率の陽性血清試料を用いて試
験したときの，使用したデキストラン硫酸の濃度とOD
492との関係を第２図（ｂ）に示す。
表３の結果から明らかなように，本発明によれば，従来
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度０から0.005の間に低下させることが可能と
なる。陽性血清に関しては，抗原・抗体反応をを特異的
に促進した結果，感度をほぼ２倍に向上させることが可
能となった。
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度０から0.005の間に低下させることが可能と
なる。陽性血清に関しては，抗原・抗体反応をを特異的
に促進した結果，感度をほぼ２倍に向上させることが可
能となった。
実施例４ （凝集板を用いたマニュアル法によるHBS抗体の測定） 本実施例において，実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
HBS抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製した精製HBS抗原を使用した。抗原は
リン酸緩衝液に溶解し，濃度をローリー法により測定し
た。使用直前に，リン酸緩衝液により希釈し，濃度を１
〜10μg/mlとなるように調製し，これをHBS抗原液とし
た。
フィーにより精製した精製HBS抗原を使用した。抗原は
リン酸緩衝液に溶解し，濃度をローリー法により測定し
た。使用直前に，リン酸緩衝液により希釈し，濃度を１
〜10μg/mlとなるように調製し，これをHBS抗原液とし
た。
HBS陽性家兎血清：精製HBS抗原を，フロイト完全アジュ
バントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を，正常
ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をしてから用い
た。正常ヒト血清を結合させたカラムはCNBr活性化セフ
ァロースCL4B（ファルマシア社）を用い，メーカー（フ
ァルマシア）の使用説明書に従って行った。吸収操作を
行った抗HBS血清は,1％BSA・PBSにより,100から400倍に
希釈して用いた。
バントとともに家兎に免疫して得られた抗血清を，正常
ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をしてから用い
た。正常ヒト血清を結合させたカラムはCNBr活性化セフ
ァロースCL4B（ファルマシア社）を用い，メーカー（フ
ァルマシア）の使用説明書に従って行った。吸収操作を
行った抗HBS血清は,1％BSA・PBSにより,100から400倍に
希釈して用いた。
（Ａ）ラテツクスへのHBS抗原の感作：ラテツクス100μ
ｌと，HBS抗原液400μｌとを速やかに混合し，室温で乾
燥した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え，室温で１
時間攪拌した後,15000rpmで１時間遠心した。これを２
回繰り返してラテツクスを洗浄した。洗浄後のプレット
を2mlのカルボキシメチルセルロース溶液〔0.01,0.1,0.
2,0.4,0.6,0.8または1.0％（W/W）〕に懸濁させ，よく
分散して固形分0.5％のラテツクス試薬を得た。これを
４℃にて保存した。
ｌと，HBS抗原液400μｌとを速やかに混合し，室温で乾
燥した。１時間後に１％BSA・PBSを5ml加え，室温で１
時間攪拌した後,15000rpmで１時間遠心した。これを２
回繰り返してラテツクスを洗浄した。洗浄後のプレット
を2mlのカルボキシメチルセルロース溶液〔0.01,0.1,0.
2,0.4,0.6,0.8または1.0％（W/W）〕に懸濁させ，よく
分散して固形分0.5％のラテツクス試薬を得た。これを
４℃にて保存した。
（Ｂ）HBS抗体の測定：HBS陽性家兎血清と本実施例
（Ａ）項で得られたラテツクス試薬とを50μｌずつ凝集
観察板上に採り，混合・攪拌したのち３分間反応させ
た。対照として，正常家兎血清についても同様に反応を
行なった。ラテツクス試薬の凝集を実施例１と同様に行
なった。その結果を表４に示す。
（Ａ）項で得られたラテツクス試薬とを50μｌずつ凝集
観察板上に採り，混合・攪拌したのち３分間反応させ
た。対照として，正常家兎血清についても同様に反応を
行なった。ラテツクス試薬の凝集を実施例１と同様に行
なった。その結果を表４に示す。
比較例４ カルボキシメチルセルロース溶液の代わりに１％BSA・P
BS,3％ポリエチレングリコール,3％デキストランまたは
デキストラン硫酸溶液〔0.01,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8また
は1.0％（W/W）〕を用いて実施例４と同様に反応を行な
った。その結果を表４に示す。
BS,3％ポリエチレングリコール,3％デキストランまたは
デキストラン硫酸溶液〔0.01,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8また
は1.0％（W/W）〕を用いて実施例４と同様に反応を行な
った。その結果を表４に示す。
表４から明らかなように，本発明によれば従来の方法で
は偽陽性が生じる検体でも，特異性高く診断することが
可能である。
は偽陽性が生じる検体でも，特異性高く診断することが
可能である。
実施例５ （全自動分析装置を用いたHBS抗体の測定） 実施例４の検体および試薬を用い，実施例２の方法に従
ってHBS抗体の測定を行なった。ラテツクス試薬につい
ても実施例２と同様に0.25％とし，希釈液にカルボキシ
メチルセルロース溶液〔0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4ま
たは0.5％（W/W）〕を使用した。その結果を表５および
第３図（ａ）に示す。
ってHBS抗体の測定を行なった。ラテツクス試薬につい
ても実施例２と同様に0.25％とし，希釈液にカルボキシ
メチルセルロース溶液〔0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4ま
たは0.5％（W/W）〕を使用した。その結果を表５および
第３図（ａ）に示す。
比較例５ 希釈液として,1％BSA・PBS,3％ポリエチレングリコー
ル,3％デキストランまたはデキストラン硫酸溶液〔0.00
5,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を用いた
こと以外は実施例５と同様である。その結果を表５およ
び第３図（ｂ）に示す。
ル,3％デキストランまたはデキストラン硫酸溶液〔0.00
5,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）〕を用いた
こと以外は実施例５と同様である。その結果を表５およ
び第３図（ｂ）に示す。
表５および第３図（ａ）および（ｂ）の結果から明らか
なように，本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかった高希釈率の陽性血清においても，陽性と判定
し得る強度の高い感度が得られた。さらに，非特異反応
による凝集が認められない。このために，特異性が高
く，高感度の測定が達成された。
なように，本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかった高希釈率の陽性血清においても，陽性と判定
し得る強度の高い感度が得られた。さらに，非特異反応
による凝集が認められない。このために，特異性が高
く，高感度の測定が達成された。
実施例６ （EIAによるインスリンの測定） 本実施例において，実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は、次
のキットおよび血清を使用した。
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は、次
のキットおよび血清を使用した。
インスリン測定用EIAキット:INSULIN〔MITSUI〕II（カ
イノス社製）。
イノス社製）。
インスリン高値血清：インスリン濃度の高値の血清で、
インスリン測定用キット［Insulin B-Test Wako（和光
純薬社製）］により，インスリンを含有することが確認
されている血清（３種類D,E,F）。
インスリン測定用キット［Insulin B-Test Wako（和光
純薬社製）］により，インスリンを含有することが確認
されている血清（３種類D,E,F）。
キット構成品である酵素標識抗体溶液中に，カルボキシ
メチルセルロースを添加し，終濃度が0.005,0.05,0.1,
0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）となるようにした。こ
の酵素標識抗体溶媒を使用し，カイノス社のキットの使
用添付書に従って，インスリン高値血清について，イン
スリン濃度の測定を行った。対照として，他のインスリ
ン測定法（Insulin B−Test Wako）によりインスリン濃
度が低値（10μU/ml以下）であると確認されたインスリ
ン低値血清（３種類A,B,C）も同時に測定した。420nmに
おける吸光度（ｎ＝4nの平均値）を表６および第４図
（ａ）に示す。
メチルセルロースを添加し，終濃度が0.005,0.05,0.1,
0.2,0.3,0.4または0.5％（W/W）となるようにした。こ
の酵素標識抗体溶媒を使用し，カイノス社のキットの使
用添付書に従って，インスリン高値血清について，イン
スリン濃度の測定を行った。対照として，他のインスリ
ン測定法（Insulin B−Test Wako）によりインスリン濃
度が低値（10μU/ml以下）であると確認されたインスリ
ン低値血清（３種類A,B,C）も同時に測定した。420nmに
おける吸光度（ｎ＝4nの平均値）を表６および第４図
（ａ）に示す。
比較例６ 実施例６において，酵素標識抗体にカルボキシメチルセ
ルロースを添加しない場合，カルボキシメチルセルロー
スの代わりにポリエチレングリコールまたはデキストラ
ンを終濃度が３％となるように添加した場合，およびテ
キストラン硫酸を終濃度が0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4
または0.5％（W/W）となるように添加した場合について
それぞれ測定を行なった。その結果を表６および第４図
（ｂ）に示す。
ルロースを添加しない場合，カルボキシメチルセルロー
スの代わりにポリエチレングリコールまたはデキストラ
ンを終濃度が３％となるように添加した場合，およびテ
キストラン硫酸を終濃度が0.005,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4
または0.5％（W/W）となるように添加した場合について
それぞれ測定を行なった。その結果を表６および第４図
（ｂ）に示す。
表６および第４図（ａ）および（ｂ）から明らかなよう
に，本発明の試薬を用いると，非特異反応が抑制され，
かつバックグラウンド値を低下させることが可能であ
る。
に，本発明の試薬を用いると，非特異反応が抑制され，
かつバックグラウンド値を低下させることが可能であ
る。
（発明の効果） 本発明によれば，このように，免疫反応を利用した被測
定物質の測定において，非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。本発明は，ラテツク
ス試薬を利用した免疫測定法,EIA,RIAなどに利用され
得，各種生理活性物質が効果的に測定され得る。
定物質の測定において，非特異反応が抑制され，かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。本発明は，ラテツク
ス試薬を利用した免疫測定法,EIA,RIAなどに利用され
得，各種生理活性物質が効果的に測定され得る。
第１図（ａ），第２図（ａ），第３図（ａ）および第４
図（ａ）は，本発明により血清中の所定の物質を測定し
たときの，カルボキシメチルセルロースの濃度と測定の
結果得られる吸光度との関係を示すグラフ，そして，第
１図（ｂ），第２図（ｂ），第３図（ｂ）および第４図
（ｂ）は，デキストラン硫酸を用いた他の方法により血
清中の所定の物質を測定したときの該デキストラン硫酸
の濃度と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラ
フである。
図（ａ）は，本発明により血清中の所定の物質を測定し
たときの，カルボキシメチルセルロースの濃度と測定の
結果得られる吸光度との関係を示すグラフ，そして，第
１図（ｂ），第２図（ｂ），第３図（ｂ）および第４図
（ｂ）は，デキストラン硫酸を用いた他の方法により血
清中の所定の物質を測定したときの該デキストラン硫酸
の濃度と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラ
フである。
Claims (3)
- 【請求項１】抗原または抗体でなる被測定物質を該抗原
または抗体に対する抗体または抗原を用いて測定する免
疫反応測定法であって，該免疫反応の反応系にカルボキ
シメチルセルロースおよび／またはその塩を存在させ
る，免疫反応測定法。 - 【請求項２】前記カルボキシメチルセルロースおよび／
またはその塩が，前記反応系に0.1〜0.3％（重量／重
量）の割合で存在する請求項１に記載の免疫反応測定
法。 - 【請求項３】被測定物質である抗原または抗体に対する
抗体または抗原；およびカルボキシメチルセルロースお
よび／またはその塩を含有する免疫反応測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5922389A JPH0687059B2 (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5922389A JPH0687059B2 (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02238360A JPH02238360A (ja) | 1990-09-20 |
| JPH0687059B2 true JPH0687059B2 (ja) | 1994-11-02 |
Family
ID=13107165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5922389A Expired - Fee Related JPH0687059B2 (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0687059B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6303313B2 (ja) * | 2013-07-26 | 2018-04-04 | コニカミノルタ株式会社 | 水分散液、病理染色液および自動染色装置用の試薬ボトル |
-
1989
- 1989-03-10 JP JP5922389A patent/JPH0687059B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02238360A (ja) | 1990-09-20 |
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| Date | Code | Title | Description |
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