JPH0687778B2 - ヒト抗トロンビン▲ｉｉｉ▼ - Google Patents

ヒト抗トロンビン▲ｉｉｉ▼

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JPH0687778B2
JPH0687778B2 JP58033900A JP3390083A JPH0687778B2 JP H0687778 B2 JPH0687778 B2 JP H0687778B2 JP 58033900 A JP58033900 A JP 58033900A JP 3390083 A JP3390083 A JP 3390083A JP H0687778 B2 JPH0687778 B2 JP H0687778B2
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description

【発明の詳細な説明】 抗トロンビンIII（AT III）は、体液の維持において重
要な役割を演ずる。血液の凝固は、一系列のセリンプロ
テアーゼによつて仲介される。抗トロンビンIIIは、因
子IX a、X a(Kurachi et al.,1976)1（1この明細書を一
部分をなす添付の文献を参照のこと。ここに対応してよ
り詳しく引用した刊行物および他の資料は、引用によつ
てここに加える）、XI（Damus et al.,1973）、XII a
（Stead et al.,1976）、およびthrombin（Rosenberg
et al.,1973）の効力のある阻害剤である。こうして、
AT IIIは活性化レベルおよびトロンビンレベルの両者に
おいて凝塊の形成を調整する。過度の凝固を防止する上
でAT IIIの生理学的重要性は、抗トロンビンのレベルが
遺伝のため（Egeberg,1965;Odegard et al.,1977;Van
der Meer et al.,1973;およびSas et al.,1974）ある
いは獲得欠乏のため（Abildgaard et al.,1970;Mannucc
i et al.,1973;Fagerhol et al.,1970）低下する、個
体の研究によつて明らかにされる。このような人は、自
発的血栓症、および散在性脈管内凝固（DIC）、心筋梗
塞、脳血管故障、肺塞栓症などの関連する危険の傾向が
ある。DICにより複雑化された重い出血障害に悩む患者
へ、血液の分別により得られれた抗トロンビンIII濃縮
物を注入することは、このような置換治療が正常の止血
機能を回復できることを示唆している（Schipper et a
l.,1978）。
ヒト抗トロンビンIIIは、肝臓により合成され、そして
血漿中にほぼ20mg/dlの濃度で存在する単一鎖の糖タン
パク質である（Collen et al.,1977）。抗トロンビンI
IIの分子量を測定すると、54,000〜65,000ダルトンの値
が得られ（RosenbergおよびDamus,1973;Nordenman et
al.,1977;Kurachi et al.,1976）、そのうちのほぼ10
％は炭水化物である（Kurachi et al.,1976）。ヒト抗
トロンビンIIIの第一アミノ酸構造はPetersen et al．
（1979）によりほとんど完全に決定された。彼らは、こ
のタンパク質がほぼ430個のアミノ酸残基、４個のグル
コサミンに基づくオリゴ糖類側鎖単位、および３個のジ
サルフアイドの架橋をもつことを報告した。しかしなが
ら、これらの研究者らは、数個のアミノ酸の正確な同一
性に関して明らかにしておらず、その上、不完全に重な
つたペプチドのため、このタンパク質の中央部における
アミノ酸の範囲の配列および長さを同定しなかつた。
AT IIIは、プロテアーゼと共有1:1化学量論的錯体を形
成することにより、トロンビンを不活性化する（Rosenb
ergおよびDamus,1973;Owen,1975）。抗トロンビンIIIの
抗凝固作用は、阻害剤−プロテアーゼ錯体の形成速度を
大きく増加する、ヘパリンにより、増強される（Abildg
aard,1968）。
微生物の構造を遺伝子操作により変えることによつて生
産されたヒト抗トロンビンIIIの治療学的投与は、血栓
を臨床的に予防しかつ管理する上でも有効であろうと、
考えられた。このような遺伝子操作法は、販売するため
の安全および効能の先要条件の証明として、その臨床的
試験を可能とするために十分な量の材料を提供するであ
ろう。したがつて、ヒト抗トロンビンIIIのための遺伝
子をクローニングし、そしてそれを宿主細胞において発
現する研究を行つた。
本発明は、１）成熟タンパク質の全DNA配列ならびにそ
の信号ポリペプチド、およびその３′−および５′−側
面に位置する（flanking）区域の発見および同定、２）
成熟ヒト抗トロンビンIIIタンパク質の増殖を可能と
し、それゆえ、その発現を可能とする、前記DNA配列、
ならびにそのMet、融合物（fusion）、またはＮ−末端
複合物からなるクローニングおよび発現の媒体（vehicl
e）の構成、および３）このような媒体を収容すること
（harboring）により遺伝的に変更され（alter）、そし
てヒト抗トロンビンIIIポリペプチドを生産できる、生
存しうる細胞培養物、を包含する、組換えDNA技術を経
てヒト抗トロンビンIIIを生産する手段および方法に関
する。さらに、本発明は、自然の環境または自然の源の
中の存在、あるいはそれからの単離から区別された、物
理的状態でヒト抗トロンビンIIIを提供し、それは、本
発明における方法のおかげで、通常の内生タンパク質お
よび他の自然材料または物質を本質的に含まない。
本発明は、その面のすべてにおいてヒト抗トロンビンII
Iの組換えDNA生産に関し、そしてここに記載しかつ本発
明の範囲に入る特定の細部に限定されると解釈してはな
らない。たとえば、ここに使用する「成熟」（mature）
という語は、ヒトAT IIIならびに、その発現ベクター
（vector）の構造中のATG翻訳コドンのおかげで存在す
る、第１アミノ酸としてのメチオニルを意味する。
ここに記載する研究は、なかでも、英国特許出願公開第
2055382A号に記載されている微生物E. coliK-12株294
（end A,thi-,hsr-,khsm+）を用いて実施された。
この株は、1978年10月28日にATCC受け入れNo.31446でジ
・アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（th
e American Type Culture Collection）に供託された。
しかしながら、種々の他の微生物の株も有用であり、こ
れには既知のE.coli株たとえばE.coli B,E.coli x1776
（ATCC No.31537、1979年７月３日供託）およびE.coli
W3110（F-，λ-，プロトローフ）（ATCC No.27325）、
あるいは他の微生物の株が包含され、前記他の微生物の
株の多くは供託されており、そしてアメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）のような、公式に
認められた微生物の供託所から（潜在的に）入手できる
−−ATCCのカタログのリストを参照。ドイツ国公開明細
書2644432号参照。これらの他の微生物は、枯草菌（Bac
illus subtilis）のようなバチルス属および他の腸内細
菌なかでもサルモネラ・チフイミリウム（Salmonella t
yphimurium）およびセラチア・マルセサンス（Serratia
marcesans）を包含し、複製し、そしてその中の異種構
造の遺伝子の配列を発現することができるプラスミドを
使用する。
バクテリア、たとえば、E.coliを使用するための発現プ
ラスミドは、ベクターとしてpBR322を使用し、官能的プ
ロモーターで操作可能な読みとり相において、異種構造
の遺伝子配列を翻訳の開始および停止の信号と一緒に適
当に挿入することにより、共通の、あるいは合成的につ
くられた制限部位を利用して、ふつうに誘導される。ベ
クターは１種またはそれ以上の表現型選択特性の遺伝子
と、宿主内の増殖を保証する複製源とを担持するであろ
う。再び、異種構造の挿入物は、たとえば、trp系遺伝
子から誘導されうる、融合した（プレ配列）と一緒に発
現されるように、整列させることができる。
また、本発明において、種々の酵母菌株、宿主適合性発
現ベクター、たとえば、プラスミドYRp7（参照 Stinchc
omb et al.,Nature282,39（1979））を用いることがで
きる。このプラスミドは、E.coliおよび酵母菌、とくに
サツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）の両者において選択および複製が可能である。１
つの有用な株は、制限なしにアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンに供託された（ATCC No.44076）
株RH218（Mioggari et al.,J.Bacteriology 134,48（1
978））である。
酵母菌中でヒト抗トロンビンIIIについての異種構造の
遺伝子を発現するためには、４種の成分を含有するプラ
スミドベクターを構成することが必要である。第１成分
は、E.coliおよび酵母菌の両者の形質転換を許し、こう
して各有機体からの選択可能な遺伝子を含有しなくては
ならない部分である。これはE.coliからのアンピシリン
抵抗性の遺伝子および酵母菌からの遺伝子TRP1であるこ
とができる。また、この成分は、両者の有機体中のプラ
スミドDNAとして維持されるべき、両者の有機体からの
複製源を必要とする。これはpBR322からのE.coli源およ
び酵母の染色体IIIからのars1源または２μ環状DNAから
の複製源であることができる。
プラスミドの第２成分は、下流に配置された構造遺伝子
の転写を促進するために、高度に発現した酵母菌遺伝子
からの５′−側面に位置する配列である。５′−側面に
位置する配列は、酵母菌の３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ（PGK）遺伝子からの配列であることができる。断
片は、構造遺伝子へ５′−側面に位置する配列を都合よ
く結合するために、XbaＩおよびEcoR I制限部位のよう
な交互する制限部位を含有する配列で置換された、PGK
構造配列のATG除去するような方法で、構成される。
この系の第３成分は、それがATG翻訳の開始信号および
停止信号の両者を含有するような方法で構成された、構
造遺伝子である。
第４成分は、転写の停止およびポリアデニル化のための
適切な信号を含有する、酵母菌遺伝子の３′−側面に位
置する配列を含有する酵母菌DNA配列である。
たとえば、酵母菌においてメチオニル−AT IIIおよびpr
eAT IIIの生産を支配するプラスミドは、8.6kbp発現プ
ラスミドYEp1PTのEcoR I部位中に、成熟タンパク質およ
び成熟タンパク質プラス信号ペプチドのための遺伝子断
片をそれぞれ挿入することによつて、構成できる。（Hi
tzeman et al,Proc.of Berkeley Workshop on Recent
Advances in Yeast Molecular Biology,20-22,1982年５
月、カリフオルニア大学、バークレイ。）YEp1PTベクタ
ーは、バクテリアの複製を許すためにpBR322源ならびに
酵母菌２μ源を含有する。YEp1PTも、トリプトフフアン
栄養要求変異種の酵母菌株においてプラスミド維持する
ために使用する、E.coliおよび酵母菌TRP1遺伝子におけ
る選択可能な特性として、アンピシリン遺伝標識を担持
する。独特のEcoR Iクローニング部位は、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（PGK）遺伝子のための効率よいプ
ロモーターを担持する1.6kb酵母菌DNAの直ぐ下流に存在
する。pAT III-E7またはpAT III-J4の完全EcoR Iおよび
部分的PstＩ消化により発生したAT III構造遺伝子断片
（下を参照）は、PGKプロモーターに隣接するYEp1PT Ec
oR I部位へ挿入することができる。酵母菌２μ環状DNA
から誘導されたA 247 bp PstI-EcoR I DNA断片は、EcoR
I末端へのAT III挿入物の３′末端におけるPstＩ部位
を変換するために有用である。このコンバーター断片
も、２μ終止物機能を提供する。
同様に、本発明は、適当なベクターをもつ種々の細胞培
養系を用いることができる。異種構造のタンパク質の生
産のために１つの有用な宿主は、サルの腎の線維芽細胞
のCOS-7系統である（Gluzman,Cell 23,175（198
1））。しかしながら、本発明は、適合しうるベクター
の複製および発現が可能である、いかなる細胞系統、た
とえば、W138,BHK,3T3,CHO,VERO,HeLa細胞系統について
も実施できる。さらに、発現ベクターについて要求され
るものは、複製源、および必要なソボソーム結合部位、
RNA切り継ぎ部位、ポリアデニル化部位、および転写終
止物配列と一緒に、発現されるべき遺伝子の前に位置す
るプロモータである。本発明は、好ましい実施態様によ
りここに説明するが、これらの配列に限定されると解釈
されるべきでないことが、理解されるであろう。たとえ
ば、SV40および他の生存しうる（たとえば、Polyoma,Ad
eno,VSV,BPVなど）ベクターの源、ならびに非組込み状
態において機能しうるであろうDNA複製の細胞源を使用
できるであろう。
哺乳動物の細胞培養における異種構造のペプチドの合成
のための細心の計画は、転写単位のコントロールのもと
での異質遺伝子を発現できるベクターの発生にある。組
織培養におけるこのベクターの複製は、DNA複製源（た
とえば、SV40ウイルス）を準備し、そしてＴ抗原を内生
的に発現する細胞系統中にこのベクターを導入すること
によりペルパー機能（Ｔ抗原）を準備することによつ
て、達成できる（Lusky et al.,Nature 293,79（198
1））。SV40ウイルスのプロモーターは構造遺伝子に先
んじ、そしてこの遺伝子の転写を保証する。あるいは、
発現された遺伝子を、既知の手順を経て細胞のゲノムへ
組込んで、この遺伝子を安定に伝達することができる。
発現を得るために有用なベクターは、E.coli（アンピシ
リン抵抗性）における選択のため選択可能な遺伝標識な
らびにDNA複製のE.coli源を提供するpBR322配列から成
る。これらの配列は、プラスミドpML-1から誘導されう
る（Lusky et al.,Nature 293,79（1981））。SV40源
は、この領域を包含する342基本対Pvu II-HindIII断片
から誘導されうる（Fiers et al.,Nature 273,113（1
978））（両末端はEcoR I末端へ変換されうる）。これ
らの配列は、DNA複製のウイルス源からなることに加え
て、初期および後期の両者の転写単位のためのプロモー
ターを符号化する。SV40源領域の配向は、初期の転写単
位のためのプロモーターがヒト抗トロンビンIIIを符号
化する遺伝子に隣接して位置するようなものである。
第１図は、抗トロンビンmRNAおよびcDNAクローンを示
す。上の線はヒト抗トロンビンIIIのmRNA暗号を表わ
す。プライマーおよび交雑プローブとして使用したDNAs
は、棒とmRNAの上の文字ａ〜ｄとによつて示されてい
る。ａ）８つのN-14マー（mer）のプール、ｂ）８つのi
-16マーのプール、ｃ）i-14マーおよびｄ）230bp Dde I
断片。成熟AT IIIポリペプチドの初期および最終のアミ
ノ酸コドンは、それぞれ円で囲んだ１および432により
示されている。鍵制限エンドヌクレアーゼ部位は、垂直
線により示されている。ヌクレオチド中の概算した大き
さの目盛りが包められている。
第２図は、ヒト抗トロンビンIIIのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を示す。ヒトAT IIImRNAのヌクレオチド配
列は、cDNAクローンpA62およびpA68のDNA配列分析から
決定した。信号および成熟AT IIIポリペプチドの推定し
たアミノ酸は、DNA配列の上に示されており、そして成
熟タンパク質の第１残基から番号を付してある。示した
ヌクレオチド配列は、AT IIImRNAの真の５′末端に伸び
ていない。
第３図は、後に詳しく説明するpAT III-E7の構造を示
す。（Ａ）重なる合成オリゴヌクレオチドの延長のDNA
Pol Iによる45bpのEcoR I-Hind IIIの合成。（Ｂ）開い
たオープンボツクス（open box）により示した、（Ａ）
からの合成断片を、pBR322のEcoR I-Hind III部位の中
へ結合した。pBR322のアンピシリン（amp）についての
遺伝子およびテトラサイクリン（tet）抵抗を暗色のボ
ツクス（dark box）により示す。40bpのEcoR I−SacＩ
断片をpR10から単離し、pA62から単離した590bPの断片
（斜交平行線のボツクスで示す）へ結合した。（Ｃ）Ec
oR I−SacＩおよびSacＩ−PstＩ（点のボツクス）断片
をLe I FA trp 103（Gray et al.,Nature 295,503（19
82））のtrp発現ベクター断片の中へ結合してpTA2を生
ずる。（Ｄ）pTA2は、E.coli trpオペロンの調節のもと
に、AT III構造遺伝子配列を含有するテトラサイクリン
抵抗プラスミドである。構造遺伝子中に見出される２つ
のスクレオチドの欠失を修正するために、EcoR I−SacI
I断片を異なる手段により合成した断片と置換した。得
られる構造、pAT III-E7およびpAT III-J4、はE.coli細
胞におけるそれぞれヒト成熟（メチオニル第１アミノ酸
の適応）AT IIIおよびヒトpreAT IIIポリペプチドの合
成を生じた。
方法： PANの製造 ヒトの肝のメツセンジヤーRNAを、グアニジウムチオシ
アネート法（Ullrich et al.,1977）により、次いでオ
リゴdTセルロースクロマトグラフイー（ポリ（Ａ）＋RN
A）により、あるいは効力のあるリボヌクレアーゼ阻害
剤、ヒドロキシスチルバニミジンイセチオネート（Liza
rdi,1980）（ポリソームのRNA）の存在下に単離したポ
リソームのフエノール抽出により、製造した。ほぼ3mg
のポリソームの（polysomal）のRNAを得るために、5gの
肝を10ミリモルNaCl、1.5ミリモルのMgCl2、１％のNP4
0、250ミリモルのスクロース、10ミリモルのTris-HCl、
pH7.5、1.5ミリモルのヒドロキシスチルバミジンイセチ
オネート（Merrell,Cincinnati,OH）中で均質化した。
核および膜をホモジネートから除去して浄化し（750×
g,5分）、そしポリソームを0.3モルのNaCl中の0.5モル
のスクロース、50ミリモルのTris-HCl、pH7.5、５ミリ
モルのMgCl2、1.5ミリモルのヒドロキシスチルバミジン
中の0.5モルのスクロースを通して、同じ緩衝液中の1.0
モルのスクロースのパツド上へスピン（spin）した（1
2,000×g,20分）。ポリソームの帯をフエノール抽出
し、エタノール沈殿させ、水中に再懸濁し、30分間の1
2,800×ｇにおえる遠心分離により浄化した。得られる
ポリソームのRNAの調製物は、1.8〜2.0の範囲のA260/A2
80比を有した。
ポリ（Poly）Ａ（＋）肝RNAを、直線のスクロース密度
勾配（0.1モルのNaCl、12.5ミリモルのEDTA、10ミリモ
ルのTris,pH7.5、0.5％のSarkosyl,Beckman SW50.1,47K
rpm,4時間、20℃中の15％‐30％のスクロース）を通す
遠心分離により、AT IIIメツセージについて濃縮した。
分別したRNAのアリコートを使用して、35S‐メチオニン
補充ウサギ網状赤血球リゼイト（BRL,Bethesda,MD）中
の生体外タンパク質合成を管理（direct）した。AT III
mRNA含有分画を、ウサギ抗ヒトAT III抗血清を用いる
生体外合成したタンパク質の免疫沈殿（Atlantic Antib
odies,New Brunswick,Maine）（Kessler,1976）および
引き続くSDSゲル電気泳動（Laemmli,1970）により、同
定した。
cDNAの合成、クローニングおよびスクリーニング 逆転写反応（0.1〜５μｇのRNAを含有する）を、テキス
ト中に指示される合成DNA断片（ほぱ200ng）またはオリ
ゴ（oligo）dT(12-18)（Collaborative）（ほぼ１μ
ｇ）で始動した。二重の鎖をもつcDNAが調製され、これ
にオリゴdCテイルを付与し、これをPstＩ分割Ｇテイル
ドCtailed）pBR322中に挿入し、そして前述のように（L
awn et al.,1981）E.coli294に形質転換した。
E.coli形質転換体を、Lawn et al．（1981）に記載さ
れているように所定の制限断片の不規則プライミングに
より調製した32P５′−末端標識合成オリゴヌクレオチ
ドまたは32P標識DNAでスクリーニングした。プライマー
およびプローブとして使用した合成DNA断片を、ホスホ
トリエステル法（CreaおよびHorn,1980）により製造し
た。DNAの製造および制限酵素の分析についての手順
も、刊行物に記載されている（Lawn et al.,1981）。
AT III交雑選択 プラスミドpA3からの230bpDNA断片のほぼ４μｇを、Noy
esおよびStark（1975）により開発された手順を用い
て、25mgのDBN-セルロースへ結合した。このDNAセルロ
ースを用いて、Bock et al．（1982）に記載される条
件下に従い、1mgのヒト肝ポリソームのRNAからAT III特
異性mRNAを単離した。
発現プラスミドの構成 DNAの単離の手順および結合反応の条件は、いずかの刊
行物に記載されており（Lawn et al.,1981）、そして
ここにおいて応用できる。プロモーターと遺伝子の５′
末端を結合する断片の合成を、後述する。
Eco R I-Hind III断片の合成 45bp EcoR I−Hind IIIを合成するために使用した36塩
基（base）（dCTAGAAT-TCTATGCACGGCTCGCCAGTGGACATCT
G）および37塩基（dCGCAAGCTTCCGCGGCT-TGGCTGTGCAGAT
オリゴヌクレオチドの設計（design）の原理を、下に詳
しく説明する。36マーおよび37マーを、それらの５′末
端においてT4ポリヌイクレオチドキナーゼ（P-L）でホ
スホリル化し、そして２μｇの各オリゴヌクレオチドで
４μｌの体積において68℃で10分間、20℃で12分間そし
て４℃で12分間一緒にアニーリングした。このアニーリ
ング反応に、デオキシヌクレオチドトリホスフエートを
補充して、400μモルの各単位および５単位のE.coli DN
Aポリメラーゼクレノウ（klenow）断片（BRL）（合計の
体積＝50μｌ）とした。重合反応を、20℃において30分
間、そして、37℃において１時間保温した。重合反応に
ついての緩衝液は、50ミリモルのNaCl、６ミリモルのTr
is.HCl、pH7.5、６ミリモルのMgCl2、５ミリモルのDT
T、および100μg/mlのBSAを含有した。アニーリング反
応はこれらの同じ成分を1.25倍の強度で含有した。重合
反応後、反応混合物をフエノールおよびクロロホルムの
抽出により脱タンパク質し、順次にHind IIIおよびEcoR
Iで消化した。得られる45bp断片を、15％のポリアクリ
ルアミドゲル中の電気泳動により精製した。
40bp EcoR I-Sac III断片の合成 AT III構造遺伝子５′末端を含有する1400bp PstＩ断片
を、pA62から単離した。５μｇのこの断片および３μｇ
の５′ホスホリル化36マー（EcoR I-HindIII断片の合成
において上で使用した）を、100℃において33μｌのH2O
中で５分間保温し、次いで急速に凍結した。このアニー
リング反応物を解凍し、20ミリモルのKCl、８ミリモル
のMgCl2、30ミリモルのDTT、20ミリモルのTris.HCl、pH
8.3,500μモルの各dGTP、dATP、dCTPおよびdTTP、およ
び25単位の逆トランスクリプターゼ（BRL）を含有する5
0μｌの最終体積に調節した。この反応物を20℃で10分
間、そして42℃において50分間保温した。脱タンパク質
後、DNAを前述のように７単位のE.coli DNAポリメラー
ゼクレノウ断片（Boehringer）で処理した。次いでSacI
I及びEcoR Iで消化すると、所望の40bpの断片が生産さ
れ、これをゲルで単離した。
DNAの配列 DNA配列は、MaxamおよびGilbert（1980）とSanger,Nick
lenおよびCoulson（1977）の方法により実施した。
タンパク質の合成 1A550単位を含有する細胞沈殿物は、抗トロンビン発現
プラスミドAT III-E7およびpAT III-f4の発酵の間にお
いて種々の段階で得られた（E.coli株W3110へ形質転換
された）。各試料を、40ミリモルのイミダゾールのCl、
pH7.5、２％のSDS、10％のグリセロールおよび５％のBM
Eを含有する緩衝液中に再懸濁し、そして３分間沸とう
させた。試料をLaemmli（1970）またはWeberおよびOsbo
rn（1969）のゲル系中で電気水動させた。合計のタンパ
ク質をクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie
Brilliant Blue）の着色により可視化し、そしてバクテ
リアより合成されたAT IIIをウエスターン（Western）
のブロツト（blot）分析（Renart et al,1975）により
同定した。
結果 ヒト抗トロンビンIIIについての初期のcDNAクロン 600bpのAT III構造遺伝子を含有する組換えプラスミド
を、合成DNA断片プローブへの交雑により、大きさで分
別したRNAから調製したcDNAバンク（bank）において同
定した。
刊行物（Petersen et al.,1979）に記載されたヒト抗
トロンビンの部分的配列を、制限されたコドン同義性を
もつ区域について検査した。２つのこのような区域を同
定し、そして長さが14または16のヌクレオチドの対応す
る合成DNAを調製した（表Ｉ）。
これらの配列のそれ以上のＣ末端に位置するもの、８つ
の16マーのプール、を使用して、AT III mRNAについて
濃縮されたポリ（Ａ）＋RNAからのcDNA合成を始動し
た。前の生体外翻訳の研究により、AT III mRNAがウシ
肝ポリ（Ａ）＋RNAのわずかに0.5％を構成することが示
唆された（MacGillivray et al.,1979）。したがつ
て、われわれはスクロースの密度の勾配の遠心分離によ
りAT III暗号化について濃縮し、そして所望の分画を生
外外翻訳測定からのAT IIIの免疫沈殿により同定した。
大きさで分別したRNAの特別に始動した逆翻訳により生
産された、オリゴdC−テイルド（tailed）、二重鎖のcD
NAを、Pas I分裂、オリゴdG−テイルドpBR322中への挿
入により、ほぼ250の形質転換体が得られた。このクロ
ンブランクを32P５′−末端標識14−および16−塩基合
成ヌクレオチド（表Ｉ）へコロニー交雑することによ
り、16マーへ強く交雑しているが、14マーへ交雑してい
ない、１つの形質転換体が明らかにされた。pA3と表示
するこのプラスミドからのDNAを、配列分析し、そして
そのヌクレオチドの配列はアミノ酸239からほぼ200の残
基についてのＣ末端へ伸びるヒト抗トロンビンIIIのタ
ンパク質配列に相当することが示された。
AT III 3′の一部分のアミノ酸残基243へのクロン暗合
化の固定は予期されなかつた。なぜなら、このクロンバ
ンクの構成に用いたcDNAは、アミノ酸243付近の区域を
暗合化することが予測された16−塩基オリゴヌクレオチ
ドのプールで始動されたからである。したがつて、相補
的プラインマーからの転写は、アミノ酸243から５′方
向に伸びることが期待され、そしてプローブへの配列
３′を含まなかつたであろう。事実、pA3は成熟タンパ
ク質のＣ−末端へ近づき始めプロープ配列へわずかに12
−ヌクレオチド５′だけ伸び、こうして14マーのプール
（タンパク質のよりＮ−末端の区域に位置する）ではな
く、16−マーのプールで交雑化する。この特定のcDNAク
ロンは、多分逆転写反応のためのAT III RNAの自己始動
から生じたのであろう。
完全なAT III構造遺伝子のためのcDNAクロン pA3からの内部の制限断片を用いて、オリゴ−dT始動（p
rimed）cDANクロンバンクの発生に引き続いて使用す
る、抗トロンビンメツセンジヤーRNAを精製した。全体
のヒトAT III構造遺伝子およびその関連する５′および
３′の翻訳されない区域を一緒に暗号化する、２つの重
なるcDNAクロンを、このバンクから単離した。
DNAセルロースをpA3の230bpのDdeＩ断片から調製し、そ
して上に概説したヒトポリソーム肝RNAの1mgから相補的
配列を選択するために使用した。結合したRNAのアリコ
ートから生外外で翻訳したタンパク質は、抗トロンビン
IIIにかなり富んでいた。交雑選択したRNAを使用して、
オリゴ−dt始動cDNA合成を管理した。二本鎖のcDNAを再
びホモポリマーのdGCテイリングを経てpBR322のPstＩ部
位中へクローニングし、このとき約500の形質転換体が
生じた。クロンバンクの４回反復したフイルターを作
と、AT III構造遺伝子の長さに沿つて分布した４つのプ
ローブでスクリーニングした（第１図）。４つの交雑プ
ローブは、次のとおりであつた：（ａ）初期のスクリー
ニング実験について合成した８つのＮ−末端14マー（N-
14マー）のプール、（ｂ）初期のスクリーニングに同様
に使用した８つの16マー（i-16マー）のプール、（ｃ）
14−塩基合成DNA（i-14マー、dTGAGGACCATGGTG）、その
配列はpA3の配列化により決定され、そしてアミノ酸271
〜276（番号の符号はPetersen et al.,1979に従う）に
おける解読鎖に対して相補的である、および（ｄ）pA3
（これもmRAN交雑選択に使用した）からの230bpのDdeＩ
断片。
交雑選択したRNAのオリゴdT始動により発生した500コロ
ニーの28gは、RNAの濃縮に使用したDdeＩ断片でスクリ
ーニングしたとき、正（positive）であつた。これらの
形質転換体中に挿入されたAT IIIDdeＩの長さを、３つ
のそれ以上のＮ−末端プロープへの交雑化により測定し
た:20はi-14マーのプローブで、17は16マーのプール
で、そして３はN-14マーでそれぞれ正（positive）であ
つた。後者の３つのプラスミドは、約1.8kbの挿入体（i
nsert）を有し、これらをさらに分析した。これらのプ
ラスミドの部分的DNA配列は、それらが事実成熟ヒト抗
トロンビンIIIのアミノ末端を暗号化したことを証明し
た。
１つのプラスミドpA62の引き続く制限地図（restrictio
n mapping）およびDNA配列は、AT III mRNAの主構造が
伸長した５′の翻訳されない区域および1390bpの解読区
域から構成されていることを明らかにした。しかしなが
ら、pA62は遺伝子の３′末端において不完全であつた。
ホモポリマーのdGC尾は、カルボキシル末端アミノ酸残
基についてのコドンの第２ヌクレオチドの後に開始し
た。こうして、このプラスミドは、Ｃ−末端コドンの最
後のヌクレオチド、停止コドンおよび３′の翻訳されな
い区域を失なつていた。
オリゴdT始動交雑−濃縮mRNAから構成されたライブラリ
ー（library）中の部分的長さのAT III cDNAクロンをさ
らに分析すると、プラスミドpA68、このプラスミドは抗
トロンビンIII構造遺伝子の３′末端からの400bpを含有
した、84bpの３′の翻訳されない区域、およびポリ
（Ａ）尾が明らかにされた。pA68および重なるクロンpA
62の配列を分析すると、ヒト抗トロンビンIII遺伝子の
完全な１次構造およびその側面に位置する（flanking）
翻訳されない区域の部分が提供された。さらに、部分的
cDNAクロンの重なる区域内の共通の制限部位を利用し
て、E.coliにおけるtrpオペレーター−プロモーターの
調節下にヒト抗トロンビンIIIの合成を管理するため
に、発現プラスミド中へ挿入された完全な長さの構造遺
伝子を構造した。
ヒト抗トロンビンIIIメツセンジヤーRNAの配列および構
造 A62およびA68cDNAクロンのヌクレオチドの配列を分析す
ると、96ヌクレオチド信号配列（32のアミノ酸）、成熟
タンパク質を暗号化する1296ヌクレチオド配列（432の
アミノ酸）、および３′の翻訳されない区域における84
残基が明らかにされる。
DNA配列は、32残基の信号ペプチドがヒト抗トロンビンI
IIの成熟Ｎ末端より多分先行することを明らかにする。
この配列は、信号ペプチド区域（Jackson およびBlobe
l,1980）に共通して帰因する２つの特徴を表わす。第１
に、非常に疎水性の区域（LeuLeuSerLeuLeuLeuIle）が
分裂（cleavage）部位の前の10残基付近に観察される。
成熟Ｎ末端の直前のシステインの存在は、分裂部位のす
ぐ前のアミノ酸残基がすべての場合において最小のアミ
ノ酸の１つであつたという先例と一致する。
ヒト抗トロンビンIIIの成熟形態は、432アミノ酸残基を
含有する。DNA分析により決定されたタンパク質配列
は、刊行物Petersen et al．（1979）に記載される部
分的配列と完全に一致し、そしてもとのアミノ酸の定量
があいまいであるかあるいは未知である区域についの明
確な配列の情報を提供した。タノパク質の配列によりGl
xとしてのみ同定された、アミノ酸残基100、101、326お
よび328（番号の構成はPetersenに従う）は、明瞭にgl
n,gln,glnおよびglnと決定された。残基329はaspであ
る。また、DNAの配列は、８つの追加のアミノ酸（ValLe
uValAsnThrIleTyrPhe）が配列のLeu213とLys214の間に
存在することを明らかにした。これはPetersen et a
l．（1979）は認識しなかつた。
最後に、AT III cDNAのヌクレオチド配列は成熟タンパ
ク質のC-末端残基、リシンのすぐ後に停止コドンが来る
ので、このタンパク質のカルボキシ末端が処理されない
ことを示す。３′の非解読（noncoding）区域は、停止
コドンUAAの次の84のヌクレオチドから成る。配列AATAA
Aは、ポリアデニル化部位から−30の残基に存在する。
ヒト抗トロンビンIIIのバクテリアの発現 50,000ダルトンのメチオニル−AT IIIを生産する7kbの
プラスミドのpAT III-E7は、E.coli trpプロモーターの
背後に部分的cDNAクロンpA62およびpA68のセグメントを
配置することによつて構成された（第３図）。この発現
プラスミドの構成は、EcoR I分裂部位、ATG翻訳開始コ
ドンおよび成熟構造遺伝子のアミノ末端を解読するヌク
レオチド配列を含むDNA断片を、第１独特制限部位SacII
を経て、合成することを必要とした。われわれは、この
ような断片を、化学的手順と酵素的手順とを組み合わせ
ることによつて、合成しようと試みた。３つの任意に選
んだヌクレオチド、引き続く６塩基のEcoR I認識配列、
次いでTATGおよび成熟ヒト抗トロンビンIIIの最初の８
つのコドンを暗号化する23のヌクレオチドを含有する36
塩基のデオキシオリゴヌクレオチドを合成した。
この合成36マーは、リボソーム配列と翻訳の開始部との
間に最適な間隔を設け、ならびに遺伝子の５′末端にお
ける第２構造を最小とするように設計した。これを達成
するために、アミノ酸残基２、３および４を暗号化する
ために選んだトリプレツトは、pA62cDNAクロン中に観察
される自然コドンに相当しない。12の塩基対により36マ
ーの３′末端へアニーリングされかつ遺伝子の３′末端
へ向かつて伸びる、37塩基のデオキシオリゴヌクレオチ
ドをも合成した。その３′から５′の末端から解読する
と、37マーは、アミノ酸残基４〜13（SacII認識配列を
含有する）とリンカー（linker）断片の増殖に使用する
人工HindIII部位とを解読するヌクレオチドを含有す
る。36マーおよび37マーをアニーリングし、そして初め
の12bpの長さの二本鎖の区域を、DNAポリメラーゼクレ
ナウ（Klenow）断片で延長した。二連の（duplex）生産
物をEcoR IおよびHindIIIでトリミング（trimming）
し、そして精製したEcoR I-HindIII断片をpBR322へ挿入
した。この構造からの挿入物pR10をDNA配列分析する
と、合成DNAは所望配列の２つの隣接するヌクレオチド
を失なつていることが明らかにされた。
欠失（deletion）は、使用したDNAポリメラーゼにより
合成DNAのこの特定の組を適切に延長することにより、
得ることができる。２塩基の欠失を修正する１つの方法
を、下に考察する。これを開発する前に、欠失を含有す
る断片は、直接発現プラスミドを構成するための便利な
EcoR I-SacIIリンカーとして利用した。
pR10からのEcoR I-SacII断片を使用して、pA62およびpA
68の部分的cDNAクロンのセグメントをpBR322中のtrpへ
接合した。pR10からのEcoR I-SacII断片のほぼ120ng
を、pA62からの590bPのSacII＝SacＩ断片の約１μｇへ
結合した。630bpのEcoR I-SacI DNA断片は、結合混合物
を適当な酵素で制限した後、ゲル単離した。このEcoR I
-SacＩ断片は、pA68、およびEcoR IおよびPstＩの末端
をもつpBR322発現ベクターのSacＩ完全およびPstＩ部分
的消化により生産された785bpのDNAへ、３つの部分の結
合反応において接合した。発現ベクターは、pBR322のEc
oR I部位へ挿入されかつamp遺伝子に対して読みをおこ
なうtrpプロモーター−オペレーター断片を含有する。E
coR I配列はプロモーターリボソーム結合部位の後に存
在し、そしてamp遺伝子中のPstＩ部位はこのベクターを
構造遺伝子の３′末端へ融合するために使用する。この
３部分結合の生産物を、pTA2と表示する。
誘導体のpTA2は、EcoR I部位、開始コドンおよびAT III
アミノ酸残基１〜12のための無傷の解読配列を含有する
合成DNAの40bpの片で、38pbのEcoR I-Sac断片を置換す
ることによつてつくつた。この40bpのDNA断片は、２つ
の異なるDNAポリメラーゼ酵素を利用した方法によつて
合成した。第１に、36塩基長さのプライマーをpA62から
の鋳型DNA断片へ交雑化し、そしてAMV逆トランスクリプ
ターゼのポリメラーゼ活性を用いて延長した。（上の36
マーの説明を参照。）プライマーの延長後、E.coliクレ
ナウ（klenow）断片の二重の３′〜５′エキソヌクレア
ーゼおよび５′〜３′ポリメラーゼ活性を活用して、過
剰の単一鎖の鋳型DNAを切り取り（trim off）、そして
構造遺伝子、翻訳開始コドンおよびEcoR I尾を重合し
た。この調製物を引き続いてEcoR IおよびSacIIで切断
し、そして40bpの断片をpTA2へ挿入した。得られたプラ
スミドのpAT III-E7は、DNA配列分析により、EcoR I部
位とSacII部位との間に正しい解読情報をもつことが証
明された。さらに、pAT III-E7は、抗トロンビンIIIと
して免疫的に同定された50,000ダルトンのタンパク質を
trp調節（control）のもとに生産する。
さらに、trpオペレーター−プロモーターの調節のもと
に前抗トロンビンIIIを発現するプラスミドのpAT III-J
4が構成された。pAT III-J4は、pTA2から、抗トロンビ
ンIIIの推定上の（presumptive）36残基の信号配列およ
び成熟ポリペプチドの最初の12アミノ酸を暗号化する14
5bpのEcoR I-SacII断片で、38bpのEcoR I-SacII断片を
置換することにより誘導された。この断片は、24塩基の
合成DNAプライマー（dCTAGAATTCATGTATTCCAATGTG）およ
び1400bpのpA62 PstＩ断片から、順次のDNAポリメラー
ゼＩ、SacIIおよびEcoR Iの処理（Lawn et al,1981）
により合成された。pAT III-J4は、trpの調節のもと
で、AT III抗血清と反応する２種類のタンパク質を発現
する。主成分は、前抗トロンビンIIIの計算した分子量
に近似する見掛けの分子量を有する。小さい帯が存在
し、それはpAT III-E7から生産されたAT IIIの帯とコミ
ゲイト（comigate）する。
バクテリア的に合成した抗トロンビンIIIによるヒトト
ロンビンの不活性化 AT IIIはトロンビンと反応して共有1:1化学量論的錯体
を形成することにより、トロンビンを不活性化する（Je
sty,1979）。たとえば、pAT III-J4で形質転換したE.co
li W3110の細胞抽出物は、ヘパリンの存在下にヒトトロ
ンビンとともに保温することができる。ポリアクリルア
ミドのゲルの電気泳動の後、AT IIIトロンビン錯体は、
ウエスターン・ブロツテイング（Western blotting）
（Renart,et al.,1979）により、ウサギ抗ヒトAT III
血清を用いて検出される。バクテリアのAT IIIヒトトロ
ンビン錯体は、トロンビンを加えた反応において観察さ
れる。
製薬学的組成物 本発明の化合物は既知の方法に従い配合して製薬学的組
成物を調製することができる。ここで、本発明のヒト抗
トロンビンIII生産物を製薬学的に許容されうる担体の
ビヒクルと混合して組み合わせる。適当なビヒクル類お
よびそれらの配合物、たとえば、他のヒトのタンパク
質、たとえば、ヒトの血清アルブミンまたは血漿の調製
物は、Remington′s Pharmaceutical Sciencesマーク
発行会社（Mark Publish-ing Co.）ペンシルバニア州イ
ーストン第15巻、第２版、1975年に記載されている。こ
のような組成物は、有効量の本発明の本発明のタンパク
質を、宿主への効果的な、好ましくは非経口的な、投与
に適する製薬学的に許容されうる組成物を調製するため
に、適当な量のビヒクルと一緒に含有する。
文献 1.Abildgaard,U.Scand.J.Heamat.５:440-453（1968）。
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【図面の簡単な説明】
第１図は、抗トロンビンIIImRNAおよびcDNAクローンを
表わす。 第２図は、ヒト抗トロンビンIIIのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を示す。 第３図は、pAT III-E7の構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸配列： からなるヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配列を含
    有するDNA。
  2. 【請求項２】該ヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配
    列が以下に示すDNA配列である特許請求の範囲第１項に
    記載のDNA。
  3. 【請求項３】アミノ酸配列： からなるヒト抗トロンビンIIIのプレ配列ペプチドをコ
    ードするDNA配列をも含有する特許請求の範囲第１項に
    記載のDNA。
  4. 【請求項４】該プレ配列ペプチドをコードするDNA配列
    が以下に示す配列である特許請求の範囲第３項に記載の
    DNA。
  5. 【請求項５】アミノ酸配列： からなるヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配列を含
    有する複製可能なクローニングベクター。
  6. 【請求項６】該ヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配
    列が以下に示すDNA配列から選択される特許請求の範囲
    第５項のクローニングベクター。
  7. 【請求項７】発現をもたらすDNA配列に対して機能する
    ように連結し、翻訳開始信号と翻訳停止信号が隣接して
    いる、アミノ酸配列： からなるヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配列を含
    有する発現ベクター。
  8. 【請求項８】該ヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配
    列が以下に示すDNA配列である特許請求の範囲第７項に
    記載の発現ベクター。
  9. 【請求項９】ヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配
    列： を保持し、以下に示す制限部位および機能地図によって
    特徴づけられる約7kbの組換えプラスミドpATIII-E7であ
    る、特許請求の範囲第７項に記載の発現ベクター。
  10. 【請求項１０】プレ抗トロンビンをコードするDNA配
    列： を保持し、以下に示す制限部位および機能地図によって
    特徴づけられる約7kbの組換えプラスミドpATIII-J4であ
    る、特許請求の範囲第７項に記載の発現ベクター。
  11. 【請求項１１】発現をもたらすDNA配列に対して機能す
    るように連結し、翻訳開始信号および翻訳停止信号が隣
    接している、アミノ酸配列： からなるヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配列を含
    有する発現ベクターで形質転換された細菌細胞。
  12. 【請求項１２】該発現ベクターが含有する該ヒト抗トロ
    ンビンIIIをコードするDNA配列が以下に示すDNA配列で
    ある特許請求の範囲第11項に記載の細菌細胞。
  13. 【請求項１３】成熟ヒト抗アンチトロンビンIIIを生産
    できる特許請求の範囲第11項記載の細菌細胞。
  14. 【請求項１４】ヒト抗トロンビンIIIをコードするDNA配
    列： を保持し、次の制限部位および機能地図： によって特徴づけられる約7kbのプラスミドからなる組
    換えプラスミドpATIII-E7で形質転換された特許請求の
    範囲第11項に記載の細菌細胞。
  15. 【請求項１５】プレ抗トロンビンをコードするDNA配
    列： を保持し、次の制限部位および機能地図： によって特徴づけられる約7kbのプラスミドからなる組
    換えプラスミドpATIII-J4で形質転換された特許請求の
    範囲第11項に記載の細菌細胞。
JP58033900A 1982-03-03 1983-03-03 ヒト抗トロンビン▲ｉｉｉ▼ Expired - Lifetime JPH0687778B2 (ja)

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GB8206262 1982-03-03
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