JPH0687779B2 - 合成構造遺伝子 - Google Patents
合成構造遺伝子Info
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- JPH0687779B2 JPH0687779B2 JP59170492A JP17049284A JPH0687779B2 JP H0687779 B2 JPH0687779 B2 JP H0687779B2 JP 59170492 A JP59170492 A JP 59170492A JP 17049284 A JP17049284 A JP 17049284A JP H0687779 B2 JPH0687779 B2 JP H0687779B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/585—Calcitonins
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サケカルシトニンの合成構造遺伝子とその製
造法に関する。
造法に関する。
（従来の技術） カルシトニンは、Ｃ末端がアミド化された32個のアミノ
酸からなるペプチドであり、高カルシウム血症、Paget
（ページェット）病について治療効果が認められてい
る。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨新生促
進作用も確認されており老人性の骨粗鬆症に対しても有
望視されている。現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウ
シ、ヒト、ラット、サケ、ウナギから分離され、それぞ
れ構造が明らかにされている。
酸からなるペプチドであり、高カルシウム血症、Paget
（ページェット）病について治療効果が認められてい
る。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨新生促
進作用も確認されており老人性の骨粗鬆症に対しても有
望視されている。現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウ
シ、ヒト、ラット、サケ、ウナギから分離され、それぞ
れ構造が明らかにされている。
由来する生物種間におけるカルシトニンの血中での生理
活性を比較すると魚類の鰓後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約30倍の比活性を示
し、効力の持続時間も長い。この理由としてサケカルシ
トニンにおいては、他のカルシトニンと較べて血中で不
活性化されにくいことが、例えば、H.Copp等、Calciton
in,Proc.2nd.Int.Sympo.London Heinemann.281（1981）
により報告されている。このため、サケカルシトニンが
特に医薬として使用するのに有利である。現在治療用の
カルシトニンとして市販されているものは、ブタ、サ
ケ、ウナギのカルシトニンであるが、これらは生体から
抽出したりまたは化学的に合成することによって得られ
ている。しかしその生産量はわずかでありまた高価であ
る。従ってサケカルシトニンを経済的、且つ大量に製造
することができる新規な方法の開発が強く望まれてい
る。
活性を比較すると魚類の鰓後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約30倍の比活性を示
し、効力の持続時間も長い。この理由としてサケカルシ
トニンにおいては、他のカルシトニンと較べて血中で不
活性化されにくいことが、例えば、H.Copp等、Calciton
in,Proc.2nd.Int.Sympo.London Heinemann.281（1981）
により報告されている。このため、サケカルシトニンが
特に医薬として使用するのに有利である。現在治療用の
カルシトニンとして市販されているものは、ブタ、サ
ケ、ウナギのカルシトニンであるが、これらは生体から
抽出したりまたは化学的に合成することによって得られ
ている。しかしその生産量はわずかでありまた高価であ
る。従ってサケカルシトニンを経済的、且つ大量に製造
することができる新規な方法の開発が強く望まれてい
る。
このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用
いる方法が最も好ましい。特開昭58-203953にはヒトカ
ルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌におけるその発現
が記載されている。しかしながらサケカルシトニン遺伝
子の合成、又は生体からの抽出について記載した文献は
存在しない。
いる方法が最も好ましい。特開昭58-203953にはヒトカ
ルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌におけるその発現
が記載されている。しかしながらサケカルシトニン遺伝
子の合成、又は生体からの抽出について記載した文献は
存在しない。
（発明が解決しようとする問題点） この発明は、前記のごとく最も有望視されているサケカ
ルシトニンを経済的、且つ大量に製造するための新規な
方法を開発する事を最終目的とし、その前提としてサケ
カルシトニン構造遺伝子を提供する事を目的とする。遺
伝子操作技術の分野においては、現在までのところ、魚
類の鰓後腺に由来するサケ型及びウナギ型のカルシトニ
ンに相当する人工合成遺伝子はいまだ合成されていな
い。その理由の１つは、構造遺伝子中に５つの反復する
ロイシン（Leu）を含む領域を持つことである。このよ
うに強いホモロジーを持つような二重鎖ポリヌクレオチ
ドは従来合成が困難であると言われていた（例えば、J.
Windass等、N.A.R.106639（1982）参照）。
ルシトニンを経済的、且つ大量に製造するための新規な
方法を開発する事を最終目的とし、その前提としてサケ
カルシトニン構造遺伝子を提供する事を目的とする。遺
伝子操作技術の分野においては、現在までのところ、魚
類の鰓後腺に由来するサケ型及びウナギ型のカルシトニ
ンに相当する人工合成遺伝子はいまだ合成されていな
い。その理由の１つは、構造遺伝子中に５つの反復する
ロイシン（Leu）を含む領域を持つことである。このよ
うに強いホモロジーを持つような二重鎖ポリヌクレオチ
ドは従来合成が困難であると言われていた（例えば、J.
Windass等、N.A.R.106639（1982）参照）。
サケカルシトニンは、32個のアミノ酸からなることが知
られている。このアミノ酸配列には、遺伝暗号の縮重の
故に、この蛋白の暗号を構成するヌクレオチド配列が多
数存在する。この様な場合には大腸菌の中でよく使用さ
れている、あるいは高発現をしている蛋白質において好
んで用いられているトリヌクレオチドコドンを使用する
ことが一般にすすめられている。しかしサケカルシトニ
ンのように、同一アミノ酸が反復して存在する領域を持
つ構造遺伝子の場合には、特定のヌクレオチド配列の選
択では目的とする遺伝子を合成することはできない。従
ってこの発明は、サケカルシトニン構造遺伝子を製造す
る方法を提供するものである。
られている。このアミノ酸配列には、遺伝暗号の縮重の
故に、この蛋白の暗号を構成するヌクレオチド配列が多
数存在する。この様な場合には大腸菌の中でよく使用さ
れている、あるいは高発現をしている蛋白質において好
んで用いられているトリヌクレオチドコドンを使用する
ことが一般にすすめられている。しかしサケカルシトニ
ンのように、同一アミノ酸が反復して存在する領域を持
つ構造遺伝子の場合には、特定のヌクレオチド配列の選
択では目的とする遺伝子を合成することはできない。従
ってこの発明は、サケカルシトニン構造遺伝子を製造す
る方法を提供するものである。
（問題点を解決するための手段） 前記の目的は、サケカルシトニン、及びその前駆体をコ
ードし、そして適当な宿主、例えば大腸菌（E.coli）の
ごとき微生物において発現され得る構造遺伝子を合成す
ることによって解決される。
ードし、そして適当な宿主、例えば大腸菌（E.coli）の
ごとき微生物において発現され得る構造遺伝子を合成す
ることによって解決される。
カルシトニンの活性の発現にはＣ末端をアミド化する事
が必要であると言われている〔たとえばS.Guttmann.Exc
erpta Medica Int.Cong.Ser.54011（1981）参照〕。発
明者らは、以下の二つの方法に依って活性のあるカルシ
トニンを製造する事を意図した。１つは、インシュリン
の豚型からの人型への転換において示されるようなペプ
チド合成技術の応用である〔たとえばK.Inove等J.A.C.
S.101751（1979）参照〕。酵素反応によってＣ末端をア
ミド基を含むジ又はオリゴペプチドで置き換える事によ
り活性のあるカルシトニンを作る事ができる。もう１つ
は生体内に存在するアミド化酵素を利用してＣ末端アミ
ド基を作り出す方法である。末端にGlyを含むトリペプ
チドを脳下垂体由来の酵素が消化してアミド基に替える
事は文献に報告されている〔たとえばA.Bradbury等、B.
B.R.C117289（1983）参照〕。
が必要であると言われている〔たとえばS.Guttmann.Exc
erpta Medica Int.Cong.Ser.54011（1981）参照〕。発
明者らは、以下の二つの方法に依って活性のあるカルシ
トニンを製造する事を意図した。１つは、インシュリン
の豚型からの人型への転換において示されるようなペプ
チド合成技術の応用である〔たとえばK.Inove等J.A.C.
S.101751（1979）参照〕。酵素反応によってＣ末端をア
ミド基を含むジ又はオリゴペプチドで置き換える事によ
り活性のあるカルシトニンを作る事ができる。もう１つ
は生体内に存在するアミド化酵素を利用してＣ末端アミ
ド基を作り出す方法である。末端にGlyを含むトリペプ
チドを脳下垂体由来の酵素が消化してアミド基に替える
事は文献に報告されている〔たとえばA.Bradbury等、B.
B.R.C117289（1983）参照〕。
サケカルシトニンのアミノ酸配列は次の通りである。
サケカルシトニンの前駆体のアミノ酸配列は次の通りで
ある。
ある。
一般にアミノ酸配列が既に知られている構造遺伝子を人
工的に製造しようとする場合、まず二本鎖ヌクレオチド
配列の決定を行う。
工的に製造しようとする場合、まず二本鎖ヌクレオチド
配列の決定を行う。
サケカルシトニンにおいては、特定のヌクレオチド配列
の選択だけでは目的とする遺伝子が合成できないため
に、本発明者らは、第一に構造遺伝子の合成に係るオリ
ゴヌクレオチド相互のハイブリダイゼーションの強さを
理論的に求め、第二に好ましくないハイブリダイゼーシ
ョンの自由エネルギーを上回るような値を、オリゴヌク
レオチドの正しい相補的な接続部位に与えるようにアミ
ノ酸のコドンを選択することによって好ましいヌクレオ
チド配列を決定した。すなわち、本発明の第１の発明
は、酵素によるペプチド変換（トランスペプチゼーショ
ン）を考慮した配列であって、次のように表わされるサ
ケカルシトニン合成構造遺伝子である。
の選択だけでは目的とする遺伝子が合成できないため
に、本発明者らは、第一に構造遺伝子の合成に係るオリ
ゴヌクレオチド相互のハイブリダイゼーションの強さを
理論的に求め、第二に好ましくないハイブリダイゼーシ
ョンの自由エネルギーを上回るような値を、オリゴヌク
レオチドの正しい相補的な接続部位に与えるようにアミ
ノ酸のコドンを選択することによって好ましいヌクレオ
チド配列を決定した。すなわち、本発明の第１の発明
は、酵素によるペプチド変換（トランスペプチゼーショ
ン）を考慮した配列であって、次のように表わされるサ
ケカルシトニン合成構造遺伝子である。
正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACT− 負鎖:ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCT CCAAGACCATGTGGA また本発明の第２の発明は、酵素によるアミデーション
サイトのin vitro変換を考慮した配列であって、アミド
化ペプチドの前駆体として、次の配列で表わされるペプ
チド鎖のＣ末端にグリシンを付加したサケカルシトニン
合成構造遺伝子である。
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCT CCAAGACCATGTGGA また本発明の第２の発明は、酵素によるアミデーション
サイトのin vitro変換を考慮した配列であって、アミド
化ペプチドの前駆体として、次の配列で表わされるペプ
チド鎖のＣ末端にグリシンを付加したサケカルシトニン
合成構造遺伝子である。
正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACT− 負鎖:ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCTGGT CCAAGACCATGTGGACCA この遺伝子のヌクレオチド配列の最初にメチオニンのコ
ドンを、末端に終止コドンを付加することが好ましく、
特に終止コドンは複数使用することが好ましい。また配
列の両端及び内部にいくつかの制限酵素認識部位及び切
断部位を組み入れることが好ましい。上流側末端の制限
酵素切断部位のヌクレオチド配列を選択することによ
り、構造遺伝子を効果的にmRNAへ転写させることができ
る。制限酵素切断部位を付加した好ましい具体例を第1A
及びＢ図に示す。
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCTGGT CCAAGACCATGTGGACCA この遺伝子のヌクレオチド配列の最初にメチオニンのコ
ドンを、末端に終止コドンを付加することが好ましく、
特に終止コドンは複数使用することが好ましい。また配
列の両端及び内部にいくつかの制限酵素認識部位及び切
断部位を組み入れることが好ましい。上流側末端の制限
酵素切断部位のヌクレオチド配列を選択することによ
り、構造遺伝子を効果的にmRNAへ転写させることができ
る。制限酵素切断部位を付加した好ましい具体例を第1A
及びＢ図に示す。
またオリゴヌクレオチドを段階的に集合、連結していく
本発明の第３の発明においても前記の方法を用いること
が好ましい。好ましいサブブロック集合法として選ばれ
た具体例を以下に示す。
本発明の第３の発明においても前記の方法を用いること
が好ましい。好ましいサブブロック集合法として選ばれ
た具体例を以下に示す。
以下に構造遺伝子の人工合成における配列の確立及び製
造法についてさらに詳細に述べる。
造法についてさらに詳細に述べる。
大腸菌内で、高発現される蛋白質において好んで用いら
れるトリプレットコドン（例えば、R.Gran-tham等N.A.
R.９r43（1981）参照）をサケカルシトニンのアミノ酸
配列にあてはめて好ましい二本鎖ヌクレオチド配列を選
び、さらにその両末端にmRNAの転写を制御する開始と終
止のコドン、及びプラスミドベクターに挿入するための
ヌクレオチド配列を付加した。この二本鎖ヌクレオチド
配列を適当な長さのオリゴヌクレオチドに分割した。
れるトリプレットコドン（例えば、R.Gran-tham等N.A.
R.９r43（1981）参照）をサケカルシトニンのアミノ酸
配列にあてはめて好ましい二本鎖ヌクレオチド配列を選
び、さらにその両末端にmRNAの転写を制御する開始と終
止のコドン、及びプラスミドベクターに挿入するための
ヌクレオチド配列を付加した。この二本鎖ヌクレオチド
配列を適当な長さのオリゴヌクレオチドに分割した。
本発明者らは、オリゴヌクレオチドの接着と結合にかか
わる反応、Annealing反応とligation反応、を常に好結
果に導く構造遺伝子のヌクレオチド配列を見い出した。
また、結合を行うために集合された複数のオリゴヌクレ
オチド相互において、設定された接着部位のハイブリダ
イゼーションの自由エネルギーが他のすべての好ましく
ないクロスハイブリダイゼーションの与える自由エネル
ギーより充分に負の値であれば反応において常に好結果
が得られることを本発明者らは見い出した。
わる反応、Annealing反応とligation反応、を常に好結
果に導く構造遺伝子のヌクレオチド配列を見い出した。
また、結合を行うために集合された複数のオリゴヌクレ
オチド相互において、設定された接着部位のハイブリダ
イゼーションの自由エネルギーが他のすべての好ましく
ないクロスハイブリダイゼーションの与える自由エネル
ギーより充分に負の値であれば反応において常に好結果
が得られることを本発明者らは見い出した。
ハイブリダイゼーションの自由エネルギーの値は、RNA
のヌクレオチド配列におけるアテェニュエーター構造の
ハイブリダイゼーションの強さを推定する計算方法（例
えば、I.Tinoco.Jr等Nature New Biology24640（1973）
参照）を用いて求められる数値で代替することが行なわ
れているようである。本発明者らは、コンピューターを
用いて第一に上記に設定した７塩基からなるオリゴヌク
レオチドの接着部位についてハイブリダイゼーションの
数値を求め、次に前記のようにして選んだ二本鎖ヌクレ
オチド配列を構成するオリゴヌクレオチド相互のクロス
ハイブリダイゼーションについて数値を求めた。両者の
数値の比較により、クロスハイブリダイゼーションが正
しい接着に優先すると判定された部分について、アミノ
酸のトリプレットコドンを縮重する他のコドンに置き換
え、二本鎖ヌクレオチド配列を修正した。このような修
正操作を繰り返すことにより好ましいヌクレオチド配列
を設定した。
のヌクレオチド配列におけるアテェニュエーター構造の
ハイブリダイゼーションの強さを推定する計算方法（例
えば、I.Tinoco.Jr等Nature New Biology24640（1973）
参照）を用いて求められる数値で代替することが行なわ
れているようである。本発明者らは、コンピューターを
用いて第一に上記に設定した７塩基からなるオリゴヌク
レオチドの接着部位についてハイブリダイゼーションの
数値を求め、次に前記のようにして選んだ二本鎖ヌクレ
オチド配列を構成するオリゴヌクレオチド相互のクロス
ハイブリダイゼーションについて数値を求めた。両者の
数値の比較により、クロスハイブリダイゼーションが正
しい接着に優先すると判定された部分について、アミノ
酸のトリプレットコドンを縮重する他のコドンに置き換
え、二本鎖ヌクレオチド配列を修正した。このような修
正操作を繰り返すことにより好ましいヌクレオチド配列
を設定した。
第２図は一般的にすすめられている方法によって選択し
た二本鎖ヌクレオチド配列であり、第１図はそれを修正
した本発明による二本鎖ヌクレオチド配列である。
た二本鎖ヌクレオチド配列であり、第１図はそれを修正
した本発明による二本鎖ヌクレオチド配列である。
具体的にはオリゴヌクレオチドU3及びU4を、U31及びU41
に修正した。これらのオリゴヌクレオチドは次の様な関
係にある。
に修正した。これらのオリゴヌクレオチドは次の様な関
係にある。
対応する負鎖L3及びL4についても対合するようにL31及
びL41に修正している。
びL41に修正している。
第２図のヌクレオチド配列に基づいてサケカルシトニン
遺伝子を合成する事は不可能である。この配列において
は５つの反復するロイシンを含む領域の遺伝子を実質的
に得る事ができない。
遺伝子を合成する事は不可能である。この配列において
は５つの反復するロイシンを含む領域の遺伝子を実質的
に得る事ができない。
また構造遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションを少
なくするためにサブブロックを作製して段階的に集合、
連結することができる。サブブロック相互の接着部位と
しては、自由エネルギーの負の値の大きい部位を選ぶこ
とが好ましい。
なくするためにサブブロックを作製して段階的に集合、
連結することができる。サブブロック相互の接着部位と
しては、自由エネルギーの負の値の大きい部位を選ぶこ
とが好ましい。
第５図のように従来の方法に従っても目的とする遺伝子
を得る事はできるが、この方法においては合成収率が非
常に低い。
を得る事はできるが、この方法においては合成収率が非
常に低い。
合成が困難な５つの反復するLeuを含むサケカルシトニ
ン遺伝子について本発明の有用性を実施例において例示
する。
ン遺伝子について本発明の有用性を実施例において例示
する。
設計されたオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法
により小ユニットから作り上げる方法、及び酵素を用い
てオリゴヌクレオチドを連結していく方法は公知である
（例えば、H.Hsivng等、N.A.R.６1371（1979）、および
K.Agarwal等、Nature22727（1970）参照）。オリゴヌク
レオチドを合成するためには固相ホスホトリエステル法
を用いることが好ましい。
により小ユニットから作り上げる方法、及び酵素を用い
てオリゴヌクレオチドを連結していく方法は公知である
（例えば、H.Hsivng等、N.A.R.６1371（1979）、および
K.Agarwal等、Nature22727（1970）参照）。オリゴヌク
レオチドを合成するためには固相ホスホトリエステル法
を用いることが好ましい。
簡単なグラスフィルター（たとえばT.Tanaka等NAR10324
9（1982）参照）内で縮合反応を行った。
9（1982）参照）内で縮合反応を行った。
オリゴヌクレオチドL-31を合成する方法を示せば、まず
樹脂担体上に３′位の水酸基を用いて固定されたベンゾ
イルシチジンの５′位の水酸基と、核酸塩基、インター
ヌクレオチドリン酸基と５′位の水酸基が保護されたダ
イマーユニットシチジン−グアノシン（CG）のグアノシ
ンの３′位の水酸基とを、リン酸基の活性化剤を用いて
縮合させる。
樹脂担体上に３′位の水酸基を用いて固定されたベンゾ
イルシチジンの５′位の水酸基と、核酸塩基、インター
ヌクレオチドリン酸基と５′位の水酸基が保護されたダ
イマーユニットシチジン−グアノシン（CG）のグアノシ
ンの３′位の水酸基とを、リン酸基の活性化剤を用いて
縮合させる。
次に新しく付加したシチジンの５′位の水酸基の保護基
を除去してダイマーユニットアデノシン−アデノシン
（AA）と縮合させる。このようにして以下、AG、CC、C
C、TT、ACのダイマーユニットを順次縮合させることに
よって保護基を含むオリゴヌクレオチドL-31が合成され
る。
を除去してダイマーユニットアデノシン−アデノシン
（AA）と縮合させる。このようにして以下、AG、CC、C
C、TT、ACのダイマーユニットを順次縮合させることに
よって保護基を含むオリゴヌクレオチドL-31が合成され
る。
オリゴヌクレオチドL-31は、担体樹脂につながるベンゾ
イルシチジンの３′位、核酸塩基、インターヌクレオチ
ドリン酸基とオリゴヌクレオチド鎖の先端のアデノシン
の５′位に存在する保護基をすべて除去することによっ
て得られる。
イルシチジンの３′位、核酸塩基、インターヌクレオチ
ドリン酸基とオリゴヌクレオチド鎖の先端のアデノシン
の５′位に存在する保護基をすべて除去することによっ
て得られる。
オリゴヌクレオチドを連結して構造遺伝子を合成するた
めには、酵素反応を用いることが好ましい。酵素ポリヌ
クレオチドキナーゼとアデノシントリリン酸（ATP）を
用いてオリゴヌクレオチドにリン酸基を付加する。この
オリゴヌクレオチドの複数を一旦加熱しさらに再冷却す
ることによって物理的に凝集させ、酵素、T4ポリヌクレ
オチドリガーゼを作用させて、オリゴヌクレオチド相互
の５′末端のリン酸基と３′末端の水酸基とを縮合させ
ると遺伝子の一部を構成するサブブロックを合成するこ
とができる。構造遺伝子はサブブロック相互を同様に縮
合させることにより製造できる。
めには、酵素反応を用いることが好ましい。酵素ポリヌ
クレオチドキナーゼとアデノシントリリン酸（ATP）を
用いてオリゴヌクレオチドにリン酸基を付加する。この
オリゴヌクレオチドの複数を一旦加熱しさらに再冷却す
ることによって物理的に凝集させ、酵素、T4ポリヌクレ
オチドリガーゼを作用させて、オリゴヌクレオチド相互
の５′末端のリン酸基と３′末端の水酸基とを縮合させ
ると遺伝子の一部を構成するサブブロックを合成するこ
とができる。構造遺伝子はサブブロック相互を同様に縮
合させることにより製造できる。
目的とする遺伝子はサブブロック相互を連結方式（Ｉ）
及び（II）によって同様に縮合させる事により製造でき
る。
及び（II）によって同様に縮合させる事により製造でき
る。
なお、この発明において、サケカルシトニンの遺伝子を
CT1、サケカルシトニン前駆体の遺伝子をCT2と称する。
CT1、サケカルシトニン前駆体の遺伝子をCT2と称する。
上記の合成構造遺伝子は公知の方法でプラスミドベクタ
ーに挿入することができる。挿入した部位の上流かつ隣
接した位置に微生物プロモーターを導入すれば、挿入さ
れた遺伝子は、このプロモーターの制御下に正しい位相
でmRNAへの転写が行なわれる。
ーに挿入することができる。挿入した部位の上流かつ隣
接した位置に微生物プロモーターを導入すれば、挿入さ
れた遺伝子は、このプロモーターの制御下に正しい位相
でmRNAへの転写が行なわれる。
プラスミドpHT2にサケカルシトニン構造遺伝子を挿入し
て造成されたプラスミドのうち、サケカルシトニン遺伝
子CT1を含有するプラスミドをpSCT1と称し、サケカルシ
トニン前駆体遺伝子CT2を含有するプラスミドをpSCT2と
称する。
て造成されたプラスミドのうち、サケカルシトニン遺伝
子CT1を含有するプラスミドをpSCT1と称し、サケカルシ
トニン前駆体遺伝子CT2を含有するプラスミドをpSCT2と
称する。
このようにして得たプラスミドpSCT1、及びpSCT2をE.コ
リ菌株RRIに形質転換することによって、それぞれ形質
転換株を得た。プラスミドpSCT1を含有する形質転換株
をRRI/pSCT1と称し、pSCT2を含有するそれをRRI/pSCT2
と称する。これらの菌株RRI/pSCT1は微工研菌寄第7774
号（FERM-P No.7774）として、RRI/pSCT2は微工研菌寄
第7775号（FERM-P No.7775）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され、微工研条寄第866号（FERM BP
-866）としてブダペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。
リ菌株RRIに形質転換することによって、それぞれ形質
転換株を得た。プラスミドpSCT1を含有する形質転換株
をRRI/pSCT1と称し、pSCT2を含有するそれをRRI/pSCT2
と称する。これらの菌株RRI/pSCT1は微工研菌寄第7774
号（FERM-P No.7774）として、RRI/pSCT2は微工研菌寄
第7775号（FERM-P No.7775）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され、微工研条寄第866号（FERM BP
-866）としてブダペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
サケカルシトニン遺伝子フラグメントの化学合成 第1A及びＢ図に本発明のサケカルシトニン遺伝子の配列
を、第２図に比較の為の配列を示した。これら第1A及び
Ｂ図及び２図に示した23個のオリゴヌクレオチドの化学
合成は、ホスホトリエステル、固相法を用いて行った。
すなわちオリゴヌクレオチドL-31の完全に保護されたオ
リゴヌクレオシドを合成するためには、40mg、2.2μmol
のシトシンヌクレオシドに15mgずつのCG、AAと、10mgず
つのAG、CC、CC、TT、ATのダイマーユニットを順次反応
させた。
を、第２図に比較の為の配列を示した。これら第1A及び
Ｂ図及び２図に示した23個のオリゴヌクレオチドの化学
合成は、ホスホトリエステル、固相法を用いて行った。
すなわちオリゴヌクレオチドL-31の完全に保護されたオ
リゴヌクレオシドを合成するためには、40mg、2.2μmol
のシトシンヌクレオシドに15mgずつのCG、AAと、10mgず
つのAG、CC、CC、TT、ATのダイマーユニットを順次反応
させた。
一回の縮合操作を示せば、縮合には20mgの2,4,16−トリ
メチルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド
（MSNT）を用い350μｌの無水ピリジン中で室温１時間
反応した。反応後、固型物をピリジンで洗浄し、ジメチ
ルアミノピリジンを触媒として用いて10％の無水酢酸ピ
リジン溶液中で室温３分間キャッピング反応を行った。
ピリジン、ジクロルメタン溶液でそれぞれ洗浄後、３％
TCAのジクロルメタン溶液10mlで固型物を洗う事により
５′末端の保護基であるジメトキシトリチル（DMTr）基
を除去した。このあと、ジクロルメタン、テトラヒドロ
フラン（THF）で洗浄し、ピリジンと共沸脱水を行う事
によって反応容器中の水分を完全に除き、次の回の縮合
反応へと続ける。DMTr基の除去率によって算出した平均
の縮合収率は91％であった。
メチルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド
（MSNT）を用い350μｌの無水ピリジン中で室温１時間
反応した。反応後、固型物をピリジンで洗浄し、ジメチ
ルアミノピリジンを触媒として用いて10％の無水酢酸ピ
リジン溶液中で室温３分間キャッピング反応を行った。
ピリジン、ジクロルメタン溶液でそれぞれ洗浄後、３％
TCAのジクロルメタン溶液10mlで固型物を洗う事により
５′末端の保護基であるジメトキシトリチル（DMTr）基
を除去した。このあと、ジクロルメタン、テトラヒドロ
フラン（THF）で洗浄し、ピリジンと共沸脱水を行う事
によって反応容器中の水分を完全に除き、次の回の縮合
反応へと続ける。DMTr基の除去率によって算出した平均
の縮合収率は91％であった。
次に40mgのヌクレオシドレジンより連続縮合反応によっ
て合成したL-31の保護基を含むオリゴヌクレオチドに対
して、0.5Mのピリジンアルドキシムとテトラメチルグア
ニジン（TMG）の50％ジオキサン水溶液を1.5ml加え、30
℃で２日間反応した。濃縮して溶媒を回収した後、封管
中で22％アンモニアを含むピリジン水溶液2mlと55℃で
５時間反応した。
て合成したL-31の保護基を含むオリゴヌクレオチドに対
して、0.5Mのピリジンアルドキシムとテトラメチルグア
ニジン（TMG）の50％ジオキサン水溶液を1.5ml加え、30
℃で２日間反応した。濃縮して溶媒を回収した後、封管
中で22％アンモニアを含むピリジン水溶液2mlと55℃で
５時間反応した。
これらの反応により、スクレオシドとレジンとの結合が
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。
レジンを別により取り除き、減圧濃縮によってアンモ
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをC-18ディスポーザブルカラムSeppak
（Waters）にかけた。15％の濃度のアセトニトリル水溶
液20mlをカラムに流した後、30％のアセトニトリル水溶
液2mlをカラムに加えると目的物が溶離、流出する。
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをC-18ディスポーザブルカラムSeppak
（Waters）にかけた。15％の濃度のアセトニトリル水溶
液20mlをカラムに流した後、30％のアセトニトリル水溶
液2mlをカラムに加えると目的物が溶離、流出する。
溶離した画分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
DMTr基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によって酢
酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、3,000回転
で10分間遠心する事によりオリゴヌクレオチドを沈下さ
せた。上清を除去した後、減圧によってエタノールを除
き、蒸留水100μｌに溶解した。
DMTr基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によって酢
酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、3,000回転
で10分間遠心する事によりオリゴヌクレオチドを沈下さ
せた。上清を除去した後、減圧によってエタノールを除
き、蒸留水100μｌに溶解した。
HPLCによる精製はμBondpak C-18（Waters）カラムを用
いて0.1Mトリエチルアミンアセテート水溶液と、アセト
ニリルの溶媒系で行った。アセトニトリル濃度を10％よ
り開始し、１分毎に0.6％の勾配で60分間上昇させた。
溶出は１分間あたり1mlの流速で行い目的とするピーク
のものをフラクションコレクター（Gilson）で集めて凍
結乾燥した。
いて0.1Mトリエチルアミンアセテート水溶液と、アセト
ニリルの溶媒系で行った。アセトニトリル濃度を10％よ
り開始し、１分毎に0.6％の勾配で60分間上昇させた。
溶出は１分間あたり1mlの流速で行い目的とするピーク
のものをフラクションコレクター（Gilson）で集めて凍
結乾燥した。
３回に分けて分取操作を行う事により、精製されたL-31
のオリゴヌクレオチドを21OD（260mμで測定）得た。
のオリゴヌクレオチドを21OD（260mμで測定）得た。
同様にして、他のオリゴヌクレオチドも合成した。合成
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。21個のオリゴヌクレオ
チドの物理的性状として１次元ホモクロマトグラフィー
におけるRf値を示す。
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。21個のオリゴヌクレオ
チドの物理的性状として１次元ホモクロマトグラフィー
におけるRf値を示す。
また半数のフラグメントに対しては２次元ホモクロマト
グラフィー法（たとえば、R.Bambara等、NAR１331（197
4）参照）又はマクサム、ギルバート法（たとえば、A.M
axam等、Methods in Enzymology65499（1980）参照）に
よって純度と塩基配列を確認した。
グラフィー法（たとえば、R.Bambara等、NAR１331（197
4）参照）又はマクサム、ギルバート法（たとえば、A.M
axam等、Methods in Enzymology65499（1980）参照）に
よって純度と塩基配列を確認した。
フラグメントによるサブブロックの作製 第３図に酵素反応によって作製したサブブロックの一部
を示す。すなわちサブブロック3-5を作製するために
は、サブブロックを構成する10個のフラグメントそれぞ
れ100pmlを蒸溜水で希釈して９μｌとし、10μciのγ
〔32p〕ATP（3100ei/mmol）を加え、溶液を50mM Tris塩
酸、pH9.6、10mM MgCl2、2mMスペルミン、100mMKCl、10
mM DTTになる様に調整し、４単位のポリヌクレオチドキ
ナーゼを加え全容積を15μｌとした。37℃で30分間反応
する事により５′末端を32pでラベルした。次にすべて
の５′末端をリン酸化するために1nmolのATPと１単位の
ポリヌクレオチドキナーゼを加え37℃で60分間反応させ
た。
を示す。すなわちサブブロック3-5を作製するために
は、サブブロックを構成する10個のフラグメントそれぞ
れ100pmlを蒸溜水で希釈して９μｌとし、10μciのγ
〔32p〕ATP（3100ei/mmol）を加え、溶液を50mM Tris塩
酸、pH9.6、10mM MgCl2、2mMスペルミン、100mMKCl、10
mM DTTになる様に調整し、４単位のポリヌクレオチドキ
ナーゼを加え全容積を15μｌとした。37℃で30分間反応
する事により５′末端を32pでラベルした。次にすべて
の５′末端をリン酸化するために1nmolのATPと１単位の
ポリヌクレオチドキナーゼを加え37℃で60分間反応させ
た。
反応後10個のフラグメントを混合し、C-18ディスポーザ
ブルカラムSeppak（Waters）を用いて前述した方法で精
製した。溶離したDNA溶液を濃縮しエタノール沈殿処理
を行ってDNAを沈下させた。上清を除去した後減圧によ
ってエタノールを除き乾固物を40μｌのリガーゼ緩衝液
（25mMN-2−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′‐２−エ
タンスルホン酸（HEPES）pH7.8、7.5mM MgCl2）に溶解
した。この溶液を1.5ml容エッペンドルフチューブに入
れ、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃にお
いて10個のフラグメントを接着させた。このDNA溶液を
0.2mMのATP、6mMのDTTを含むリガーゼ緩衝溶液とし、T4
リガーゼ８単位を加え、全容量を50μｌとし、12℃で16
時間反応させた。
ブルカラムSeppak（Waters）を用いて前述した方法で精
製した。溶離したDNA溶液を濃縮しエタノール沈殿処理
を行ってDNAを沈下させた。上清を除去した後減圧によ
ってエタノールを除き乾固物を40μｌのリガーゼ緩衝液
（25mMN-2−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′‐２−エ
タンスルホン酸（HEPES）pH7.8、7.5mM MgCl2）に溶解
した。この溶液を1.5ml容エッペンドルフチューブに入
れ、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃にお
いて10個のフラグメントを接着させた。このDNA溶液を
0.2mMのATP、6mMのDTTを含むリガーゼ緩衝溶液とし、T4
リガーゼ８単位を加え、全容量を50μｌとし、12℃で16
時間反応させた。
反応溶液を一部取り出し12％のポリアクリルアミドゲル
電気泳動で検討した。ゲルは7M尿素を含んだものと含ま
ないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジオオ
ートグラフィーを行い、デンシトメーター（Helena Lab
oratories）を用いて反応物の組成を検討した。その結
果78塩基と93塩基に相当するDNAが15％と27％の割合で
生成していた。同様にして他のサブブロックを合成し
た。
電気泳動で検討した。ゲルは7M尿素を含んだものと含ま
ないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジオオ
ートグラフィーを行い、デンシトメーター（Helena Lab
oratories）を用いて反応物の組成を検討した。その結
果78塩基と93塩基に相当するDNAが15％と27％の割合で
生成していた。同様にして他のサブブロックを合成し
た。
第２図のヌクレオチド配列に基づくサブブロックは、3-
1、3-2であり、５つの反復するLeuのトリヌクレオチド
コドンはフラグメントU1,L2,U2,L3,U3,L4,U4,L5上に存
在する。
1、3-2であり、５つの反復するLeuのトリヌクレオチド
コドンはフラグメントU1,L2,U2,L3,U3,L4,U4,L5上に存
在する。
合成収率は次の通りであった。サブブロック 収率（％） 3-1 0.3 3-2 2 3-3 85 3-4 65 3-5 23 3-6 31 3-7 50 3-8 48 この表から明らかなごとく、本発明により修正する前の
塩基配列を有するサブブロック3-1、及び3-2の収率は非
常に低かったが、この発明に係るその他のサブブロック
の収率は十分に高かった。
塩基配列を有するサブブロック3-1、及び3-2の収率は非
常に低かったが、この発明に係るその他のサブブロック
の収率は十分に高かった。
サブブロックによる全遺伝子の製造 サブブロックを集合、連結してヌクレオチド配列の全体
を製造した。
を製造した。
すなわち、前（Ｉ）式の方法で全遺伝子を製造するため
には、サブブロック3-5と3-7のリガーゼ反応終了後の反
応液各45μｌを1.5ml容エッペンドルフチューブ内で混
合し、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃に
おいてサブブロックDNA相互を接着させた。このDNA溶液
に新たに30nmolのATPと500nmolのDTTを加えT4リガーゼ1
2単位を加えて全量を100μｌとし12℃で16時間反応させ
た。
には、サブブロック3-5と3-7のリガーゼ反応終了後の反
応液各45μｌを1.5ml容エッペンドルフチューブ内で混
合し、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃に
おいてサブブロックDNA相互を接着させた。このDNA溶液
に新たに30nmolのATPと500nmolのDTTを加えT4リガーゼ1
2単位を加えて全量を100μｌとし12℃で16時間反応させ
た。
反応物の組成を検討すると113塩基と115塩基の対合に相
当するDNAが全体の23％の割合で生成していた。（第４
図参照） 次に上記の反応溶液全量を7M尿素を含む12％のポリアク
リルアミド電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フィーにより目的のDNAを確認したのち、その部分のゲ
ル片を切り出して透析チューブに入れ、89mMトリスホウ
酸、2mM EDTA緩衝液を満たしシールした後、同緩衝液中
で50Vの定電圧で12時間電気泳動する事によりゲル中のD
NAを溶出させた。次にDNAを透析チューブより取り出し
凍結乾燥し、乾固物を100μｌの蒸溜水に溶解して、イ
オン交換ディスポーザブルカラムElotip-d（Schleicher
＆Schuell）を用いて精製した。
当するDNAが全体の23％の割合で生成していた。（第４
図参照） 次に上記の反応溶液全量を7M尿素を含む12％のポリアク
リルアミド電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フィーにより目的のDNAを確認したのち、その部分のゲ
ル片を切り出して透析チューブに入れ、89mMトリスホウ
酸、2mM EDTA緩衝液を満たしシールした後、同緩衝液中
で50Vの定電圧で12時間電気泳動する事によりゲル中のD
NAを溶出させた。次にDNAを透析チューブより取り出し
凍結乾燥し、乾固物を100μｌの蒸溜水に溶解して、イ
オン交換ディスポーザブルカラムElotip-d（Schleicher
＆Schuell）を用いて精製した。
同様にして前（II）式の方法ではサブブロック3-6と3-8
とをオリゴヌクレオチドL5、U5とで集合連結して、113
塩基と115塩基の対合に相当するDNAを全体の11％の割合
で得た。
とをオリゴヌクレオチドL5、U5とで集合連結して、113
塩基と115塩基の対合に相当するDNAを全体の11％の割合
で得た。
また、オリゴヌクレオチドを段階的に集合連結していく
従来の手法においては、第５図に示したような精製した
小ブロックを順次連結していく方法も一般的に行なわれ
ている。
従来の手法においては、第５図に示したような精製した
小ブロックを順次連結していく方法も一般的に行なわれ
ている。
（たとえば、Ａ・Gddstein等、Biochemistry196096（19
80）参照） 第1A及びＢ図のヌクレオチド配列を用い第５図の方法で
ヌクレオチド配列の全体を製造したところ、それぞれ50
pmolのフラグメントを使用して122塩基と116塩基が対合
したDNAが0.2pmol得られた。
80）参照） 第1A及びＢ図のヌクレオチド配列を用い第５図の方法で
ヌクレオチド配列の全体を製造したところ、それぞれ50
pmolのフラグメントを使用して122塩基と116塩基が対合
したDNAが0.2pmol得られた。
製造した全遺伝子はすべてT4ポリヌクレオチドキナーゼ
とATPを用いて５′末端をリン酸化した。
とATPを用いて５′末端をリン酸化した。
組み替えベクタープラスミドの造成 プラスミドpHT2は発現用ベクターpKC30（たとえばH.Shi
matake等Nature292128（1981）参照）に、pCQV2（たと
えば、C.Queen、J.Mol・Appl・Genetics２１（1983）参
照）由来のCIts遺伝子を組み込んで宿主域を広げたプラ
スミドであり、一ケ所の制限酵素HpaIの切断部位をＮ蛋
白構造遺伝子内に有する。この切断部位にアミノ酸のト
リヌクレオチドコドンの位相を合はせて外来遺伝子を挿
入する事により、PLプロモーターの発現調整支配下にＮ
蛋白との雑種蛋白を発現する事が可能である。
matake等Nature292128（1981）参照）に、pCQV2（たと
えば、C.Queen、J.Mol・Appl・Genetics２１（1983）参
照）由来のCIts遺伝子を組み込んで宿主域を広げたプラ
スミドであり、一ケ所の制限酵素HpaIの切断部位をＮ蛋
白構造遺伝子内に有する。この切断部位にアミノ酸のト
リヌクレオチドコドンの位相を合はせて外来遺伝子を挿
入する事により、PLプロモーターの発現調整支配下にＮ
蛋白との雑種蛋白を発現する事が可能である。
プラスミドpHT2のHpaI、ClaI断片にHpaI、ClaIの制限酵
素認識配列が再生するようにサケカルシトニン遺伝子を
組み込んだ組み替えプラスミドを造成した（第６図参
照）。
素認識配列が再生するようにサケカルシトニン遺伝子を
組み込んだ組み替えプラスミドを造成した（第６図参
照）。
すなわち、pHT2の20μｇを100μｌのClaI反応液（6mM T
ris塩酸、pH7.9、6mM MgCl2、50mM NaCl）中で制限酵素
ClaIを10単位加え37℃60分間反応を行いエタノール沈殿
処理によってDNAを沈下させた。
ris塩酸、pH7.9、6mM MgCl2、50mM NaCl）中で制限酵素
ClaIを10単位加え37℃60分間反応を行いエタノール沈殿
処理によってDNAを沈下させた。
このDNA沈殿を100μｌのHpaI反応液（10mM Tris塩酸、p
H7.5、7mM MgCl2、100mM KCl、7mMβメルカプトエタノ
ール）に溶解し制限酵素HpaIを15単位加えて37℃90分間
反応を行った。さらに反応液に、大腸菌アルカリフォス
ファターゼ0.08単位を加え65℃30分間反応させて５′末
端を脱リン酸化した。反応液を100μｌのフェノールで
洗浄したあと0.7％アガロースゲル電気泳動を行い、大
きなDNA断片を電気泳動法によって回収した。
H7.5、7mM MgCl2、100mM KCl、7mMβメルカプトエタノ
ール）に溶解し制限酵素HpaIを15単位加えて37℃90分間
反応を行った。さらに反応液に、大腸菌アルカリフォス
ファターゼ0.08単位を加え65℃30分間反応させて５′末
端を脱リン酸化した。反応液を100μｌのフェノールで
洗浄したあと0.7％アガロースゲル電気泳動を行い、大
きなDNA断片を電気泳動法によって回収した。
このようにして得たpHT2のClaI、HpaI断片DNA0.5pmol
と、５′末端にリン酸基を含むサケカルシトニン遺伝子
0.5pmolを、T4DNAライゲーション反応液20μｌ（25mM H
EPES、pH7.8、7.5mM MgCl2、0.2mM ATP、6mM DTT）に
溶解して、T4DNAリガーゼ３単位と20℃16時間反応し、
そのうちの10μｌを用いて大腸菌株RRIに形質転換させ1
00μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選んだ。
第３図のサブブロック3-6と3-8とオリゴヌクレオチドL5
とU5とを連結し、制限酵素HpaIによって５′末端を切断
した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT1、サブブロック3-5
と3-7を連結した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT2と命名
した。
と、５′末端にリン酸基を含むサケカルシトニン遺伝子
0.5pmolを、T4DNAライゲーション反応液20μｌ（25mM H
EPES、pH7.8、7.5mM MgCl2、0.2mM ATP、6mM DTT）に
溶解して、T4DNAリガーゼ３単位と20℃16時間反応し、
そのうちの10μｌを用いて大腸菌株RRIに形質転換させ1
00μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選んだ。
第３図のサブブロック3-6と3-8とオリゴヌクレオチドL5
とU5とを連結し、制限酵素HpaIによって５′末端を切断
した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT1、サブブロック3-5
と3-7を連結した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT2と命名
した。
組み替えプラスミドpSCT1はサケカルシトニンの遺伝子
を有し、組み替えプラスミドpSCT2はサケカルシトニン
の前駆体の遺伝子を有する。
を有し、組み替えプラスミドpSCT2はサケカルシトニン
の前駆体の遺伝子を有する。
組み替えプラスミドpSCT1、pSCT2は末端がアミド化され
ていないサケカルシトニンのペプチド、及びカルシトニ
ンの前駆体のペプチドをＮ蛋白との雑種蛋白として発現
する事が可能である。
ていないサケカルシトニンのペプチド、及びカルシトニ
ンの前駆体のペプチドをＮ蛋白との雑種蛋白として発現
する事が可能である。
人工合成サケカルシトニン遺伝子の塩基配列の確認 上記形質転換株のプラスミド中のサケカルシトニン遺伝
子の塩基配列は次のようにして分析した。
子の塩基配列は次のようにして分析した。
すなわち、pSCT1、pSCT2の各プラスミドDNA15μｇを15
単位の制限酵素HpaIを用いて切断し、大腸菌アルカリフ
ォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化した後γ
〔32p〕ATP及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
末端を32pラベルした。次に15単位の制限酵素BamH1を用
いて分解後目的とするDNA断片を精製し、マクサム、ギ
ルバート法により塩基配列を決定した（第７〜14図参
照）。
単位の制限酵素HpaIを用いて切断し、大腸菌アルカリフ
ォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化した後γ
〔32p〕ATP及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
末端を32pラベルした。次に15単位の制限酵素BamH1を用
いて分解後目的とするDNA断片を精製し、マクサム、ギ
ルバート法により塩基配列を決定した（第７〜14図参
照）。
その結果、すべてのプラスミドは設計通りの塩基配列を
有していた。但しpSCT1とpSCT2は制限酵素Cla1の認識配
列を有しながらも、ClaIで切断されなかった。
有していた。但しpSCT1とpSCT2は制限酵素Cla1の認識配
列を有しながらも、ClaIで切断されなかった。
第1A、及び1B図は、この発明に従って設計された、サケ
カルシトニン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及び
その周辺部分を含む）の全体図であり； 第２図は、従来技術に従って設計されたサケカルシトニ
ン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及びその周辺部
分を含む）の全体図であり； 第３図は、サケカルシトニン及びその前駆体遺伝子の合
成過程で使用したサブブロックの構成図であって、●印
は酵素によるリン酸基の付加を示し； 第４図は、方式（Ｉ）に従って、サブブロック3-5と3-7
とからサケカルシトニン前駆体遺伝子が生成することを
確認するラジオオートグラム図であり； 第５図は、従来技術の手法に従ってサブブロックを作製
し、これを集合、連結してカルシトニン前駆体遺伝子を
合成する工程を示し； 第６図は、出発プラスミドpHT2と、この発明の遺伝子CT
1、又はCT2から組換プラスミドpSCT1、又はpSCT2を造成
する場合の工程図であり；そして、 第７〜14図は、マキサム・ギルバート法による塩基配列
の決定を示す電気泳動図である。
カルシトニン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及び
その周辺部分を含む）の全体図であり； 第２図は、従来技術に従って設計されたサケカルシトニ
ン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及びその周辺部
分を含む）の全体図であり； 第３図は、サケカルシトニン及びその前駆体遺伝子の合
成過程で使用したサブブロックの構成図であって、●印
は酵素によるリン酸基の付加を示し； 第４図は、方式（Ｉ）に従って、サブブロック3-5と3-7
とからサケカルシトニン前駆体遺伝子が生成することを
確認するラジオオートグラム図であり； 第５図は、従来技術の手法に従ってサブブロックを作製
し、これを集合、連結してカルシトニン前駆体遺伝子を
合成する工程を示し； 第６図は、出発プラスミドpHT2と、この発明の遺伝子CT
1、又はCT2から組換プラスミドpSCT1、又はpSCT2を造成
する場合の工程図であり；そして、 第７〜14図は、マキサム・ギルバート法による塩基配列
の決定を示す電気泳動図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/36 8318−4Ｈ (72)発明者 碇 貴臣 神奈川県相模原市西大沼４−４―１ (72)発明者 成島 裕之 神奈川県相模原市西大沼４−４―１ (72)発明者 斎藤 あけみ 神奈川県横浜市緑区すすき野３−６―１― 303 (72)発明者 松本 礼子 神奈川県相模原市麻溝台2621 (56)参考文献 特公 昭57−16977（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭53−1806（ＪＰ，Ｂ２) 特表 昭59−501096（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501097（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子。 - 【請求項２】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子の製造方法であって、（１）該構造遺伝子の塩基配列
の部分を構成する複数のオリゴヌクレオチドフラグメン
トを合成し、（２）該フラグメントを連結することによ
って複数のサブブロックを作製し、（３）該サブブロッ
クを連結する段階を含んで成る方法。 - 【請求項３】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子を含有するプラスミド。 - 【請求項４】pSCT1又はpSCT2である特許請求の範囲第３
項記載のプラスミド。 - 【請求項５】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子を含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌。 - 【請求項６】RRI/pSCT1（FERM-P No7774）、又はRRI/pS
CT2（FERM-BP No866）である特許請求の範囲第５項記載
の大腸菌。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59170492A JPH0687779B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 合成構造遺伝子 |
| EP19850904145 EP0191869A4 (en) | 1984-08-17 | 1985-08-16 | FISH-CALCITONINE COMBAT AND ITS PRODUCTION AND GENE SYSTEM FOR THIS. |
| AU47273/85A AU4727385A (en) | 1984-08-17 | 1985-08-16 | Fish calcitonin derivative, process for its preparation, and gene system therefor |
| PCT/JP1985/000459 WO1986001226A1 (fr) | 1984-08-17 | 1985-08-16 | Derive de calcitonine de poisson, son procede de preparation et systeme genique relatif |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59170492A JPH0687779B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 合成構造遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152288A JPS6152288A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0687779B2 true JPH0687779B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=15905964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59170492A Expired - Lifetime JPH0687779B2 (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 合成構造遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0687779B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5716977B2 (ja) | 2010-08-13 | 2015-05-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 分子共鳴の鏡像力顕微鏡 |
-
1984
- 1984-08-17 JP JP59170492A patent/JPH0687779B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5716977B2 (ja) | 2010-08-13 | 2015-05-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 分子共鳴の鏡像力顕微鏡 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6152288A (ja) | 1986-03-14 |
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