JPH0687797B2 - α―アミラーゼの測定法 - Google Patents
α―アミラーゼの測定法Info
- Publication number
- JPH0687797B2 JPH0687797B2 JP63333410A JP33341088A JPH0687797B2 JP H0687797 B2 JPH0687797 B2 JP H0687797B2 JP 63333410 A JP63333410 A JP 63333410A JP 33341088 A JP33341088 A JP 33341088A JP H0687797 B2 JPH0687797 B2 JP H0687797B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- glucose
- reagent
- fructose
- measured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、α−アミラーゼの測定法の改良に関する。
（従来の技術） 急性すい炎、耳下線炎等の診断のために血清や尿中のα
−アミラーゼ活性を測定することが重要である。α−ア
ミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷんが用い
られてきたが、精度の点で問題があった。近年、でんぷ
んに代わってマルトペンタオース（G5）に代表されるオ
リゴ糖がアミラーゼの基質として採用されつつある。即
ち、マルトペンタオースを基質に用いて共役酵素にα−
グルコシダーゼを組み合わせて測定することができる。
−アミラーゼ活性を測定することが重要である。α−ア
ミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷんが用い
られてきたが、精度の点で問題があった。近年、でんぷ
んに代わってマルトペンタオース（G5）に代表されるオ
リゴ糖がアミラーゼの基質として採用されつつある。即
ち、マルトペンタオースを基質に用いて共役酵素にα−
グルコシダーゼを組み合わせて測定することができる。
（上式において、ATP:アデノシントリホスフェート、AD
P:アデノシンジホスフェート、NAD:ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、NADH:ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型、Ｇ−６−PDH:グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素） ここで生成したグルコースをヘキソキナーゼ（HK）／グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）によ
りNADをNADHに変化させて酵素活性を測定する。この場
合、グルコースを経由させて反応させるから、血清及び
尿中のグルコースの影響を受けるということが難点であ
った。
P:アデノシンジホスフェート、NAD:ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、NADH:ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型、Ｇ−６−PDH:グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素） ここで生成したグルコースをヘキソキナーゼ（HK）／グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）によ
りNADをNADHに変化させて酵素活性を測定する。この場
合、グルコースを経由させて反応させるから、血清及び
尿中のグルコースの影響を受けるということが難点であ
った。
最近、内因性のグルコースの影響を回避するためにｐ−
ニトロフェノールを修飾した各種のオリゴ糖が用いられ
るようになった。これによれば、α−グルコシダーゼを
組み合わせて、α−アミラーゼによって生じたｐ−ニト
ロフェノールを最終的に測定することができるので、内
因性のグルコースの影響がなくてすむものである。そし
て、ｐ−ニトロフェノールを修飾したオリゴ糖を基質と
して用いる方法は、グルコースの影響を受けずに測定で
きるので、かなり測定しやすく、また精度もよくなった
が、ビリルビンやヘモグロビンの影響を受ける点でまだ
問題が残されていた。
ニトロフェノールを修飾した各種のオリゴ糖が用いられ
るようになった。これによれば、α−グルコシダーゼを
組み合わせて、α−アミラーゼによって生じたｐ−ニト
ロフェノールを最終的に測定することができるので、内
因性のグルコースの影響がなくてすむものである。そし
て、ｐ−ニトロフェノールを修飾したオリゴ糖を基質と
して用いる方法は、グルコースの影響を受けずに測定で
きるので、かなり測定しやすく、また精度もよくなった
が、ビリルビンやヘモグロビンの影響を受ける点でまだ
問題が残されていた。
そこで、さらにこれらの問題を改善するため特開昭63-1
29997号に開示されているフラクトースを修飾したオリ
ゴ糖を用いる方法が開発された。このフラクトースのオ
リゴ糖を用いる方法は、α−アミラーゼの作用によって
生じた生成物にα−グルコシダーゼを働かせ、このとき
遊離したフラクトースにマンニトールデヒドロゲナーゼ
（MDH）を作用させて、NADHをNADに変化させてα−アミ
ラーゼ活性を測定できるものである。この方法は、内因
性のグルコースやマルトースの影響も受けず、しかもビ
リルビンやヘモグロビンにも影響されることがなく非常
に優れた方法である。しかし、この方法においては、共
役酵素として加えたα−グルコシダーゼはα−アミラー
ゼ及びグルコアミラーゼによって生じたサッカロースに
は十分作用せず、フラクトースの遊離が不完全であっ
た。
29997号に開示されているフラクトースを修飾したオリ
ゴ糖を用いる方法が開発された。このフラクトースのオ
リゴ糖を用いる方法は、α−アミラーゼの作用によって
生じた生成物にα−グルコシダーゼを働かせ、このとき
遊離したフラクトースにマンニトールデヒドロゲナーゼ
（MDH）を作用させて、NADHをNADに変化させてα−アミ
ラーゼ活性を測定できるものである。この方法は、内因
性のグルコースやマルトースの影響も受けず、しかもビ
リルビンやヘモグロビンにも影響されることがなく非常
に優れた方法である。しかし、この方法においては、共
役酵素として加えたα−グルコシダーゼはα−アミラー
ゼ及びグルコアミラーゼによって生じたサッカロースに
は十分作用せず、フラクトースの遊離が不完全であっ
た。
（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、上記した従来技術の問題点に鑑み、サッカ
ロースに作用しやすい酵素に着目することによって本発
明に到達したものである。換言すれば、本発明者は、シ
ュクロースホスホリラーゼ（SP）を用いて容易にフラク
トースが捕捉されることを見出し本発明を完成したもの
である。
ロースに作用しやすい酵素に着目することによって本発
明に到達したものである。換言すれば、本発明者は、シ
ュクロースホスホリラーゼ（SP）を用いて容易にフラク
トースが捕捉されることを見出し本発明を完成したもの
である。
本発明は、サッカロースに着目することにより、測定待
ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で済みしかも高濃
度のものまで測定できるようにしたα−アミラーゼの測
定法を提供することを目的とするものである。
ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で済みしかも高濃
度のものまで測定できるようにしたα−アミラーゼの測
定法を提供することを目的とするものである。
（課題を解決するための手段） 上記目的を達成するために、本発明においては、フラク
トースを修飾したオリゴ糖を基質に用いるα−アミラー
ゼの測定において、グルコアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼにα−グルコシダーゼを組み合わせることにより生
成するサッカロースをシュクロースホスホリラーゼを用
いて測定するものである。即ち、リン酸の存在のもと
に、サッカロースをシュクロースホスホリラーゼにより
グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）とフラクトース
を生成させるものである。
トースを修飾したオリゴ糖を基質に用いるα−アミラー
ゼの測定において、グルコアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼにα−グルコシダーゼを組み合わせることにより生
成するサッカロースをシュクロースホスホリラーゼを用
いて測定するものである。即ち、リン酸の存在のもと
に、サッカロースをシュクロースホスホリラーゼにより
グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）とフラクトース
を生成させるものである。
さらに、シュクロースホスホリラーゼにより生成したグ
ルコース−１−リン酸又はフラクトースを測定するのが
好ましい。即ち、グルコース−１−リン酸又はフラクト
ースを測定することにより検体中のα−アミラーゼ活性
を求めることができる。
ルコース−１−リン酸又はフラクトースを測定するのが
好ましい。即ち、グルコース−１−リン酸又はフラクト
ースを測定することにより検体中のα−アミラーゼ活性
を求めることができる。
α−アミラーゼ測定用の基質に用いるフラクトースを修
飾したオリゴ糖は、特開昭63-129997号公報に開示され
た各種基質を用いることができる。例えば、イソプロピ
リデン・マルトヘプタオシル・フルクシド（IPG7F）や
イソプロピリデン・マルトペンタオシル・フルクシド
（IPG5F）等が好適である。これらを使用する場合、フ
ラクトース修飾のオリゴ糖の非還元末端が無修飾及び修
飾ということは、本発明においては問題となるものでは
ない。
飾したオリゴ糖は、特開昭63-129997号公報に開示され
た各種基質を用いることができる。例えば、イソプロピ
リデン・マルトヘプタオシル・フルクシド（IPG7F）や
イソプロピリデン・マルトペンタオシル・フルクシド
（IPG5F）等が好適である。これらを使用する場合、フ
ラクトース修飾のオリゴ糖の非還元末端が無修飾及び修
飾ということは、本発明においては問題となるものでは
ない。
（作用） 本発明の具体的を測定法として、例えば、以下のように
３つの方法を考えることができる。
３つの方法を考えることができる。
（１法） （上式において、G:グルコース、F:フラクトース、P:リ
ン酸、GF:サッカロース、MDH:マンニトールデヒドロゲ
ナーゼ、Ｇ−１−P:グルコース−１−リン酸） （２法） 上記の反応によって生成したＧ−１−Ｐより以下の如く
測定する。
ン酸、GF:サッカロース、MDH:マンニトールデヒドロゲ
ナーゼ、Ｇ−１−P:グルコース−１−リン酸） （２法） 上記の反応によって生成したＧ−１−Ｐより以下の如く
測定する。
（上式において、α−PGM:α−ホスホグルコムターゼ、
Ｇ−1,6−P:グルコース−1,6−リン酸、Ｇ−６−PDH:グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素） （３法） 上記した２法の反応により生じた６−ホスホグルコン酸
を利用して感度を上げるために次のように測定する。
Ｇ−1,6−P:グルコース−1,6−リン酸、Ｇ−６−PDH:グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素） （３法） 上記した２法の反応により生じた６−ホスホグルコン酸
を利用して感度を上げるために次のように測定する。
（上式において、６−PGDH:6−ホスホグルコン酸脱水素
酵素） 上記の各反応において、グルコアミラーゼの作用を補強
するためにα−グルコシダーゼを加えることができる。
酵素） 上記の各反応において、グルコアミラーゼの作用を補強
するためにα−グルコシダーゼを加えることができる。
（実施例） 以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 試薬組成 第１試薬 リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca2+ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……60U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……3U/ml マンニトールデヒドロゲナーゼ ……10U/ml NADH ……0.2mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体40μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
結果 タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ、第１図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。
ースをとったところ、第１図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。
直線性 高濃度のα−アミラーゼ活性を含む検体を５段階希釈し
測定を行った結果、第２図に示すごとく、約1000U/l以
下で原点を通る直線性が確認できた。
測定を行った結果、第２図に示すごとく、約1000U/l以
下で原点を通る直線性が確認できた。
実施例２ 実施例１の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
１と同様の成績が得られた。
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
１と同様の成績が得られた。
実施例３ 試薬組成 第１試薬 リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca2+ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……100U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……5U/ml α−ホスホグルコムターゼ ……1U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ……3U/ml ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素 ……0.5U/ml グルコース−1,6−リン酸 ……0.02mM NAD ……4mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体20μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
結果 タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ、第３図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。
ースをとったところ、第３図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。
実施例４ 実施例３の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
３と同様の成績が得られた。
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
３と同様の成績が得られた。
実施例５ 試薬組成 第１試薬 リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca2+ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……100U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……5U/ml α−ホスホグルコムターゼ ……1U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ……3U/ml グルコース−1,6−リン酸 ……0.02mM NAD ……4mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体40μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。
結果 タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ反応が直線的に進んだ。
ースをとったところ反応が直線的に進んだ。
実施例６ 実施例５の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
５と同様の成績が得られた。
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
５と同様の成績が得られた。
（発明の効果） 以上述べたごとく、本発明のα−アミラーゼの測定法に
よれば、測定待ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で
済みしかも高濃度のものまで測定できるという大きな効
果を奏するものである。
よれば、測定待ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で
済みしかも高濃度のものまで測定できるという大きな効
果を奏するものである。
第１図は実施例１のタイムコースを示すグラフ、第２図
は実施例１の直線性を示すグラフ及び第３図は実施例３
のタイムコースを示すグラフである。
は実施例１の直線性を示すグラフ及び第３図は実施例３
のタイムコースを示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】フラクトースを修飾したオリゴ糖を基質に
用いるα−アミラーゼの測定において、グルコアミラー
ゼ又はグルコアミラーゼにα−グルコシダーゼを組み合
わせることにより生成するサッカロースをシュクロース
ホスホリラーゼを用いて測定することを特徴とするα−
アミラーゼの測定法。 - 【請求項２】シュクロースホスホリラーゼにより生成し
たグルコース−１−リン酸又はフラクトースを測定する
ことを特徴とする請求項（１）のα−アミラーゼの測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63333410A JPH0687797B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | α―アミラーゼの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63333410A JPH0687797B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | α―アミラーゼの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02177900A JPH02177900A (ja) | 1990-07-10 |
| JPH0687797B2 true JPH0687797B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=18265802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63333410A Expired - Lifetime JPH0687797B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | α―アミラーゼの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0687797B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5043436A (en) * | 1986-11-20 | 1991-08-27 | Kurita Water Ind., Ltd. | Substrate for measurement of alpha-amylase activity |
| CN109996783A (zh) * | 2016-11-30 | 2019-07-09 | 巴斯夫欧洲公司 | 使用mor骨架结构的铜改性沸石将单乙醇胺转化成乙二胺的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60237998A (ja) * | 1983-12-22 | 1985-11-26 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
| JPH0650996B2 (ja) * | 1986-11-20 | 1994-07-06 | 善資 小川 | α−アミラ−ゼ活性測定用基質及び測定方法 |
-
1988
- 1988-12-29 JP JP63333410A patent/JPH0687797B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02177900A (ja) | 1990-07-10 |
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