JPS60237998A - α−アミラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたαアミラー
ゼ活性測定法に関するものである。最近、ヒト体液中の
アミラーゼ活性の測定用基質として、構造の明確なマル
トオリゴ糖、例えばマルトテトラオース、マルトペンタ
−オース、マルトヘキサオースなどが使用される様にな
りつつある。

これらのうち代表例としてマルトペンタオースを基質と
して使用する場合をとりあげて説明すると、測定様式は
次の様に表わすことができる。

（１）　マルトペンタオースーーーーーーー１戸アミラ
ーゼ マ　ル　ト　−　ス　＋　１ワレトトリオース＋２１　
マルトース＋マルトトリオース一一］７ここに生成した
グルコースは、公知の方法、例えコムターゼ／グルコー
ス−６−ホスフｚ−）ｆヒロ ドへゲナーゼ／ＮＡＤＨ系等で測定される。

ところがこの測定系には、基質（マルトオリゴ糖）に対
しわずかではあるが、α−グルコシダーゼが作用すると
いう欠点があり、ブランク値が上昇する。

他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチ
ル基或はそれらの類似体を結合した基質が合成され、次
の様なものを基質とするアミラーゼ測定試薬が提案され
ている。

ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイト（特公昭５７
−５３０７９号公報） ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオサイド（特公昭５７
−５３０７９号公報） ｐ−ニトロフェニルマルトへブタオサイド（特１：１１
ｉ１昭５４−５１８９２号公報）２．４−ジクロロフェ
ニルマルトペンタオサイト（特開昭５６−３５９９８号
公報） これらの化合物を基質とするアミラーゼ活性の測定様式
を例示すると、次の様になる。

ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタサイトの場合 ｆｉｌ　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオサイ
ド−ＬＬムニヱ→ｐ−ニトロフェニル−α−マルトサイ
ド＋マルトトリオース トロフェノール＋グルコース この系においても、基質のｐ−ニトロフェニル−ａ−マ
ルトペンタオサイドにα−グルコシダーゼが作用してブ
ランク値が上昇する。

（１１２，４−ジクロロフェニル−β−マルトヘンタオ
サイド　ｙｓｔ二二→２，４−ジシクロロフェニルーβ
−マルトサイド＋マルトトリオース（２−ａ　）　２．
４−クシクロロフェニル−β−α−グルコシ マルトサイド＋マルトトリオース□ ダーゼ 一一一→２．４−ジクロロフェニル−β−グルコサイド
＋グルコース （２−ｂ）２．４−ジｌクロロフェニルーβ−β−グル
コシダーゼ グルコサイド　２．４−ジ クロロフェノール＋グルコース この系においても、基質である２、４−ジクロロフェニ
ル−β−マルトペンタオサイトニα−クルコシダーゼが
作用してブランクが上昇する。

結局、従来提供されてきた基質を使用する測定系では、
α−グルコシダーゼが基質に作用することから、試薬ブ
ランク値の上昇が著しいという問題点がある。さらにα
−グルコシダーゼ液と基質液の一液化は、α−グルコシ
ダーゼの基質分解により、試薬の安だ性を著しく損うと
いう共通の問題点があった。

　５− そこで、本発明者等は種々研究した結果、非遣元末端に
置換基を導入することにより、これらの問題点が解決で
きることを知り、本発明を完成するに到った。

すなわち本発明は、 （式中　Ｒ−はハロゲン原子または−Ｘ−Ｒ″　または
グルコビラノース残基を示す。

Ｘは０、ｏｏｃ、ｏｓｏ、またはＮＨｅ示し、ＲｓたＲ
２は置換または未置換のフェノール残基を示す。ｎは０
〜８の整数を示す。）で表わされる非還元性末端を修飾
したα−および／またはβ−フェニルマルトオリゴサイ
ドを基質として、α−グルコシダーゼおよび／またはグ
ルコアミラーゼお　６− よび必要によりβ−グルコシダーゼの共存下に、試料を
接触させ、遊離するフェノール系化合物を測定すること
により、試料中のα−アミラーゼ活性を？Ｉ１．ｌＩ定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測Ｔ法である
。

本発明の基質はマルトオリゴ塩の非還元性末端が・・ロ
ゲン原子、−Ｘ　−Ｒ’　またはグルコビラノース残基
により修飾されている。

本発明に用いるマルトオリゴ塩は糖の数が２〜１０であ
り、具体的にはマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオース等がある。特にマルトテトラオ
ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マル
トヘプタオースが好ましい。

本発明の基質に修飾されるノ・ロゲン原子としては、喝
素、臭素、フッ素、沃素が挙げられる。

本発明の基質に修飾される一Ｘ　−Ｒ”は、　Ｘが０、
ＯＯＣ％Ｏ８Ｏ，またはＮＨを示し、Ｒ′は炭素原子数
１〜６のアルキル基、置換アルキル基、フェニル基マタ
はアルキル置換フェニル基、アルコキシ置換フェニル基
等の置換フェニル基またはピリジル基を示し、具体的に
はメトキシ、エトキシ等のアルコキシ基、フェノキシ基
、アルキル置換フェノキシ基、アルコキシ置換フェノキ
シ基、ピリジルオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基
、ペンツイルオキシ基、アルキル置換ベンゾイルオキシ
基、アルコキシ置換ヘンジイルオキシ基、ピリジルカル
ボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、フェニ
ルスルホニルオキシ基、トシルオキシなどのアルキル置
換フェニルスルホニルオキシ基、アルコキシ置換フェニ
ルスルホニルオキシ基、ヒリジルスルホニルオキシ基、
モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アニリノ
基、トルイジノなどのアルキル核置換アニリノ基、アニ
シジンなどのアルコキシ置換アニリノ基、ピリジルアミ
ン基などが挙げられる。

本発明の基質に修飾されるグルコビラノース残基として
は、αおよびβ（ｌ→６）のグルコビラノース残基など
が挙げられる。

本発明の基質は還元性末端に置換または未置換のフェニ
ル基を有するα−および／またはβ−フェニルマルトオ
リゴサイドでもある。

本発明の基質にα−および／またはβ−結合により結合
した置換または未置換のフェノール類とコキシ基、アル
コキシカルボニル基またはニトロ基を有するフェノール
類であり、例えばクロロフェノール、ジクロロフェノー
ル、ヒドロキシフェノール１アルキルフエノール、アル
コキシフェノール、安息香酸またはニトロフェノール、
ハロゲン化ニトロフェノール、アルキル化ニトロフェノ
ール、アルコキシ化ニトロフェノール、ニトロ化安息香
酸、ジニトロフェノールなどが挙げられる。

特に少なくとも１つのニトロ基を有するフェノ−に類、
例工ＬＩ’　４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−
二トロフェノール、２．６−ジクロロ−４−二トロフェ
ノール、２．６−ジプロモー４−ニトロフェノール、２
−プロモー４−二トロフェノール、２−ニトロフェノー
ル、２−ヒドロキシ−９− ４−ニトロフェノール、３−ヒドロキシ−４−二トロフ
ェノールなどが好ましい。

次に本発明の基質ｆｉ＋を更に具体例によって説明４−
ニトロフェノール　０−６−泰４０−６−デオキシーα
−Ｄ−グルコピラノシル−（（ｉ→４）−〇−σ−Ｄ−
グルコピラノシルー１−ｏ−メトキシ−６−ジオキシ−
α−０−グルコピラノシル−（（ｉ→４）−〇−α−Ｄ
−グルコピラノーβ−マルトペンタオシド〕 ４−ニトロフェノール　α−Ｄ−グルコピラノミル−（
（１→４）−〇−σ−Ｄ−グルコピラノー　ｌ〇　− シルーに’−”−β−Ｄ−グルコピラノシド〔４−ニト
ロフェニル−β−マルトペンタオシグルコピラノシル−
（（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー）ｓ　
−ｏ−β−Ｄ−グルコピラデオキシ−６−（（２−ピリ
ジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（（ｌ→
４）−〇−４ヒ０ −Ｄ−グルコ電シラノシル−、−〇−α−Ｄ−グルエニ
ルーα−マルトペンタオシド〕 ４−ニトロフェノール　０−６−ｐ−）ルエンスルホニ
ルオキシー〇−α−Ｄ−グルコピラノシル−（（１→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル）、−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシド〔トシルオキシ　４−ニトロフェニル
−α−マルトヘプタオシド〕 本発明の基質ｆＩｌは新規な化合物であり、例えばｆａ
ｔ非還元末端クロル置換の基質は、式ｆｌＴｌで表わさ
れる化合物とｐ−）ルエンスルホニルクロライドを反応
させ、生成した式（１）で表わされる化合物にテトラメ
チルアンモニウムクロライドと反応させて製造する。大
通らの研究報告Ｌ　？４−ＰＯＭＩＣＨＸｒＪ、旧ｏｅ
ｈｅｍ　６．８４，８３５−８４１（１９７Ｂ））を参
照しくｂｌメトキシ基置換の基質は、式（ｍｌで表わさ
れる化合物とメタノールを反応させて製造する。Ｇ、　
Ｎ。

ＢＯＬＬＫＮＢＡＣＫの報告ＣＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　
ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＢＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ｖｏｗ
、　［３２６）を参照した。

（ｃ）トシルオキシ基置換の基質は式ｔｉｔで表わされ
る化合物を意味する。

ｆｄｌピリジルアミノ基置換の基質は、式（川で表わさ
れる化合物とピリジルアミンを反応させて製造する。大
通らの研究報告 （Ｋ、ＯＭＩＣＨＩ　ＩＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３
．１０５５−１０６０（１９８３）〕を参照した。

ｔ、ｌアニリノ基、トルイジノ基またはアニシジノ基置
換の基質は、式＋ｆｉ＋で表わされる化合物とアニリン
、トルイジンまたはアニシジを反応させて製造する。ｔ
ｄｌの方法を参照した。

（ｆｌフェノキシ基置換の基質は、式（ＴＩＩで表わさ
れる化合物とフェノールを反応させて製造する。（ｂｌ
の方法を参照した。

Ｉｇｌベンゾイルオキシ基置換の基質は式ｔｕｔで表わ
される化合物とベンジルアルコールを反応させて　１３
− 製造する。（ｂｌの方法を参照した。

また、式＋ＩＴＩで表わされる化合物の代わりα、β（
、）テトラメチルアンモニウムクロライドｔｂ＋メタノ
ール ｌｃｌ　ｐ　−）ルエンスルホニルクロライト（ｄ）ピ
リジルアミン ＋−）アニリン、トルイジンまたはアニシジンＴｆｌフ
ェノール （ｇｌベンジルアルコール とそれぞれ反応させて、 質 ｆｃｌ非還元末端（Ｃ−６位）トシルオキシ基ｌ置換の
基質 アニ ｆ、ｌ非還元末端（Ｃ−６位）　、ヤ＋　リノ基、トル
イジノ基またはアニシジノ基置換の基質 　１４− ｆｆｌ非還元末端（Ｃ−６位）フェノキシ基置換の基質 （ｇｌ非還元末端ベンジルオキシ基置換の基質を製造し
、さらにサイクロデキストリントランスフェラーゼを作
用させて、目的のマルトオリゴ糖を製造する方法とがあ
る。

本発明に使用するα−グルコシダーゼは動物、随物、微
生物など如何なる起源のものを用いてもよいが、特に酵
母から得たものが、その基質特異性の点で好ましい。す
なわち、酵母起源のα−グルコシダーゼはアグリコン特
異性が広く、さらにマルトトリオシト以下のグリコシド
にはよく作用するが、マルトテトラオシド以上のグリコ
シドには作用しない点で特に本発明の目的に適合してい
る。

β−グルコシダーゼも如何なる起源のものを用いてもよ
く、例えばアーモンドから得たものが使用できる。

グルコアミラーゼに関しても如何なる起源のものを用い
てもよく、例えばリゾプスデレマーから得たものが使用
できる。

α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミ
ラーゼの使用法は具体的には、（１）α−グルコシダー
ゼ （１）α−グルコシダーゼおヨヒβ−グルコシダ〜ゼ （＋１１１グルコアミラーゼ （１ｖ）グルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼｆ
Ｖｌグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ（ｖｌ
ｌ　グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼ のいずれの使用法でもよく、特に、α−グルコシダーゼ
、グルコアミラーゼを共存した方法（１ｖ）、（ｖｌ）
が好ましい。

本発明の方法は、必要によりその他の添加物を添加して
もよい。

本発明は上記基質に、追随酵素の共存下に、試料を接触
させ、遊離するフェノール系化合物を測定することによ
り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する。

フェノール系化合物の測定法としては、基質から解離し
たフェノール系化合物が基質とは異なるスペクトル吸収
を示す場合には、反応生成物のスペクトル吸収を直接測
定する。

また基質から解離したフェノール系化合物が基質とほぼ
同じスペクトル吸収を示す場合には、呈色試薬、例えば
４−アミノアンチピリンなどの化合物と酸化縮合させ、
その発色強度を測定する。

フェノール系化合物の測定方法としては、α−アミラー
ゼの反応を連続的に追跡するレート法あるいは一定時間
反応させた後、反応を止めて測定する法、いずれの方法
を用いてもよい。

本発明では上記基質ケ用いることにより、α−グルコシ
ダーゼの基質に対する作用を防ぎ、試薬ブランクの上昇
抑制に著しい効果があり、追随酵素液、基質液の一液化
が可能となった。

また、無置換非還元末端のマルトオリゴ糖基質において
、適用不可能だったグルコアミラーゼ（無置換還元末端
のマルトオリゴ糖はグルコアミラーゼの基質となる）の
使用も可能となった。

　１７− α−グルコシダーゼはマルトトリオシト以下の低分子グ
リコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド以上
のグリコシドには作用しない。

マルトヘプタオサイド以上の高分子グリコシドをアミラ
ーゼ基質とした場合、マルチトラシト以上のグリコシド
が生成する。ｄ−グルコシダーゼを追随酵素として用い
た場合は、アミラーゼによる氷解生成物のマルトトリオ
シト以下の低分子グリコシドにのみ作用するＪしかし、
グルコアミラーゼを用いた場合、マルチトラシト以上の
グリコシドにも作用し、測定系の感度が上昇するという
グルコシダーゼ使用の優位点がある。

本発明の測定法は自動分析機にも容易にかけられる優れ
た方法である。

以下、本発明を実施例により説明する。

実施例１ 下記の試薬を用い、下記方法によりブランク値を測定し
た。

試薬：５０ｍＭ　グツドバッファーｐＨ７，０α−グル
コシダーゼ　８０　Ｕ　／　ｍｌ１８− β−グルコシダーゼ　ＩＯＵ／耐 第１表に示される基質　２ｍＭ 第　１　表 測足法： 上記試薬３　ｗｇを取り、試薬ブランクの経時変化を見
た。（測定波長４００ｎｒｎ、温度３７℃）その結果を
！＠２表に示す。

本発明の試薬Ａ、Ｂは試薬Ｃ，Ｄと比較して、試薬ブラ
ンクの上昇が小さい。

実施例２ 試料中のび一アミラーゼ活性を、下記の試薬を用い、下
記方法により測定した。

試薬Ａ：５０ｍＭ　グツドバッファ　−ｐ　Ｉ（７，０
ド　２ｍＭ 試薬Ｂ：５０ｍＭ　グツドバッファ　−ｐ　Ｈ７，０−
マルトペンタオシド　２ｍＭ 測定法： 試薬ＡまたＢ各３　ｗｅを取り、３７℃での試薬ブラン
ク経時変化を４００ｎｍで測定した。

試料（血清）５０／’ｊに、試薬ＡまたはＢ各３−を添
加し、添加後５〜６分後の吸光度変化（α−アミラーゼ
活性）を測定した。（測定波長４００　ｎｍ、反応温度
３７℃） 試薬ブランクの経時変化を第３表に、血清の吸光度測定
を第４表に示す。

第　４　表 本発明の試薬Ａは試薬Ｂに比較して、試薬ブランクの上
昇は小さく、α−アミラーゼ活性値は試薬ＡＳＢともに
差はない。

実施例３ 試料中のα−アミラーゼ活性を、下記の試薬を用い、下
記方法により測定した。

試薬Ａ：５０ｍＭ　グツドバッファー（ｐ　Ｈ７，０２
１− α−グルコシダーゼ　８０Ｕ／ｄ グルコアミラーゼ　１０　＃ トシルオキシ　４−ニトロフェニル− α−マルトヘプタオシド　２ｍＭ 試薬Ｂ：５０ｍＭ　グツドバッフｙ　−（ｐ　Ｈ７，０
）α−グルコシダーゼ　８０　Ｕ／ｌ／ トシルオキシ　４−ニトロフェニル− α−マルトヘプタオシド　２ｍＭ 試薬Ｃ：５０ｍＭ　グツドバッフアー（ｐＨ７，すα−
グルコシダーゼ　８０Ｕ／ａｇ ゲルコアばラーゼ　１０　Ｕ／ｄ ４−ニトロフェニル−α−マルトヘプ タオシド　２ｍＭ 測定法： 試薬Ａ、ＢまたはＣ各３　ｍｌを取り、３７℃での試薬
ブランク経時変化を４００ｎｍで測定した、試料血清５
０１Ｌｔに試薬Ａ、ＢまたはＣ各３ｄを添加し、添加後
５〜６分後の吸光度変化（アミラーゼ活性）を測定した
。（測定波長４００ｎｍ、反応温度３７℃） 試薬ブランクの経時変化を第５表に血清の吸光度変化を
第６安に示す。

　２２− 第　５　表 第６表 本発明の試薬ＡまたはＢは試薬Ｃに比較して、試薬ブラ
ンクの上昇は小さい。αアミラーゼ活性値は試薬Ｂ、Ｃ
に差はない。試薬Ａはグルコアミラーゼ添加により感度
が上昇した。

特許出願人　東洋紡績株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 昭和５８年特許願第２４２８９０号 ａ　発明の名称 ａ−アミラーゼ活性測定法 ＆　補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 昭和６０年５月８日 （発送日　昭和６０年５月２８日） ａ　補正の内容 １　明細書第１頁第３行目 ｒａ−ラミラーゼ活性測定法」を「α−アミラーゼ活性
測定法」に訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｃ式中　いはノ・ロゲン原子または−　−Ｒ１またはグ
   ルコビラノース残基を示す。 Ｘは０．ＯＯＣ，０８０，またはＮＵを示し、ａ　Ｓは
   、を換または未置換のアルキル基・置換または未置換の
   フェニル基またはピリジル基を示す。またＲ′は置換ま
   たは未置換の７１ノール残基を示す。ｎは０〜８の整数
   を示す。）で表わされる非還元性末端を修飾したα−お
   よび／またはβ−フェニルマルトオリゴサイドを基質と
   して、α−グルコシダーゼおよび／またはグルコアミラ
   ーゼおよび必要によりβ−グルコシダーゼの共存下に、
   試料を接触させ、遊離するフェノール系化合物を測定す
   ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
   ことを特徴とするσ−アミラーゼ活性測定法。