JPH0687903A - グリカンの単離 - Google Patents
グリカンの単離Info
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- glycans
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】糖複合体から放出されたグリカンの単離方法を
提供する。 【構成】糖複合体にグリカン放出処理を施し、得られた
反応混合物をクロマトグラフィーと接触させて、目的と
するグリカン（及びそのいずれかの誘導体）をクロマト
グラフィー物質に吸着させ、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収する
ことを特徴とする方法。
提供する。 【構成】糖複合体にグリカン放出処理を施し、得られた
反応混合物をクロマトグラフィーと接触させて、目的と
するグリカン（及びそのいずれかの誘導体）をクロマト
グラフィー物質に吸着させ、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収する
ことを特徴とする方法。
Description
【０００１】本発明はグリカンの単離方法に関する。本
発明の一面によれば、糖複合体から放出された（後記の
ような）グリカンの単離方法が提供されるが、その方法
ではグリカン（及びそのいずれかの誘導体）をクロマト
グラフィー物質に吸着させ、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収す
る。クロマトグラフィー物質へのグリカンの吸着及びク
ロマトグラフィー物質の適切な溶出は、複合体及び／又
は複合体由来物質からグリカンを分離するために用いら
れる。あらゆる残留複合体及び／又は複合体由来物質か
らのグリカンの分離は、例えば更にクロマトグラフィー
により行ってもよい。グリカンはいずれかの常法で、例
えば後記のような放出剤の使用により糖複合体から放出
される。
発明の一面によれば、糖複合体から放出された（後記の
ような）グリカンの単離方法が提供されるが、その方法
ではグリカン（及びそのいずれかの誘導体）をクロマト
グラフィー物質に吸着させ、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収す
る。クロマトグラフィー物質へのグリカンの吸着及びク
ロマトグラフィー物質の適切な溶出は、複合体及び／又
は複合体由来物質からグリカンを分離するために用いら
れる。あらゆる残留複合体及び／又は複合体由来物質か
らのグリカンの分離は、例えば更にクロマトグラフィー
により行ってもよい。グリカンはいずれかの常法で、例
えば後記のような放出剤の使用により糖複合体から放出
される。
【０００２】本発明の一態様によれば、糖複合体からの
グリカンの放出により形成された放出後反応混合物から
（後記のような）グリカンを単離するための方法が提供
されるが、その方法ではクロマトグラフィー物質にグリ
カン（及びそのいずれかの誘導体）を吸着させるために
放出後反応混合物をクロマトグラフィー物質と接触さ
せ、クロマトグラフィー物質を溶出に付し（ここで、前
記吸着及び溶出は複合体及び／又は複合体由来物質から
グリカン（及びそのいずれかの誘導体）を分離させかつ
糖複合体からのグリカンの放出に用いられた放出剤を除
去させるように行われる）、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収する
ことからなる。
グリカンの放出により形成された放出後反応混合物から
（後記のような）グリカンを単離するための方法が提供
されるが、その方法ではクロマトグラフィー物質にグリ
カン（及びそのいずれかの誘導体）を吸着させるために
放出後反応混合物をクロマトグラフィー物質と接触さ
せ、クロマトグラフィー物質を溶出に付し（ここで、前
記吸着及び溶出は複合体及び／又は複合体由来物質から
グリカン（及びそのいずれかの誘導体）を分離させかつ
糖複合体からのグリカンの放出に用いられた放出剤を除
去させるように行われる）、残留複合体及び／又は複合
体由来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収する
ことからなる。
【０００３】グリカンはいずれか適切な方法で残留複合
体及び／又は複合体由来物質から分離される。このため
例えば、グリカン並びに残留複合体及び／又は複合体由
来物質はクロマトグラフィー物質から溶出され、更に分
離（例えばクロマトグラフィーによる）に付される。
体及び／又は複合体由来物質から分離される。このため
例えば、グリカン並びに残留複合体及び／又は複合体由
来物質はクロマトグラフィー物質から溶出され、更に分
離（例えばクロマトグラフィーによる）に付される。
【０００４】本明細書で用いられる“グリカン”という
用語はＮ‐グリカン、Ｏ‐グリカン並びにＮ‐及びＯ‐
グリカンを包含する。Ｎ‐グリカンがＮ‐グリコシド結
合で複合体に共有結合されたオリゴ糖（即ち、Ｎ‐結合
型オリゴ糖）であり、Ｏ‐グリカンがＯ‐グリコシド結
合で複合体に共有結合されたオリゴ糖（即ち、Ｏ‐結合
型オリゴ糖）であることは明らかである。Ｎ‐グリカン
及び／又はＯ‐グリカンが糖複合体で生じることも明ら
かである。このような糖複合体において、グリカンは複
合体（例えば、ペプチド複合体）に（Ｎ‐グリカンの場
合にはＮ‐グリコシド結合又はＯ‐グリカンの場合には
Ｏ‐グリコシド結合で）共有結合される。
用語はＮ‐グリカン、Ｏ‐グリカン並びにＮ‐及びＯ‐
グリカンを包含する。Ｎ‐グリカンがＮ‐グリコシド結
合で複合体に共有結合されたオリゴ糖（即ち、Ｎ‐結合
型オリゴ糖）であり、Ｏ‐グリカンがＯ‐グリコシド結
合で複合体に共有結合されたオリゴ糖（即ち、Ｏ‐結合
型オリゴ糖）であることは明らかである。Ｎ‐グリカン
及び／又はＯ‐グリカンが糖複合体で生じることも明ら
かである。このような糖複合体において、グリカンは複
合体（例えば、ペプチド複合体）に（Ｎ‐グリカンの場
合にはＮ‐グリコシド結合又はＯ‐グリカンの場合には
Ｏ‐グリコシド結合で）共有結合される。
【０００５】糖複合体の例は糖タンパク質、糖ホルモ
ン、糖脂質及びムチンである。放出剤は、糖複合体の複
合体からＮ‐グリカン及び／又はＯ‐グリカンを放出さ
せるように、Ｎ‐グリコシド結合及び／又はＯ‐グリコ
シド結合の開裂を生じるのであればいかなる物質であっ
てもよい。例えば、本発明による処理用の放出後反応混
合物は糖複合体及び放出剤を互いに反応させることで形
成される。
ン、糖脂質及びムチンである。放出剤は、糖複合体の複
合体からＮ‐グリカン及び／又はＯ‐グリカンを放出さ
せるように、Ｎ‐グリコシド結合及び／又はＯ‐グリコ
シド結合の開裂を生じるのであればいかなる物質であっ
てもよい。例えば、本発明による処理用の放出後反応混
合物は糖複合体及び放出剤を互いに反応させることで形
成される。
【０００６】放出剤の例は酵素及び化学試薬（例えば、
アルカリ溶液又は（実質上無水のヒドラジンのような）
ヒドラジン試薬）である。酵素は非誘導化放出剤（即
ち、複合体から放出された後にグリカンの誘導をおこさ
ない放出剤）である。例えばグリカンが誘導化放出剤
（即ち、複合体から放出後にグリカンの誘導をおこす放
出剤）を用いて糖複合体から放出された場合には、非還
元グリカンを再生する反応を行うことが望ましい。例え
ばヒドラジン試薬は遊離第一アミノ酸基を有するグリカ
ン誘導体を生じ、このためＮ‐アセチル化反応が非還元
グリカンを生成させるために行われる。更に例えば、用
いられたＮ‐アセチル化反応の形が望ましくない一価及
び／又は二価陽イオンを導入する場合には、これらは残
留複合体及び／又は複合体由来物質からグリカンを分離
してグリカンを回収する前に除去してよい。
アルカリ溶液又は（実質上無水のヒドラジンのような）
ヒドラジン試薬）である。酵素は非誘導化放出剤（即
ち、複合体から放出された後にグリカンの誘導をおこさ
ない放出剤）である。例えばグリカンが誘導化放出剤
（即ち、複合体から放出後にグリカンの誘導をおこす放
出剤）を用いて糖複合体から放出された場合には、非還
元グリカンを再生する反応を行うことが望ましい。例え
ばヒドラジン試薬は遊離第一アミノ酸基を有するグリカ
ン誘導体を生じ、このためＮ‐アセチル化反応が非還元
グリカンを生成させるために行われる。更に例えば、用
いられたＮ‐アセチル化反応の形が望ましくない一価及
び／又は二価陽イオンを導入する場合には、これらは残
留複合体及び／又は複合体由来物質からグリカンを分離
してグリカンを回収する前に除去してよい。
【０００７】更に、いずれかのグリカン誘導体がグリカ
ンを回収する前に存在する場合には、これらの誘導体は
非還元グリカンに変換してよい。
ンを回収する前に存在する場合には、これらの誘導体は
非還元グリカンに変換してよい。
【０００８】このためもう１つの態様において、本発明
は糖複合体からのグリカンの放出により形成された放出
後反応混合物から（前記のような）グリカンを単離する
ための方法を提供するが、その方法ではクロマトグラフ
ィー物質にグリカン（及びそのいずれかの誘導体）を吸
着させるために放出後混合物を第一クロマトグラフィー
物質と接触させ、クロマトグラフィー物質を溶出に付し
（ここで、前記吸着及び溶出は複合体及び／又は複合体
由来物質からグリカン（及びそのいずれかの誘導体）を
分離させかつ糖複合体からのグリカンの放出に用いられ
た放出剤を除去させるように行われる）、遊離第一アミ
ノ酸基を有するグリカンの誘導体が存在する場合には遊
離第一アミノ酸基を有するグリカン誘導体から非還元グ
リカンを得るためＮ‐アセチル化反応を行い、Ｎ‐アセ
チル化反応が行われた方法で望まれる場合には、Ｎ‐ア
セチル化反応後に得られた反応混合物から一価及び／又
は二価陽イオンを除去し、第二クロマトグラフィー物質
への吸着及びそれからの選択的溶出により反応混合物か
らグリカン又はその誘導体を分離し、いずれのグリカン
誘導体も非還元グリカンに変換する。
は糖複合体からのグリカンの放出により形成された放出
後反応混合物から（前記のような）グリカンを単離する
ための方法を提供するが、その方法ではクロマトグラフ
ィー物質にグリカン（及びそのいずれかの誘導体）を吸
着させるために放出後混合物を第一クロマトグラフィー
物質と接触させ、クロマトグラフィー物質を溶出に付し
（ここで、前記吸着及び溶出は複合体及び／又は複合体
由来物質からグリカン（及びそのいずれかの誘導体）を
分離させかつ糖複合体からのグリカンの放出に用いられ
た放出剤を除去させるように行われる）、遊離第一アミ
ノ酸基を有するグリカンの誘導体が存在する場合には遊
離第一アミノ酸基を有するグリカン誘導体から非還元グ
リカンを得るためＮ‐アセチル化反応を行い、Ｎ‐アセ
チル化反応が行われた方法で望まれる場合には、Ｎ‐ア
セチル化反応後に得られた反応混合物から一価及び／又
は二価陽イオンを除去し、第二クロマトグラフィー物質
への吸着及びそれからの選択的溶出により反応混合物か
らグリカン又はその誘導体を分離し、いずれのグリカン
誘導体も非還元グリカンに変換する。
【０００９】例えば、グリカン及びそのいずれの誘導体
もＮ‐アセチル化反応を行う前に第一クロマトグラフィ
ー物質から溶出される。一方、例えば、グリカン及びそ
のいずれの誘導体も第一クロマトグラフィー物質から溶
出される前にＮ‐アセチル化反応に付される。更に例え
ば、グリカンのアセトヒドラゾン誘導体が（例えば、第
二クロマトグラフィー物質からの溶出後に）存在する場
合には、酸性条件が非還元グリカンを形成させるために
用いられる。このため例えば、マイルドな酸性条件が固
定形の酸（即ち、固定された酸種）、鉱酸又はルイス酸
により適用される。
もＮ‐アセチル化反応を行う前に第一クロマトグラフィ
ー物質から溶出される。一方、例えば、グリカン及びそ
のいずれの誘導体も第一クロマトグラフィー物質から溶
出される前にＮ‐アセチル化反応に付される。更に例え
ば、グリカンのアセトヒドラゾン誘導体が（例えば、第
二クロマトグラフィー物質からの溶出後に）存在する場
合には、酸性条件が非還元グリカンを形成させるために
用いられる。このため例えば、マイルドな酸性条件が固
定形の酸（即ち、固定された酸種）、鉱酸又はルイス酸
により適用される。
【００１０】放出剤がヒドラジン試薬である場合、ヒド
ラジン試薬は、Ｎ‐グリカン及びＯ‐グリカンを複合体
に結合させるＮ‐グリコシド及び／又はＯ‐グリコシド
結合の望ましい開裂を起こしうるのであれば、例えばヒ
ドラジン自体でも又はそのいずれかの適切な誘導体もし
くは化合物（例えば、関連塩）であってもよい。ヒドラ
ジン試薬は例えば液体形（例えば、無水形）又は蒸気形
で用いられる。
ラジン試薬は、Ｎ‐グリカン及びＯ‐グリカンを複合体
に結合させるＮ‐グリコシド及び／又はＯ‐グリコシド
結合の望ましい開裂を起こしうるのであれば、例えばヒ
ドラジン自体でも又はそのいずれかの適切な誘導体もし
くは化合物（例えば、関連塩）であってもよい。ヒドラ
ジン試薬は例えば液体形（例えば、無水形）又は蒸気形
で用いられる。
【００１１】糖複合体からのＮ‐グリカン及び／又はＯ
‐グリカンの放出及びその後の単離はいくつかの理由か
ら重要である。これらのうち主なものは以下である：第
一に、糖複合体の詳細な構造的特徴化にはあらゆる連結
グリカンの構造分析が必要となる。いくつかのこのよう
なグリカンは単一複合体に結合されており、しかもグリ
カンの構造分析は単一の精製グリカンで最も正確に行わ
れることから、このような分析はまえもっての複合体か
らのかかるグリカンの放出前、それに続く複合体からの
かかるグリカンの単離、そして他からのグリカンの精製
を必要とする。第二に、このようなグリカンはそれ自体
重要な生物学的分子として次第に認識されてきている。
Ｎ‐グリカン及びＯ‐グリカンの生物学的性質の研究は
複合体でないＮ‐グリカン及びＯ‐グリカンを用いて優
先的に行われる。
‐グリカンの放出及びその後の単離はいくつかの理由か
ら重要である。これらのうち主なものは以下である：第
一に、糖複合体の詳細な構造的特徴化にはあらゆる連結
グリカンの構造分析が必要となる。いくつかのこのよう
なグリカンは単一複合体に結合されており、しかもグリ
カンの構造分析は単一の精製グリカンで最も正確に行わ
れることから、このような分析はまえもっての複合体か
らのかかるグリカンの放出前、それに続く複合体からの
かかるグリカンの単離、そして他からのグリカンの精製
を必要とする。第二に、このようなグリカンはそれ自体
重要な生物学的分子として次第に認識されてきている。
Ｎ‐グリカン及びＯ‐グリカンの生物学的性質の研究は
複合体でないＮ‐グリカン及びＯ‐グリカンを用いて優
先的に行われる。
【００１２】例えば、本発明はヒドラジン試薬を用いた
糖複合体からかかるグリカンの放出後にＮ‐グリカン、
Ｏ‐グリカン並びにＮ‐及びＯ‐グリカンの単離に適用
された。このため本発明によれば、Ｎ‐グリカンは牛フ
ェツイン、ヒト血清α１‐酸糖タンパク質、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ及びニワトリ卵オボアルブミンから放
出後に単離され、Ｏ‐グリカンは牛フェツイン、ブタ下
顎ムチン及びアシアログロボシドから放出後に単離さ
れ、Ｎ‐及びＯ‐グリカンは牛フェツインから放出後に
単離された。
糖複合体からかかるグリカンの放出後にＮ‐グリカン、
Ｏ‐グリカン並びにＮ‐及びＯ‐グリカンの単離に適用
された。このため本発明によれば、Ｎ‐グリカンは牛フ
ェツイン、ヒト血清α１‐酸糖タンパク質、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ及びニワトリ卵オボアルブミンから放
出後に単離され、Ｏ‐グリカンは牛フェツイン、ブタ下
顎ムチン及びアシアログロボシドから放出後に単離さ
れ、Ｎ‐及びＯ‐グリカンは牛フェツインから放出後に
単離された。
【００１３】本発明に従い用いられるクロマトグラフィ
ー物質の例は微結晶セルロース及びＣ18逆相物質であ
る。
ー物質の例は微結晶セルロース及びＣ18逆相物質であ
る。
【００１４】本発明によれば、単離が例えばグリカン
（即ち、オリゴ糖成分）及び複合体双方の性質から独立
した方法で複合体からグリカンを単離するために用いら
れることは明らかである。更に例えば、本発明による単
離は放出されたグリカンに不可逆的化学ダメージを与え
ることなく達成される。例えば、放出されるグリカンの
高収率は本発明に従い得られる。高収率とは８５％以上
と定義されるが、但し収率が実際上有益であるかぎりこ
れより低くてもよい。このため好ましい収率は８５％以
上のような高収率であるが、更に低い収率でも許容され
る場合には適用してよい。
（即ち、オリゴ糖成分）及び複合体双方の性質から独立
した方法で複合体からグリカンを単離するために用いら
れることは明らかである。更に例えば、本発明による単
離は放出されたグリカンに不可逆的化学ダメージを与え
ることなく達成される。例えば、放出されるグリカンの
高収率は本発明に従い得られる。高収率とは８５％以上
と定義されるが、但し収率が実際上有益であるかぎりこ
れより低くてもよい。このため好ましい収率は８５％以
上のような高収率であるが、更に低い収率でも許容され
る場合には適用してよい。
【００１５】放出されたグリカンからの放出剤の分離並
びに複合体及び／又は複合体由来物質の除去後に、グリ
カンが例えば放出剤並びに複合体又は複合体由来物質の
ない未分別プールとして得てもよいことは明らかであ
る。
びに複合体及び／又は複合体由来物質の除去後に、グリ
カンが例えば放出剤並びに複合体又は複合体由来物質の
ない未分別プールとして得てもよいことは明らかであ
る。
【００１６】本発明によるグリカンを単離するための方
法は、グリカンが糖複合体から放出される方法と独立し
ていることが理解される。本発明の方法は、グリカンが
糖複合体から（例えば、化学的又は酵素的に）どのよう
にして放出されるかとは無関係に及びグリカン単離が非
還元グリカン又はグリカンの誘導体を伴うか否かとは無
関係に、放出グリカンの単離に適用してよい。
法は、グリカンが糖複合体から放出される方法と独立し
ていることが理解される。本発明の方法は、グリカンが
糖複合体から（例えば、化学的又は酵素的に）どのよう
にして放出されるかとは無関係に及びグリカン単離が非
還元グリカン又はグリカンの誘導体を伴うか否かとは無
関係に、放出グリカンの単離に適用してよい。
【００１７】更に本発明による単離方法では、すべての
ステップ（例えば、分離、Ｎ‐アセチル化及び酸処理）
が反応後混合物が形成された方法とは無関係に放出後反
応混合物で行われることから、放出後反応混合物がどの
ようにして形成されたかという知識を必ずしも必要とし
ない。（幾つかの場合には本発明によるステップが余分
となるかもしれない（例えば、遊離第一アミノ酸基を有
する誘導体が存在しない場合にはＮ‐アセチル化反応又
はアセトヒドラゾン誘導体が存在しない場合には酸処
理）。しかしながら、すべてのステップが放出後反応混
合物で行われることから、どのステップが具体的ケース
で行われることを要するかに関する決定は必ずしも行う
必要がない。このため、本発明による同様の単離方法が
放出後反応混合物にかかわりなく適用される。）
ステップ（例えば、分離、Ｎ‐アセチル化及び酸処理）
が反応後混合物が形成された方法とは無関係に放出後反
応混合物で行われることから、放出後反応混合物がどの
ようにして形成されたかという知識を必ずしも必要とし
ない。（幾つかの場合には本発明によるステップが余分
となるかもしれない（例えば、遊離第一アミノ酸基を有
する誘導体が存在しない場合にはＮ‐アセチル化反応又
はアセトヒドラゾン誘導体が存在しない場合には酸処
理）。しかしながら、すべてのステップが放出後反応混
合物で行われることから、どのステップが具体的ケース
で行われることを要するかに関する決定は必ずしも行う
必要がない。このため、本発明による同様の単離方法が
放出後反応混合物にかかわりなく適用される。）
【００１８】本発明は、単なる例示として添付図面の図
及び以下の例１〜７を参照して更に記載される。例１ ：牛血清フェツインからのＮ‐及びＯ‐グリカンの
放出及び単離 この例において、Ｎ‐及びＯ‐グリカンを糖タンパク質
牛フェツインから単離し、こうして回収されたＮ‐及び
Ｏ‐グリカンを完全性、収率及び純度に関して調べた。
牛胎児血清からのフェツインはシグマ・ケミカル社(Sig
ma Chemical Company)（Poole ，Dorsets ，英国）から
購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸留水に対する十
分なマイクロフロー透析により無塩化した。透析後、溶
液はエドワーズ・モジュルヨ(Edwards Modulyo) 凍結乾
燥機を用い２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反
応管内で凍結乾燥させた。凍結乾燥された糖タンパク質
に無水ヒドラジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．
５mlを加えた。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封
し、しかる後９５℃で平衡化されたオーブンに３．７５
時間いれた。
及び以下の例１〜７を参照して更に記載される。例１ ：牛血清フェツインからのＮ‐及びＯ‐グリカンの
放出及び単離 この例において、Ｎ‐及びＯ‐グリカンを糖タンパク質
牛フェツインから単離し、こうして回収されたＮ‐及び
Ｏ‐グリカンを完全性、収率及び純度に関して調べた。
牛胎児血清からのフェツインはシグマ・ケミカル社(Sig
ma Chemical Company)（Poole ，Dorsets ，英国）から
購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸留水に対する十
分なマイクロフロー透析により無塩化した。透析後、溶
液はエドワーズ・モジュルヨ(Edwards Modulyo) 凍結乾
燥機を用い２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反
応管内で凍結乾燥させた。凍結乾燥された糖タンパク質
に無水ヒドラジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．
５mlを加えた。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封
し、しかる後９５℃で平衡化されたオーブンに３．７５
時間いれた。
【００１９】次いで、未反応ヒドラジンを下記のように
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
【００２０】次いで得られたＮ‐アセチル化混合物を容
量２．２mlのダウエックス(Dowex)ＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ
+ ）カラムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の
蒸留水で洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１,v/v）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５,v/v/v）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス(Chelex)１００（Ｎａ+ ）及びダウエッ
クスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タ
ンデムカラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で
洗浄し、溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM
テフロン膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾
固し、ガラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ
糖分画をニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含
有量に関して分析した（結果は下記表１で示されてい
る）。一部の非還元オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４
還元で放射性同位元素標識し、こうして得られた放射性
同位元素標識オリゴ糖アルジトールを（脱酸性化後）荷
電及びサイズに関して分析した。結果は添付図面の図３
及び４で示されている。これら分析の全体的結論は、ペ
プチド物質以外の汚染物質が検出できず、ペプチドのレ
ベルが１０％（重量）以下であり、グリカンが完全であ
って高収率（例えば８５％以上）で回収されることであ
る。
量２．２mlのダウエックス(Dowex)ＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ
+ ）カラムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の
蒸留水で洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１,v/v）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５,v/v/v）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス(Chelex)１００（Ｎａ+ ）及びダウエッ
クスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タ
ンデムカラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で
洗浄し、溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM
テフロン膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾
固し、ガラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ
糖分画をニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含
有量に関して分析した（結果は下記表１で示されてい
る）。一部の非還元オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４
還元で放射性同位元素標識し、こうして得られた放射性
同位元素標識オリゴ糖アルジトールを（脱酸性化後）荷
電及びサイズに関して分析した。結果は添付図面の図３
及び４で示されている。これら分析の全体的結論は、ペ
プチド物質以外の汚染物質が検出できず、ペプチドのレ
ベルが１０％（重量）以下であり、グリカンが完全であ
って高収率（例えば８５％以上）で回収されることであ
る。
【００２１】 表１ Ｎ‐アセチル Ｎ‐アセチル アミノ酸の ガラクトサミンの グルコサミンの 全含有量 全含有量* (nmol) 全含有量* (nmol) (nmol) 出発糖タンパク質 52.5 252.5 6918最終グリカンプール 45.1 217.2 332
【００２２】*糖タンパク質フェツインにおいて、Ｎ‐
及びＯ‐グリカンの含有量はＮ‐アセチルグルコサミン
及びＮ‐アセチルガラクトサミンの含有量に各々直接関
連していることが通常認められる。したがって、Ｎ‐ア
セチルグルコサミン及びＮ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は、本発明で記載された方法を行った後に得られ
たグリカンプール及びフェツイン糖タンパク質双方にお
けるＮ‐及びＯ‐グリカン含有量の好ましい測定値とし
て用いられる。
及びＯ‐グリカンの含有量はＮ‐アセチルグルコサミン
及びＮ‐アセチルガラクトサミンの含有量に各々直接関
連していることが通常認められる。したがって、Ｎ‐ア
セチルグルコサミン及びＮ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は、本発明で記載された方法を行った後に得られ
たグリカンプール及びフェツイン糖タンパク質双方にお
けるＮ‐及びＯ‐グリカン含有量の好ましい測定値とし
て用いられる。
【００２３】本発明に従い糖タンパク質牛フェツインを
処理することにより、あるプロセス順序で汚染物質のな
い完全Ｎ‐及びＯ‐グリカンを高収率（例えば８５％以
上）で回収しうることが確立された。完全Ｎ‐及びＯ‐
グリカンが回収されるプロセス順序が規定されたが、こ
の順序は容易に自動化しうるようなものである。これが
そうであることは、糖複合体の凍結乾燥サンプルを回収
して、かつ、その糖複合体と前に連結していた完全Ｎ‐
及びＯ‐グリカンを首尾よく運搬しうる機械を構築し、
動作させることによって立証される。
処理することにより、あるプロセス順序で汚染物質のな
い完全Ｎ‐及びＯ‐グリカンを高収率（例えば８５％以
上）で回収しうることが確立された。完全Ｎ‐及びＯ‐
グリカンが回収されるプロセス順序が規定されたが、こ
の順序は容易に自動化しうるようなものである。これが
そうであることは、糖複合体の凍結乾燥サンプルを回収
して、かつ、その糖複合体と前に連結していた完全Ｎ‐
及びＯ‐グリカンを首尾よく運搬しうる機械を構築し、
動作させることによって立証される。
【００２４】例２：牛フェツインからのＮ‐グリカンの
単離 この例において、Ｎ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから単離し、こうして回収されたＮ‐グリカンを完
全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清からの
フェツインはシグマ・ケミカル社（Poole ，Dorset，英
国）から購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸留水に
対する十分なマイクロフロー透析により無塩化した。透
析後、溶液はエドワーズ・モジュルヨ凍結乾燥機を用い
２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反応管内で凍
結乾燥させた。凍結乾燥されたタンパク質に無水ヒドラ
ジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５mlを加え
た。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、しかる
後１００℃で平衡化されたオーブンに１０時間いれた。
単離 この例において、Ｎ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから単離し、こうして回収されたＮ‐グリカンを完
全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清からの
フェツインはシグマ・ケミカル社（Poole ，Dorset，英
国）から購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸留水に
対する十分なマイクロフロー透析により無塩化した。透
析後、溶液はエドワーズ・モジュルヨ凍結乾燥機を用い
２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反応管内で凍
結乾燥させた。凍結乾燥されたタンパク質に無水ヒドラ
ジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５mlを加え
た。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、しかる
後１００℃で平衡化されたオーブンに１０時間いれた。
【００２５】次いで、未反応ヒドラジンを下記のように
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラムの頂部にフローなし
で平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内から反応混合物
（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５ml）を溶媒に加
え、しかる後すべてフローなしに十分ミックスして単一
相を形成させた。次いで液体フローを始め、すべての液
体がカラムを通過したとき、カラムを３倍カラム容量の
平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラムを１倍カラム容量
のメタノールしかる後２倍カラム容量の水性酢酸ナトリ
ウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄した。再Ｎ‐アセ
チル化はプールされた溶出液への０．５ml無水酢酸添加
及び室温で１時間のインキュベートにより行った。
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラムの頂部にフローなし
で平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内から反応混合物
（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５ml）を溶媒に加
え、しかる後すべてフローなしに十分ミックスして単一
相を形成させた。次いで液体フローを始め、すべての液
体がカラムを通過したとき、カラムを３倍カラム容量の
平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラムを１倍カラム容量
のメタノールしかる後２倍カラム容量の水性酢酸ナトリ
ウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄した。再Ｎ‐アセ
チル化はプールされた溶出液への０．５ml無水酢酸添加
及び室温で１時間のインキュベートにより行った。
【００２６】次いで得られたＮ‐アセチル化混合物を容
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、しかる後ロータリ
ー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガラス蒸留
水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノール、メタ
ノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調製前平衡
化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）の頂部に
フローなしに適用した。水層及びブタノール／エタノー
ル相を単一な均一相になるまで十分にミックスし、しか
る後フローを始めた。すべての液体が通過した後、カラ
ムを５倍カラム容量のブタノール、エタノール、水溶媒
（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。次いでカラ
ムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カラム容量の
蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を同時プール
し、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水溶液０．２
mlにいれ、室温で３０分間インキュベートし、キレック
ス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ５０Ｘ１２
（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカラムに通し
た。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、溶出液及び
洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン膜フィルタ
ー）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガラス蒸留水
１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖をニンヒドリン法
により単糖組成及びアミノ酸含有量に関して分析した
（結果は下記表２で示されている）。別に一部の非還元
オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で放射性同位元
素標識し、こうして得られた放射性同位元素標識オリゴ
糖アルジトールを脱酸性化し、サイズに関して分析した
（結果は添付図面の図５で示されている）。
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、しかる後ロータリ
ー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガラス蒸留
水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノール、メタ
ノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調製前平衡
化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）の頂部に
フローなしに適用した。水層及びブタノール／エタノー
ル相を単一な均一相になるまで十分にミックスし、しか
る後フローを始めた。すべての液体が通過した後、カラ
ムを５倍カラム容量のブタノール、エタノール、水溶媒
（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。次いでカラ
ムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カラム容量の
蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を同時プール
し、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水溶液０．２
mlにいれ、室温で３０分間インキュベートし、キレック
ス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ５０Ｘ１２
（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカラムに通し
た。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、溶出液及び
洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン膜フィルタ
ー）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガラス蒸留水
１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖をニンヒドリン法
により単糖組成及びアミノ酸含有量に関して分析した
（結果は下記表２で示されている）。別に一部の非還元
オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で放射性同位元
素標識し、こうして得られた放射性同位元素標識オリゴ
糖アルジトールを脱酸性化し、サイズに関して分析した
（結果は添付図面の図５で示されている）。
【００２７】例３：ヒト血清α１‐酸糖タンパク質から
のＮ‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例２で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくヒ
ト血清α１‐酸糖タンパク質であった。単糖組成及びア
ミノ酸含有量に関する分析結果は下記表２で示されてい
る。サイズ分析の結果は添付図面の図６で示されてい
る。
のＮ‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例２で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくヒ
ト血清α１‐酸糖タンパク質であった。単糖組成及びア
ミノ酸含有量に関する分析結果は下記表２で示されてい
る。サイズ分析の結果は添付図面の図６で示されてい
る。
【００２８】例４：西洋ワサビペルオキシダーゼからの
Ｎ‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例２で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は西洋ワサビペルオキシダ
ーゼであって、牛フェツインではない。単糖組成及びア
ミノ酸含有量に関する分析結果は下記表２で示されてい
る。サイズ分析の結果は添付図面の図７で示されてい
る。
Ｎ‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例２で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は西洋ワサビペルオキシダ
ーゼであって、牛フェツインではない。単糖組成及びア
ミノ酸含有量に関する分析結果は下記表２で示されてい
る。サイズ分析の結果は添付図面の図７で示されてい
る。
【００２９】例５：ニワトリ卵オボアルブミンからのＮ
‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体はニワトリ卵オボアルブミ
ンであった。単糖組成及びアミノ酸含有量に関する分析
結果は下記表２で示されている。サイズ分析の結果は添
付図面の図８で示されている。これら分析の全体的結論
は、ペプチド物質以外の汚染物質が検出できず、ペプチ
ドのレベルが１０％（重量）以下であり、Ｎ‐グリカン
が完全であって高収率（例えば８５％以上）で回収され
ることである。
‐グリカンの単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体はニワトリ卵オボアルブミ
ンであった。単糖組成及びアミノ酸含有量に関する分析
結果は下記表２で示されている。サイズ分析の結果は添
付図面の図８で示されている。これら分析の全体的結論
は、ペプチド物質以外の汚染物質が検出できず、ペプチ
ドのレベルが１０％（重量）以下であり、Ｎ‐グリカン
が完全であって高収率（例えば８５％以上）で回収され
ることである。
【００３０】 表２ Ｎ‐アセチル アミノ酸の グルコサミンの 全含有量 全含有量(nmol)* (μg) 出発牛フェツイン 319 1000 牛フェツイン 284 47 Ｎ‐グリカンプール 出発ヒト血清α１‐酸 801 1000 ヒト血清α１‐酸 746 53 Ｎ‐グリカンプール 出発西洋ワサビペルオキシダーゼ 246 1000 西洋ワサビペルオキシダーゼ 230 61 Ｎ‐グリカンプール 出発ニワトリ卵オボアルブミン 192 1000 ニワトリ卵オボアルブミン 171 39 Ｎ‐グリカンプール
【００３１】*Ｎ‐グリカンの含有量はＮ‐アセチルグ
ルコサミンの含有量に直接関連していることが通常認め
られる。したがって、Ｎ‐アセチルグルコサミンの含有
量は記載された方法を行った後に得られたグリカンプー
ル及び出発糖複合体双方におけるＮ‐グリカン含有量の
好ましい測定値として用いられる。
ルコサミンの含有量に直接関連していることが通常認め
られる。したがって、Ｎ‐アセチルグルコサミンの含有
量は記載された方法を行った後に得られたグリカンプー
ル及び出発糖複合体双方におけるＮ‐グリカン含有量の
好ましい測定値として用いられる。
【００３２】本発明に従い上記糖複合体を処理すること
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｎ‐グ
リカンを高収率（例えば８５％以上）で回収しうること
が確立された。完全Ｎ‐グリカンが回収できるプロセス
順序が規定されたが、この順序は容易に自動化しうるよ
うなものである。これがそうであることは、糖複合体の
凍結乾燥サンプルを回収してかつその糖複合体と前に連
結していた完全Ｎ‐グリカンを首尾よく運搬しうる機械
を構築し、動作させることによって立証される。
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｎ‐グ
リカンを高収率（例えば８５％以上）で回収しうること
が確立された。完全Ｎ‐グリカンが回収できるプロセス
順序が規定されたが、この順序は容易に自動化しうるよ
うなものである。これがそうであることは、糖複合体の
凍結乾燥サンプルを回収してかつその糖複合体と前に連
結していた完全Ｎ‐グリカンを首尾よく運搬しうる機械
を構築し、動作させることによって立証される。
【００３３】例６：牛フェツインからのＯ‐グリカンの
単離 この例において、Ｏ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから単離し、こうして回収されたＯ‐グリカンを完
全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清からの
フェツインはシグマ・ケミカル社（プール，ドーセッ
ト，英国）から購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸
留水に対する十分なマイクロフロー透析により無塩化し
た。透析後、溶液はエドワーズ・モジュルヨ凍結乾燥機
を用い２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反応管
内で凍結乾燥させた。凍結乾燥された糖タンパク質に無
水ヒドラジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５ml
を加えた。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、
しかる後６５℃で平衡化されたオーブンに８時間いれ
た。
単離 この例において、Ｏ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから単離し、こうして回収されたＯ‐グリカンを完
全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清からの
フェツインはシグマ・ケミカル社（プール，ドーセッ
ト，英国）から購入した。糖タンパク質１mgをガラス蒸
留水に対する十分なマイクロフロー透析により無塩化し
た。透析後、溶液はエドワーズ・モジュルヨ凍結乾燥機
を用い２５ミリバール圧で作動させて透明ガラス反応管
内で凍結乾燥させた。凍結乾燥された糖タンパク質に無
水ヒドラジン（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５ml
を加えた。管を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、
しかる後６５℃で平衡化されたオーブンに８時間いれ
た。
【００３４】次いで、未反応ヒドラジンを下記のように
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
【００３５】次いで得られたＮ‐アセチル化混合物を容
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、２倍容量のメタノ
ール及び５倍容量の水による洗浄で予め調整されたＣ18
逆相カートリッジ〔米国マサチューセッツ州ミルフォー
ド，ミリポア社ウォーターズ事業部(Waters Division o
f MilliporeCorporation)のウォーターズＳＥＰ‐ＰＡ
ＫＣ18カートリッジ〕に通した。18カートリッジを２倍
容量の水で洗浄し、溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ
５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカ
ラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、
溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン
膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガ
ラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖分画を
ニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含有量に関
して分析した（結果は下記表３で示されている）。一部
の非還元オリゴ糖分画をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で
放射性同位元素標識し、こうして得られた放射性同位元
素標識オリゴ糖アルジトールを荷電及びサイズに関して
分析した。結果は添付図面の図９及び１０で示されてい
る。
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、２倍容量のメタノ
ール及び５倍容量の水による洗浄で予め調整されたＣ18
逆相カートリッジ〔米国マサチューセッツ州ミルフォー
ド，ミリポア社ウォーターズ事業部(Waters Division o
f MilliporeCorporation)のウォーターズＳＥＰ‐ＰＡ
ＫＣ18カートリッジ〕に通した。18カートリッジを２倍
容量の水で洗浄し、溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ
５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカ
ラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、
溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン
膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガ
ラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖分画を
ニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含有量に関
して分析した（結果は下記表３で示されている）。一部
の非還元オリゴ糖分画をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で
放射性同位元素標識し、こうして得られた放射性同位元
素標識オリゴ糖アルジトールを荷電及びサイズに関して
分析した。結果は添付図面の図９及び１０で示されてい
る。
【００３６】例７：ブタ下顎ムチンからのＯ‐グリカン
の単離 この例では本質的に同様の操作が例６で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくブ
タ下顎ムチンであった。単糖組成及びアミノ酸含有量に
関する分析結果は下記表３で示されている。荷電及びサ
イズ分析の結果は添付図面の図１１及び１２で示されて
いる。
の単離 この例では本質的に同様の操作が例６で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくブ
タ下顎ムチンであった。単糖組成及びアミノ酸含有量に
関する分析結果は下記表３で示されている。荷電及びサ
イズ分析の結果は添付図面の図１１及び１２で示されて
いる。
【００３７】例８：アシアログロボシドからのＯ‐グリ
カンの単離 この例では本質的に同様の操作が例６で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくア
シアログロボシドであった。単糖組成及びアミノ酸含有
量に関する分析結果は下記表３で示されている。サイズ
分析の結果は添付図面の図１３で示されている。これら
分析の全体的結論は、ペプチド物質以外の汚染物質が検
出できず、ペプチドのレベルが１０％（重量）以下であ
り、Ｏ‐グリカンが完全であって高収率（例えば８５％
以上）で回収されることである。
カンの単離 この例では本質的に同様の操作が例６で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくア
シアログロボシドであった。単糖組成及びアミノ酸含有
量に関する分析結果は下記表３で示されている。サイズ
分析の結果は添付図面の図１３で示されている。これら
分析の全体的結論は、ペプチド物質以外の汚染物質が検
出できず、ペプチドのレベルが１０％（重量）以下であ
り、Ｏ‐グリカンが完全であって高収率（例えば８５％
以上）で回収されることである。
【００３８】 表３ Ｎ‐アセチル アミノ酸の ガラクトサミンの 全含有量* 全含有量* (nmol) (μg) 出発牛フェツイン 69 1000 牛フェツイン 60 74 Ｏ‐グリカンプール 出発ブタ下顎ムチン 603 1000 ブタ下顎ムチン 561 56 Ｏ‐グリカンプール 出発アシアログロボシド 963 0 アシアログロボシド 831 0 Ｏ‐グリカンプール
【００３９】*Ｏ‐グリカンの含有量はＮ‐アセチルガ
ラクトサミンの含有量に直接関連していることが通常認
められる。したがって、Ｎ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は記載された方法を行った後に得られたグリカン
プール及び出発糖複合体双方におけるＯ‐グリカン含有
量の好ましい測定値として用いられる。
ラクトサミンの含有量に直接関連していることが通常認
められる。したがって、Ｎ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は記載された方法を行った後に得られたグリカン
プール及び出発糖複合体双方におけるＯ‐グリカン含有
量の好ましい測定値として用いられる。
【００４０】本発明に従い上記糖複合体を処理すること
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｏ‐グ
リカンを高収率で回収しうることが確立された。完全Ｏ
‐グリカンが高収率でかつ汚染物質なしに回収されるプ
ロセス順序が規定されたが、この順序は容易に自動化し
うるようなものである。これがそうであることは、糖複
合体の凍結乾燥サンプルを回収してかつその糖複合体と
前に連結していた完全Ｏ‐グリカンを首尾よく運搬しう
る機械を構築し、動作させることによって立証される。
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｏ‐グ
リカンを高収率で回収しうることが確立された。完全Ｏ
‐グリカンが高収率でかつ汚染物質なしに回収されるプ
ロセス順序が規定されたが、この順序は容易に自動化し
うるようなものである。これがそうであることは、糖複
合体の凍結乾燥サンプルを回収してかつその糖複合体と
前に連結していた完全Ｏ‐グリカンを首尾よく運搬しう
る機械を構築し、動作させることによって立証される。
【図１】Ｎ‐グリカン及びＯ‐グリカンをペプチド複合
体に結合するＯ‐グリコシド結合及びＮ‐グリコシド結
合の概要を示す。
体に結合するＯ‐グリコシド結合及びＮ‐グリコシド結
合の概要を示す。
【図２】Ｎ‐グリコシド及びＯ‐グリコシド結合の現在
実施されるアルカリ開裂に関して重要な化学反応の概要
を示す。
実施されるアルカリ開裂に関して重要な化学反応の概要
を示す。
【図３】脱酸性化後における（例１に従い単離された）
放射性同位元素標識グリカンの高電圧放射線電気泳動グ
ラフである。
放射性同位元素標識グリカンの高電圧放射線電気泳動グ
ラフである。
【図４】放射性同位元素標識グリカン（例１に従い単離
されたグリカン）のゲル濾過クロマトグラムである。
されたグリカン）のゲル濾過クロマトグラムである。
【図５】牛血清フェツインから誘導されたグリカンアル
ジトールのサイズクロマトグラムである（例２参照）。
ジトールのサイズクロマトグラムである（例２参照）。
【図６】ヒト血清α１‐酸糖タンパク質から誘導された
グリカンアルジトールのサイズクロマトグラムである
（例３参照）。
グリカンアルジトールのサイズクロマトグラムである
（例３参照）。
【図７】西洋ワサビペルオキシダーゼから誘導されたア
ルジトールのサイズクロマトグラムである（例４参
照）。
ルジトールのサイズクロマトグラムである（例４参
照）。
【図８】ニワトリ卵オボアルブミンから誘導されたアル
ジトールのサイズクロマトグラムである（例５参照）。
ジトールのサイズクロマトグラムである（例５参照）。
【図９】放射性同位元素標識グリカンの高電圧放射線電
気泳動グラフ（牛血清フェツインから誘導されたグリカ
ンアルジトールのサイズクロマトグラム）である（例
６）。
気泳動グラフ（牛血清フェツインから誘導されたグリカ
ンアルジトールのサイズクロマトグラム）である（例
６）。
【図１０】脱酸性化後における放射性同位元素標識グリ
カンのゲル濾過クロマトグラム（牛血清フェツインから
誘導されたグリカンアルジトールのサイズクロマトグラ
ム）である（例６）。
カンのゲル濾過クロマトグラム（牛血清フェツインから
誘導されたグリカンアルジトールのサイズクロマトグラ
ム）である（例６）。
【図１１】ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアル
ジトールのチャージクロマトグラムである（例６）。
ジトールのチャージクロマトグラムである（例６）。
【図１２】ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアル
ジトールのサイズクロマトグラムである（例７）。
ジトールのサイズクロマトグラムである（例７）。
【図１３】アシアログロボシドから誘導されたグリカン
アルジトールのサイズクロマトグラムである（例８）。
アルジトールのサイズクロマトグラムである（例８）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニー、ヒュー、メリー イギリス国オクソン、チャールベリ、リト ル、リーズ、22 (72)発明者 ジェームズ、ブルース イギリス国オクソン、エンシャム、ウィタ ム、ビュー、53
Claims (16)
- 【請求項１】糖複合体から放出されたグリカンの単離方
法であって、 グリカン（及びそのいずれかの誘導体）をクロマトグラ
フィー物質に吸着させ、残留複合体及び／又は複合体由
来物質からグリカンを分離し、グリカンを回収すること
を特徴とする方法。 - 【請求項２】糖複合体からのグリカンの放出により形成
された放出後反応混合物からグリカンを単離するため
に、クロマトグラフィー物質にグリカン（及びそのいず
れかの誘導体）を吸着させるために放出後反応混合物を
クロマトグラフィー物質と接触させ、クロマトグラフィ
ー物質を溶出ん付し（ここで、前記吸着及び溶出は複合
体及び／又は複合体由来物質からグリカン（及びそのい
ずれかの誘導体）を分離させかつ糖複合体からのグリカ
ンの放出に用いられた放出剤を除去させるように行われ
る）、残留複合体及び／又は複合体由来物質からグリカ
ンを分離し、グリカンを回収することからなる、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】糖複合体からのグリカンの放出により形成
された放出後反応混合物からグリカンを単離するため
に、クロマトグラフィー物質にグリカン（及びそのいず
れかの誘導体）を吸着させるために放出後混合物を第一
クロマトグラフィー物質と接触させ、クロマトグラフィ
ー物質を溶出に付し（ここで、前記吸着及び溶出は複合
体及び／又は複合体由来物質からグリカン（及びそのい
ずれかの誘導体）を分離させかつ糖複合体からのグリカ
ンの放出に用いられた放出剤を除去させるように行われ
る）、遊離第一アミノ酸基を有するグリカンの誘導体が
存在する場合には遊離第一アミノ酸基を有するグリカン
誘導体から非還元グリカンを得るためＮ‐アセチル化反
応を行い、Ｎ‐アセチル化反応が行われた方法で望まれ
る場合には、Ｎ‐アセチル化反応後に得られた反応混合
物から一価及び／又は二価陽イオンを除去し、第二クロ
マトグラフィー物質への吸着及びそれからの選択的溶出
により反応混合物からグリカン又はその誘導体を分離
し、いずれのグリカン誘導体も非還元グリカンに変換す
ることからなる、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】グリカン及びそのいずれの誘導体もＮ‐ア
セチル化反応を行う前に第一クロマトグラフィー物質か
ら溶出される、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】グリカン及びそのいずれの誘導体も第一ク
ロマトグラフィー物質から溶出される前にＮ‐アセチル
化反応に付される、請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】グリカンのいずれのアセトヒドラゾン誘導
体も非還元グリカンを形成させるため酸性条件下に付さ
れる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】酸性条件が固定形の酸、鉱酸又はルイス酸
により適用される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】グリカンがＮ‐グリカン、Ｏ‐グリカン又
はＮ‐及びＯ‐グリカンである、請求項１〜７のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項９】グリカンが放出される糖複合体が糖タンパ
ク質、糖ホルモン、糖脂質又はムチンである、請求項１
〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】Ｎ‐グリカンが、牛フェツイン、ヒト血
清α１‐酸糖タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ
又はニワトリ卵オボアルブミンから放出後に単離され
る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】Ｏ‐グリカンが、牛フェツイン、ブタ下
顎ムチン又はアシアログロボシドから放出後に単離され
る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】Ｎ‐及びＯ‐グリカンが牛フェツインか
ら放出後に単離される、請求項１〜９のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１３】微結晶セルロース又はＣ18逆相物質がク
ロマトグラフィー物質として用いられる、請求項１〜１
２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】高収率のグリカンが得られる、請求項１
〜１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】単離されるグリカンが、酵素又は化学物
質を含む放出剤の使用により糖複合体から放出される、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】化学物質がヒドラジン試薬である、請求
項１５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9013831.4 | 1990-06-21 | ||
| GB9013828.0 | 1990-06-21 | ||
| GB909013828A GB9013828D0 (en) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | Release and isolation of unreduced'n-and o-linked type'oligosaccharides |
| GB9013830.6 | 1990-06-21 | ||
| GB909013831A GB9013831D0 (en) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | Release and isolation of unreduced'n-linked type'oligosaccharides |
| GB909013830A GB9013830D0 (en) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | Release and isolation of unreduced'o-linked type'oligosaccharides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0687903A true JPH0687903A (ja) | 1994-03-29 |
Family
ID=27265150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17750791A Pending JPH0687903A (ja) | 1990-06-21 | 1991-06-21 | グリカンの単離 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0462795A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0687903A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4846254A (en) * | 1987-06-11 | 1989-07-11 | Hitachi, Ltd. | Rolling installation for and rolling method of continuous cast strip |
| JP2014185226A (ja) * | 2013-03-22 | 2014-10-02 | San Akuteisu:Kk | β−グルカンの製造方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9013831D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-linked type'oligosaccharides |
| GB9013828D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-and o-linked type'oligosaccharides |
| GB9013830D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'o-linked type'oligosaccharides |
| DE69130136T2 (de) * | 1990-06-21 | 1999-03-11 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd., Abingdon, Oxon | Automatisiertes Verfahren zur Spaltung von Biomolekülen |
| US5831077A (en) * | 1993-12-09 | 1998-11-03 | Redmond; John William | Glycosylhydrazines, preparation, immobilization and reactions of: glycoprotein analysis and O-glycan removal |
| US20140135235A1 (en) * | 2011-06-06 | 2014-05-15 | Hui Zhang | Glycan and glycopeptide capture and release using reversible hydrazone-based method |
| US9939444B2 (en) | 2012-09-10 | 2018-04-10 | The Johns Hopkins University | Isobaric aldehyde-reactive tags for and analysis of glycans using same |
| US9310344B2 (en) | 2013-06-14 | 2016-04-12 | Dionex Corporation | HILIC/anion-exchange/cation-exchange multimodal media |
| US9169331B2 (en) | 2012-12-21 | 2015-10-27 | Dionex Corporation | Separation of glycans by mixed-mode liquid chromatography |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3347163A1 (de) * | 1983-12-27 | 1985-07-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verwendung von oligosacchariden zur chemotherapie oder chemoprophylaxe der malaria |
| US4719294A (en) * | 1985-09-06 | 1988-01-12 | Monsanto Company | Isolation of unreduced oligosaccharides |
| GB9013831D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-linked type'oligosaccharides |
| GB9013828D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-and o-linked type'oligosaccharides |
| GB9013830D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'o-linked type'oligosaccharides |
-
1991
- 1991-06-18 EP EP19910305496 patent/EP0462795A3/en not_active Withdrawn
- 1991-06-21 JP JP17750791A patent/JPH0687903A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4846254A (en) * | 1987-06-11 | 1989-07-11 | Hitachi, Ltd. | Rolling installation for and rolling method of continuous cast strip |
| JP2014185226A (ja) * | 2013-03-22 | 2014-10-02 | San Akuteisu:Kk | β−グルカンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0462795A3 (en) | 1993-02-24 |
| EP0462795A2 (en) | 1991-12-27 |
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