JPH0687905A - Ｏ‐グリカンの放出及び単離 - Google Patents
Ｏ‐グリカンの放出及び単離Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 糖複合体からＯ‐グリカンを放出させる方法
を提供する。 【構成】 糖複合体をヒドラジン試薬の影響下におき
（ここで、前記糖複合体は実質上無塩かつ実質上無水で
あり、前記ヒドラジン試薬は実質上無水である）、実質
上非還元かつ完全な形でＯ‐グリカンを後に回収しうる
ような方法で糖複合体からＯ‐グリカンを放出させるよ
うに、糖複合体がヒドラジン試薬の影響下におかれてい
る条件をコントロールすることを特徴とする方法。
を提供する。 【構成】 糖複合体をヒドラジン試薬の影響下におき
（ここで、前記糖複合体は実質上無塩かつ実質上無水で
あり、前記ヒドラジン試薬は実質上無水である）、実質
上非還元かつ完全な形でＯ‐グリカンを後に回収しうる
ような方法で糖複合体からＯ‐グリカンを放出させるよ
うに、糖複合体がヒドラジン試薬の影響下におかれてい
る条件をコントロールすることを特徴とする方法。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は、糖複合体からのＯ‐グリカン（即ち、Ｏ‐結
合型オリゴ糖）の放出方法、並びに、かかるグリカンの
単離に関する。糖複合体の例は糖タンパク質、糖ホルモ
ン又は糖脂質である。
合型オリゴ糖）の放出方法、並びに、かかるグリカンの
単離に関する。糖複合体の例は糖タンパク質、糖ホルモ
ン又は糖脂質である。
【０００２】“Ｏ‐結合型”オリゴ糖はＯ‐グリコシド
結合で複合体に共有結合されたオリゴ糖である。糖タン
パク質で典型的にみられるような結合の例は添付図面の
図１で示されている。本発明の目的のため、放出とは
“Ｏ‐結合型”オリゴ糖を複合体に結合させる共有Ｏ‐
グリコシド結合の開裂を導く方法又はプロセスに関し、
単離とは複合体又は複合体由来物質から放出されるオリ
ゴ糖の物理的分離を導く方法又はプロセスに関する。
結合で複合体に共有結合されたオリゴ糖である。糖タン
パク質で典型的にみられるような結合の例は添付図面の
図１で示されている。本発明の目的のため、放出とは
“Ｏ‐結合型”オリゴ糖を複合体に結合させる共有Ｏ‐
グリコシド結合の開裂を導く方法又はプロセスに関し、
単離とは複合体又は複合体由来物質から放出されるオリ
ゴ糖の物理的分離を導く方法又はプロセスに関する。
【０００３】糖複合体からの“Ｏ‐結合型”オリゴ糖
（以下、“Ｏ‐グリカン”と称される）の放出及びその
後の単離はいくつかの理由から重要である。これらのう
ち主なものは以下である：第一に、糖複合体の詳細な構
造的特徴化にはあらゆる連結Ｏ‐グリカンの構造分析が
必要となる。いくつかのこのようなグリカンは単一複合
体に結合されており、しかもＯ‐グリカンの構造分析は
単一の精製グリカンで最も正確に行われることから、こ
のような分析はまえもっての複合体からのＯ‐グリカン
の放出、それに続く複合体からのＯ‐グリカンの単離、
そして他からのグリカンの精製を必要とする。第二に、
Ｏ‐グリカンはそれ自体重要な生物学的分子として次第
に認識されてきている。Ｏ‐グリカンの生物学的性質の
研究は複合体でないＯ‐グリカンを用いて優先的に行わ
れる。
（以下、“Ｏ‐グリカン”と称される）の放出及びその
後の単離はいくつかの理由から重要である。これらのう
ち主なものは以下である：第一に、糖複合体の詳細な構
造的特徴化にはあらゆる連結Ｏ‐グリカンの構造分析が
必要となる。いくつかのこのようなグリカンは単一複合
体に結合されており、しかもＯ‐グリカンの構造分析は
単一の精製グリカンで最も正確に行われることから、こ
のような分析はまえもっての複合体からのＯ‐グリカン
の放出、それに続く複合体からのＯ‐グリカンの単離、
そして他からのグリカンの精製を必要とする。第二に、
Ｏ‐グリカンはそれ自体重要な生物学的分子として次第
に認識されてきている。Ｏ‐グリカンの生物学的性質の
研究は複合体でないＯ‐グリカンを用いて優先的に行わ
れる。
【０００４】糖複合体からＯ‐グリカンの放出及び単離
をうまく行う方法で同時に満足されるべき基準は以下の
とおりである： (i) 放出方法は、好ましくはオリゴ糖成分及び複合体成
分双方の性質から独立した方法でＯ‐グリコシド結合を
開裂するべきである。 (ii) 放出方法は、好ましくは開裂されたグリカンにと
り永続的な（即ち、容易に可逆的でない）化学的ダメー
ジなしに開裂を行うべきである。 (iii)単離方法は、前記(i) のように好ましくはオリゴ
糖成分及び複合体成分双方の性質から独立した方法で複
合体からＯ‐グリカンを分離するべきである。 (iv) 単離方法は、好ましくは開裂されたグリカンに化
学的ダメージを与えることなく単離を達成すべきであ
る。
をうまく行う方法で同時に満足されるべき基準は以下の
とおりである： (i) 放出方法は、好ましくはオリゴ糖成分及び複合体成
分双方の性質から独立した方法でＯ‐グリコシド結合を
開裂するべきである。 (ii) 放出方法は、好ましくは開裂されたグリカンにと
り永続的な（即ち、容易に可逆的でない）化学的ダメー
ジなしに開裂を行うべきである。 (iii)単離方法は、前記(i) のように好ましくはオリゴ
糖成分及び複合体成分双方の性質から独立した方法で複
合体からＯ‐グリカンを分離するべきである。 (iv) 単離方法は、好ましくは開裂されたグリカンに化
学的ダメージを与えることなく単離を達成すべきであ
る。
【０００５】加えて、その方法は出発糖複合体の量に関
係なく高収率（例えば８５％以上）でＯ‐グリカンの回
収も果たせることが好ましい。
係なく高収率（例えば８５％以上）でＯ‐グリカンの回
収も果たせることが好ましい。
【０００６】以前は、２つの異なる方法がＯ‐グリカン
双方の放出のために用いられてきた。これらを以下で簡
単に要約し、上記基準に従い評価する。
双方の放出のために用いられてきた。これらを以下で簡
単に要約し、上記基準に従い評価する。
【０００７】Ａ．酵素方法‐例えば、糖タンパク質から
糖ペプチドを得るためプロナーゼのようなタンパク質分
解酵素を使用し、及び／又は、糖複合体から一部のＯ‐
グリカンを開裂するためＯ‐グリカナーゼ(O-glycanase
TM) (E.C.No.3.2.1.97) のような酵素を使用する。この
ような方法はいくつかの理由から、但し主にＯ‐グリカ
ン放出の選択性のために、通常満足できない。酵素は本
来非常に特異的であり、あるＯ‐グリカンのみを放出
し、しかも結合複合体によりいくぶん影響される。即
ち、現在実施かつ理解されるような酵素方法は上記基準
(i) を満足しない。
糖ペプチドを得るためプロナーゼのようなタンパク質分
解酵素を使用し、及び／又は、糖複合体から一部のＯ‐
グリカンを開裂するためＯ‐グリカナーゼ(O-glycanase
TM) (E.C.No.3.2.1.97) のような酵素を使用する。この
ような方法はいくつかの理由から、但し主にＯ‐グリカ
ン放出の選択性のために、通常満足できない。酵素は本
来非常に特異的であり、あるＯ‐グリカンのみを放出
し、しかも結合複合体によりいくぶん影響される。即
ち、現在実施かつ理解されるような酵素方法は上記基準
(i) を満足しない。
【０００８】Ｂ．化学的方法‐２つの化学的方法がＯ‐
グリカンの放出のために実施されてきた。これらは以下
である：
グリカンの放出のために実施されてきた。これらは以下
である：
【０００９】(i)アルカリ溶液を使用する。Ｏ‐グリカ
ンを複合体に結合させるＯ‐グリコシド結合はアルカリ
で不安定であり、したがってアルカリ溶液はＯ‐グリカ
ンの放出に用いることができる。例えば、５０mM Ｎａ
ＯＨと共に４５℃で１６時間のインキュベーションが成
功裡に用いられてきた。この方法の確立かつ認容された
不利な点は、ほとんどのＯ‐グリカンがアルカリ不安定
性であることである。ペプチドに結合されるほとんどの
Ｏ‐グリカンは添付図面の図２で示された構造で結合さ
れている。アルカリによる開裂（図２参照）時に、還元
末端単糖は更にアルカリで分解される。このような分解
は大過剰の還元剤存在下でアルカリ誘導放出を行うこと
による還元末端残基の還元で防止できる。典型的には４
ＭＮａＢＨ４が用いられる。この還元では放出されるＯ
‐グリカンをアルジトール形に変換する（図２）。した
がって、過剰還元剤の存在又は非存在に関係なく、開裂
されたＯ‐グリカンは永続的に化学的変換された形（即
ち、天然化合物としてでない）で回収される。このため
この方法は前記基準(ii)を満足しない。
ンを複合体に結合させるＯ‐グリコシド結合はアルカリ
で不安定であり、したがってアルカリ溶液はＯ‐グリカ
ンの放出に用いることができる。例えば、５０mM Ｎａ
ＯＨと共に４５℃で１６時間のインキュベーションが成
功裡に用いられてきた。この方法の確立かつ認容された
不利な点は、ほとんどのＯ‐グリカンがアルカリ不安定
性であることである。ペプチドに結合されるほとんどの
Ｏ‐グリカンは添付図面の図２で示された構造で結合さ
れている。アルカリによる開裂（図２参照）時に、還元
末端単糖は更にアルカリで分解される。このような分解
は大過剰の還元剤存在下でアルカリ誘導放出を行うこと
による還元末端残基の還元で防止できる。典型的には４
ＭＮａＢＨ４が用いられる。この還元では放出されるＯ
‐グリカンをアルジトール形に変換する（図２）。した
がって、過剰還元剤の存在又は非存在に関係なく、開裂
されたＯ‐グリカンは永続的に化学的変換された形（即
ち、天然化合物としてでない）で回収される。このため
この方法は前記基準(ii)を満足しない。
【００１０】(ii) 無水ヒドラジンを使用する。Ｏ‐グ
リカンに関する科学文献中いくつかの報告は、Ｏ‐グリ
カンが無水糖タンパク質を無水ヒドラジンと共に高温
（典型的には１００℃以上）で数時間（典型的には１０
時間以上）インキュベートした後にペプチド複合体から
放出されることを示唆している。このような各報告は、
こうして放出されるいかなるＯ‐グリカンも、ヒドラジ
ンにより放出Ｏ‐グリカンの徹底した化学的分解及び変
換をうけることを更に示している。実際に、一般的な科
学的見解では、“Ｏ‐グリコシド結合グリカンのヒドラ
ジンに対する挙動はまだ解明されていない。しかしなが
ら、一部の結果はアルカリ安定結合が´ピーリング´(p
eeling) 反応を停止させるまでそれらがかなり分解され
ることを示す”〔J.Montreuil et al.,in 'Carbohydrat
e Analysis-A Practical Approach'（炭水化物分析‐実
施アプローチ),Ed.M.F.Chaplin及びJ.F.Kennedy,IRL Pr
ess,1986〕ことを示している。Rademacher及びDwek（欧
州特許出願第０，２１５，７６６Ａ２号明細書）の方法
において、無水ヒドラジンが糖タンパク質からグリカン
を放出させるために用いられる条件が規定されている
が、但しこれらの条件はＮ‐グリカンのみに関して議論
されている。しかもこれらの条件はＯ‐グリカンに関し
て適切でない。したがって一般的に、ヒドラジンの使用
は完全Ｏ‐グリカンを放出させる上で科学者により広く
考えられてはいない。要するに、現在実施かつ理解され
ているような前記方法はいずれも完全未変換Ｏ‐グリカ
ンの放出に適さないのである。
リカンに関する科学文献中いくつかの報告は、Ｏ‐グリ
カンが無水糖タンパク質を無水ヒドラジンと共に高温
（典型的には１００℃以上）で数時間（典型的には１０
時間以上）インキュベートした後にペプチド複合体から
放出されることを示唆している。このような各報告は、
こうして放出されるいかなるＯ‐グリカンも、ヒドラジ
ンにより放出Ｏ‐グリカンの徹底した化学的分解及び変
換をうけることを更に示している。実際に、一般的な科
学的見解では、“Ｏ‐グリコシド結合グリカンのヒドラ
ジンに対する挙動はまだ解明されていない。しかしなが
ら、一部の結果はアルカリ安定結合が´ピーリング´(p
eeling) 反応を停止させるまでそれらがかなり分解され
ることを示す”〔J.Montreuil et al.,in 'Carbohydrat
e Analysis-A Practical Approach'（炭水化物分析‐実
施アプローチ),Ed.M.F.Chaplin及びJ.F.Kennedy,IRL Pr
ess,1986〕ことを示している。Rademacher及びDwek（欧
州特許出願第０，２１５，７６６Ａ２号明細書）の方法
において、無水ヒドラジンが糖タンパク質からグリカン
を放出させるために用いられる条件が規定されている
が、但しこれらの条件はＮ‐グリカンのみに関して議論
されている。しかもこれらの条件はＯ‐グリカンに関し
て適切でない。したがって一般的に、ヒドラジンの使用
は完全Ｏ‐グリカンを放出させる上で科学者により広く
考えられてはいない。要するに、現在実施かつ理解され
ているような前記方法はいずれも完全未変換Ｏ‐グリカ
ンの放出に適さないのである。
【００１１】発明の概要
【００１２】本発明の一面によれば、糖複合体をヒドラ
ジン試薬の影響下におき（いこで、前記糖複合体は実質
上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒドラジン試薬は実
質上無水である）、実質上非還元かつ完全な形でＯ‐グ
リカンを後に回収しうるような方法で糖複合体からＯ‐
グリカンを放出させるように、糖複合体がヒドラジン試
薬の影響下におかれている条件をコントロールすること
からなる糖複合体からＯ‐グリカンを放出させるための
方法が提供される。
ジン試薬の影響下におき（いこで、前記糖複合体は実質
上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒドラジン試薬は実
質上無水である）、実質上非還元かつ完全な形でＯ‐グ
リカンを後に回収しうるような方法で糖複合体からＯ‐
グリカンを放出させるように、糖複合体がヒドラジン試
薬の影響下におかれている条件をコントロールすること
からなる糖複合体からＯ‐グリカンを放出させるための
方法が提供される。
【００１３】一態様において、本発明はＯ‐グリカンの
高収率を達成するために用いられる。本発明によれば、
高収率とは８５％以上と定義されるが、但し収率が実際
上有益であるかぎりこれより低くてもよい。
高収率を達成するために用いられる。本発明によれば、
高収率とは８５％以上と定義されるが、但し収率が実際
上有益であるかぎりこれより低くてもよい。
【００１４】糖複合体は場合によりヒドラジン試薬の影
響下におきかつエネルギー入力に付してもよい。このた
め例えば、糖複合体及びヒドラジン試薬は一緒にされ、
得られた反応混合物はいずれか適切な手段で加熱され
る。他の形のエネルギー入力も所望であれば用いてよい
（例えば、マイクロ波照射又は赤外線照射）。
響下におきかつエネルギー入力に付してもよい。このた
め例えば、糖複合体及びヒドラジン試薬は一緒にされ、
得られた反応混合物はいずれか適切な手段で加熱され
る。他の形のエネルギー入力も所望であれば用いてよい
（例えば、マイクロ波照射又は赤外線照射）。
【００１５】ヒドラジン試薬は、Ｏ‐グリカンを複合体
に結合させるＯ‐グリコシド結合の望ましい開裂を起こ
しうるのであればヒドラジン自体でも又はそのいずれか
の適切な誘導体もしくは化合物（例えば、関連塩）であ
ってもよい。ヒドラジン試薬は例えば液体形又は蒸気形
で用いられる。
に結合させるＯ‐グリコシド結合の望ましい開裂を起こ
しうるのであればヒドラジン自体でも又はそのいずれか
の適切な誘導体もしくは化合物（例えば、関連塩）であ
ってもよい。ヒドラジン試薬は例えば液体形又は蒸気形
で用いられる。
【００１６】一例として、本発明は、糖複合体から非還
元かつ完全Ｏ‐グリカンを放出させるための方法であっ
て、方法完全な形でＯ‐グリカンを後に回収しうるよう
な方法で複合体からＯ‐グリカンを放出させるような最
適条件下で実質上無塩かつ本質的に無水の糖複合体を主
に無水のヒドラジン試薬と共に加熱することからなるを
方法を提供する。
元かつ完全Ｏ‐グリカンを放出させるための方法であっ
て、方法完全な形でＯ‐グリカンを後に回収しうるよう
な方法で複合体からＯ‐グリカンを放出させるような最
適条件下で実質上無塩かつ本質的に無水の糖複合体を主
に無水のヒドラジン試薬と共に加熱することからなるを
方法を提供する。
【００１７】本明細書で用いられる“無塩”という用語
は、本発明による方法の実施（例えば、糖複合体からＯ
‐グリカンの放出）で何らかの許容しえない干渉をおこ
せる程度までには塩を含有していないことを意味する。
は、本発明による方法の実施（例えば、糖複合体からＯ
‐グリカンの放出）で何らかの許容しえない干渉をおこ
せる程度までには塩を含有していないことを意味する。
【００１８】本明細書で用いられる“無水”という用語
は、本発明による方法の実施（例えば、糖複合体からＯ
‐グリカンの放出）で何らかの許容しえない干渉をおこ
せる程度までには水を含有していないことを意味する。
加熱は微視的又は巨視的にいずれで行ってもよい。
は、本発明による方法の実施（例えば、糖複合体からＯ
‐グリカンの放出）で何らかの許容しえない干渉をおこ
せる程度までには水を含有していないことを意味する。
加熱は微視的又は巨視的にいずれで行ってもよい。
【００１９】一態様において、本発明の方法はヒドラジ
ン試薬の影響下におく前に糖複合体から塩を除去する工
程を含んでもよい。もう１つの態様において、本発明の
方法はヒドラジン試薬の影響下におく前に糖複合体から
水を除去する工程を含んでもよい。
ン試薬の影響下におく前に糖複合体から塩を除去する工
程を含んでもよい。もう１つの態様において、本発明の
方法はヒドラジン試薬の影響下におく前に糖複合体から
水を除去する工程を含んでもよい。
【００２０】本発明は完全かつ非還元Ｏ‐グリカンを単
離する工程を含んだ糖複合体からのＯ‐グリカンの放出
方法も提供する。放出後、いかなる残留未反応ヒドラジ
ン試薬も、放出された全部のＯ‐グリカンを未分別プー
ルとして残しておくため除去されることが好ましい。ク
ロマトグラフィー操作が、Ｏ‐グリカンから複合体又は
複合体由来物質を実質的に除去し、かかる物質のない未
分別プールとしてＯ‐グリカンを残しておくために行わ
れることも好ましい。
離する工程を含んだ糖複合体からのＯ‐グリカンの放出
方法も提供する。放出後、いかなる残留未反応ヒドラジ
ン試薬も、放出された全部のＯ‐グリカンを未分別プー
ルとして残しておくため除去されることが好ましい。ク
ロマトグラフィー操作が、Ｏ‐グリカンから複合体又は
複合体由来物質を実質的に除去し、かかる物質のない未
分別プールとしてＯ‐グリカンを残しておくために行わ
れることも好ましい。
【００２１】あるグリカンの場合には、ヒドラジンとの
反応結果として生じるあらゆる遊離アミノ基をＮ‐アセ
チル化させるＮ‐アセチル化反応を行うことが必要かも
しれない。関与するグリカンの全構造の前知識なしで
は、このようなＮ‐アセチル化が必要かどうかを事前に
予想することは困難である。したがって、すべてのケー
スにおいてこの反応を予防処置として行うことが好まし
い。
反応結果として生じるあらゆる遊離アミノ基をＮ‐アセ
チル化させるＮ‐アセチル化反応を行うことが必要かも
しれない。関与するグリカンの全構造の前知識なしで
は、このようなＮ‐アセチル化が必要かどうかを事前に
予想することは困難である。したがって、すべてのケー
スにおいてこの反応を予防処置として行うことが好まし
い。
【００２２】Ｎ‐アセチル化された単離Ｏ‐グリカン
は、反応中に生成するアセトヒドラゾン誘導体を開裂し
て完全未変換Ｏ‐グリカンを再生成させるため、酸性条
件下（固定形の酸、鉱酸又はルイス酸の使用による）に
おかれることも好ましい。
は、反応中に生成するアセトヒドラゾン誘導体を開裂し
て完全未変換Ｏ‐グリカンを再生成させるため、酸性条
件下（固定形の酸、鉱酸又はルイス酸の使用による）に
おかれることも好ましい。
【００２３】本発明は、Ｏ‐グリカンの単離も含むＯ‐
グリカンの放出方法も提供し、その方法は、糖複合体を
ヒドラジン試薬の影響下におき（ここで、前記糖複合体
は実質上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒドラジン試
薬は実質上無水である）、実質上非還元かつ完全な形で
Ｏ‐グリカンを後に回収しうるような方法で糖複合体か
らＯ‐グリカンを放出させるように、糖複合体がヒドラ
ジン試薬の影響下におかれている条件をコントロール
し、クロマトグラフィー物質にＯ‐グリカン（及びその
いずれかの誘導体）を吸着させるために、糖複合体をヒ
ドラジン試薬の影響下におくことで形成された反応混合
物を第一クロマトグラフィー物質と接触させ、クロマト
グラフィー物質を溶出に付し（ここで、前記吸着及び溶
出は複合体及び／又は複合体由来物質からＯ‐グリカン
（及びそのいずれかの誘導体）を分離させかつヒドラジ
ン試薬を除去させるように行われる）、遊離第一アミノ
酸基を有するＯ‐グリカンの誘導体が存在する場合には
その誘導体から非還元グリカンを得るためＮ‐アセチル
化反応を行い、Ｎ‐アセチル化反応が行われた方法で必
要とされる場合にはＮ‐アセチル化反応後に得られた反
応混合物から一価及び／又は二価陽イオンを除去し、第
二クロマトグラフィー物質への吸着及びそれからの選択
的溶出によりかかる反応混合物からＯ‐グリカン又はそ
の誘導体を分離し、そしていずれのＯ‐グリカン誘導体
も非還元形に変換する工程を含んでなるもの、である。
グリカンの放出方法も提供し、その方法は、糖複合体を
ヒドラジン試薬の影響下におき（ここで、前記糖複合体
は実質上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒドラジン試
薬は実質上無水である）、実質上非還元かつ完全な形で
Ｏ‐グリカンを後に回収しうるような方法で糖複合体か
らＯ‐グリカンを放出させるように、糖複合体がヒドラ
ジン試薬の影響下におかれている条件をコントロール
し、クロマトグラフィー物質にＯ‐グリカン（及びその
いずれかの誘導体）を吸着させるために、糖複合体をヒ
ドラジン試薬の影響下におくことで形成された反応混合
物を第一クロマトグラフィー物質と接触させ、クロマト
グラフィー物質を溶出に付し（ここで、前記吸着及び溶
出は複合体及び／又は複合体由来物質からＯ‐グリカン
（及びそのいずれかの誘導体）を分離させかつヒドラジ
ン試薬を除去させるように行われる）、遊離第一アミノ
酸基を有するＯ‐グリカンの誘導体が存在する場合には
その誘導体から非還元グリカンを得るためＮ‐アセチル
化反応を行い、Ｎ‐アセチル化反応が行われた方法で必
要とされる場合にはＮ‐アセチル化反応後に得られた反
応混合物から一価及び／又は二価陽イオンを除去し、第
二クロマトグラフィー物質への吸着及びそれからの選択
的溶出によりかかる反応混合物からＯ‐グリカン又はそ
の誘導体を分離し、そしていずれのＯ‐グリカン誘導体
も非還元形に変換する工程を含んでなるもの、である。
【００２４】例えば、Ｎ‐アセチル化反応は第一クロマ
トグラフィー物質からの脱着前又は後のいずれで行って
もよい。
トグラフィー物質からの脱着前又は後のいずれで行って
もよい。
【００２５】更に例えば、第二クロマトグラフィー物質
から溶出後に得られるＯ‐グリカンの誘導体がアセトヒ
ドラゾン誘導体である場合には、マイルドな酸性条件が
非還元Ｏ‐グリカンを生成させるために用いられる。
から溶出後に得られるＯ‐グリカンの誘導体がアセトヒ
ドラゾン誘導体である場合には、マイルドな酸性条件が
非還元Ｏ‐グリカンを生成させるために用いられる。
【００２６】発明の具体的な説明 本発明は糖複合体に全般的に適用可能であるが、しかし
ながら以下では、特定糖複合体の具体例に言及する。糖
複合体の一例は、同様にＯ‐グリカンを含有した科学文
献で研究用のモデル糖タンパク質として許容される牛フ
ェツインである。
ながら以下では、特定糖複合体の具体例に言及する。糖
複合体の一例は、同様にＯ‐グリカンを含有した科学文
献で研究用のモデル糖タンパク質として許容される牛フ
ェツインである。
【００２７】糖複合体をヒドラジン試薬の影響下におく
（即ち、ヒドラジン分解）前に、糖複合体及びヒドラジ
ン試薬は下記のように調製されることが好ましい。糖複
合体は例えば適切な系で透析、ゲル濾過又はクロマトグ
ラフィーにより本質的に無塩化される。無塩化される
と、糖複合体は例えば凍結乾燥で本質的に無水化される
が、含水率は２５℃で２５ミリバールの凍結乾燥条件下
において少なくとも平衡状態に達するまで減少される。
ヒドラジン試薬の含水率も同様に関連し、４容量／容量
％を超えるべきではない。このため最も商業的に利用さ
れる無水ヒドラジン試薬が適切であるが、但しヒドラジ
ン試薬の乾燥は多数報告されたプロセスのうち１つで行
うことができる。次いで適切なヒドラジン試薬は気密容
器内で適切に調製されたサンプルに加えられる。糖複合
体とヒドラジン試薬の反応は微視的又は巨視的のいずれ
かでエネルギー入力により、例えば温度を高めることに
より開始することができる。いかなるエネルギー入力方
法の場合でも、反応に関する最適条件は様々な実験的ア
プローチから求めることができる。本開示における反応
を開始させる好ましい方法では温度を定常状態まで上昇
させる。
（即ち、ヒドラジン分解）前に、糖複合体及びヒドラジ
ン試薬は下記のように調製されることが好ましい。糖複
合体は例えば適切な系で透析、ゲル濾過又はクロマトグ
ラフィーにより本質的に無塩化される。無塩化される
と、糖複合体は例えば凍結乾燥で本質的に無水化される
が、含水率は２５℃で２５ミリバールの凍結乾燥条件下
において少なくとも平衡状態に達するまで減少される。
ヒドラジン試薬の含水率も同様に関連し、４容量／容量
％を超えるべきではない。このため最も商業的に利用さ
れる無水ヒドラジン試薬が適切であるが、但しヒドラジ
ン試薬の乾燥は多数報告されたプロセスのうち１つで行
うことができる。次いで適切なヒドラジン試薬は気密容
器内で適切に調製されたサンプルに加えられる。糖複合
体とヒドラジン試薬の反応は微視的又は巨視的のいずれ
かでエネルギー入力により、例えば温度を高めることに
より開始することができる。いかなるエネルギー入力方
法の場合でも、反応に関する最適条件は様々な実験的ア
プローチから求めることができる。本開示における反応
を開始させる好ましい方法では温度を定常状態まで上昇
させる。
【００２８】経時的に様々な温度下における収率の実験
測定によれば、Ｏ‐グリカンを放出させる糖複合体とヒ
ドラジン試薬の反応は一次反応速度論に従うことが本発
明により示された。
測定によれば、Ｏ‐グリカンを放出させる糖複合体とヒ
ドラジン試薬の反応は一次反応速度論に従うことが本発
明により示された。
【００２９】したがって、実験結果の分析に関する好ま
しい理論的骨格はアレニウス式であるが、これは反応速
度の温度依存性を一次近似に規定するために普通用いら
れる。この式は下記のとおりである： ｋ＝Ａｅ-EACT/RT 上記式中ｋ＝反応速度 Ａ＝アレニウス定数 Ｒ＝気体定数 ＥACT ＝活性化エネルギー Ｔ＝温度
しい理論的骨格はアレニウス式であるが、これは反応速
度の温度依存性を一次近似に規定するために普通用いら
れる。この式は下記のとおりである： ｋ＝Ａｅ-EACT/RT 上記式中ｋ＝反応速度 Ａ＝アレニウス定数 Ｒ＝気体定数 ＥACT ＝活性化エネルギー Ｔ＝温度
【００３０】Ｏ‐グリカンが放出され、しかる後放出さ
れたＯ‐グリカンが追加（分解）反応に付されるような
いかなる化学反応においても、それは下記アレニウス式
から求められる： 完全形で放出されるＯ‐グリカンのモル分率＝
れたＯ‐グリカンが追加（分解）反応に付されるような
いかなる化学反応においても、それは下記アレニウス式
から求められる： 完全形で放出されるＯ‐グリカンのモル分率＝
【数２】
【００３１】上記式中ｅ＝自然対数 Ａro＝Ｏ‐グリカンの放出に関するアレニウス定数 Ａdo＝Ｏ‐グリカンの分解に関するアレニウス定数 ＥR O ＝Ｏ‐グリカンの放出に関する活性化エネルギー ＥD O ＝Ｏ‐グリカンの分解に関する活性化エネルギー Ｒ＝気体定数 Ｔ＝温度 ｔ＝時間
【００３２】条件は完全Ｏ‐グリカンの前選択収率（例
えば、８５％以上のような収率）を達成しうるように上
記式に従い選択される。
えば、８５％以上のような収率）を達成しうるように上
記式に従い選択される。
【００３３】好ましい収率は８５％以上のような高収率
であるが、更に低い収率が許容されてもよく、このよう
に低い収率を導く条件も前記式に従い選択してよい。
であるが、更に低い収率が許容されてもよく、このよう
に低い収率を導く条件も前記式に従い選択してよい。
【００３４】完全Ｏ‐グリカンの放出に関して適した温
度及び時間の条件は、完全Ｏ‐グリカンの放出が温度の
みの関数として測定される実験から求めることができる
が、このような実験ではＡro、Ａdo、ＥR O 、ＥD O の
決定が可能である。かかる実験の結果は添付図面の図３
で示されるが、その場合に完全Ｏ‐グリカンの相対的放
出率は様々な温度で８時間適切なヒドラジンと共に糖タ
ンパク質牛フェツインのインキュベート後で測定され
る。
度及び時間の条件は、完全Ｏ‐グリカンの放出が温度の
みの関数として測定される実験から求めることができる
が、このような実験ではＡro、Ａdo、ＥR O 、ＥD O の
決定が可能である。かかる実験の結果は添付図面の図３
で示されるが、その場合に完全Ｏ‐グリカンの相対的放
出率は様々な温度で８時間適切なヒドラジンと共に糖タ
ンパク質牛フェツインのインキュベート後で測定され
る。
【００３５】図３で示されたデータから、ヒドラジン試
薬が完全Ｏ‐グリカンを高収率で放出させるために使用
でき、かつ、１組の完全Ｏ‐グリカン最適放出（８５％
以上）がヒドラジン試薬と共に６５℃で８時間以上のイ
ンキュベーションにより達成されることは明らかであ
る。完全Ｏ‐グリカンの高収率放出のため、更に低い温
度における反応ではより長いインキュベーション時間を
要し、温度が高くなると短い時間で済む。より高い温度
でより長い時間であるとＯ‐グリカンを回収でき、ある
分画のみが完全なそれとなる。いかなる温度でもインキ
ュベート時間は前記パラメーターの測定後にアレニウス
式から大体計算でき、こうして計算された条件は当業者
によって実験的に容易に確認されうる。同様の分析が他
の形の反応開始に関する反応条件を規定するために用い
てもよい。
薬が完全Ｏ‐グリカンを高収率で放出させるために使用
でき、かつ、１組の完全Ｏ‐グリカン最適放出（８５％
以上）がヒドラジン試薬と共に６５℃で８時間以上のイ
ンキュベーションにより達成されることは明らかであ
る。完全Ｏ‐グリカンの高収率放出のため、更に低い温
度における反応ではより長いインキュベーション時間を
要し、温度が高くなると短い時間で済む。より高い温度
でより長い時間であるとＯ‐グリカンを回収でき、ある
分画のみが完全なそれとなる。いかなる温度でもインキ
ュベート時間は前記パラメーターの測定後にアレニウス
式から大体計算でき、こうして計算された条件は当業者
によって実験的に容易に確認されうる。同様の分析が他
の形の反応開始に関する反応条件を規定するために用い
てもよい。
【００３６】以上で、糖複合体からＯ‐グリカンをうま
く放出させる反応は完成である。更に未放出グリカンの
研究及び分析のために、グリカンは未反応ヒドラジン試
薬及び複合体又は複合体由来物質から最初に単離される
ことが好ましい。インキュベート後、未反応ヒドラジン
試薬は２通りのうち１つで除去できる。第一は減圧蒸発
しかる後混和性物質（例えば無水トルエン）との反復共
蒸発による。第二の及び本明細書で記載される好ましい
方法は、クロマトグラフィー媒体への反応混合物中グリ
カンの吸着によるが、そのうち本明細書で好ましい媒体
はセルロースベース物質であり、それによってＯ‐グリ
カンの反復操作がなく、放出Ｏ‐グリカン収率の選択的
低下及び汚染物質の導入なしに、未反応ヒドラジン試薬
を除去しかつ放出Ｏ‐グリカンから複合体又は複合体由
来物質も実質上除去しうる。これは下記のように行われ
る：
く放出させる反応は完成である。更に未放出グリカンの
研究及び分析のために、グリカンは未反応ヒドラジン試
薬及び複合体又は複合体由来物質から最初に単離される
ことが好ましい。インキュベート後、未反応ヒドラジン
試薬は２通りのうち１つで除去できる。第一は減圧蒸発
しかる後混和性物質（例えば無水トルエン）との反復共
蒸発による。第二の及び本明細書で記載される好ましい
方法は、クロマトグラフィー媒体への反応混合物中グリ
カンの吸着によるが、そのうち本明細書で好ましい媒体
はセルロースベース物質であり、それによってＯ‐グリ
カンの反復操作がなく、放出Ｏ‐グリカン収率の選択的
低下及び汚染物質の導入なしに、未反応ヒドラジン試薬
を除去しかつ放出Ｏ‐グリカンから複合体又は複合体由
来物質も実質上除去しうる。これは下記のように行われ
る：
【００３７】適切な抽出溶媒（その例はブタノール、エ
タノール及び酢酸（４：１：０．０１〜０．６(v/v/v)
）の間で変化）中で平衡化された微結晶セルロース
（その市販例はアビセル(Avicel)である）のカラムに、
反応混合物が適用される。Ｏ‐グリカンはセルロース粒
子に吸着され、ヒドラジン試薬は抽出溶媒を用いて溶出
され（典型的には溶媒の３回カラム洗浄が必要であ
る）、Ｏ‐グリカンはメタノール及び水又は望ましい水
性緩衝液（典型的には２〜３倍カラム容量）を用いて脱
着（及びこうして溶出）される。
タノール及び酢酸（４：１：０．０１〜０．６(v/v/v)
）の間で変化）中で平衡化された微結晶セルロース
（その市販例はアビセル(Avicel)である）のカラムに、
反応混合物が適用される。Ｏ‐グリカンはセルロース粒
子に吸着され、ヒドラジン試薬は抽出溶媒を用いて溶出
され（典型的には溶媒の３回カラム洗浄が必要であ
る）、Ｏ‐グリカンはメタノール及び水又は望ましい水
性緩衝液（典型的には２〜３倍カラム容量）を用いて脱
着（及びこうして溶出）される。
【００３８】こうして得られたＯ‐グリカンは遊離第一
アミノ基部分を有しているかもしれない。したがって、
これらの基は真に非還元のＯ‐グリカンを生成するため
所望であればＮ‐アセチル化できる。様々な方法がこの
ようなＮ‐アセチル化を行うために報告されている。好
ましい態様において、Ｏ‐グリカンは、メタノール／水
混合液又はｐＨ５．０の水性酢酸ナトリウム緩衝液のい
ずれかの中における、過剰無水酢酸との反応でＮ‐アセ
チル化される。このようなＮ‐アセチル化は効率低下な
しに０〜３７℃の温度で行えるが、定量的Ｎ‐アセチル
化は３０分間以内でおきる。メタノール／水又は酢酸ナ
トリウム溶液の使用は、ヒドラジン試薬除去用セルロー
スカラムからＯ‐グリカンを溶出させるのに用いること
ができ、その結果Ｎ‐アセチル化前にあらゆるサンプル
操作を回避できるので好ましい。一価陽イオン含有水性
緩衝液が用いられる場合には、このような陽イオンはプ
ロトン形の強陽イオン交換樹脂にＮ‐アセチル化混合物
を通して除去される。様々なこのような樹脂が利用可能
かつ適切であるが、好ましい樹脂はスルホン酸官能基を
有するスチレン／ジビニルベンゼンポリマー格子、ダウ
エックス(Dowex)ＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）である。一価
及び／又は二価陽イオン含有水性緩衝液が用いられる場
合には、かかる双方のイオンを除去するために十分な樹
脂を含有した混合層カラムが用いられる。これは典型的
には二価陽イオンを除去するためキレックス(Chelex)１
００（Ｎａ+ ）及び一価陽イオンを除去するためダウエ
ックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の使用を要する。Ｎ‐ア
セチル化が陽イオンの非存在下で行われる場合には、か
かる陽イオン交換クロマトグラフィーは不要である。
アミノ基部分を有しているかもしれない。したがって、
これらの基は真に非還元のＯ‐グリカンを生成するため
所望であればＮ‐アセチル化できる。様々な方法がこの
ようなＮ‐アセチル化を行うために報告されている。好
ましい態様において、Ｏ‐グリカンは、メタノール／水
混合液又はｐＨ５．０の水性酢酸ナトリウム緩衝液のい
ずれかの中における、過剰無水酢酸との反応でＮ‐アセ
チル化される。このようなＮ‐アセチル化は効率低下な
しに０〜３７℃の温度で行えるが、定量的Ｎ‐アセチル
化は３０分間以内でおきる。メタノール／水又は酢酸ナ
トリウム溶液の使用は、ヒドラジン試薬除去用セルロー
スカラムからＯ‐グリカンを溶出させるのに用いること
ができ、その結果Ｎ‐アセチル化前にあらゆるサンプル
操作を回避できるので好ましい。一価陽イオン含有水性
緩衝液が用いられる場合には、このような陽イオンはプ
ロトン形の強陽イオン交換樹脂にＮ‐アセチル化混合物
を通して除去される。様々なこのような樹脂が利用可能
かつ適切であるが、好ましい樹脂はスルホン酸官能基を
有するスチレン／ジビニルベンゼンポリマー格子、ダウ
エックス(Dowex)ＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）である。一価
及び／又は二価陽イオン含有水性緩衝液が用いられる場
合には、かかる双方のイオンを除去するために十分な樹
脂を含有した混合層カラムが用いられる。これは典型的
には二価陽イオンを除去するためキレックス(Chelex)１
００（Ｎａ+ ）及び一価陽イオンを除去するためダウエ
ックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の使用を要する。Ｎ‐ア
セチル化が陽イオンの非存在下で行われる場合には、か
かる陽イオン交換クロマトグラフィーは不要である。
【００３９】本方法のこの段階において、いかなる残留
する微量の複合体又は複合体由来物質も２ステップクロ
マトグラフィープロセスによりＯ‐グリカン含有Ｎ‐ア
セチル化混合物から除去される。無陽イオン混合物は最
初（予めメタノールで洗浄され、しかる後水中で平衡化
された）逆相カートリッジに通される。このようなカー
トリッジの例はＣ18結合シリカ逆相カートリッジであ
る。通過後カートリッジは（収率を最大にするため）１
倍カラム容量で１回洗浄され、溶出液及び洗液が同時プ
ールされる。次いでこのプールは実質的に前記原理に従
いセルロースカラムクロマトグラフィーに付される。予
め水及びメタノールで連続洗浄され、しかる後ブタノー
ル、エタノール、水溶媒（組成４：１：＜０．５）で十
分平衡化された微結晶セルロースのカラムに、逆相カー
トリッジ（例えばＣ18カートリッジ）から得られたサン
プルが４：１：＜０．５(v/v/v) のブタノール、エタノ
ール、水組成溶媒で適用される。すべてのサンプルを充
填した後、いかなる複合体又は複合体由来物質もブタノ
ール、エタノール、水溶媒（典型的組成４：１：０．５
v/v/v）又はトルエン、メタノール、酢酸溶媒（典型的
組成３：１：１ v/v/v）の使用により吸着されたＯ‐グ
リカンから溶出される。典型的には、３〜５倍カラム容
量の洗浄液がこのような物質をうまく除去する上で必要
である。次いでＯ‐グリカンはメタノール、水又は望ま
しい水性緩衝液での溶出により脱着され、こうして溶出
されたＯ‐グリカンが集められる。
する微量の複合体又は複合体由来物質も２ステップクロ
マトグラフィープロセスによりＯ‐グリカン含有Ｎ‐ア
セチル化混合物から除去される。無陽イオン混合物は最
初（予めメタノールで洗浄され、しかる後水中で平衡化
された）逆相カートリッジに通される。このようなカー
トリッジの例はＣ18結合シリカ逆相カートリッジであ
る。通過後カートリッジは（収率を最大にするため）１
倍カラム容量で１回洗浄され、溶出液及び洗液が同時プ
ールされる。次いでこのプールは実質的に前記原理に従
いセルロースカラムクロマトグラフィーに付される。予
め水及びメタノールで連続洗浄され、しかる後ブタノー
ル、エタノール、水溶媒（組成４：１：＜０．５）で十
分平衡化された微結晶セルロースのカラムに、逆相カー
トリッジ（例えばＣ18カートリッジ）から得られたサン
プルが４：１：＜０．５(v/v/v) のブタノール、エタノ
ール、水組成溶媒で適用される。すべてのサンプルを充
填した後、いかなる複合体又は複合体由来物質もブタノ
ール、エタノール、水溶媒（典型的組成４：１：０．５
v/v/v）又はトルエン、メタノール、酢酸溶媒（典型的
組成３：１：１ v/v/v）の使用により吸着されたＯ‐グ
リカンから溶出される。典型的には、３〜５倍カラム容
量の洗浄液がこのような物質をうまく除去する上で必要
である。次いでＯ‐グリカンはメタノール、水又は望ま
しい水性緩衝液での溶出により脱着され、こうして溶出
されたＯ‐グリカンが集められる。
【００４０】本方法のこの段階において、セルロースカ
ラムからＯ‐グリカンを溶出させるために用いられた前
記場合と関連した組成の溶媒中に（元来糖複合体に結合
していた）完全Ｏ‐グリカンを含有した溶液が存在す
る。この段階におけるＯ‐グリカンは、かかるＯ‐グリ
カンの真に非還元のオリゴ糖及びアセトヒドラゾン誘導
体の混合物からなる。アセトヒドラゾンの開裂によるア
セトヒドラゾン誘導体からの真に非還元のＯ‐グリカン
への変換は、固定されているか否かにかかわらないマイ
ルドな酸、鉱酸又はルイス酸に、Ｏ‐グリカン混合物を
接触させることで行われる。様々なこのような方法が以
前報告ており、通常それらは満足できる。Ｏ‐グリカン
は通常蒸発により溶媒から除去され、水に再懸濁され、
更に調べられる前に凍結乾燥される。
ラムからＯ‐グリカンを溶出させるために用いられた前
記場合と関連した組成の溶媒中に（元来糖複合体に結合
していた）完全Ｏ‐グリカンを含有した溶液が存在す
る。この段階におけるＯ‐グリカンは、かかるＯ‐グリ
カンの真に非還元のオリゴ糖及びアセトヒドラゾン誘導
体の混合物からなる。アセトヒドラゾンの開裂によるア
セトヒドラゾン誘導体からの真に非還元のＯ‐グリカン
への変換は、固定されているか否かにかかわらないマイ
ルドな酸、鉱酸又はルイス酸に、Ｏ‐グリカン混合物を
接触させることで行われる。様々なこのような方法が以
前報告ており、通常それらは満足できる。Ｏ‐グリカン
は通常蒸発により溶媒から除去され、水に再懸濁され、
更に調べられる前に凍結乾燥される。
【００４１】上記方法により、複合体又は複合体由来物
質に汚染されていない完全非還元Ｏ‐グリカンは、Ｏ‐
グリコシド結合で複合体に結合されたＯ‐グリカンを含
有した糖複合体から高収率で得られる。最終プール中に
おける複合体又は複合体由来物質の存在は様々な技術で
評価できるが、その中の１つは酸性加水分解（６ＮＨＣ
ｌ、１０４℃、６０分間）しかる後ペプチド物質のニン
ヒドリンに基づく定量である；これは当業者に利用可能
な標準的操作である。
質に汚染されていない完全非還元Ｏ‐グリカンは、Ｏ‐
グリコシド結合で複合体に結合されたＯ‐グリカンを含
有した糖複合体から高収率で得られる。最終プール中に
おける複合体又は複合体由来物質の存在は様々な技術で
評価できるが、その中の１つは酸性加水分解（６ＮＨＣ
ｌ、１０４℃、６０分間）しかる後ペプチド物質のニン
ヒドリンに基づく定量である；これは当業者に利用可能
な標準的操作である。
【００４２】Ｏ‐グリカンの完全性及び定量は様々な技
術で評価できる。本発明に関して用いられる２つの例は
以下である： （１）Ｏ‐グリカンから得られる単糖類の組成分析 （２）Ｏ‐グリカンの還元放射性同位元素標識（例え
ば、トリチウム化）アルジトールの高電圧ペーパー電気
泳動及び高分解能ゲル透過クロマトグラフィー
術で評価できる。本発明に関して用いられる２つの例は
以下である： （１）Ｏ‐グリカンから得られる単糖類の組成分析 （２）Ｏ‐グリカンの還元放射性同位元素標識（例え
ば、トリチウム化）アルジトールの高電圧ペーパー電気
泳動及び高分解能ゲル透過クロマトグラフィー
【００４３】本発明は、単なる例示として添付図面及び
以下の例１〜３を参照して記載される。例１ ：牛血清フェツインからのＯ‐グリカンの放出及び
単離 この例において、Ｏ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから放出させ、こうして回収されたＯ‐グリカンを
完全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清から
のフェツインはシグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co
mpany)（Poole ，Dorset，英国）から購入した。糖タン
パク質１mgをガラス蒸留水に対する十分なマイクロフロ
ー透析により無塩化した。透析後、溶液はエドワーズ・
モジュルヨ(Edwards Modulyo) 凍結乾燥機を用い２５ミ
リバール圧で作動させて透明ガラス反応管内で凍結乾燥
させた。凍結乾燥された糖タンパク質に無水ヒドラジン
（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５mlを加えた。管
を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、しかる後６５
℃で平衡化されたオーブンに８時間いれた。
以下の例１〜３を参照して記載される。例１ ：牛血清フェツインからのＯ‐グリカンの放出及び
単離 この例において、Ｏ‐グリカンを糖タンパク質牛フェツ
インから放出させ、こうして回収されたＯ‐グリカンを
完全性、収率及び純度に関して調べた。牛胎児血清から
のフェツインはシグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co
mpany)（Poole ，Dorset，英国）から購入した。糖タン
パク質１mgをガラス蒸留水に対する十分なマイクロフロ
ー透析により無塩化した。透析後、溶液はエドワーズ・
モジュルヨ(Edwards Modulyo) 凍結乾燥機を用い２５ミ
リバール圧で作動させて透明ガラス反応管内で凍結乾燥
させた。凍結乾燥された糖タンパク質に無水ヒドラジン
（相対含水率２．０％v/v 以下）０．５mlを加えた。管
を無水かつ無酸素雰囲気下室温で密封し、しかる後６５
℃で平衡化されたオーブンに８時間いれた。
【００４４】次いで、未反応ヒドラジンを下記のように
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
カラムクロマトグラフィーにより管内において反応混合
物から除去した。微結晶セルロース（アビセル）の前調
製前平衡化（組成４：１：０．１５v/v/v のブタノー
ル、エタノール、酢酸溶媒）カラム（層容量２ml）の頂
部にフローなしで平衡化溶媒４mlを加えた。次いで管内
から反応混合物（即ち、ヒドラジン分解産物）（０．５
ml）をカラムに加え、しかる後すべてフローなしに十分
ミックスして単一相を形成させた。次いで液体フローを
始め、すべての液体がカラムを通過したとき、カラムを
３倍カラム容量の平衡化溶媒で洗浄した。次いでカラム
を１倍カラム容量のメタノールしかる後２倍カラム容量
の水性酢酸ナトリウム（２００mM、ｐＨ５．０）で洗浄
した。再Ｎ‐アセチル化はプールされた溶出液への０．
５ml無水酢酸添加及び室温で１時間のインキュベートに
より行った。
【００４５】次いで得られたＮ‐アセチル化混合物を容
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、２倍容量のメタノ
ール及び５倍容量の水による洗浄で予め調整されたＣ18
逆相カートリッジ〔米国マサチューセッツ州ミルフォー
ド，ミリポア社ウォーターズ事業部(Waters Division o
f MilliporeCorporation)のウォーターズＳＥＰ‐ＰＡ
ＫＣ18カートリッジ〕に通した。18カートリッジを２倍
容量の水で洗浄し、溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ
５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカ
ラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、
溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン
膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガ
ラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖分画を
ニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含有率に関
して分析した（結果は下記表１で示されている）。一部
の非還元オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で放射
性同位元素標識し、こうして得られた放射性同位元素標
識オリゴ糖アルジトールを荷電及びサイズに関して分析
した。結果は添付図面の図４及び図９で示されている。
量２．２mlのダウエックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）カラ
ムに通し、しかる後カラムを５倍カラム容量の蒸留水で
洗浄した。溶出液及び洗液を合わせ、２倍容量のメタノ
ール及び５倍容量の水による洗浄で予め調整されたＣ18
逆相カートリッジ〔米国マサチューセッツ州ミルフォー
ド，ミリポア社ウォーターズ事業部(Waters Division o
f MilliporeCorporation)のウォーターズＳＥＰ‐ＰＡ
ＫＣ18カートリッジ〕に通した。18カートリッジを２倍
容量の水で洗浄し、溶出液及び洗液を合わせ、しかる後
ロータリー式に蒸発乾固させた。次いで全サンプルをガ
ラス蒸留水０．３mlにいれ、セルロース層上にブタノー
ル、メタノール（４：１v/v ）２．０mlを含有した前調
製前平衡化微結晶セルロースのカラム（０．８×５cm）
の頂部にフローなしに適用した。水層及びブタノール／
エタノール相を単一な均一相になるまで十分にミックス
し、しかる後フローを始めた。すべての液体が通過した
後、カラムを５倍カラム容量のブタノール、エタノー
ル、水溶媒（組成４：１：０．５v/v/v ）で洗浄した。
次いでカラムを１倍カラム容量のメタノール及び２倍カ
ラム容量の蒸留水で洗浄した。メタノール及び水分画を
同時プールし、ロータリー蒸発させ、１mM酢酸銅(II)水
溶液０．２mlにいれ、室温で３０分間インキュベート
し、キレックス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ
５０Ｘ１２（Ｈ+ ）の各樹脂３００μＬ含有タンデムカ
ラムに通した。カラムを５倍カラム容量の水で洗浄し、
溶出液及び洗液を同時プールし、（０．２μM テフロン
膜フィルター）濾過し、ロータリー式に蒸発乾固し、ガ
ラス蒸留水１mlにいれた。一部の非還元オリゴ糖分画を
ニンヒドリン法により単糖組成及びアミノ酸含有率に関
して分析した（結果は下記表１で示されている）。一部
の非還元オリゴ糖をアルカリ性ＮａＢ３Ｈ４還元で放射
性同位元素標識し、こうして得られた放射性同位元素標
識オリゴ糖アルジトールを荷電及びサイズに関して分析
した。結果は添付図面の図４及び図９で示されている。
【００４６】例２：ブタ下顎ムチンからのＯ‐グリカン
の放出及び単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくブ
タ下顎ムチンであった。単糖組成及びアミノ酸含有率に
関する分析結果は下記表１で示されている。荷電及びサ
イズ分析の結果は添付図面の図６及び図７で各々示され
ている。
の放出及び単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくブ
タ下顎ムチンであった。単糖組成及びアミノ酸含有率に
関する分析結果は下記表１で示されている。荷電及びサ
イズ分析の結果は添付図面の図６及び図７で各々示され
ている。
【００４７】例３：アシアログロボシドからのＯ‐グリ
カンの放出及び単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくア
シアログロボシドであった。単糖組成及びアミノ酸含有
率に関する分析結果は下記表１で示されている。サイズ
分析の結果は添付図面の図８で示されている。これら分
析の全体的結論は、ペプチド物質以外の汚染物質が検出
できず、ペプチドのレベルが１０％（重量）以下であ
り、Ｏ‐グリカンが完全であって高収率（例えば８５％
以上）で回収されることである。
カンの放出及び単離 この例では本質的に同様の操作が例１で示されたとおり
に行われたが、但し糖複合体は牛フェツインではなくア
シアログロボシドであった。単糖組成及びアミノ酸含有
率に関する分析結果は下記表１で示されている。サイズ
分析の結果は添付図面の図８で示されている。これら分
析の全体的結論は、ペプチド物質以外の汚染物質が検出
できず、ペプチドのレベルが１０％（重量）以下であ
り、Ｏ‐グリカンが完全であって高収率（例えば８５％
以上）で回収されることである。
【００４８】 表１ Ｎ‐アセチル アミノ酸の ガラクトサミンの 全含有量* 全含有量* (nmol) (μg) 出発牛フェツイン 69 1000 牛フェツイン 60 74 Ｏ‐グリカンプール 出発ブタ下顎ムチン 603 1000 ブタ下顎ムチン 561 56 Ｏ‐グリカンプール 出発アシアログロボシド 963 0 アシアログロボシド 831 0 Ｏ‐グリカンプール
【００４９】*Ｏ‐グリカンの含有量はＮ‐アセチルガ
ラクトサミンの含有量に直接関連していることが通常認
められる。したがって、Ｎ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は記載された方法を行った後に得られたグリカン
プール及び出発糖複合体双方におけるＯ‐グリカンの好
ましい測定値として用いられる。
ラクトサミンの含有量に直接関連していることが通常認
められる。したがって、Ｎ‐アセチルガラクトサミンの
含有量は記載された方法を行った後に得られたグリカン
プール及び出発糖複合体双方におけるＯ‐グリカンの好
ましい測定値として用いられる。
【００５０】本発明に従い上記糖複合体を処理すること
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｏ‐グ
リカンを高収率で回収しうることが確立された。完全Ｏ
‐グリカンが高収率でかつ汚染物質なしに回収されるプ
ロセス順序が規定されたが、この順序は容易に自動化し
うるようなものである。これがそうであることは、糖複
合体の凍結乾燥サンプルを回収して、かつ、その糖複合
体と前に連結していた完全Ｏ‐グリカンを首尾よく運搬
しうる機械を構築し、動作させることによって立証され
る。
により、あるプロセス順序で汚染物質のない完全Ｏ‐グ
リカンを高収率で回収しうることが確立された。完全Ｏ
‐グリカンが高収率でかつ汚染物質なしに回収されるプ
ロセス順序が規定されたが、この順序は容易に自動化し
うるようなものである。これがそうであることは、糖複
合体の凍結乾燥サンプルを回収して、かつ、その糖複合
体と前に連結していた完全Ｏ‐グリカンを首尾よく運搬
しうる機械を構築し、動作させることによって立証され
る。
【００５１】自動化プロセスの説明 Ｏ‐結合グリカンは図９で示された自動化プロセスで本
開示の方法を用いて糖複合体から放出させることができ
る。
開示の方法を用いて糖複合体から放出させることができ
る。
【００５２】水、メタノール、ブタノール／エタノール
４：１(v/v) 、ブタノール／エタノール／酢酸４：１：
０．１５(v/v/v) 、０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液、０．
１Ｍ酢酸銅／酢酸ｐＨ４．０溶液、無水酢酸（１７．４
Ｍ）及びヒドラジンを各々含有した上の列のすべての容
器は、市販グレードの無水アルゴンの供給機に連結され
ていることに留意せよ。各容器の内容物のうち望ましい
量が、加圧アルゴン導入ラインを用いて関連容器をアル
ゴンで加圧することによって、Ｌ１路に沿い供給でき、
このような運搬はシステムソフトウェアのコントロール
下にある。本明細書で記載された全プロセスにおいて、
すべての溶媒及び試薬は上記容器の１つに貯蔵されかつ
そこから運搬される。
４：１(v/v) 、ブタノール／エタノール／酢酸４：１：
０．１５(v/v/v) 、０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液、０．
１Ｍ酢酸銅／酢酸ｐＨ４．０溶液、無水酢酸（１７．４
Ｍ）及びヒドラジンを各々含有した上の列のすべての容
器は、市販グレードの無水アルゴンの供給機に連結され
ていることに留意せよ。各容器の内容物のうち望ましい
量が、加圧アルゴン導入ラインを用いて関連容器をアル
ゴンで加圧することによって、Ｌ１路に沿い供給でき、
このような運搬はシステムソフトウェアのコントロール
下にある。本明細書で記載された全プロセスにおいて、
すべての溶媒及び試薬は上記容器の１つに貯蔵されかつ
そこから運搬される。
【００５３】被験糖複合体は例えば適切な系で透析、ゲ
ル濾過又はクロマトグラフィーにより実質的に無塩化さ
れる。無塩化させると、糖複合体は例えば凍結乾燥で本
質的に無水化され、サンプルの含水率は２５℃で２５ミ
リバールの凍結乾燥条件下において少なくとも平衡状態
に達するまで減少される。実質上無水のサンプルはリア
クターＲ１に導入されるが、これは図９で示されるよう
な自動化システムに連結されている。サンプルのヒドラ
ジン分解前に、リアクターＲ１内の空気をアルゴンで実
質上置き換えるために無水アルゴンが最初Ｌ１、Ｌ３路
に沿いサンプル上に通される。次いで相対含水率２．０
％(v/v) 以下のヒドラジンが図９の上の部分に示される
ようなポイントＣ１の前でＬ１路に連結して示されるヒ
ドラジン含有容器からＬ１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ
１に運搬される。 Ｏ‐グリカンの放出
ル濾過又はクロマトグラフィーにより実質的に無塩化さ
れる。無塩化させると、糖複合体は例えば凍結乾燥で本
質的に無水化され、サンプルの含水率は２５℃で２５ミ
リバールの凍結乾燥条件下において少なくとも平衡状態
に達するまで減少される。実質上無水のサンプルはリア
クターＲ１に導入されるが、これは図９で示されるよう
な自動化システムに連結されている。サンプルのヒドラ
ジン分解前に、リアクターＲ１内の空気をアルゴンで実
質上置き換えるために無水アルゴンが最初Ｌ１、Ｌ３路
に沿いサンプル上に通される。次いで相対含水率２．０
％(v/v) 以下のヒドラジンが図９の上の部分に示される
ようなポイントＣ１の前でＬ１路に連結して示されるヒ
ドラジン含有容器からＬ１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ
１に運搬される。 Ｏ‐グリカンの放出
【００５４】Ｒ１への一部ヒドラジンの運搬後に、Ｏ‐
結合グリカンを放出させるヒドラジン分解反応が本発明
に従い選択される時間にわたりリアクターＲ１内の温度
を（周辺に置かれた加熱装置の使用で）上昇させること
で、典型的には６５℃で８時間行われ、しかる後反応混
合物は環境温度まで冷却される。
結合グリカンを放出させるヒドラジン分解反応が本発明
に従い選択される時間にわたりリアクターＲ１内の温度
を（周辺に置かれた加熱装置の使用で）上昇させること
で、典型的には６５℃で８時間行われ、しかる後反応混
合物は環境温度まで冷却される。
【００５５】Ｏ‐グリカンの単離放出されたグリカンからのヒドラジン除去 クロマトグラフィープロセスで未反応ヒドラジンを除去
するため、リアクターＲ１の内容物をその一部分づつＬ
３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いアルゴン圧下でクロマトグラフ
ィーカラムＡ（微結晶セルロースのようなセルロースベ
ース媒体含有）に移し、この後者の通過時にバルブＶ１
及びＶ２を用いてブタノール、エタノール及び酢酸４：
１：０．１５(v/v/v) の溶媒（Ｌ１路に沿い運搬され
る）とＲ１内容物５％対溶媒９５％(v/v) の適切な比率
で混ぜ、混合物をカラムＡからウェイスト(waste) Ｗ２
に通す。次いで更に組成ブタノール、エタノール及び酢
酸４：１：０．１５(v/v/v) の溶媒３mlをＬ１、Ｌ３路
に沿いリアクターＲ１に及びそこからＬ３、Ｌ５、Ｌ２
路に沿いカラムＡに運搬するが、カラム出口は再びウェ
イストＷ２に向けられる。これはすべての微量ヒドラジ
ンがリアクターＲ１から除去されることを保証するため
同溶媒６mlで繰り返される。組成ブタノール、エタノー
ル４：１(v/v) の溶媒６ml容量を、カラムＡに存在する
いかなる酢酸も除去するためＬ１、Ｌ３路に沿いリアク
ターＲ１に及びそこからＬ３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いカラ
ムＡに運搬するが、カラムＡの出口はなおウェイストＷ
２に連結される。
するため、リアクターＲ１の内容物をその一部分づつＬ
３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いアルゴン圧下でクロマトグラフ
ィーカラムＡ（微結晶セルロースのようなセルロースベ
ース媒体含有）に移し、この後者の通過時にバルブＶ１
及びＶ２を用いてブタノール、エタノール及び酢酸４：
１：０．１５(v/v/v) の溶媒（Ｌ１路に沿い運搬され
る）とＲ１内容物５％対溶媒９５％(v/v) の適切な比率
で混ぜ、混合物をカラムＡからウェイスト(waste) Ｗ２
に通す。次いで更に組成ブタノール、エタノール及び酢
酸４：１：０．１５(v/v/v) の溶媒３mlをＬ１、Ｌ３路
に沿いリアクターＲ１に及びそこからＬ３、Ｌ５、Ｌ２
路に沿いカラムＡに運搬するが、カラム出口は再びウェ
イストＷ２に向けられる。これはすべての微量ヒドラジ
ンがリアクターＲ１から除去されることを保証するため
同溶媒６mlで繰り返される。組成ブタノール、エタノー
ル４：１(v/v) の溶媒６ml容量を、カラムＡに存在する
いかなる酢酸も除去するためＬ１、Ｌ３路に沿いリアク
ターＲ１に及びそこからＬ３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いカラ
ムＡに運搬するが、カラムＡの出口はなおウェイストＷ
２に連結される。
【００５６】脱Ｎ‐アセチル化グリカンのＮ‐アセチル
化 脱Ｎ‐アセチル化を行うため、無水酢酸０．２mlをＬ
１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ１にしかる後Ｌ３、Ｌ
５、Ｌ２路に沿いカラムＡに運搬するが、この後者の通
過時にそれをバルブＶ１及びＶ２を用いて溶媒ブタノー
ル、エタノール４：１(v/v) （Ｌ１路に沿い運搬され
る）と無水酢酸５％対溶媒９５％(v/v) の適切な比率で
混ぜ、混合物をカラムＡからウェイストＷ２に通す。こ
の運搬及びＮ‐アセチル化反応は３０分間続ける。次い
で過剰無水酢酸を除去するため、ブタノール、エタノー
ル４：１(v/v) 溶媒３mlをＬ１、Ｌ２路に沿いカラムＡ
に運搬する。すべての操作において、カラムＡからの出
口はウェイストＷ２に向けられる。このステップの最後
に、Ｏ‐グリカン及び複合体又は複合体由来物質をカラ
ムＡのセルロースに吸着させる。
化 脱Ｎ‐アセチル化を行うため、無水酢酸０．２mlをＬ
１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ１にしかる後Ｌ３、Ｌ
５、Ｌ２路に沿いカラムＡに運搬するが、この後者の通
過時にそれをバルブＶ１及びＶ２を用いて溶媒ブタノー
ル、エタノール４：１(v/v) （Ｌ１路に沿い運搬され
る）と無水酢酸５％対溶媒９５％(v/v) の適切な比率で
混ぜ、混合物をカラムＡからウェイストＷ２に通す。こ
の運搬及びＮ‐アセチル化反応は３０分間続ける。次い
で過剰無水酢酸を除去するため、ブタノール、エタノー
ル４：１(v/v) 溶媒３mlをＬ１、Ｌ２路に沿いカラムＡ
に運搬する。すべての操作において、カラムＡからの出
口はウェイストＷ２に向けられる。このステップの最後
に、Ｏ‐グリカン及び複合体又は複合体由来物質をカラ
ムＡのセルロースに吸着させる。
【００５７】複合体物質からのグリカンの分離 複合体又は複合体由来物質を除去するため、水０．５ml
容量をＬ１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ１に運搬する。
次いで組成ブタノール、エタノール及び水４：１：０．
２５(v/v/v) の溶媒混合液を形成するためＲ１の内容物
をバルブＶ１及びＶ２を用いてブタノール、エタノール
４：１(v/v) 溶媒（Ｌ１路に沿い運搬される）と水５％
対溶媒９５％(v/v) の適切な比率で混ぜ、この溶媒をカ
ラムＡに通すが、カラムＡの出口はウェイストＷ２に連
結されている。
容量をＬ１、Ｌ３路に沿いリアクターＲ１に運搬する。
次いで組成ブタノール、エタノール及び水４：１：０．
２５(v/v/v) の溶媒混合液を形成するためＲ１の内容物
をバルブＶ１及びＶ２を用いてブタノール、エタノール
４：１(v/v) 溶媒（Ｌ１路に沿い運搬される）と水５％
対溶媒９５％(v/v) の適切な比率で混ぜ、この溶媒をカ
ラムＡに通すが、カラムＡの出口はウェイストＷ２に連
結されている。
【００５８】次いでカラムＡのセルロースからＯ‐グリ
カンの脱着が下記のように生じる。メタノール（０．２
ml）をＬ１、Ｌ２路に沿いカラムＡに４パルス（各５０
μＬ）で通すが、各パルスは直ちにアルゴンパルスで追
随され、カラムＡの出口はＬ４路で保持容器（Ｈ１）に
連結されている。次いで酢酸ナトリウム溶液（３．０m
l）をＬ１、Ｌ２路に沿いアルゴンの同パルスでカラム
Ａに通すが、カラムＡの出口はなお保持容器（Ｈ１）に
連結されている。
カンの脱着が下記のように生じる。メタノール（０．２
ml）をＬ１、Ｌ２路に沿いカラムＡに４パルス（各５０
μＬ）で通すが、各パルスは直ちにアルゴンパルスで追
随され、カラムＡの出口はＬ４路で保持容器（Ｈ１）に
連結されている。次いで酢酸ナトリウム溶液（３．０m
l）をＬ１、Ｌ２路に沿いアルゴンの同パルスでカラム
Ａに通すが、カラムＡの出口はなお保持容器（Ｈ１）に
連結されている。
【００５９】次いでＯ‐グリカンの完全な再Ｎ‐アセチ
ル化を保証するため、無水酢酸０．１ml容量をＬ１、Ｌ
３、Ｌ４路に沿い保持容器Ｈ１に通し、反応混合物を環
境温度で３０分間おく。
ル化を保証するため、無水酢酸０．１ml容量をＬ１、Ｌ
３、Ｌ４路に沿い保持容器Ｈ１に通し、反応混合物を環
境温度で３０分間おく。
【００６０】完全未変換グリカンの再生 次いでＮａ+ イオンをＨ+ イオンで置き換えるため、保
持容器（Ｈ１）の内容物をＬ４路に沿い１．０mlダウエ
ックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）層含有クロマトグラフィ
ーカラムＢに及びカラムＢから直接リアクターＲ１にＬ
２、Ｌ５、Ｌ３路経由で通す。加えて存在する残留複合
体又は複合体由来物質及び他の汚染物質をカラムＢに充
填された１ml層のＣ18結合シリカ（メタノール及び水で
前洗浄）に通すことで除去する。次いでグリカン‐アセ
トヒドラゾン開裂を行い完全未変換グリカンを再生する
ため、酢酸銅０．２mlの溶液をリアクターＲ１にＬ１、
Ｌ３路経由で運搬し、反応混合物を環境温度で６０分間
おく。次いでＣｕ2+イオンをＨ+ イオンで置き換えるた
め、混合物をＲ１からＬ３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いキレッ
クス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ５０Ｘ１２
（Ｈ+ ）の各０．５ml混合物含有クロマトグラフィーカ
ラムＣ経由でＬ４、Ｌ９路に沿い遠隔回収部に通す。次
いで水１ml容量を洗浄目的でＬ１、Ｌ３路に沿いリアク
ターＲ１にしかる後カラムＣ経由でＬ３、Ｌ５、Ｌ２、
Ｌ４、Ｌ９路に沿い遠隔回収部に運搬する。遠隔回収部
で回収された溶液は希酢酸溶液中に放出された完全なＯ
‐グリカンを含有しており、次の分析のために装置から
除去してもよい。
持容器（Ｈ１）の内容物をＬ４路に沿い１．０mlダウエ
ックスＡＧ５０Ｘ１２（Ｈ+ ）層含有クロマトグラフィ
ーカラムＢに及びカラムＢから直接リアクターＲ１にＬ
２、Ｌ５、Ｌ３路経由で通す。加えて存在する残留複合
体又は複合体由来物質及び他の汚染物質をカラムＢに充
填された１ml層のＣ18結合シリカ（メタノール及び水で
前洗浄）に通すことで除去する。次いでグリカン‐アセ
トヒドラゾン開裂を行い完全未変換グリカンを再生する
ため、酢酸銅０．２mlの溶液をリアクターＲ１にＬ１、
Ｌ３路経由で運搬し、反応混合物を環境温度で６０分間
おく。次いでＣｕ2+イオンをＨ+ イオンで置き換えるた
め、混合物をＲ１からＬ３、Ｌ５、Ｌ２路に沿いキレッ
クス１００（Ｎａ+ ）及びダウエックスＡＧ５０Ｘ１２
（Ｈ+ ）の各０．５ml混合物含有クロマトグラフィーカ
ラムＣ経由でＬ４、Ｌ９路に沿い遠隔回収部に通す。次
いで水１ml容量を洗浄目的でＬ１、Ｌ３路に沿いリアク
ターＲ１にしかる後カラムＣ経由でＬ３、Ｌ５、Ｌ２、
Ｌ４、Ｌ９路に沿い遠隔回収部に運搬する。遠隔回収部
で回収された溶液は希酢酸溶液中に放出された完全なＯ
‐グリカンを含有しており、次の分析のために装置から
除去してもよい。
【図１】Ｏ‐グリカンをペプチドに結合するＯ‐グリコ
シド結合の図
シド結合の図
【図２】アルカリβ‐脱離によるＯ‐グリコシド結合の
開裂に関して現在実施される方法において重要な化学反
応を要約した図
開裂に関して現在実施される方法において重要な化学反
応を要約した図
【図３】ヒドラジン分解反応を用いた糖タンパク質牛フ
ェツインからのＯ‐グリカン放出に関してインキュベー
トの定常状態温度の効果を測定するために行われた研究
の結果を要約したグラフ
ェツインからのＯ‐グリカン放出に関してインキュベー
トの定常状態温度の効果を測定するために行われた研究
の結果を要約したグラフ
【図４】本明細書で記載された好ましい方法の実施によ
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：放射性同位元素標識グリカンの高電圧放射線電気泳
動グラフ（牛血清フェツインから誘導されたグリカンア
ルジトールのチャージクロマトグラム）
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：放射性同位元素標識グリカンの高電圧放射線電気泳
動グラフ（牛血清フェツインから誘導されたグリカンア
ルジトールのチャージクロマトグラム）
【図５】本明細書で記載された好ましい方法の実施によ
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：脱酸性化後における放射性同位元素標識グリカンの
ゲル濾過クロマトグラム（牛血清フェツインから誘導さ
れたグリカンアルジトールのサイズクロマトグラム）
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：脱酸性化後における放射性同位元素標識グリカンの
ゲル濾過クロマトグラム（牛血清フェツインから誘導さ
れたグリカンアルジトールのサイズクロマトグラム）
【図６】本明細書で記載された好ましい方法の実施によ
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアルジトー
ルのチャージクロマトグラム
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアルジトー
ルのチャージクロマトグラム
【図７】本明細書で記載された好ましい方法の実施によ
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアルジトー
ルのサイズクロマトグラム
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：ブタ下顎ムチンから誘導されたグリカンアルジトー
ルのサイズクロマトグラム
【図８】本明細書で記載された好ましい方法の実施によ
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：アシアログルボシドから誘導されたグリカンアルジ
トールのサイズクロマトグラム
り牛フェツインから得られたＯ‐グリカンの分析の要
約：アシアログルボシドから誘導されたグリカンアルジ
トールのサイズクロマトグラム
【図９】自動化方式で糖複合体からＯ‐グリカンの放出
及び／又は単離を行うために示された装置の概略図
及び／又は単離を行うために示された装置の概略図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニー、ヒュー、メリー イギリス国オクソン、チャールベリ、リト ル、リーズ、22 (72)発明者 ジェームズ、ブルース イギリス国オクソン、エンシャム、ウィタ ム、ビュー、53
Claims (21)
- 【請求項１】糖複合体からＯ‐グリカンを放出させる方
法であって、 糖複合体をヒドラジン試薬の影響下におき（ここで、前
記糖複合体は実質上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒ
ドラジン試薬は実質上無水である）、実質上非還元かつ
完全な形でＯ‐グリカンを後に回収しうるような方法で
糖複合体からＯ‐グリカンを放出させるように、糖複合
体がヒドラジン試薬の影響下におかれている条件をコン
トロールすることを特徴とする方法。 - 【請求項２】Ｏ‐グリカンが収率８５％以上で得られ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】糖複合体から非還元かつ完全Ｏ‐グリカン
を放出させるために、完全な形でＯ‐グリカンを後に回
収しうるような方法で複合体からＯ‐グリカンを放出さ
せるような最適条件下で、実質上無塩かつ本質的に無水
の複合体を主に無水のヒドラジン試薬と共に加熱するこ
とからなる、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】放出された完全かつ非還元Ｏ‐グリカンを
単離する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項５】Ｏ‐グリカンの放出のために、糖複合体を
ヒドラジン試薬の影響下におき（ここで、前記糖複合体
は実質上無塩かつ実質上無水であり、前記ヒドラジン試
薬は実質上無水である）、実質上非還元かつ完全な形で
Ｏ‐グリカンを後に回収しうるような方法で糖複合体か
らＯ‐グリカンを放出させるように糖複合体がヒドラジ
ン試薬の影響下におかれている条件をコントロールし、
クロマトグラフィー物質にＯ‐グリカン（及びそのいず
れかの誘導体）を吸着させるために、糖複合体をヒドラ
ジン試薬の影響下におくことで形成された反応混合物を
第一クロマトグラフィー物質と接触させ、クロマトグラ
フィー物質を溶出に付し（ここで、前記吸着及び溶出は
複合体及び／又は複合体由来物質からＯ‐グリカン（及
びそのいずれかの誘導体）を分離させかつヒドラジン試
薬を除去させるように行われる）、遊離第一アミノ酸基
を有するＯ‐グリカンの誘導体が存在する場合にはその
誘導体から非還元グリカンを得るためＮ‐アセチル化反
応を行い、Ｎ‐アセチル化反応が行われた方法で必要と
される場合にはＮ‐アセチル化反応後に得られた反応混
合物から一価及び／又は二価陽イオンを除去し、第二ク
ロマトグラフィー物質への吸着及びそれからの選択的溶
出によりかかる反応混合物からＯ‐グリカン又はその誘
導体を分離し、いずれのＯ‐グリカン誘導体も非還元形
に変換する工程を含んでなる、Ｏ‐グリカンの単離も含
む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】条件が完全Ｏ‐グリカンの前選択収率を達
成しうるように下記方程式に従い選択される、請求項１
〜５のいずれか一項に記載の方法。 【数１】 〔上記式中ｍo ＝完全形で放出されるＯ‐グリカンのモ
ル分率 ｅ＝自然対数 Ａro＝Ｏ‐グリカンの放出に関するアレニウス定数 Ａdo＝Ｏ‐グリカンの分解に関するアレニウス定数 ＥR O ＝Ｏ‐グリカンの放出に関する活性化エネルギー ＥD O ＝Ｏ‐グリカンの分解に関する活性化エネルギー Ｒ＝気体定数 Ｔ＝温度 ｔ＝時間〕 - 【請求項７】条件が完全Ｏ‐グリカンの収率８５％以上
を達成するように選択される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】糖複合体が糖タンパク質、糖ホルモン、糖
脂質又はムチンである、請求項１〜７のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項９】糖複合体をヒドラジン試薬の影響下におく
前に糖複合体から塩を除去する工程を更に含む、請求項
１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】糖複合体をヒドラジン試薬の影響下にお
く前に糖複合体から水を除去する工程を更に含む、請求
項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】ヒドラジン試薬がヒドラジン、ヒドラジ
ン蒸気、ヒドラジンの化合物又はヒドラジンの誘導体で
ある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】糖複合体及びヒドラジン試薬が一緒にさ
れ、得られた反応混合物が加熱される、請求項１〜１１
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】Ｎ‐アセチル化反応が第一クロマトグラ
フィー物質からの脱着前に行われる、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項１４】Ｎ‐アセチル化反応が第一クロマトグラ
フィー物質からの脱着後に行われる、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項１５】アセトヒドラゾン誘導体である得られた
Ｏ‐グリカンの誘導体が非還元Ｏ‐グリカンを形成させ
るために酸性条件下におかれる、請求項１〜１４のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】塩が透析、ゲル濾過又はクロマトグラフ
ィーにより糖複合体から除去される、請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１７】水が凍結乾燥により糖複合体から除去さ
れる、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１８】水が２５℃で２５ミリバールの凍結乾燥
条件下で少なくとも平衡な含水率まで除去される、請求
項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】ヒドラジン試薬が４容量／容量％を超え
ない含水率を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項２０】糖複合体が牛血清フェツイン、ブタ下顎
ムチン又はアシアログロボシドである、請求項１〜１９
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２１】完全Ｏ‐グリカンが６５℃で８時間以上
のヒドラジンとのインキュベーションにより糖複合体か
ら放出される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB9013830.6 | 1990-06-21 | ||
| GB909013830A GB9013830D0 (en) | 1990-06-21 | 1990-06-21 | Release and isolation of unreduced'o-linked type'oligosaccharides |
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|---|---|
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|---|---|
| US (1) | US6180779B1 (ja) |
| EP (1) | EP0462798B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0687905A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009523736A (ja) * | 2006-01-13 | 2009-06-25 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | ポリサッカライドを精製する方法 |
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-
1993
- 1993-03-12 US US08/032,166 patent/US6180779B1/en not_active Expired - Lifetime
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