JPH068822B2 - 保護結合検定法 - Google Patents

保護結合検定法

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JPH068822B2
JPH068822B2 JP59084170A JP8417084A JPH068822B2 JP H068822 B2 JPH068822 B2 JP H068822B2 JP 59084170 A JP59084170 A JP 59084170A JP 8417084 A JP8417084 A JP 8417084A JP H068822 B2 JPH068822 B2 JP H068822B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合検定の分野に関し、さらに詳しくは
非タンパク質リガンドの凝集検定における非特異性タン
パク質の干渉の克服に関する。凝集検定法は極めて高感
度であつて各種の物質の測定に使用されている。この検
定法は、例えばトリヨード−Ｌ−チロニン（T3）および
（または）チロキシン（T4）の検出に使用されるような
市販の試験用キツトとして具体化されている。
特異的結合検定技術の発達により、液体媒質中に非常に
低濃度で現れる、診断上、医療上、環境上および産業上
重要な種々の有機物質を測定する極めて有用な分析方法
が提供された。特異的結合検定法はリガンド、すなわち
測定すべき、結合し得る被分析物とこれに対する結合性
パートナーすなわち受容体との特異的干渉に基くもので
ある。リガンドとその結合性パートナーとのうち一つが
抗体であり他の一つが対応するハプテンまたは抗原であ
る場合はこの検定は免疫検定として知られている。
これらの特異的結合検定は、分析用素子または試験用細
片、被覆管、粒子結合剤等を含む種々の固体状の形態と
して提供されてきた。凝集検定は固体状特異的結合検定
のうち、通常免疫検定として、最も広く使用されている
ものの一つであつて、直接、間接（受動）または阻害型
凝集検定に分類し得る。直接凝集検定においては、特異
的結合性ペアの一つのメンバー（例えば受容体）である
表面成分を有する粒子を、特異的結合性ペアの他の一つ
のメンバー（例えばリガンド）を分析すべき試料と反応
させる。間接（受動）凝集形態においては、特異的結合
性ペアの一つのメンバー（例えば受容体）を固体基質粒
子に結合し、この粒子に結合したメンバーを、そのペア
のもう一方のメンバー（例えばリガンド）を分析すべき
試料と反応させる。阻害型凝集検定においては、結合性
ペアの一つのメンバーを測定すべき試料を、先ずその結
合性ペアのもう一方のメンバーを含有する溶液と反応さ
せ、この予備処理した溶液を次に試料中に存在させると
考えられる結合性ペアのメンバーを含有する（直接）か
それを結合した（間接）粒子と反応させる。凝集検定に
ついてはすでに文献に要約されている。例えばベランテ
イ（Bellanti）著、免疫学（Immunology）、ダブリュ
ー、ビー、ソーンダス社（W.B.Saunders Co.,）フイラ
デルフイア（1971年刊）、139ページ以降、およびフデ
ンベルグ（Fudenberg）ら、基礎及び臨床免疫学（Basic
＆Clinical Immunology）、ランゲ、メデイカル、パブ
リケーシヨンズ、（Lange Medical Publications、ロス
アルトス、カルホルニア（1976年刊）308ページ以降
参照。また沢井ら、米国特許第4,118,192号および4,20
8,185号は凝集検定に関している。同様に凝集検定に関
連のあるより以前の文献としてはシンガー（Singer）
ら、J.Colloid and Interface Science,45, 608-614(19
73)およびフアウレ（Faure）ら、Protides of the Biol
ogical Fluids,Proceedings of the Colloquium,20,589
-593（1972）がある。
特定の被分析物またはリガンド用の多数の凝集検定用試
験キツトが市販されて居り、また文献に記載されてい
る。例えばローズ（Rose）ら（編）、臨床免疫マニユア
ル（Manual of Clinical Immunology）、アメリカ微生
物学界(American Society for microbiology)ワシント
ンD.C.（1978年刊）参照。
複雑な液体例えばヒト血清の分析の場合は、多種の非特
異性蛋白質例えばリポタンパクや自己抗体が凝集反応を
阻害する。従つてリガンド濃度を正確に測定するために
はこれらのタンパク質を破壊しなければならない。従前
技術においては検定と別個に前処理を行うことが必要で
あつた。例えば小林ら〔Steroids,34,829-834(1979)〕
は、非特異性血清タンパク質の螢光標識ハプテン（コル
チゾル）との結合をドデシルスルホン酸ナトリウム（SD
S）によつて排除する、血清コルチゾルの直接螢光偏光
免疫検定を開示している。SDSは検定実施前に除去され
なかつた。
非タンパク質リガンドの検定における非特異性タンパク
質の干渉はタンパク質分解酵素例えばペプシンを使用し
て先ずそのタンパク質を消化することによつて克服する
ことができる。次いで酵素を検定前に不活性化または破
壊する。例えばコレツト−カサール（Collet-Cassart）
ら、〔Clin.Chem.,27，1205-09(1981)〕は、ペプシンで
予備消化した試料中のジゴキシンの粒子計数免疫検定
（PACIA）を開示している。消化はペプシンを不活性化
するトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンの添加に
より停止させた。なおチヤウ(Chau)ら、J.Clin.Endocri
nol.Metab.,42,189-192(1976)をも参照のこと。
T3およびT4測定用のものを含めて今日まで利用し得た凝
集検定は非特異性タンパク質の干渉に悩んできた。この
干渉の原因を除去するには予備的操作を実施することが
必ず必要であつた。すなわち、上記の文献に反映されて
いる努力にもかゝわらず、予備処理を必要とせずにこの
干渉の影響を防止し得るような特異的結合凝集検定を提
供する問題に答えた者は今まで誰も居なかつた。
本発明によれば、非特異性タンパプ質干渉の影響を予備
処理工程を必要とぜずに防止ないし克服する特異的結合
検定法が提供される。すなわち今や、この干渉を克服し
かつ自動分析系に使用するのに特に適当な均一系免疫検
定の形態を提供することが可能である。
これらの利点は本発明の特異的結合性耐酵素性リガンド
検定試験材料によつて達成され、本材料は(a)該リガン
ドまたはその結合性類似体とそれに対する特異的結合性
タンパク質とから成る特異的結合性ペアの一方のパート
ナーと一体化した固相、(b)前記ペアの特異的結合性タ
ンパク質がそのパートナーと結合する場合に前者の酵素
による不活性化から保護する物質と一体化した、前記特
異的結合性ペアの他方のパートナーを含有して成る複合
体、および(c)活性なタンパク質不活性化酵素を含有し
て成る。
本発明はさらに、試料中の耐酵素性リガンドの検定用で
あつて、本質的に次の工程すなわち(i)反応混合物中に
おいて前記試料を(a)前記リガンドまたはその結合性類
似体とそれに対する特異的結合性タンパク質とから成る
特異的結合性ペアの一方のパートナーと一体化した固
相、(b)前記ペアの特異的結合性タンパク質がそのパー
トナーと結合する場合に前者を酵素による不活性化から
保護する物質と一体化した、前記特異的結合性ペアの他
方のパートナーを含有して成る複合体、および(c)活性
なタンパク質不活性化酵素と結合させ、そして(ii)前記
反応混合物中に生成する結合を検出する工程から成る特
異的結合検定方法を提供する。
この方法を含みまたはこれを使用する種々の態様も考え
られる。例えば、前記試験材料を試験用キツトの一部と
して提供することができる。このキツトはこの試験材料
の構成要素をおさめた容器またはその構成要素を組込ん
だ装置１個以上の、任意の種々の物理的形態を有する組
合せセツトから成つている。
本発明の好ましい態様には、粒子結合凝集検定試薬組成
物、この試験用組成物の１個以上の構成要素をそれぞれ
組込んだ容器または装置を他の構成要素または材料とセ
ツトに組合せたものから成る試験キツト、および本発明
の試験用組成物およびキツトを使用する方法が包含され
る。以下の記述は特定の態様のみに関するものであるが
それに使用される特定の用語は特に示さない限りすべて
の態様に対して適用されるものである。
試験対象の流体には生物学的、生理学的、産業的、環境
的等の液体が包含される。特に興味があるのは生物学的
流体例えば血清、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、乳、肉汁
その他の培養基およびこれらの上清ならびに画分であ
る。興味のある生理学的流体の例としては輸液、緩衝
液、保存剤または抗菌液等が挙げられる。産業的流体と
しては発酵媒質その他の、例えば医薬、乳製品および麦
芽飲料の製造に使用される反応工程液が挙げられる。そ
の他の、従来の方法によつて試験される試料液の源もこ
の用語の意味内に含まれ、同様に本発明によつて検定す
ることができる。
本発明の記述において「リガンド」なる用語は、タンパ
ク質不活性化酵素に作用されず、かつ例えば上記したよ
うな試料流体中におけるその存在を定性的にまたは定量
的に測定すべき任意の物質、または関連する物質の分類
を指す。本検定は、それに対する特異的結合性パートナ
ーが存在する任意のかかるリガンドの検出、および逆
に、ある液体がかかるリガンドを（通常試料中のそのリ
ガンドに対する結合性パートナーの存在によつて）結合
する能力の検出に適用することができる。リガンドは、
通常、これに対する特異的結合性パートナーが存在する
かまたはこれを発現させることができる有機分子であ
る。リガンドは、機能的に云えば通常、抗原、ハプテ
ン、ホルモン、ビタミン、中間代謝物および薬理学的
剤、ならびにそれらの受容体および結合性物質から選ば
れる。本発明を使用して検出し得るリガンドの具体例と
しては、ホルモン例えばチロキシン(T4)およびトリヨー
ドチロニン(T3)、抗原およびハプテン例えばフエリチ
ン、ブラジキニン、プロスタグランジンおよび腫瘍特異
性抗原、ビタミン例えばビオチン、ビタミンＢ12葉酸、
ビタミンＥ、ビタミンＡおよびアスコルビン酸、中間代
謝物例えば3′，5′−グアノシンモノホスフエート、薬
理学的剤または医薬例えば、ゲンタマイシン、アミカシ
ン、シソマイシンのような抗生物質、または乱用性医薬
例えばアヘンアルカロイドおよび麦角誘導体が挙げられ
る。
「特異的結合性タンパク質」または「受容体」なる用語
は、他の物質には結合せずにリガンドに対して特異的に
結合する親和力を有する任意の物質、または物質分類を
意味する。本発明の具体的態様の多くにおいては、試料
中のリガンドまたはその結合能力と互いに免疫化学的に
使用する特異的結合検定試薬が組入れられている。すな
わち試薬および（または）試料中のリガンドまたはその
結合能力との間には抗原−抗体またはハプテン−抗体の
関係がある。従つてかかる検定は免疫検定と名づけら
れ、リガンドとその受容体または結合性パートナーとの
間の特殊な相互作用は免疫化学的結合である。ポリクロ
ーナルの、またはモノクローナルの抗体のいずれかの使
用が考えられる。さらに、リガンドと結合性パートナー
との間のその他の相互結合作用、例えばホルモン、ビタ
ミン、中間代謝物および薬理学的剤とそれらのそれぞれ
の受容体および結合性物質との間の相互結合作用が特異
的結合検定法の基礎として役立つことは、当業界におい
てよく理解し得るところである。例えば結合性剤または
パートナーとしてのポリペプチドホルモン受容体につい
てはランガン（Langan）ら（編）、リガンドアツセイ
（Ligand Assay）、マツソンパブリツシング（Masson P
ublishing）USA社、ニユーヨーク、211ページ以降（198
1年刊）に論じられている。
本発明における「活性なタンパク質不活性化酵素」と
は、タンパク質（通常生体内起源のタンパク質）に特異
的結合凝集検定反応に対する非特異的干渉効果を生じさ
せるその化学的または生物学的性質を無効にするに有効
な任意の酵素のことである。これらの干渉効果の減少ま
たは排除にかかる酵素を使用することは、実際の検定操
作とは別に試料の予備処理においてすでに既載されてい
る。それに記載された、または実質的に同様の効果を有
する任意の酵素を使用することができる。例としては先
ずタンパク質分解酵素例えばトリプシン、ペプシン、キ
モトリプシン、カルボキシペプチターゼ、およびプロテ
アーゼ混合物例えばプロナーゼ（Pronase）混合酵素剤
（Calbiochem-Behring社、La Jolla、カルホルニア）が
挙げられる。かかるタンパル質不活性化酵素はペルルマ
ンおよびロランド（Perlmann＆Lorand）（編）、酵素学
の方法−タンパク質分解酵素（Methods in Enzymology-
Proteolytic Enzymes）、１９巻、Academic Press，ニ
ユーヨーク（1970年刊）に詳細に論じられている。
本発明における「固体状（態）」または「固相」は種々
の形状とすることができ、従つて広い意味を表わすもの
である。これは、類似のまたは異なる吸収特性その他の
物理的特性を有する一種以上の適当な材料または媒質を
含有して成る単相または多相のものであつてよく、疎水
性でも親水性でも、また吸水性でも非多孔質でもよい。
最も効果的は態様においては、固相は使用すべき特定の
特異的結合検定系の特性に適合するよう注意深く調製さ
れる。
一つの態様においては固相は特異的結合検定試剤と一体
化し得るマトリツクスまたは表面である。その形状は化
学的および酵素的溶液分析に使用する如き種々の公知の
ものであつてよい。固相試験装置は特異的結合検定に使
用されてきた。よく使用される固相装置は非多孔質表面
例えば試験管その他の容器の内部表面に吸着または共有
結合によつて抗体を付加または被覆したものである。同
様に抗体試薬を流通カラム内に保持されたマトリツクス
に固定した特異的結合検定用の装置が知られている（米
国特許第4,036,947号明細書、4,039,652号明細書、4,05
9,684号明細書、4,153,675号明細書、および4,166,102
号明細書）。米国特許第3,826,619号明細書、4,001,583
号明細書、4,017,597号明細書および4,105,410号明細書
は抗体で被覆した試験管の放射免疫検定への使用に関し
ている。固相試験装置または酵素免疫検定（米国特許第
4,016,043号明細書および4,147,752号明細書）および螢
光免疫検定（米国特許第4,025,310号明細書および4,05
6,724号明細書、英国特許明細書第1,552,374号明細書）
に使用されている。かかる不均一系特異的結合検定試験
装置の使用の好例は米国特許第4,135,884号明細書に示
されている。試験装置は抗体試薬とを一体化されて、液
体試料および反応系の残りの試薬と接触させられる。イ
ンキユベーシヨン期間後、固相装置を物理的に反応液か
ら取去り、溶液内または試験装置上の標識を測定する。
好ましい一態様においては、この素子はポリエチレンの
ような材料で、少くとも１個の反応用くぼみを通常その
中央部に有するように成形された試験用スライドの形で
あつてもよい。このくぼみは通常直径が約1.0ないし約
２．５cm、深さが約１．０ないし約10mm、好ましくは約
２ないし約６mmである。
最も好ましい固相の形態は粒子である。先に述べた通
り、粒子結合凝集検定には、特異的結合性ペアのメンバ
ーを表面成分として有する粒子または、かかる成分があ
らかじめ結合された基質粒子を使用する検定が含まれ
る。これら基質粒子の大さは好ましくは直径約０．１な
いし約５．０ミクロンで、バクテリア基質粒子の直径は
通常約１ないし約３ミクロンである。特異的結合性ペア
メンバーの担体として使用されてきた基質粒子の例とし
ては真核生物赤血球（未変化のまたは褐色化したも
の）、シリカ質粘土（例えばベントナイト）、ラテツク
スおよび原核生物性粒子（例えばバクテリア細胞）が挙
げられる。いわゆるラテツクス粒子は通常合成ポリマー
材料例えばポリスチレンから成つている。その他の適当
な有機ポリマーとしてはブタジエン、スチレン−ブタジ
エンコポリマー、アクリルポリマーまたはこれらの混合
物か挙げられる。原核生物粒子例えばバクテリアまたは
菌類の細胞またはビルス粒子も凝集検定における基質粒
子として広く使用されてきた。基質粒子として使用され
るバクテリアにはぶどう状球菌属のもの、特に黄色ぶど
う状球菌（Ｓ.aureus）が含まれる。例えば黄色ぶどう
状球菌〔コワン（Cowan）Ｉ型〕はその細胞壁表面から
延びているＡタンパク質分子を介して結合性パートナー
と結合された。
多くの有機分子は非共有結合的吸着により容易にかかる
基質粒子に付着する。例えば赤血球は多くの多糖類を容
易に吸着する。また、コワンＩ型黄色ぶどう状球菌中の
Ａタンパク質はある種の免疫グロブリンのＦC座に特異
的に係合する。しかしタンパク質を付着させるためには
通常先ず粒子を処理するか、タンパク質を例えば結合原
子団を介して共有結合させることが必要である。現在ま
でに使用された結合原子団の例としてはビスジアゾベン
ジジン、グルタルアルデヒドおよび１，３−ジフルオロ
−４，６−ジニトロベンゼンがある。その他のものはフ
デンベルグ（Fudenberg）ら（編）、基礎および臨床免
疫学（Basic＆Clinical Immunology）、ランゲメジカル
パブリケーシヨンズ、ロスアルトス、カリホルニア、31
0ページ（1976年刊）に論じられている。
特異的結合性ペアの特異的結合性タンパク質がそのパー
トナーと結合する場合に「前者を酵素による不活性化か
ら保護する物質」とは、それ自体はタンパク質不活性化
酵素の作用を受けず、かつ金属封鎖、偽装好ましくは結
合等によつて特異的結合性タンパク質と結びついてこれ
をタンパク質不活性化酵素に作用されないようにするこ
とのできる任意の天然または合成の分子を意味する。こ
の目的に使用し得る物質の例としては結合性タンパク質
と結合した場合これを酵素の攻撃から立体的に保護する
大型分子が挙げられる。かかる大型分子の適当な例とし
てはデキストランまたはフイコル（Ficoll）〔フアルマ
シアフアインケミカルズ社（Pharmacia Fine Chemical
s. Inc.），ニユーマーケット、ニユージヤーシイ〕エ
ピクロロヒドリンとスクロースとの反応によるポリマー
性生成物）の如き高分子量ポリマーが挙げられる。
本発明の試料材料には、ペアの一方の特異的結合性タン
パク質がそのパートナーと結合する場合に前者を酵素の
不活性化作用から保護する物質と一体化した、特異的結
合性タンパク質からリガンドかのいずれかであるにせ
よ、固相に結びついた種に対する結合性パートナーを含
有して成る複合体が含まれる。この複合体は、その含有
する結合性パートナーの特異性を害したり変化させたり
しないような慣用の有機合成技法を使用して形成され
る。
本発明は次の機構を論拠としなければならぬものではな
いが、凝集結合性タンパク質保護において予期しなかつ
た成果が達成されたことに対する説明として少くとも一
つの機構を述べることができる。すべての場合に、リガ
ンドまたはその結合性類似体とそれに対する特異的結合
性タンパク質とから成る特異的結合性ペアの一方のパー
トナーと一体化された固相が存在する。こゝに提出する
機構においては、複合体は前記特異的結合性ペアの一方
のパートナーを含有して成り、（このパートナーはある
結合活性を有し、かつある濃度で存在し、両者合わせて
ある第一の結合速度を与える）、このパートナーは前記
ペアの特異的結合性タンパク質がそのパートナーと結合
する場合にタンパク質を酵素による不活性化から保護す
る物質と一体化しており、また活性なタンパク質不活性
化酵素はある結合活性を有しかつある濃度で存在し、両
者合せて第一の結合速度より小さい第二の結合速度を与
える。
この機構およびその他の可能な機構に従えば、特異的結
合性タンパク質例えば抗体の反応混合物中における濃度
は約０．０４％（W/V）以上、好ましくは約０．０４％
（W/V）ないし約０．０７％（W/V）である。同様に、タ
ンパク質不活性化酵素の濃度は約４．０mg／ml以下、好
ましくは約２．０ないし約４．０mg／mlである。この一
例は、(a)粒子に結合したチロキシンまたはトリヨード
チロニン抗体を濃度約０．０４ないし約０．０７％（W/
V）、(b)トリプシンを濃度約２．０ないし約４．０mg／
ml、そして(c)上記したような複合体を濃度約０．２２
ないし約０．８８μg/ml含有する特異的結合検定用組成
物または材料である。
以下の実施例は本発明の開発に当つて実施した実験を記
載するものである。可能な場合は常に、標準的な市販試
薬級薬品を使用した。
例 １ チロキシン保護結合検定 全血清チロキシン（T4）の測定は甲状腺機能測定のため
の唯一の最も重要な試験である。正常なT4の範囲は４．
５−１２．０μg/dlであるが、試験では１．０μg/dlの
低濃度から２４．０μg/dlの高濃度まで測定可能でなけ
ればならない。これは甲状腺障害を害する患者を正確に
識別するために必要である。本例は、本発明による非同
位元素的均一系免疫検定を説明する実験について報告す
る。
抗血清製造 T4に対する抗体は、ニユージーランドウサギに、等容量
のフロインドの完全補助液中に乳化したウシ血清アルブ
ミン（BSA）にT4を共有結合的に結合した複合体400μg
を皮内に第一次注射を行つて誘発させた。第二次増強免
疫は、等容量のフロインド不完全補助液中に乳化したＴ
４-BSA複合体400μgを１月に１回投与して行つた。動物
は週に３回採血した。
抗体精製 T4に対して特異性の抗体を免疫吸着によつて単離した。
免疫吸着剤はセフアロース４Ｂ（フアルマシアフアイン
ケミカルズ社、Piscataway，ニユージヤーシー）に共有
結合的に結合したT4から成る。この材料はサンドバーグ
およびポラス（Sundberg and Porath）がJ.Cheromato
g.,90,87-98（1974）に記載したビスオキシラン法によ
つて製造した。免疫吸着剤５mlを、２×20cmのガラス製
クロマトカラム中のセフアデツクスＧ−25（フアルマシ
ア社、上記）25mlの上に充填した。前記のように製造し
た抗血清５mlをカラムに加え、その赤色または琥珀色が
免疫吸着剤とセフアテヅクスの境界に達するまで流入さ
せたのち、抗血清をさらに３０分間室温で引続き吸着剤
と接触させた。次に免疫吸着剤をカラム容量の２倍量の
バルビタール緩衝食塩水（バルビタール０．０５Ｍ、Na
Cl０．１５Ｍ，NaN3０．１％，pH８．６）で洗浄、次で
流出液の280ナノメートル(nm)における吸光度を０．０
１以下とするに十分な量のホウ酸塩緩衝食塩水（ホウ酸
塩０．０４Ｍ、NaCl０．１５Ｍ、NaN3０．１％、pH８．
１）で洗浄した。次に、吸着された抗体を1.0Ｍ酢酸溶
液で溶離した。溶出液をフラクシヨンコレクターにより
１mlずつのアリコートとして採取した。280ｎｍにおけ
る吸光度が０．１より大きくpH７．０より大きい画分を
合一し、使用する迄-20℃で貯蔵した。１mlの抗血清の
通常１−２mgの精製抗体が単離された。
抗体感作ラテツクスの製造 上記の精製抗体を、マツソン（Masson）らの方法〔Meth
ods In Enzymology，79，106-139(1981)〕の変形法によ
つてクロロメチルスチレンラテツクスに結合した。前記
抗体を使用しマツソンらの方法（同上）と全く同じ方法
により製造することもできる。
T4−フイコル複合体製造 Ｔ４を臭化シアンで活性化したフイコル400（フアルマ
シア社、前出）に共有結合的に結合した。フイコル100m
gを０．４ＭK2CO3溶液６mlに溶解しpHを１１．０に調節
した。溶液を急速にかきまぜ、臭化シアン溶液（N,N−
ジメチルホルムアミド中333mg／ml）50μｌを３回添加
した。フイコル溶液のpHは2N NaOH溶液を添加して１
１．０に保つた。臭化シアンの添加は毎回、前回の添加
から１分以内に行い、最終添加後溶液を４分間インキユ
ベートした。次に２NHClによつてpHを１０．０とし、T4
溶液０．５mlを加えた。（０．４ＭK2CO3 11-15滴によ
つてアルカリ性としたN,N−ジメチルホルムアミド中80m
g／ml）。反応混合物を室温で２時間かきまぜた後０．
０１ＭNa2HPO4溶液（pH９．０）により徹底的に透析し
た。通常、フイコル１モル当りT4 60-70モルが結合さ
れた。
T4−フイコル複合体／トリプシン試薬製造 前記により製造したT4−フイコル複合体、ポリエチレン
グリコール8000〔ジエーー、テイー、ベーカーケミカル
社（Ｊ．Ｔ．Baker Chemical Co.），Phillipsburg，ニ
ユージヤーシイ〕、トウイーン(Twwen)-20〔テクニコン
インストルメンツ社（Technicon Instruments Crp.）、
Tarrytown，ニユージヤージ、〕、CaCl2、およびウシ膵
臓トリプシン〔シグマケムカル社（Sigma Chemical C
o.）、St.Louis、ミズリー〕をバルビタール緩衝食塩水
（pH８．６）中に最終濃度がそれぞれ１．２μg/ml、
３．７６％（W/V）、０．１１％（V/V）、１ｍＭおよび
７．３mg／mlになるように混合した。
抗体感作ラテツクス試薬製造 前記の如く製造した抗体感作ラテツクス、８−アニリノ
−１−ナフタレンスルホン酸〔イーストマンコダツク社
（Eastman Kodak Co.）、Rochester、ニユーヨーク〕、
トウイーン−20およびフイコル400を、炭酸塩０．３５
Ｍ、バルビタール０．０１５Ｍ、塩化ナトリウム０．１
５Ｍおよび窒化ナトリウム０．１％から成る緩衝液（pH
９．７）中、最終濃度がそれぞれ０．１７％（W/V）
０．１０３mg／ml、０．１１％（V/V）および０．８６m
g／mlとなるように混合した。
参考法 参考法は固相被覆管ガンマコート（Gamma Coat）（登録
商標）放射免疫検定（RIA）〔クリニカルアツセイズ（C
linical Assays）、トラベノールラボラトリーズ社（Tr
avenol Laboratories）の一事業部、Cambridgc、マサチ
ユセツツ〕で、製造業者の指示に従つて使用した。
検定操作および結果 本発明の検定は分光光度計または自動臨床化学分析器を
使用して行うことができる。ここに報告する結果の大部
分にはテクニコン（Technicon）RA-1000（登録商標）装
置系を使用した。下記の各実験において検定は26μｌの
試験血清、対照または標準を175μｌのT4−フイコル／
トリプシン試薬に添加して開始した。次で反応混合物を
３７℃で２分間インキユベートした後、抗体感作ラテツ
クス試薬175μを添加した。全反応混合物をさらに１分
間インキユベートした後、600nmにおける吸光度を１５
秒おきに２分間記録した。吸光度変化速度を吸光度と時
間のデータから最小自乗法によつて求めた。この直線の
傾斜は試験試料中のT4濃度に反比例した。データのログ
−ロジツト変換によつて直線状標準曲線を得、これを下
記のように未知試料の分析に使用した。
第一段階として、T4−フイコルによる結合抗体の保護を
実証した。抗体感作ラテツクス試薬、4−フイコル／ト
リプシン試薬および血清をベースとするT4を含まぬ標準
品を０．５cmの石英キユベツト中で混合した。キユベツ
トをベツクマンDU-８分光光度計〔ベツクマンインスツ
ルメンツ社（Beckman Instruments，Inc）、Fullerto
n、カルホルニア〕内に置き、600nmにおける吸光度を時
間の関数として測定した。凝集速度はフアウレ（Faur
e）ら〔Protides of the Biological Flids，20，589-5
93(1972)〕およびシンガー（Singer）ら〔Journal of C
olloid and Interface Science，45，608−614(1973)〕
が述べた通り光学濃度の変化速度に正比例する。第１図
のデータは光学濃度が急速に増加した後約10分間のイン
キユベーシヨンの後平になり始めることを示す。これら
の粒子は一夜インキユベーシヨン後もなお凝集したまま
であつた。
次にヒト血清103個を、テクニコンRA-1000装置系で自動
化した本発明の方法、および先に記したRIA参考法によ
つて分析し、二方法による結果の相関の程度を求めた。
データを第２図に示す。相関データを直交線型回帰法に
よつて解析した結果をまとめて下に示す。
これと比較のため、反応混合物中にトリプシンを加えぬ
以外は本発明について前記したと同様にして、ヒト血清
21個を分析した。データを第３図に示し、まとめた結果
を下に示す。
結論 第１図の結果は特異的抗体−ラテツクス／T4-フイコル
凝集が高濃度のトリプシンの存在においても生成し持続
することを示している。この観察に対する可能な一つの
説明は、T4-フイコルと抗体−ラテツクスの組合せがタ
ンパク質分解酵素の接近を立体的に障害し、酵素が抗体
を分解するのを防止するということである。
タンパク質分解酵素例えばトリプシンを反応混合物に加
えることによつてもたらされた改善効果は第２図と第３
図との差から証明される。第３図に示すように、トリプ
シン不在の場合はラテツクス免疫検定法によつて得られ
る値の約２倍であつた。これは非特異的血清干渉による
もので、血清試料に誤つて高い測定値を与えられる結果
となつた。この非特異的干渉は第２図に示す通りトリプ
シンによつて破壊され、この結果トリプシンの存在での
ラテツクス免疫検定と参考法との優れた相関性が得られ
る。
例２ T4保護結合検定法におけるT4−デキストランの使用 ここに報告する実験はT4−デキストランの使用とT4−フ
イコル複合体の使用とを比較するものである。抗血清製
造、抗体精製、抗体感作ラテツクスおよび抗体感作ラテ
ツクス試薬の製造、T4−フイコル複合体およびT4−フイ
コル複合体／トリプシン試薬の製造、および分析操作は
例１に述べたのと同一である。
T4−デキストラン複合体製造 例１においてT4−フイコルについて述べたと全く同様の
操作によつてT4を臭化シアン活性化デキストランＴ500
（フアルマシア社、前出）と共有結合的に結合させた。
T4−デキストラン複合体／トリプシン試薬製造 T4−デキストラン、ポリエチレングリコール8000、トウ
イーン−20、CaCl2、およびウシ膵臓トリプシンを最終
濃度がそれぞれ１．０μg/ml、３．７６％（W/V）、
０．１１％（V/V）、１ｍＭおよび７．３mg／mlとなる
ように混合した。材料はすべてバルビタール緩衝食塩水
（pH８．６）に溶解した。
検定操作および結果 T4標準曲線はテクニコンRA-1000装置系を使用し、T4−
フイコルがＴ−デキストランかのいずれかを用いて求め
た。第４図のデータは、このT4結合保護ラテツクス免疫
検定に対してT4−フイコルとT4−デキストランのいずれ
もが「保護剤」として機能することを示す。T4−フイコ
ルの場合の方がT4−デキストランよりも大きな信号変化
が認められたが、T4−デキストランで得られる信号はポ
リエチレングリコール濃度を増すことにより増大する。
結論 T4−デキストランおよびT4−フイコルの両者とも抗原保
護ラテックス免疫検定において機能して適当な服量反応
曲線を生ずる。高分子量の非タンパク質分子はこの目的
に有効な部類の材料である。
例３ T4保護結合検定法におけるキモトリプシの使用 ここに報告する実験はタンパク質分解酵素としてのキモ
トリプシンの使用をトリプシンの使用と比較するもので
ある。抗血清構造、抗体精製、抗体感作ラテツクスと抗
体感作ラテツクス試薬との製造、T4−フイコル複合体と
T4−フイコル複合体／トリプシン試薬との製造、および
分析操作は例１に記したものと同一であつた。
T4−フイコル複合体／キモトリプシン試薬製造 この試薬は、ウシ膵臓２−キモトリプシン（シグマケミ
カル社、前出）を試薬中に最終濃度７．３mg/mlとなる
よう加えた以外は、例１においてT4−フイコル複合体／
トリプシン試薬について記したと全く同様にして製造し
た。
検定操作および結果 ヒト血清21個をテクニコンRA-1000装置系を使用し、ト
リプシンがキモトリプシンかのいずれかの存在において
抗原保護ラテツクス免疫検定法により分析した。データ
を第５図に分散プロツトとして示し、次の通り直交線型
回帰法により解析した。
結論 キモトリプシンは本発明の保護結合検定においてトリプ
シンの代りに使用し得る。反応混合物中にトリプシンま
たはキモトリプシンのいずれが含まれる場合も第５図に
示す通り同等の結果が得られた。T4−フイコルは結合抗
体をキモトリプシンのタンパク質分解作用から保護した
が、キモトリプシンは血清タンパク質を消化してラテツ
クス粒子との非特異的干渉が除かれ正しいT4値が得られ
るように作用した。
例４ T4保護結合検定法におけるプロナーゼの使用 ここに報告する実験はプロナーゼ〔Ｂ級、カルビオケム
−ベーリング社（Calbiochem-Behring Corp.）、La Jol
la、カリホルニア〕タンパク質分解酵素混合物の使用を
トリプシンの使用と比較するものである。抗血清製造、
抗体精製、抗体感作ラテツクスと抗体感作ラテツクス試
薬との製造、T4−フイコル複合体とT4−フイコル複合体
／トリプシン試薬との製造、および分析操作は例１に記
したものと同一である。
T4−フイコル複合体／プロナーゼ試薬製造 この試薬は、プロナーゼを試薬中に最終農7.3mg／ml加
えた以外はT4−フイコル複合体／トリプシン試薬につい
て例１に記したと全く同様にして製造した。
分析操作および結果 ヒト血清21個をテクニコンRA-1000装置系を使用し、ト
リプシンまたはプロナーゼのいずれかの存在において抗
原保護ラテツクス免疫検定により分析した。データを第
６図に今散プロツトとして示し、直交線型回帰法により
次の通り解析した。
結論 プロナーゼは本発明の保護結合検定においてトリプシン
の代りに使用し得る。本検定にトリプシンかプロナーゼ
かのいずれかを使用した場合も第６図に示す通り同等の
結果が得られた。両酵素ともほぼ同しT4平均値すなわち
トリプシンの場合11.2μg/dl、プロナーゼの場合11.6μ
g/dlを与え、相関プロツトの傾斜は1.02であつた。反応
混合物中のT4−フイコルはトリプシンによるタンパク質
分解作用から抗体を保護したが、T4測定に干渉するタン
パク質を破壊した。
例 ５ テオフイリン保護結合検定法 テオフイリン（1,3−ジメチルキサンチン）は気管支喘
息の治療にひろく使用される。この薬は治療範囲が10−
20μg/mlと狭く20μg/ml以上の濃度では有毒のことがあ
るため、血清中の濃度を綿密に監視しなければならな
い。以下に報告する実験は本発明の抗原保護ラテツクス
免疫検定法が血清中のテオフイリン濃度を正確に定量す
るのに使用し得ることを実証するものである。
抗血清製造 ウサギ抗テオフイリン抗血清はカレスタド（Kallesta
d）、（Austin，テキサス）から購入した。
抗体精製 抗体は硫酸アンモニウム沈殿法によつて単離した。抗血
清はあらかじめpH8に調節した飽和硫酸アンモニウム溶
液と等容量に混合した。溶液を４℃で２時間かきまぜた
後沈殿した抗体を遠心分離により単離した。沈殿物は元
の抗血清の容積と等容量の、pH８．０の50％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液で２回洗浄した。次に沈殿を元の抗血清
の容積と等容のホウ酸塩緩衝食塩水（pH8.1）中に可溶
化した。次にこの抗体溶液をホウ酸塩緩衝食塩水（pH
８．１）により十分に透析し、遠心分離によつて清澄化
した。単離した抗体は使用するまで−20℃で貯蔵した。
抗体感作ラテツクス製造 前記の精製抗体をマツソン（Masson）らの方法〔Method
s in Enzymology,74，106-139(1981)〕を変形した方法
によりクロロメチルスチレンラテツクスに結合した。前
記抗体を使用してマツソンら（同上）と全く同じ方法に
より製造することもできる。
8-Ｅカルボキシプロピルテオフイリンの合成 8-Ｅカルボキシプロピルテオフイリンはクツク（Cook）
ら〔Research Communications in Chemical Pathology
and Pharmacology，13，479-505(1976)〕の方法と全く
同様にして合成した。
Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化フイコル
の合成 Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化フイコル
（AECM-フイコル）はインマン（Inman）らの方法〔Ｊ．
Immunol．114，704−709(1975)〕と全く同様にして合成
した。
テオフイリン−フイコル複合体製造 ８−Ｅカルボキシプロピルテオフイリンをカルボジイミ
ドカツプリング法を使用してAECM−フイコルに結合し
た。１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチ
ルカルボジイミドヒドロクロリド〔アルドリツヒケミカ
ル社（Aldrich Chemical Co.）、Metuchen、ニユージヤ
ーシイ〕23mgをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１mlに溶
解した10mgの８−Ｅ−カルボキシプロピル−テオフイリ
ンに加えた。溶液を室温で４０分間放置活性化した後、
この溶液320μlを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（pH6.3）に
溶解したAECM−フイコルの10mg／ml溶液０．５mlに加
え、反応混合物を４℃で一夜インキユベートした。過剰
の試薬は０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）２
、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）２、ホ
ウ酸塩緩衝食塩水（pH８．１）２、さらに新しいホウ
酸塩緩衝食塩水（pH８．１）２により逐次透析して除
去した。AECM-フイコル１モル当り60ないし70モルのテ
オフイリンが結合した。
テオフイリン−フイコル複合体／トリプシン試薬製造 前記のようにして製造したテオフイリン−フイコル複合
体、トウイーン20、CaCl2およびウシ膵像トリプシンを
ホウ酸塩緩衝食塩水（pH８．１）中に最終濃度がそれぞ
れ1.25μg/ml、０．１％（V/V）、１mMおよび６mg／ml
になるように混合した。
抗体感作ラテツクス試薬製造 前記のようにした製造した抗体感作ラテツクスとトウイ
ーン−20とをウシ血清アルブミン０．１％（W/V）を含
むホウ酸塩緩衝食塩水（pH8.1）中で混合した。抗体感
作ラテツクスの最終濃度は０．１２％（W/V）でトウイ
ーン−20は０．１％（W/V）であつた。
参考法 参考法をエミトアード（Emit-aad）オリフイリン検定
〔シバ（Syva）(Palo Alto，カリホルニア）〕で、製造
業者の指示に従つて使用した。
検定操作および結果 本発明の検定は分光光度計か自動臨床化学分析器かを使
用して実施することができる。ここに報告する結果には
すべてテクニコンRA-1000（登録商標）装置系を使用し
た。検定は２μlの試験血清、対照または標準を200μl
の抗体感作ラテツクス試薬に添加して開始した。次に反
応混合物を37℃で１５秒間インキユベートした後テオフ
イリン−フイコル／トリプシン試200μlを加えた。全反
応混合物を37℃でさらに30秒間インキユベートした後、
600nmにおける吸光度を15秒おきに２分間記録した。吸
光度の変化速度は吸光度対時間のデータから最小自乗法
によつて求めた。この傾斜は試験試料中のテオフイリン
濃度に反比例した。データをログ−ロジツト変換して直
線状標準曲線を得、これを未知試料の分析に使用した。
テオフイリンによる治療を行つている患者からヒト血清
８１個を得た。これらの血清をカレスタドポリクローナ
ル抗体を使用する本発明の方法およびシバエミト参考法
によつて分析し、二つの方法による結果の相関度を求め
た。データを第７図に示す。相関データを直交線型回帰
法によつて解析して下記に示す。
結論 相関データはテオフイリン保護免疫検定法と参考法とが
極めてよく一致することを示す。本発明の方法によつて
得られる平均値11.5μg/mlは参考法による平均値10.6μ
g/mlとほとんど等しい。分散プロツトの傾斜は１に近
く、切片は無視し得る程小さく、相関係数は０．９９で
あつた。これらはすべて、本方法が参考法と同等の結果
を与えることを示している。
例６ モノクローナル抗体を使用するテオフイリン保護結合検
定 ここに報告する実験は、テオフイリン保護結合検定にお
けるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の比較を
行うものである。すべての材料、製造および操作は例５
に記したと同一で、このほかモノクローナルのマウス抗
テオフイリンもカレスタド（Austin、テキサス）から購
入した。
結果 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体について得た
服量反応曲線を第８図に示す。二種の抗体は本発明の検
定に使用する場合類似の動的範囲および感度を示す。
結論 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は本発明の検
定に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、例１の実験で述べた吸光度の時間的変化に基
く、本発明の保護結合検定法（PBA）により達成され
る、凝集複合体における特異的結合性タンパク質の保護
を説明するグラフである。 第２図は例１の実験に基く、本発明のT4保護結合検定法
と参考法の放射免疫検定法との相関の分散プロツトであ
る。 第３図はやはり例１の実験に基く、トリプシンを含まぬ
従来のT4凝集検定法と参考法の放射免疫検定法との相関
の分散プロツトである。 第４図は例２の実験に基く、T4−フイコルまたはT4−デ
キストラン複合体のいずれかを組込んだ本発明の保護結
合検定法を使用する種々のT4濃度における吸光度を示す
グラフである。 第５図は例３の実験に基く、本発明のT4保護結合検定法
において唯一の相異点としてトリプシンかキモトリプシ
ンかのいずれかを使用した場合の間の相関の分散プロツ
トである。 第６図は例４の実験に基く、本発明のT4保護結合検定法
において唯一の相異点としてトリプシンかプロナーゼか
のいずれかを使用した場合の間の相関の分散プロツトで
ある。 第７図は例５の実験に基く、本発明のテオフイリン保護
結合検定法と参考法との相関の分散プロツトである。 第８図は例６の実験に基く、ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体のいずれかを結合した本発明の保護結合
検定法を使用する、種々のテオフイリン濃度における吸
光度を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−133661（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−104896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−115814（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−105291（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の非タンパク質性リガンドの測定用
    であつて、 （ａ）前記リガンドまたはその結合性類似体とこれに対
    する特異的結合性タンパク質とから成る特異的結合性ペ
    アの一方のパートナーと一体化した固相、 （ｂ）前記ペアの特異的結合性タンパク質がそのパート
    ナーと結合する場合に前者を酵素による不活性化から保
    護する物質と共有結合させた、前記特異的結合性ペアの
    他方のパートナーを含有して成る複合体、および （ｃ）活性なタンパク質不活性化酵素 を含有して成る特異的結合検定試験用組成物。
  2. 【請求項２】特異的結合性パートナーと一体化した前記
    固相が、特異的結合性タンパク質表面部分を有する粒子
    または特異的結合性タンパク質に結合した基質粒子を含
    有して成る、前項（１）に記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記基質粒子が真核生物細胞、原核生物細
    胞および合成粒子たとえばラテックスから選ばれる、前
    項（２）に記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記特異的結合性タンパク質が約０．０４
    ないし約０．０７パーセントの濃度で存在する抗体であ
    る、前項（１）に記載の組成物。
  5. 【請求項５】前記非タンパク質性リガンドの前記複合体
    が、高分子量担体と共有結合させたリガンドまたはその
    特異的結合性類似体を含有して成る、前項（１）〜
    （４）のいずれかに記載の組成物。
  6. 【請求項６】前記高分子量担体がデキストランまたはエ
    ピクロロヒドリンとスクロースとの橋かけ生成物であ
    る、前項（５）に記載の組成物。
  7. 【請求項７】前記タンパク質不活性化酵素がトリプシン
    またはペプシンであり、約４．０ミリグラム／ミリリッ
    トル以下の濃度で存在する、前項（１）〜（６）のいず
    れかに記載の組成物。
  8. 【請求項８】（ａ）粒子と結合したチロキシンまたはト
    リヨードチロニン抗体、 （ｂ）トリプシン、および （ｃ）高分子量ポリマーと共有結合により結合したチロ
    キシンまたはトリヨードチロニンを含有して成る複合体 を含有して成り、 （ａ）前記の粒子と結合したチロキシンまたはトリヨー
    ドチロニン抗体は好ましくは約０．０４ないし約０．０
    ７パーセントの濃度で存在し、 （ｂ）前記トリプシンは好ましくは約２．０ないし約
    ４．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で存在し、そし
    て （ｃ）前記複合体は約０．２２ないし約０．８８マイク
    ログラム／ミリリットルの濃度で存在する、 チロキシンまたはトリヨードチロニン用の前項（１）に
    記載の組成物。
  9. 【請求項９】試料中の非タンパク質性リガンドの検定用
    であつて、本質的に次の工程すなわち i)反応混合物中において前記試料を （ａ）前記リガンドまたはその結合性類似体とこれに対
    する特異的結合性タンパク質とから成る特異的結合性ペ
    アの一方のパートナーと一体化した固相、 （ｂ）前記ペアの特異的結合性タンパク質がそのパート
    ナーと結合する場合に前者を酵素による不活性化から保
    護する物質と共有結合させた、前記特異的結合性ペアの
    他方のパートナーを含有して成る複合体、および （ｃ）活性なタンパク質不活性化酵素 と結合させ、そして ii)前記の反応混合物中に生成する結合を免疫検定にお
    いてそれ自体公知の方法により検出する 工程から成る、特異的結合検定方法。
  10. 【請求項１０】（ａ）試料中の非タンパク質性リガンド
    またはその結合性類似体とそれに対する特異的結合性タ
    ンパク質とを含有して成る特異的結合性ペアの一方のパ
    ートナーと一体化した固相、 （ｂ）前記ペアの特異的結合性タンパク質がそのパート
    ナーと結合する場合に前者を酵素による不活性化から保
    護する物質と共有結合させた、前記特異的結合性ペアの
    他方のパートナーを含有して成る複合体、および （ｃ）活性なタンパク質不活性化酵素 を構成要素として含有して成る組成物の１個以上の構成
    要素をそれぞれ組込んだ容器または装置を他の構成要素
    とセットに組合わせたものから成る、試料中の非タンパ
    ク質性リガンドの特異的結合検定法による測定用の試験
    キット。
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