JPH06103305B2 - 特異的結合分析法 - Google Patents
特異的結合分析法Info
- Publication number
- JPH06103305B2 JPH06103305B2 JP60146630A JP14663085A JPH06103305B2 JP H06103305 B2 JPH06103305 B2 JP H06103305B2 JP 60146630 A JP60146630 A JP 60146630A JP 14663085 A JP14663085 A JP 14663085A JP H06103305 B2 JPH06103305 B2 JP H06103305B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- microplate
- specific binding
- carrier particles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、特異的結合分析法に関し、更に詳しくは、血
清等の液性媒体中のリガンドを簡便かつ高感度に検出す
ることができる特異的結合分析法に関する。
清等の液性媒体中のリガンドを簡便かつ高感度に検出す
ることができる特異的結合分析法に関する。
［従来技術及びその問題点］ 従来、液性媒体中のリガンドを測定するための特異的結
合分析法としては、受身赤血球凝集法、ラジオイムノア
ッセイ、酵素抗体法が知られている。
合分析法としては、受身赤血球凝集法、ラジオイムノア
ッセイ、酵素抗体法が知られている。
受身赤血球凝集法は、抗原又は抗体を固定赤血球等の担
体に人工的に結合させて、対応する抗体又は抗原を凝集
反応によって検出する方法である。本法な簡便で安定な
方法であるが、感度が低く、また被検血清原液から８倍
希釈位まで非特異的凝集が生じてしまうためそれ以上の
希釈を必要とするという欠点を有する。
体に人工的に結合させて、対応する抗体又は抗原を凝集
反応によって検出する方法である。本法な簡便で安定な
方法であるが、感度が低く、また被検血清原液から８倍
希釈位まで非特異的凝集が生じてしまうためそれ以上の
希釈を必要とするという欠点を有する。
ラジオイムノアッセイは、放射性同位元素を抗原又は抗
体に結合させて、対応する抗体又は抗原をガンマーカウ
ンター、ベーターカウンターで測定する方法である。本
法は現在の免疫学的測定法のうち最も高感度な方法であ
るが、放射性同位元素を用いるために特別な検査施設を
必要とし、また放射性同位元素の半減期が短いことなど
から費用がかかるという欠点を有する。
体に結合させて、対応する抗体又は抗原をガンマーカウ
ンター、ベーターカウンターで測定する方法である。本
法は現在の免疫学的測定法のうち最も高感度な方法であ
るが、放射性同位元素を用いるために特別な検査施設を
必要とし、また放射性同位元素の半減期が短いことなど
から費用がかかるという欠点を有する。
酵素抗体法は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ等の酵素を抗原又は抗体に結合させて、対応する抗
体又は抗原を発色基質を用いての呈色反応で検出する方
法である。本法はラジオイムノアッセイにほぼ匹敵する
感度を示すが、反応条件が厳格で、比色計等の機器を必
要とし、また試薬の費用がラジオイムノアッセイ程では
ないが高価であるという欠点を有する。
ーゼ等の酵素を抗原又は抗体に結合させて、対応する抗
体又は抗原を発色基質を用いての呈色反応で検出する方
法である。本法はラジオイムノアッセイにほぼ匹敵する
感度を示すが、反応条件が厳格で、比色計等の機器を必
要とし、また試薬の費用がラジオイムノアッセイ程では
ないが高価であるという欠点を有する。
［発明の目的］ 従来法の欠点を克服し、簡便性、高感度、安定性、低費
用等の諸条件を満たす特異的結合分析法を提供すること
を目的とする。
用等の諸条件を満たす特異的結合分析法を提供すること
を目的とする。
［発明の構成］ 本発明の特異的結合分析法は、ヒト体液中の被検抗体又
は抗原を、担体粒子を用いた免疫学的結合反応により検
出する特異的結合分析法であって、 （１）正常人にとって異物である抗原、又は該抗原に対
応する特異結合性の抗体を、Ｕ型又はＶ型のマイクロプ
レートの内面に結合させ、 （２）次にヒト体液を前記マイクロプレートの内面に接
触させ、 （３）（１）でマイクロプレートに結合させた抗原又は
抗体と同一種類の抗原又は抗体が結合した担体粒子を、
（２）のマイクロプレートの内面に接触させ、 （４）（３）のマイクロプレートの底面における担体粒
子の凝集を観察し、ヒト体液中の被検抗体又は抗原を検
出することを特徴とするものである。
は抗原を、担体粒子を用いた免疫学的結合反応により検
出する特異的結合分析法であって、 （１）正常人にとって異物である抗原、又は該抗原に対
応する特異結合性の抗体を、Ｕ型又はＶ型のマイクロプ
レートの内面に結合させ、 （２）次にヒト体液を前記マイクロプレートの内面に接
触させ、 （３）（１）でマイクロプレートに結合させた抗原又は
抗体と同一種類の抗原又は抗体が結合した担体粒子を、
（２）のマイクロプレートの内面に接触させ、 （４）（３）のマイクロプレートの底面における担体粒
子の凝集を観察し、ヒト体液中の被検抗体又は抗原を検
出することを特徴とするものである。
本発明において、分析対象となるリガンドとしては、α
−フェトプロテイン、HBs抗原、HBe抗原、薬物、毒物、
細菌、ウィルス、癌のマーカー等のヒトにとって異物で
ある抗原；及びこれらに特異的に結合する抗体が挙げら
れる。
−フェトプロテイン、HBs抗原、HBe抗原、薬物、毒物、
細菌、ウィルス、癌のマーカー等のヒトにとって異物で
ある抗原；及びこれらに特異的に結合する抗体が挙げら
れる。
本発明に用いるマイクロプレートとしては、Ｕ型又はＶ
型のものであれば如何なるものでもよいが、通常はプラ
スチックを主成分とするもの、例えばポリスチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリアクリレートからなるものを用い
る。かかるマイクロプレートとしては、NSCプレート
（バイオテック社製）、ペトレイ96U（テルモ社製）、
イムノアッセイプレート（大日本製薬（株）製）等が市
販されている。
型のものであれば如何なるものでもよいが、通常はプラ
スチックを主成分とするもの、例えばポリスチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリアクリレートからなるものを用い
る。かかるマイクロプレートとしては、NSCプレート
（バイオテック社製）、ペトレイ96U（テルモ社製）、
イムノアッセイプレート（大日本製薬（株）製）等が市
販されている。
前記マイクロプレート及び担体粒子に結合させる、前記
リガンドの特異的結合の対応体とは、該リガンドと特異
的に結合するものであれば如何なるものでもよく、例え
ば、リガンドが、抗原又はハプテンである場合は対応す
る抗体を、抗体である場合は対応する抗原又はイディオ
タイプ抗体をいう。該対応体が抗体である場合には、モ
ノクローナル抗体を用いてもよい。
リガンドの特異的結合の対応体とは、該リガンドと特異
的に結合するものであれば如何なるものでもよく、例え
ば、リガンドが、抗原又はハプテンである場合は対応す
る抗体を、抗体である場合は対応する抗原又はイディオ
タイプ抗体をいう。該対応体が抗体である場合には、モ
ノクローナル抗体を用いてもよい。
マイクロプレートと対応体との結合は、例えば次のよう
にして行うことができる。即ち、対応体が蛋白質の場合
は、通常、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（以下「PB
S」という）、ホウ酸緩衝液等、好ましくは0.15Mホウ酸
緩衝液（pH8.4）を用いて、対応体を約１μg/mlの濃度
で25μずつ各穴に滴下し、一晩４℃で静置することに
より行うことができる。また、対応体が蛋白質以外の場
合は、ヒトアルブミン、ウシアルブミン等を該対応体と
混合して結合させ、これを各穴に滴下し、一晩４℃で静
置することにより行うことができる。
にして行うことができる。即ち、対応体が蛋白質の場合
は、通常、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（以下「PB
S」という）、ホウ酸緩衝液等、好ましくは0.15Mホウ酸
緩衝液（pH8.4）を用いて、対応体を約１μg/mlの濃度
で25μずつ各穴に滴下し、一晩４℃で静置することに
より行うことができる。また、対応体が蛋白質以外の場
合は、ヒトアルブミン、ウシアルブミン等を該対応体と
混合して結合させ、これを各穴に滴下し、一晩４℃で静
置することにより行うことができる。
本発明に用いる担体粒子としては、ヒト又は動物の血
球、細菌、ラテックス、ゼラチン、リポゾーム等が挙げ
られる。該担体粒子とリガンドの特異的結合の対応体と
の結合は、常法に従って行うことができる。例えば、赤
血球と抗体との結合は、カップリング剤としてタンニン
酸、グルタルアルデヒド、塩化クロム等を用いることに
より行うことができる。担体粒子にリガンドを結合させ
たものは、種々市販されており、これらの市販品を用い
てもよい。
球、細菌、ラテックス、ゼラチン、リポゾーム等が挙げ
られる。該担体粒子とリガンドの特異的結合の対応体と
の結合は、常法に従って行うことができる。例えば、赤
血球と抗体との結合は、カップリング剤としてタンニン
酸、グルタルアルデヒド、塩化クロム等を用いることに
より行うことができる。担体粒子にリガンドを結合させ
たものは、種々市販されており、これらの市販品を用い
てもよい。
前記対応体を結合させたマイクロプレートと液性媒体と
の接触時間は、通常30分〜２時間である。
の接触時間は、通常30分〜２時間である。
該接触後、洗浄処理を行うが、ここで用いる洗浄液とし
ては、水道水、脱イオン水、蒸留水を用いてもよいが、
特にトゥイーン（Tween）20を含有するPBSを用いること
が好ましい。
ては、水道水、脱イオン水、蒸留水を用いてもよいが、
特にトゥイーン（Tween）20を含有するPBSを用いること
が好ましい。
次いで、リガンドの特異的結合の対応体を結合させた担
体粒子を接触させるが、ここでの接触時間は、通常２〜
４時間である。
体粒子を接触させるが、ここでの接触時間は、通常２〜
４時間である。
以上のようにして処理したマイクロプレートの底部の凝
集像を観察すると、マイクロプレートの底部がＵ型又は
Ｖ型に傾斜しているので、反応陰性の場合には担体粒子
が重力に従って底部の中心に落下しボタン状の凝集像を
呈し、一方、反応陽性の場合には担体粒子が底部まで落
下しないで斜面に付着し拡散した凝集像を呈する。従っ
て、該凝集像を観察することにより、反応の陽性・陰性
を肉眼で判定することができる。
集像を観察すると、マイクロプレートの底部がＵ型又は
Ｖ型に傾斜しているので、反応陰性の場合には担体粒子
が重力に従って底部の中心に落下しボタン状の凝集像を
呈し、一方、反応陽性の場合には担体粒子が底部まで落
下しないで斜面に付着し拡散した凝集像を呈する。従っ
て、該凝集像を観察することにより、反応の陽性・陰性
を肉眼で判定することができる。
［発明の効果］ 本発明の特異的結合分析法は、簡便性、安定性、低費用
の諸条件を満たし、かつ、ラジオイムノアッセイにほぼ
匹敵する感度を有する。
の諸条件を満たし、かつ、ラジオイムノアッセイにほぼ
匹敵する感度を有する。
［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１ α‐フェトプロテインの測定 家兎由来の抗α‐フェトプロテイン精製抗体を生理食塩
水に溶解してマイクロプレートＵ型（ペトレイ96U（テ
ルモ社製））の各穴に１μg/mlの濃度で25μずつ滴下
し、４℃で一晩静置した。トゥイーン20を0.05％含有す
るPBS（以下「トゥイーン20-PBS」という）でプレート
を洗浄後、トゥイーン20-PBSを各穴に25μずつ加え
た。次いで、被検血清をPBSで希釈して、各穴に25μ
ずつ滴下し、室温で１時間感作した。プレートをトゥイ
ーン20-PBSで５回洗浄後、抗α‐フェトプロテイン家兎
特異抗体結合ヒツジ赤血球（三共（株）製）を0.1％の
濃度で各穴に25μずつ加え、室温で約３時間静置した
後、管底像を判定した。比較対照として、酵素抗体法
（三井製薬（株）製酵素抗体法キット使用）を行った。
α‐フェトプロテイン量は、標準試料との比較により換
算した。結果を表１に示す。表１において、α‐フェト
プロテイン量の単位はng/mlである。
水に溶解してマイクロプレートＵ型（ペトレイ96U（テ
ルモ社製））の各穴に１μg/mlの濃度で25μずつ滴下
し、４℃で一晩静置した。トゥイーン20を0.05％含有す
るPBS（以下「トゥイーン20-PBS」という）でプレート
を洗浄後、トゥイーン20-PBSを各穴に25μずつ加え
た。次いで、被検血清をPBSで希釈して、各穴に25μ
ずつ滴下し、室温で１時間感作した。プレートをトゥイ
ーン20-PBSで５回洗浄後、抗α‐フェトプロテイン家兎
特異抗体結合ヒツジ赤血球（三共（株）製）を0.1％の
濃度で各穴に25μずつ加え、室温で約３時間静置した
後、管底像を判定した。比較対照として、酵素抗体法
（三井製薬（株）製酵素抗体法キット使用）を行った。
α‐フェトプロテイン量は、標準試料との比較により換
算した。結果を表１に示す。表１において、α‐フェト
プロテイン量の単位はng/mlである。
表１から、本発明方法は、酵素抗体法と同程度の感度及
び再現性を有することがわかる。
び再現性を有することがわかる。
実施例２ HBs抗原の測定 モルモット由来の抗HBs精製抗体を生理食塩水に溶解し
てマイクロプレートＵ型（ペトレイ96U（テルモ社
製））の各穴に１μg/mlの濃度で25μずつ滴下し、４
℃で一晩静置した、トゥイーン20-PBSでプレートを洗浄
後、トゥイーン20-PBSを各穴に25μずつ加えた。次い
で、被検血清をPBSを希釈して、各穴に25μずつ滴下
し、室温で１時間感作した。プレートをトゥイーン20-P
BSで５回洗浄後、抗HBs家兎特異抗体結合ヒツジ赤血球
（山之内製薬（株）製）を0.1％の濃度で各穴に25μ
ずつ加え、室温で約３時間静置した後、管底像を判定し
た。比較対照として、ラジオイムノアッセイ（ダイナボ
ット社製ラジオイムノアッセイキット使用）を行った。
ラジオイムノアッセイの判定基準は、カット・オフ値
（正常人血清５本の平均値×2.1）の２倍以上を陽性と
した。結果を表２に示す。
てマイクロプレートＵ型（ペトレイ96U（テルモ社
製））の各穴に１μg/mlの濃度で25μずつ滴下し、４
℃で一晩静置した、トゥイーン20-PBSでプレートを洗浄
後、トゥイーン20-PBSを各穴に25μずつ加えた。次い
で、被検血清をPBSを希釈して、各穴に25μずつ滴下
し、室温で１時間感作した。プレートをトゥイーン20-P
BSで５回洗浄後、抗HBs家兎特異抗体結合ヒツジ赤血球
（山之内製薬（株）製）を0.1％の濃度で各穴に25μ
ずつ加え、室温で約３時間静置した後、管底像を判定し
た。比較対照として、ラジオイムノアッセイ（ダイナボ
ット社製ラジオイムノアッセイキット使用）を行った。
ラジオイムノアッセイの判定基準は、カット・オフ値
（正常人血清５本の平均値×2.1）の２倍以上を陽性と
した。結果を表２に示す。
表２から、本発明方法はラジオイムノアッセイと同程度
の感度及び再現性を有することがわかる。
の感度及び再現性を有することがわかる。
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト体液中の被検抗体又は抗原を、担体粒
子を用いた免疫学的結合反応により検出する特異的結合
分析法であって、 （１）正常人にとって異物である抗原、又は該抗原に対
応する特異結合性の抗体を、Ｕ型又はＶ型のマイクロプ
レートの内面に結合させ、 （２）次にヒト体液を前記マイクロプレートの内面に接
触させ、 （３）（１）でマイクロプレートに結合させた抗原又は
抗体と同一種類の抗原又は抗体が結合した担体粒子を、
（２）のマイクロプレートの内面に接触させ、 （４）（３）のマイクロプレートの底面における担体粒
子の凝集を観察し、ヒト体液中の被検抗体又は抗原を検
出することを特徴とする特異的結合分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60146630A JPH06103305B2 (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 特異的結合分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60146630A JPH06103305B2 (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 特異的結合分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS628056A JPS628056A (ja) | 1987-01-16 |
| JPH06103305B2 true JPH06103305B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=15412076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60146630A Expired - Lifetime JPH06103305B2 (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 特異的結合分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06103305B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56130657A (en) * | 1980-03-19 | 1981-10-13 | Terumo Corp | Determination method and device for antiacetylcholine receptor antibody |
| JPS56151357A (en) * | 1980-04-25 | 1981-11-24 | Hitachi Ltd | Immunoassay method |
-
1985
- 1985-07-05 JP JP60146630A patent/JPH06103305B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS628056A (ja) | 1987-01-16 |
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