JPH0689031B2 - マイトジエン活性を有するペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 本発明は、マイクロファージ様細胞に対するマイトジエ
ン活性を有する新規ペプチドに関する。

トロンビンは、細胞に対し様々な影響を及ぼすことが知
られている。フイブリノーゲンを凝固させ、血漿凝固シ
ステムにおける他の因子を酵素により活性化させるほか
に、トロンビンは様々な組織培養繊維芽細胞系におい
て、マイトジエン活性を有することが報告されている
［Perdueら、J.Biol.Chem. 256,2767−2776（1981）参
照］。繊維芽細胞に対する増殖刺激物としてのその機能
は、そのエステル分解活性と密接に関連している。

また、ごく最近になつて、トロンビンはヒト抹消血液単
球において走化性活性を有すと言われるようになつた
［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 96,282−285（198
3）］。

様々な生物学的活性の原因となる、トロンビンのドメイ
ンを同定する試みがされてきた。Bar−Shavitらは、Sci
ence 220,728−730（1983）、において、エステル分解
活性およびフイブリノゲン認識に必要な部位と独立し
た、トロンビン分子上の特異的な領域により、走化性活
性は仲介されていると結論を下している。走化性機能で
重要なのは、それが組織損傷部位における炎症反応の重
要な生理学的刺激物であるかもしれないということであ
る。細胞の指向的移動を伴う、この走化性機能は、細胞
における増殖因子活性である、マイトジエン機能と区別
される。すなわちその因子とは、細胞の分裂や分化を刺
激する。またこれまでトロンビンは、マクロファージ様
細胞に対するマイトジエン効果を誘導することができる
と言われてきた［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 97,39
6a,Abstract 1494（1983）］。

〈発明の簡単な説明〉 本発明により、ヒトトロンビンＢ鎖と類似のテトラデカ
ペプチドが、マクロフアージ様細胞に対する有力なマイ
トジエンであることが発見された。これらマイトジエン
ペプチドは、次に示すアミノ酸配列を含むペプチド、あ
るいはそれから生理学的に受け入れられる塩である。

Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Ｘ−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−Gl
u−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,（ここで、Ｘ＝Trp）。

ここに示されているペプチド構造では、アミノ酸組成は
次のように慣習的に省略して示す。

ペプチドＩは、アミノ酸配列： Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,を有し、ヒトトロンビン
Ｂ鎖の367−380残基（あるいは、ヒトプレトロンビン２
の配列の96−109残基）を示す。ヒトプレトロンビン２
の配列は、But Kowskiら、J.Biol.Chem. 252,4942−49
57（1977）によつて報告されている。ヒトプレトロンビ
ン２の１次構造を誘導するため、But Kowskiらはプレト
ロンビン１のプロモシアン切断生成物のキモトリプテイ
ツクペプチド断片を作成した。その断片の１つは、プレ
トロンビン２の95−109残基に相当する。しかしなが
ら、この断片については、何らの生物学的活性も調べら
れなかつた。また、本発明の96−109断片も作成あるい
は示唆されなかつた。

驚ろくべきことに、次に示す２つの断片は不活性である
のに、本発明の新規テトラデカペプチドはマクロフアー
ジ様細胞に対して有力なマイトジエン活性を示した。

ペプチドIII:H−Tyr−Glu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH ペプチドIV:H−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−Glu−Asn−A
sp−Leu−Leu−OH これらの発見は、ペプチドＩのアミノ末端部分が本発明
のペプチドのマイトジエン活性に重要であるということ
を示唆している。

〈発明の詳細な説明〉 本明細書は、この発明作成に関係する主題を特に指摘
し、明確にクレイムしているクレイムをもつて終わつて
いるが、本発明は、添付図面と関連した抜擢実施態様に
対する次の詳細な説明から、よく理解されるものと思わ
れる。その添付図面とは、第１図がヒトα−トロンビン
構造のモデルであり、第２図が本発明の１実施態様とし
て、合成マイトジエンペプチドへ細胞をさらした後の、
J774マウスマクロフアージ様細胞によるチミジン取り込
みおよび全細胞タンパク質レベルをグラフに示したもの
である。

第１図のヒトα−トロンビンモデルは、プロトロンビン
のタンパク質命名法に基づいており、１本鎖チモーゲン
は後に活性化され、因子Xaによつて、272および321残基
のところで２本鎖構造に切断される。このように生成し
た活性型酵素は、自触作用により、285残基のところで
Ａ鎖のはじめの13残基を削除し、α−トロンビンを生成
する。ペプチドCB67−129の構造を、斜線で示した「ル
ープＢ」挿入配列（すなわち367−375残基）と共に示し
てある。また、この断片の重要な構造上の特徴である、
活性部位His363（六角形）と炭水化物付着部位（Asn37
3）の場所も示してある。「ループＢ」トロンビンＢ鎖
挿入配列の正確な範囲がはつきりしないのと同様、Asx3
55と371のアミドの指定ははつきりしない。

この発明の新規マイトジエンペプチドは、ペプチド合成
に対する適当な常法手段を適用することにより作成され
る。従つて、伸長しつつあるペプチド鎖へ構成アミノ酸
が望ましい配列で加えられる、一連のカツプリング反応
により、ペプチド鎖は作成される。様々なＮ保護基、例
えばカルボベンジルオキシ基あるいはｔ−ブチルオキシ
カルボニル基（BOC）、様々なカツプリング試薬、例え
ばシジクロヘキシルカルボジイミドあるいはカルボニル
ジイミダゾール、様々な活性エステル、例えばＮ−ヒド
ロキシフタルイミドあるいはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのエステル、そして様々な脱保護剤、例えばトリフ
ルオロ酢酸、HCl/ジオキサン、トリス（トリフルオロ酢
酸）ホウ素、臭化シアンの使用、中間生成物の分離、精
製を伴う液相中での反応は、周知の古典的ペプチド方法
論によつて実施できる。

本発明のペプチドは、有名ばメリフイールド固相法によ
り作成される［Merrifield,J.Amer.Chem.Soc 85,2149
−54（1963）およびScience 150,178−85（1965）参
照］。この方法は、古典的ペプチド合成と同様な多くの
化学反応および保護基を使用しているが、カルボキシル
末端が固相、すなわち普通、架橋ポリスチレンあるいは
スチレンジビニルベンゼン共重合体に結合している、伸
長しつつあるペプチド鎖を与えている。各段階での過剰
な試薬の除去は、単にポリマーの洗浄をするのみである
ので、この方法は便宜的に手順上の処理数を簡易化して
いる。

伝統的なメリフイールドペプチド合成の一般的反応順序
を次のように図解する。

ペプチド付着のための反応性基を与えるクロロメチル化
の段階、PS＝ポリスチレン残基。

エステル化の段階−ｔ−BOC保護基を使つて保護した第
１のアミノ酸（R¹）のトリエチルアンモニウム塩との反
応。

ジシクロヘキシルカルボジイミドカツプリング試薬を用
いた、ペプチド合成段階。この段階IIIの次に、例え
ば、トリフルオロ酢酸の25％塩化メチレン溶液によるｔ
−BOCの脱保護および過剰のトリエチルアミンによるＮ
末端アミンの遊離を行い、それが、保護した第２のアミ
ノ酸（R²）の活性カルボキシル基と反応するのを可能に
する。最終段階は、完成したペプチドを、例えば無水HF
のアニソール溶液で処理することにより、PS樹脂から切
断する。

確立された固相合成法に関する背景の情報はさらに、St
ewartとYoungの論文、“Solid Phase Peptide Synthesi
s,"W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969、およびAd
vance in Enzymolgy 32,pp.221−296,F.F.Nold,Ed.,In
terscience Publishers,New York,1969,のメリーフイー
ルドによる総説の章および、Erickson and Merrifield,
The Proteins,Vol.2,p.225et seq.（ed.Neurath and Hi
ll）,Academic Press,New York,1976を参照することに
よつて得られる。

マクロフアージ様細胞の増殖刺激は、本発明のマイトジ
エンペプチドの様々な濃度における細胞による、チミジ
ン取り込みを測定することにより、測定される。これ
は、J774,P388D1,RAW,PU5を含む多くのマクロフアージ
様細胞系に対して測定された。これらは、例えばAmeric
an Type Culture Collection,Rockville,Marylandより
入手できる有名な、マウス細胞系である。

この発明は、これら以下の実施例に限定されず、次の実
施例は、この発明をさらに説明するであろう。

実施例１ ヒトトロンビンＢ鎖の367−380残基を示し、第１図に示
すようなループＢ挿入配列を含むペプチドI, Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH, は、Wilnerら、Biochemistry 15（６） 1209−1213（1
976）および18（23）、5078−5082（1979）に記載され
ているように、伝統的なメリフイールド固相ペプチド合
成の修正により合成された。充分保護されたペプチド
は、Tamら，J.Am.Chem.Soc．105,6442−6455（1983）の
２段階HF触媒S_N２法により、同時に脱保護および、支持
体である樹脂から切断した。粗ペプチドは、Wilnerら、
Biochemistry 15（６） 1209−1213（1976）に書かれ
ている方法により、DEAE−Sephacel カラムを使つたイ
オン交換クロマトグラフイーで精製した。ペプチドの純
度は、単一ピークとしてクロマトグラフ分析される、Fu
lmerら，J.Biol.Chem.，254,7208−7212（1979）、の方
法に従い、逆相系C₁₈高速液体クロマトグラフイー（HPL
C）により確かめた。また、薄相クロマトグラフイー（T
LC）により、２つの異なる溶媒系を用いた時、単一スポ
ツトとして移動することから、ペプチドが同種であるこ
とも認められた。アミノ酸分析では、望ましいペプチド
配列と一致した、モル比を生じた。

このペプチド合成において、すべての成分は、試薬グレ
ードを持つていた。Ｎ^α−tert−ブトキシカルボニル
（BOC）Ｌ−アミノ酸は、Bachem,Inc.,Torrance,CAより
購入した。側鎖を保護されたBOCアミノ酸は、γ−ベン
ジルグルタミン酸、β−ベンジルアスパラギン酸、Ｏ−
ベンジルトレオニン、２−クロロベンシルオキシカルボ
ニルレーリシン、Ｎ−ホルミルトリプトフアン、Ｏ−ベ
ンジルチロシンであつた。アスパラギンは、等モルの１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下で、ジシクロヘ
キシルカルボジイミドと直接結合させることにより、保
護せずに、誘導された。BOCアミノ酸の純度は、融点
（補正されていない）と薄相クロマトグラフイーによつ
て評価された。DEAE−SephacelはParmacia Fine Chemic
als,Piscataway,NJより購入した。Bio−Gel Ｐ−２（2
0−400メツシユ）はBio−Rad Laboratorise,Rockville
Centre,NY、より購入した。スチレンジビニルベンゼビ
ーズ、１％架橋、200−400メツシユ、クロロメチル化
（1.16ミリ当量Cl/g）は、Lab Systems,Ins.,San Mate
o.CAより購入し、使用前、18時間、温（60℃）ジメチル
ホルムアミドによつて抽出した。

ペプチド合成において、テトラメチルアンモニウムヒド
ロキシドにより、この残基（例えばロイシン）を中和
し、Ｎ^α−tert−BOC−Ｌ−ロイシンテトラメチルアン
モニウム塩とクロロメチル化された樹脂とをジメチルス
ルホキシド（DMSO）中で、80°１時間反応させることに
より、不溶性支持体へのCOOH末端残基のエステル化は行
われた。アミノ基の脱保護は、25％トリフルオロ酢酸の
塩化メチレン溶液を使つて行われ、中和は、10％トリエ
チルアミンの塩化メチレン溶液を使つて行われた。すべ
ての残基カツプリングは、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド塩化メチレン溶液（４当量）を使つて行われ、カツ
プリングは、Kaiser（ニンヒドリン）法により検査し
た。そして、Ｎ−アセチルイミダゾールを使い、ターミ
ネイト（もし必要であれば）した。完成し、充分に保護
されたペプチドは、先に述べた２段階HF−触媒S_N２法に
より、不溶性の支持体より切断し、脱保護した。

ドライエチルエーテルにより樹脂を洗浄した後、粗ペプ
チドは、10％酢酸中に抽出し、凍結乾燥した。ペプチド
は、DEAE−Sephacelカラムにより同時に脱塩、精製し、
varigrad device（Buchler Instruments,Ins.,Fort Le
e,N.J.）において開発された、リニヤーソルトグラジエ
ンとにより溶出した。初期緩衝液は、0.05Mホウ酸ナト
リウムで、最終緩衝液は、0.5M塩化ナトリウムを含む初
期緩衝液であつた。カラムの大きさは、1.2×40cmであ
つた。溶出画分は、225nMの吸収およびシリカゲルＧ（M
erck Darmstadt,Germany）でプレコートしたガラスプレ
ートを使つた薄相クロマトグラフイーによつて分析し
た。フルオレスカミンおよび塩素:O−トリジン噴霧は、
ペプチド発色に用いられた。薄相クロマトグラフイーに
用いた２つの溶媒系は、 （１）１−ブタノール−酢酸−水（1:1:1、v/v/v）およ
び （２）酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 （5:5:1:3、v/v/v/v）であつた。

望ましいペプチドが、主要ピークとして溶出した。この
ピークは続いて、0.5M重炭酸アンモニウム緩衝液を用い
て2.5×100cmBio−Gel P−２カラムにより脱塩した。逆
相C₁₈カラムを使つたこのペプチドのHPLC分析により、
ペプチドは同種であることが示された。また、このペプ
チドは、アミノ酸分析において予想されたモル比も与え
た。

実施例２ 実施例１の精製テトラデカペプチドのマクロフアージ様
細胞に対するマイトジエン効果を測定するため、次の試
験を行なつた。³ [H]−TdR取り込み 24ウエルデイスポーザブルプラスチツクプレート（Falc
on,Oxnard,CA）１ウエル当り５×10⁵の初期濃度、37℃9
5％CO₂、湿潤条件下で、10％ウシ胎児血清（FCS）を含
むダルベツコ変法イーグル培地（DMEM）に浮遊した様々
な細胞系をプレートに入れた。DNA合成の停止（すなわ
ちG₀／G₁）は、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む
血清不含DMEMで、48時間細胞を培養することにより、行
なった。それから、細胞をペプチドあるいは様様なトロ
ンビン型、あるいはFCSに48時間さらした。チミジン取
り込みの増加は、Ｎ−メチル³[H]−TdR（１μCi/ml）の
２時間のパルスの後に、評価された。細胞は３倍量のPB
S（リン酸緩衝食塩水、pH7.4）で４回洗浄し、10％トリ
クロル酢酸で沈澱させ（30分、４回）、その不溶物は、
２倍量のETOH:ET₂Ｏ（3:1 v/v）で抽出した。沈澱物
は、N NaOHで溶解し、dye−bindingアツセイ（Bio Rad
Labs,Richmond,CA）を使つたタンパク質定量と、液体シ
ンチレーシヨンスペクトロメトリーのため、適量が回収
された。

これらの試験に使用した様々な細胞系は、マウスマクロ
フアージ様細胞系、J774,P388D1,RAW,PU5であつた。こ
れらの試験に使用した様々なトロンビンの種類は、血小
板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、繊維
芽細胞成長因子（FGF）、神経成長因子（NGF）であつ
た。これら既知のポリペプチド成長因子に関する背景の
情報としては例えば、Krisらによる最近の総説記事、Bi
otechnology,February 1985,pp.135−140,およびHormon
al Proteins and Peptides,Ed.by Choh Hao Li,Vol.12,
“Growth Factors",Academic Press,1984における包括
的な総説を参照することができる。EGF,NGF,FGFは、Bio
medical Technologies,Cambridge,Massachusettsより商
業上入手できる。典型的なテストにおいて、最適ペプチ
ド濃度（すなわち10⁸Ｍ）に増殖停止した細胞を24時間
さらした後、細胞数はコントロール値、培養ウエル当り
1.2−２×10⁵細胞の２倍に増加した。対照として、既知
の増殖促進作用剤である、PDGF,EGF,NGF,FGFは500ng/ml
の濃度範囲まで、これらの細胞の増殖を誘導しなかつ
た。その結果は、第２図および表１で、下記に示してあ
る。第２図において、静止したJ774細胞中のベースライ
ントリチウムラベルチミジン（³[H]−TdR）取り込み
は、１ウエル当り、5000cpm±420s.e.m（平均標準誤
差）であつた。結果は、トリプリケート測定の平均値で
表現してある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトα−トロンビン構造のモデルであり、第
２図は、本発明の１実施態様として、合成マイトジエン
ペプチドへ細胞をさらした後の、J774マウスマクロフア
ージ様細胞によるチミジン取り込みおよび全細胞タンパ
ク質レベルをグラフに示したものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列 Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
   lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,からなる強力なマイトジ
   エン活性を有するペプチドあるいはその生理学的に許容
   できる塩。
2. 【請求項２】生理学的に許容できる担体または賦形剤と
   ともに、活性成分として次のアミノ酸配列 Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
   lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,からなるペプチドまたは
   その製薬的に許容できる塩を含む、インビトロマクロフ
   ァージ様細胞の生長刺激用薬剤。